Souris
Mise au point et caractérisation de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour la mise en place de nouveaux modèles d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.
Choix des espèces
Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Etudes de tolérance à de nouvelles molécules avant études d’efficacité.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
1 200 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par injection ou gavage, jusqu'à dix-huit administrations sur six semaines, afin de déterminer la dose maximale tolérée avant de futures études d'efficacité. Le porteur précise que les dommages attendus tiennent à une toxicité que les tests in vitro n'auraient pas détectée et que les animaux atteignant un point limite seront tués. Il affirme qu'il n'est pas possible d'étudier la tolérance d'un composé sans animaux, les approches in vitro et in silico ne tenant pas compte de l'"organisme entier".
Objectifs
Notre laboratoire travaille avec des laboratoires qui développent des composés à visée thérapeutique. Ces laboratoires nous sollicitent ensuite afin de réaliser par imagerie In Vivo des études d’efficacité sur des modèles animaux de pathologie ; classiquement il s’agit de modèles de cancer. Avant de pouvoir réaliser ces études d’efficacité, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée qui pourra être utilisée. Les expériences menées dans ce projet sont donc des études préliminaires de tolérance menées chez l'animal sain. L’objectif est également de cibler au mieux les doses à utiliser afin de limiter le nombre de lots expérimentaux dans les projets futurs d'efficacité menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Avant de recevoir les composés et d’envisager l’administration à des souris, le client aura réalisé une analyse de la littérature afin de vérifier si des études ont déjà été faites sur des composés de même classe et qu’ils ne possèdent pas de toxicité avérée. Le client aura également réalisé des tests in vitro pour déterminer la dose efficace 50% du composé. A partir de cette dose, la dose efficace équivalente chez la souris est déterminée par des calculs prenant en compte différents facteurs tel que le volume sanguin. C’est à partir de cette dose théorique que les doses à tester sont déterminées. Notre laboratoire n’a pas la capacité de tester des marqueurs biochimiques ou des marqueurs de tolérabilité et/ou l’obtenir des données de pharmacocinétiques. Ces analyses nécessiteraient en outre l’utilisation d’un grand nombre de souris supplémentaires. De plus, ce projet ne s’inscrit pas dans le cadre des études réglementaires de toxicité. Le déroulement des études prévues permettra de limiter au maximum du nombre de souris. Si la dose administrée est tolérée, une dose supérieure pourra être administrée au lot de souris suivant et ainsi de suite jusqu'à l'observation d'effets indésirables. (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement…). Dans ce cas, la dose supérieure ne sera pas administrée et si l'un des points limites est atteint, l'animal sera mis à mort. La dose sélectionnée sera la dose précédant celle qui a induit des effets indésirables.
Bénéfices attendus
Les expériences menées dans cette saisine ne s'inscrivent pas dans les études réglementaires de toxicité mais en tant qu'études préliminaires menées chez l'animal sain, avant des essais menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Ce projet permet de cibler les doses qui seront utilisées pour de futures études d'efficacités évalué par imagerie. Lors de ces études, le nombre de lots utilisés sera donc réduit.
Procédures
- Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour une injection unique": Pour chaque souris, administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire: Sur chaque souris, au maximum 3 prélèvements de 100µl avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. - Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour des injections répétées": Pour chaque souris,administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. La dose sera administrée à plusieurs occasions, avec un maximum de 18 administrations sur 6 semaines maximum et au maximum 1 administration 1 fois/jour. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire. Sur chaque souris,au maximum 7 prélèvements de 100µL avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés à une toxicité in vivo qui n'aurait pas pu être détectée in vitro. Une observation méticuleuse de l'état général des animaux tout au long des expériences ainsi que la définition de points limites pertinents permettra d'anticiper toute douleur ou souffrance chez les animaux.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.
Remplacement
Dans le cadre du développement de futurs médicaments, il est nécessaire d'évaluer leur toxicité potentielle en fonction de la dose administrée. Pour ce type de développements, les études sont classiquement réalisées in vitro, in silico ou avec des modèles animaux. Les études in vitro et in silico ne tiennent pas compte de la complexité d'un organisme entier (variété des tissus, communications inter organes etc...) et il n'est pas possible à l'heure actuelle d'étudier la tolérance d'un composé sans utiliser d'animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats pertinents soit 2 souris par doses. Il n’y a pas de test statistiques prévu. Les doses testées seront administrées de la dose la plus faible à la dose la plus forte, en décalé dans le temps sur des souris différentes (24h minimum ou plus entre 2 doses, en fonction de la cinétique d'élimination du composé, estimée par le client) ainsi si des effets indésirables sont observés sur 1 des 2 souris d’une dose, la dose inférieure sera retenue comme étant la dose maximale tolérée et les autres souris ne seront pas injectées avec les doses supérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages en portoir ventilé avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation et des objets d'enrichissement du milieu (celluron). Les animaux sont observés scrupuleusement quotidiennement afin de respecter leur bien-être et de déceler tout signes d’apparition d’effets indésirables (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement, douleurs…). Nous avons mis en place une grille de scoring et des points limites.
Choix des espèces
Ces études sont menées chez la souris saine car elles se situent en amont d'essais qui seront ensuite réalisés sur des animaux modèles de pathologie expérimentale.(modèles animaux de cancer par implantation orthotopique ou sous-cutanée de cellules tumorales par exemple) La taille de l'animal est compatible avec l'administration de composés parfois difficiles à produire par les chimistes en grande quantité et la petite taille de la souris (nécessitant donc peu de composés) en fait un animal souvent utilisé pour les premières études réalisées in vivo. C'est chez la souris qu'il existe le plus grand nombre de modèles de pathologies. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 6 et 12 semaines en fonction de la demande du chercheur. En effet, par la suite, les études d’efficacité se feront sur des modèles pathologiques de souris. Les modèles cancéreux sont induits sur des souris de 6 semaines minimum. Les traitements peuvent commencer immédiatement et jusqu’à 6 semaines après l’induction d'où le choix de l'utilisation d'animaux agés de 6 à 12 semaines.
Compréhension des mécanismes expliquant l’activité anti-pseudomonale de deux souches de Lactobacillus dans un modèle murin de pneumonie à Pseudomonas aeruginosa.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
84 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Anesthésiées à l'isoflurane, elles reçoivent dans les narines une instillation de Pseudomonas aeruginosa, bactérie responsable de pneumonies, puis sont tuées 24 heures plus tard. Le porteur indique que les souris recevant seulement la bactérie peuvent subir une perte de poids, des douleurs et une mobilité réduite. Il affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des cultures cellulaires et choisit donc de conserver le modèle animal pour tester des probiotiques.
Objectifs
Contexte : Pseudomonas aeruginosa est la première bactérie responsable de pneumonies nosocomiales. Ces pneumonies à P. aeruginosa sont grevées d’une mortalité variant de 30 à 70%. Cette bactérie colonise également les voies aériennes inférieures de 40% des patients atteints de mucoviscidose âgés de plus de 18 ans, entraînant une dégradation respiratoire. Cette bactérie, qui possède déjà de nombreuses résistances innées, peut acquérir des résistances à d’autres antibiotiques voire à tous les antibiotiques habituellement actifs. Cette quasi résistance à tous les antibiotiques disponibles conduit à des impasses thérapeutiques d’où la nécessité d’alternatives aux traitements par antibiotiques. Les probiotiques, qui sont des bactéries bénéfiques pour la santé de l’hôte, et notamment les Lactobacillus qui semblent avoir une efficacité dans le traitement de ces infections.
Bénéfices attendus
Les nouvelles données obtenues grâce à ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes d’action bénéfique in vivo des Lactobacillus vis-à-vis des pneumonies à Pseudomonas aeruginosa, pathogène souvent responsables d’infection respiratoire chez les patients atteint de mucoviscidose et entrainant un déclin de leur fonction respiratoire) et sujet à une résistance aux antibiotiques importante et croissante. Si plusieurs des mécanismes d’action envisagés sont impliqués (immunomodulation, préservation de la barrière alvéolo-capillaire), il existera des arguments importants pour la construction future des essais cliniques de phase I pour valider cette thérapeutique alternative aux antibiotiques.
Procédures
Les souris seront pesées dès leur arrivée à l’annexe de l’animalerie infectieuse, et quotidiennement jusqu’à leur mise à mort, soit une fois par jours pendant 4 jours, ce geste dure environ 30 secondes. Ensuite, les animaux seront préalablement anesthésiés avec de l’isoflurane gazeux afin de leur administrer deux instillations intranasales à 18h d'écart ; nous déposons, à l’aide d’une pipette à l’entrée des narines des souris une suspension qui sera inhalée par la souris via ses mouvements respiratoires naturels. Ce geste est très court, également environ 60 secondes.
Impact sur les animaux
Ce projet peut induire un stress chez les animaux lors des pesées quotidiennes (30 secondes). Ce stress peut exister également lors de l’anesthésie gazeuse (30 secondes) nécessaire à l’instillation intranasale, technique qui permet l’introduction de bactéries au niveau pulmonaire et qui prends moins de 30 secondes. Le temps total incluant l’anesthésie, l’instillation et la récupération de l’animal dans la cage est d’environ 60 secondes. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa (souche de laboratoire PAO1) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire une inactivité.
Devenir
Les 84 souris C57BL/6 mâles seront mises à mort 24h après l’instillation de Pseudomonas aeruginosa
Remplacement
Les données de la littérature et les résultats obtenus dans nos précédentes études in vivo mettent en avant les effets bénéfiques des Lactobacillus sur les pneumonies à Pseudomonas aeruginosa. Nous souhaitons donc poursuivre sur cette voie en analysant les mécanismes d’actions des Lactobacillus au niveau du parenchyme pulmonaire ; la cytométrie de masse en image sur le tissu pulmonaire permet d’analyser ex vivo sur une même coupe les cellules épithéliales respiratoires, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P.aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P.aeruginosa et celui recevant du Lactobacillus préalablement à l’instillation de P.aeruginosa, à l’aide d’un test de Student réalisé sur les données log-transformées afin de respecter la condition de normalité requise. En cas d’écart à la normalité persistant malgré cette transformation, un test non paramétrique de Mann-Whitney sera utilisé. La différence attendue sur les données transformées est donc de 1 point pour un écart type de 0,6 point (données personnelles). Afin de garantir une puissance de 80 %, 6 souris sont nécessaires dans chaque groupe lorsque ce groupe est comparé au groupe contrôle P. aeruginosa. Pour chacune des 3 expérimentations, le nombre total sera de 84.
Raffinement
Avant toute instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés par isoflurane gazeux. Une analgésie sera mise en place en fonction de notre table de suivi de soin par injection de buprénorphine pour réduire au minimum la douleur. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie sans augmenter les inoculums de Pseudomonas (comme pour les souris BALB/c en particulier qui sont naturellement plus résistantes. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur un modèle de stress induit par une contention forcée sur souris.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections jusqu'à deux fois par jour pendant un à trois mois, puis subissent une fois une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer le stress que le projet cherche à étudier, avant d'être décapitées ou perfusées sous anesthésie. Le porteur indique que les souris génétiquement modifiées ne peuvent pas échapper à leur phénotype dommageable et que la mise à mort peut entraîner un stress pré-mortem important. Le projet répond à des demandes de laboratoires clients pour évaluer, avant les essais réglementaires, des molécules liées au stress.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Les animaux vigiles seront injectés deux fois par jour, au maximum, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est en moyenne d’un mois mais peut durer jusqu’à trois mois. Les contentions répétées nécessaires à ces injections répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge, par décapitation rapide ou par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse juste après l’induction de ce stress.
Impact sur les animaux
Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-*- Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée de une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse et la décapitation rapide peuvent amener un stress pre-mortem important.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.
Effets d’une exposition maternelle et/ou développementale à de faibles doses d’un pesticide contenant du manganèse, chez la souris C57bl6J mâle et femelle. Caractérisation des altérations métaboliques dans le foie et le tissu hématopoïétique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées via leur mère au maneb, un pesticide contenant du manganèse, puis pour certaines à un régime gras et sucré, elles subissent perçage des oreilles, gavages d'huile, injections de glucose ou d'insuline et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal à l'œil. Le porteur affirme que ces actes ne développent pas d'anxiété chez l'animal. Il revendique l'étude sur l'"animal entier" et présente le projet comme apportant des preuves pour réduire l'usage des pesticides.
Objectifs
L’exposition des travailleurs agricoles aux fongicides utilisés pour lutter contre la présence des champignons parasites des fruits et légumes a des effets négatifs en santé humaine. Ainsi, des études préliminaires indirectes suggèrent que le foie et la moelle osseuse (site de production des cellules du sang) sont des tissus cibles en particulier des fongicides contenant du manganèse comme le maneb à des doses compatibles avec une exposition environnementale. Or, en fin de vie fœtale, le foie qui est initialement un organe hématopoïétique (site de fabrication des globules rouges) va acquérir les fonctions retrouvées à l’âge adulte comme des fonctions nutritionnelles (régulations du métabolisme des glucides, des lipides) et antitoxiques (polluants, médicaments). Ces fonctions sont essentielles à la vie. Elles permettent la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang), la détoxification des polluants et médicaments et elles s’opposent au stockage de lipides appelé stéatose hépatique. Les objectifs sont de démontrer par des preuves directes sur l’animal entier (1) si le foie est une cible du maneb tout au long du développement depuis la vie fœtale jusqu’au stade adulte ; (2) si une exposition à doses faibles pendant la vie fœtale va modifier la fonction hématopoïétique du foie fœtal et l’acquisition des fonctions dites « adultes »; (3) si une exposition au maneb prédispose à la prise de poids et aggrave la stéatose hépatique lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en graisses et en sucre à l’âge adulte pour mimer le régime appelé « Western-diet »; (4) Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles afin de déterminer s’il existe des effets dépendants du sexe. Un total de 342 souris seront nécessaires pour ce projet. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier si l’obésité, les maladies hépatiques liées à l’obésité ou si certaines maladies du sang pourraient être la conséquence d’une exposition au maneb en particulier pendant la vie fœtale. En effet, les doses utilisées dans ce projet sont compatibles avec une exposition environnementale. La réalisation de ce projet pourra avoir de fortes implications en termes de recommandations notamment pour les femmes en âge de procréer et pour la sécurité des marchés alimentaires. Ce projet fournira des arguments et des preuves scientifiques aux autorités politiques pour soutenir la réduction de l'utilisation massive des pesticides contenant du manganèse comme le maneb, dans le monde, et notamment dans les mélanges extemporanés de pesticides appelés « bouillies » qui font l’objet d’une règlementation.
Procédures
Les interventions sont nutritionnelles (exposition au maneb par l’alimentation et exposition à un régime riche en graisses et en sucres, classiquement appelé Western diet). Les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles (éveillés) après une mise à jeun de courte durée (6 heures). Il s’agit de prélèvements de sang à la queue et du prélèvement terminal à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Cela permet de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou d’insuline ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre), d’insuline ou un gavage d’huile alimentaire ait été réalisé. La durée totale des tests est de moins de 90 minutes (5 prélèvements pour dosage de la glycémie ou du taux d’insuline) et de moins de 4 heures (4 prélèvements pour dosage des lipides). Chaque prélèvement en lui-même dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont de classe légère (procédure 3) ou modérée (procédures 1 et 2). La présence de maneb dans le régime alimentaire est très faible et ne devrait pas perturber la prise alimentaire. La quantité de nourriture contaminée proposée aux souris correspond à la dose sans effet toxique. De même, le régime riche en graisses et en sucres est bien accepté des souris. La souris étant un animal nocturne, la mise à jeun (limitée à 6 heures entre 7h30 et 1 3h30) n’a pas de conséquence sur l'état général, les biberons d’eau n’étant pas enlevés. Les autres nuisances incluent le perçage des oreilles, les gavages d’huile, les injections de glucose ou d’insuline et l'incision très fine au niveau de la queue à l’aide d’un scalpel, ou le prélèvement rétro-orbital après dépôt d’un analgésique. Enfin, les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort. Ces actes sont pratiqués par du personnel compétent et ne développent pas d’anxiété chez l’animal.
Devenir
Tous mis à mort en raison des prélèvements d’organes réalisés sur tous les animaux expérimentés
Remplacement
La réalisation de ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition maternelle au fongicide maneb sur le développement des souris jusqu’à l’âge adulte. Ce projet vise aussi à étudier l’effet aggravant d’une exposition maternelle au maneb sur le développement des maladies liées à l’obésité. Enfin, ce projet vise à étudier la transition fonctionnelle du foie dans le fœtus exposé via la mère au maneb en comparaison de fœtus issus de mères non exposées. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont très nombreuses et ne peuvent donc pas être étudiées autrement que sur l’animal entier. Enfin, la dépendance avec le sexe est un paramètre également difficilement analysable autrement que sur l’animal entier.
Réduction
Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et tirer des conclusions qui puissent faire poids auprès des évaluateurs du risque pour diminuer l’utilisation des pesticides en France et en dehors de la France. Au total sur les 5 années, le nombre d’animaux sera de 342 animaux
Raffinement
Pendant toute la durée des études, les souris sont surveillées individuellement 3 fois par semaine pour les souris adultes et au moins 5 fois lissés sur la semaine entière au moment de la gestation, la mise-bas et l’allaitement. Du coton est déposé dans la cage pour que la femelle puisse faire son nid et maintenir au chaud sa portée. Les études sont réalisées dans une pièce au calme. Une surveillance accrue sera réalisée chez les mères allaitantes n’ayant pas développé un comportement maternel. Dans ce cas, les petits de la cage seront déplacés dans des cages d’adoption après les avoir mouillés avec de l’urine des petits de la cage naturelle pour qu’ils soient acceptés par la mère d’adoption. Le test métabolique de sensibilité à l’insuline consiste à vérifier que le taux de sucre dans le sang diminue bien après une injection d'insuline; sinon , on parle de résistance à l'insuline. Lors de la réalisation de ce test, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée dans du coton supplémentaire pour éviter l’hypothermie (froid). Un analgésique (anti-douleur) est utilisé pour permettre le prélèvement sanguin à l’œil sans souffrance et les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort.
Choix des espèces
La souris a de nombreuses caractéristiques « proches » de celles de l’homme. Le projet vise à étudier les effets nocifs liés à l’exposition au maneb dans un modèle souris, en particulier lorsque l’exposition a lieu pendant la période maternelle, une période de haute sensibilité aux polluants. Cela nécessite d’étudier à la fois les fœtus en réponse précoce à l’exposition et les individus une fois devenus adultes, à la fois les mâles et les femelles. Les souris utilisées répondent très bien aux régimes dits obésogènes qui sont riches en graisses et en sucres au sens où les souris vont prendre du poids en les consommant et présenter un certain nombre de désordres métaboliques retrouvés chez l’homme et liés à l’obésité comme le stockage de lipides dans le foie (stéatose hépatique). Or, obésité et stéatose touchent aujourd’hui 20% de la population en France (plus de 35% aux US) ; ce qui en fait aujourd’hui des problèmes majeurs de Santé Publique.
Étude du thalamus paraventriculaire dans les processus d’homéostasie énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies avec pose de fibres optiques et de cathéter gastrique, puis des tests de comportement, de métabolisme du glucose et de calorimétrie, pour étudier le rôle d'une structure du cerveau dans la régulation de l'appétit. Le porteur indique que le port des fibres et du cathéter induit un stress initial et une mobilité réduite, et qu'une fuite gastrique entraîne la mise à mort immédiate. Il affirme que l'étude, fondée sur la physiologie intégrée, ne peut être menée in vitro ni sur des invertébrés.
Objectifs
La régulation de l’homéostasie énergétique est un processus physiologique capitale et extrêmement conservé. Le contrôle de cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer de multiples signaux indiquant les états nutritionnels/énergétiques de l'organisme, et à mettre en place des réponses appropriées. Les dysfonctionnements de ce contrôle peuvent conduire à une pléthore de troubles alimentaires (surpoids, obésité). Même si l'hypothalamus a été désigné comme le régulateur principal de l'équilibre énergétique, d'autres circuits ont été récemment identifiés. Parmi les structures extra-hypothalamiques, le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) apparaît comme un centre critique car il joue un rôle essentiel dans le relais bidirectionnel des informations du tronc cérébral vers des structures telles que l'amygdale, le striatum ventral, le cortex préfrontal et l'hypothalamus. Le PVT est principalement composé de neurones glutamatergiques. Un nombre croissant d’évidences indique un rôle clé des neurones PVT dans le contrôle des comportements liés à la nourriture. Cependant, ces études se sont principalement concentrées sur l'alimentation sans tenir compte des composantes énergétiques et métaboliques de ce comportement complexe ni de l'hétérogénéité des types cellulaires des neurones PVT. Il est intéressant de noter qu'une sous-population neuronale du PVT exprime les récepteurs D2 de la dopamine, fournissant un outil pour discriminer les sous-types cellulaires du PVT. On ignore encore si et comment les neurones exprimant les D2R peuvent moduler les adaptations homéostatiques, l'équilibre énergétique et les comportements liés à la prise alimentaire. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer la contribution des neurones PVTD2R dans la régulation de la prise alimentaire et le métabolisme énergétique. 2. Étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones PVTD2R 3. Étudier le rôle des projections des neurones PVTD2R 4. Comprendre la dynamique de l’activité des neurones PVTD2R
Bénéfices attendus
Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. La prise alimentaire et la régulation de l’homéostasie énergétique ont souvent été étudiées sous l’angle d’une implication et dysfonctionnement de l’hypothalamus. Cependant, d’autres structures extra-hypothalamiques jouent aussi un rôle clé dans ces processus. Nos résultats préliminaires indiquent que le noyau paraventriculaire du thalamus PVT aurait un rôle central dans la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique. Le projet ThalHOME vise à établir un nouveau cadre conceptuel qui voit dans les neurones D2R du PVT une population centrale pour la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques sous-jacents au développement du syndrome métabolique. Nous sommes convaincus que la mise en lumière des aspects intégratifs de la physiopathologie du PVT dans la surconsommation alimentaire sera essentielle pour élaborer et accélérer les stratégies préventives et thérapeutiques. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ThalHOME pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).
Procédures
Les animaux seront soumis : -pour 7 lots à une chirurgie (1j), puis après une période de repos, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots. -pour 2 lots à deux chirurgies qui se feront en une ou deux fois en fonction du bien être de la souris et de sa capacité à supporter une anesthésie longue. Si cela doit se faire en deux fois les souris auront une phase de repos de 10-15j minimum avant la deuxième anesthésie. Après une période de repos de deux semaines minimum, les lots seront soumis à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur un de ces deux lots.
Impact sur les animaux
Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress; de même pour le cathéter gastrique. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres/cathéters étant légèrs, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrements et de perfusions. Le cathéter peut également se déloger de l'estomac, se qui provoque une fuite gastrique en intrapéritonéale. L'animal sera mis à mort immédiatement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests nonparamétriques.
Raffinement
Le soin apporté aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.
TL EVOTEC IMMUNO Mise au point de solutions thérapeutiques modulant le système immunitaire dans les domaines de l’inflammation de l’immuno-oncologie et de la vaccination
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 700
Lapins : 500
55 000 animaux non-humains vont être utilisés, en majorité des souris avec 700 rats et 500 lapins, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés-tests, des prélèvements sanguins répétés et des immunisations, certaines souris étant irradiées puis greffées de cellules immunitaires humaines, pour sélectionner des candidats médicaments destinés aux dossiers réglementaires. Le porteur indique que les hébergements longs, les doses mal tolérées et l'injection de cellules humaines peuvent provoquer perte de poids et difficultés de déplacement. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires.
Bénéfices attendus
Sélectionner de nouvelles entités thérapeutiques innovantes pour des pathologies dont les besoins médicaux et la prise en charge de patients sont non satisfaits aujourd'hui.
Procédures
Administration unique ou répétée (plusieurs fois par jour sans dépasser 3 fois) de composés-tests à des doses pharmacologiquement actives. Prélèvements de sang sériés sur un même animal sans dépasser 7.5% du volume total du sang sur une semaine. Administration d'un antigène afin d'immuniser un animal sous anesthésie. Irradiation non létale de souris hautement immunodéfiscientes afin d'éliminer les cellules immunitaires murines avant de greffer des cellules immunitaires humaines.
Impact sur les animaux
Ces modèles sont de longue durée (1 à 40 semaines) pour se mettre en place. Cela signifie un impact négatif relatif à un hébergement de longues durées en groupe sociaux sur le bien-être des animaux bien que tous les moyens disponibles sont utilisés pour minimiser cet aspect. Les effets indésirables peuvent provenir de niveaux de doses administrées mal tolérées pour obtenir un effet pharmacologique ou d’un effet adverse de l’injection de cellules humaines dans un environnement murin. Les signes en seraient alors une perte de poids, des difficultés à se déplacer. Des administrations de composés à des doses sub-toxiques durant plusieurs jours, des prélèvements de sang sériés pour évaluer l'exposition à un composé peuvent nuire au confort des animaux, peut générer du stress.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang terminaux ou des collectes d'organes pour mesurer certains paramètres ou la concentration des composés-test adminsitrés. Les animaux dits "contrôle" sont mis à mort également pour des prélèvements de sangs ou d'organes afin de disposer d'échantillons contrôles au niveau des analyses faites ultérieurement.
Remplacement
A notre connaissance il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité du rôle du système immunitaire dans le développement des réponses immunitaires anti-tumorales et l’activation du système immunitaire à des fins vaccinales. Les actions du système immunitaire impliquent de nombreux tissus et organes avec des mécanismes sous-jacent encore largement inexpliqués. Le modèle animal est également nécessaire pour recueillir des données pertinentes sur les mécanismes d’action du système immunitaire suite à l’administration d’un composé afin de développer des solutions thérapeutiques innovantes.
Réduction
Les composés passeront des filtres pour réduire le nombre des études in vivo et la quantité d’animaux utilisés dans ce projet. Ces filtres comprennent des tests in vitro et des études pharmacocinétiques chez le rongeur. Seuls les produits à forts potentiels seront testés dans les études d’efficacité in vivo. Les modèles animaux utilisés suivront les protocoles décrits dans la littérature. Nous confirmerons la taille des groupes qui permettrait de détecter un effet statistiquement significatif pour une différence entre les gropes controles et traités de 40% en considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront sous anesthésie. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Des consignes spécifiques seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Les animaux affectés recevront des soins adaptés, par ou sous autorité du vétérinaire ou seront euthanasiés
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : • Espèce développant une maladie identique à celle touchant l’homme (par exemple, la rage) (Souris) • Espèce sensible à l’infection (par exemple l’Herpès Simplex) (Souris, lapin) • Espèce développant une réponse immunitaire similaire à l’homme (par exemple CMV) (Souris, Rat) • Type d’antigènes (protéines, polysaccharides, germes atténués…) ou d’adjuvants D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire. Dans la plupart des procédures, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Pour des demandes particulières, des animaux âgés peuvent être utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles peuvent être utilisés (souriceaux, ratons ; etc…).
Rôle antiviral de l’ARN interférence in vivo
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
494 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des adultes et des souriceaux d'une semaine sont infectés par le virus Zika ou Sindbis par injection, pour étudier le rôle antiviral d'une protéine in vivo. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une cachexie avec perte de poids supérieure à 20 %, poil hérissé, prostration et rejet des souriceaux par la mère. Il affirme que le modèle souris reste "indispensable" malgré des méthodes alternatives déjà utilisées par le laboratoire.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier l’infection aux virus SARS-CoV-2 et Zika, deux virus d’importance médicale chez l’humain, et d’analyser les mécanismes immunitaires en jeu lors de l’infection virale. La rencontre avec un virus se traduit en effet par l’activation de multiples mécanismes de protection nommés immunité innée (interféron) et adaptative. Cependant, toutes les cellules du corps ne sont pas protégées de la même façon par ces mécanismes. En effet, le corps humain est composé de cellules dites différenciées, qui forment les organes et effectuent des fonctions spécialisées, ainsi que de cellules souches. Le remplacement des cellules différenciées dépend de la division des cellules souches, qui ont donc pour rôle de maintenir l‘architecture des tissus. Les cellules différenciées sont protégées par des mécanismes appartenant à l’immunité innée, notamment l’interféron, qui ne sont pas actifs dans les cellules souches. Malgré cela, les cellules souches sont généralement peu susceptible d’être infectées par des virus, car elles possèdent des mécanismes de défense spécifiques. Ces mécanismes peuvent être étudiés avec des modèles de souris. Par exemple, un de ces mécanismes est capable de dégrader l’ARN viral (grâce à une protéine d’intérêt) et ainsi de contrecarrer l’infection par les virus à ARN, notamment les virus Sindbis et Zika. Nous avons en effet démontré in vitro que l’activité de cette protéine d’intérêt permettait de protéger les cellules souches neuronales des virus zika et SARS-CoV-2 Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes de stimulation de cette voie récemment identifiée qui induit une réponse spécifique anti virale efficace Pour cela, nous allons interroger la perte de notre protéine d’intérêt sur : 1) l’évolution de l’infection virale, en mesurant l’accumulation de particules virales durant l’infection 2) « l’infectabilité » et la mortalité des cellules souches dans les organes cibles du virus (intestin, cerveau, peau). 3) la capacité des cellules souches à régénérer les tissus dans les organes infectés Ce projet représente la première caractérisation du rôle de notre protéine d’intérêt in vivo. Comme cette protéine est aussi présente dans les cellules souches humaines, ce projet pourrait ouvrir la voie à l’exploration de son importance chez les patients.
Bénéfices attendus
Malgré le rôle pivot des cellules souches dans le maintien de l’architecture tissulaire, les mécanismes antiviraux qui les protègent sont peu étudiés. Nous avons récemment découvert une protéine qui protège les cellules souches en culture contre les virus à ARN. Ce projet propose d’analyser le rôle de cette protéine in vivo, en utilisant deux virus, dont Zika virus, d’importance médicale. En effet, le virus Zika a été responsable d’une épidémie massive dans les Amériques il y a quelques années. A long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle in vivo dans la protection de cellules souches, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients.
Procédures
Injection de virus et anticorps par voie intrapéritonéale sur animaux vigiles : 1 injection/animal Injection d'anticorps par voie sous-cutanée sur animaux anesthésiés : 1 injection/animal. Anesthésie < à 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’infection au virus Sindbis ou Zika peut entraîner, en fonction de la dose : - Une cachexie (perte de poids >20%du poids initial) - Poils hérissés et prostration - Une altération de l’état général, incluant un défaut de coloration chez les souriceaux. - Rejet des souriceaux par la mère Ces effets peuvent apparaître et durer tout au long de l’infection virale, i.e. jusqu’à sa résolution chez l’adulte out jusqu’à l’atteinte d’un point limite chez le souriceau.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à des temps déterminés pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle antiviral de notre protéine d’intérêt chez la souris, organisme vivant intégré et autonome. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 494 souris Le nombre de souris par groupe a été défini a minima. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée trois fois avec le même nombre d’animaux par groupe. Une expérience pilote permettra de sélectionner le meilleur modèle en termes de quantité de virus injecté et seul ce modèle sera utilisé dans les procédures suivantes.
Raffinement
Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les souriceaux seront manipulés a minima afin de perturber le moins possible la portée et la relation avec la mère. Les points limites conduisant à l’euthanasie des souris seront précoces et prédictifs pour l’apparition d’une douleur. Les souris seront alors euthanasiées. Les points limites spécifiques sont : - Cachexie (perte de poids >20% du poids initial) - Poils hérissés et prostration pour les adultes L’altération de l’état général de la souris sera évaluée selon une grille de score adaptée pour les souriceaux ).
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antivirale : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez la souris. Chez les souris adultes, l’infection aux virus Sindbis et Zika est empêchée par l’activation de la réponse interféron, ce qui se traduit par une très faible réplication virale. Pour obtenir une infection robuste, des souris âgées d'une semaine sont infectées (voir les références https://doi.org/10.1128/JVI.74.7.3366-3378.2000 et https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/JVI.73.12.10387-10398.1999 pour Sindbis et https://doi.org/10.1016/j.chom.2016.03.010 pour Zika). Des souris adultes chez lesquelles la voie interféron sera bloquée seront aussi utilisées.
Etude de la fonction lièe au microtubule de WDR47 dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.
Procédures
Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.
Réduction
La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47
Etude de l’efficacité de nouvelles thérapies combinatoires utilisant des anticorps bloquants anti-PD-1 chez la souris PD-1 humanisée.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souris génétiquement humanisées pour le récepteur PD-1 reçoivent une inoculation de tumeur par voie sous-cutanée, intraveineuse ou chirurgicale, puis des injections répétées de traitement, pour évaluer de nouvelles combinaisons d'anticorps anti-PD-1 contre le cancer. Le porteur indique que les modèles orthotopiques, notamment pulmonaire, sont sévères et peuvent provoquer douleur, perte de poids et mobilité réduite. Il affirme que ces modèles permettent de valider l'effet des traitements à l'échelle de l'organisme avant un essai clinique.
Objectifs
Dans le but d’échapper au système immunitaire, les cellules tumorales créent un microenvironnement suppresseur pour inhiber la réponse des lymphocytes T via la voie PD-1/PD-L1. La molécule PD-L1 exprimée à la surface des cellules tumorales interagit avec son récepteur PD-1 exprimé à la surface des lymphocytes T et bloque leur capacité anti-tumorale. Pour réactiver la réponse immunitaire antitumorale, des anticorps thérapeutiques bloquants PD-1 (Pembrolizumab, Nivolumab) ou PD-L1 (Avelumab) ont été développés. Ces anticorps ont démontré une efficacité clinique impressionnante chez les patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon et sont aujourd’hui utilisés comme première ligne de traitement. Malgré le succès de cette thérapie, seulement des sous-groupes de patients sont répondeurs. Il est donc nécessaire de tester de nouvelles cibles thérapeutiques et de les combiner avec des anti-PD-1/PD-L1 pour induire une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Au laboratoire, nous avons identifié des cibles capables d’améliorer l’effet des anticorps anti-PD1 sur la réponse immunitaire anti-tumorale. Pour simultanément cibler le récepteur PD-1 et les cibles que nous avons identifiées, nous avons généré de nouveaux formats d’anticorps dit « bispécifiques » en fusionnant un anticorps anti-PD-1 à ces cibles. L’objectif du projet est d’étudier l’effet thérapeutique de ces anticorps bispécifiques dans des modèles tumoraux murins : leucémie, cancer du pancréas, cancer du poumon et mélanome.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet en complément du projet pourrait permettre de développer et valider des traitements innovants efficaces contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toute ces évaluations pré-cliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, intraveineuse ou via intervention chirurgicale sous anesthésie (un modèle par animal). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéale pour les traitements (environ 3 fois par semaine) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape #3 du projet, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L’induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques : -cancer du poumon : altération de la respiration (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si l'état de la tumeur se détériorent (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 1500mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanées sont considérés comme des procédures modérés. La durée de ces effets est dépendant du type d’expérimentation : - évaluation de l’effet thérapeutique du traitement (étape #2) : étude de la survie de la souris. Les effets indésirables seront présents jusqu’à la mise à mort de l’animal. Celle-ci intervient lors de l’accumulation de ses effets ou l’apparition d’un effet considéré grave (points-limites). - évaluation mécanistique des traitements (étape #3) : mis à mort de l’animal avant l’apparition de points limites (à la fin de la séquence thérapeutique) afin d’étudier l’impact des traitements sur le système immunitaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Les traitements évalués lors de ce projet ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro chez l’homme sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de lignées cellulaires, PBMC humains frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris humanisée pour le récepteur PD-1 nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Ce projet nécessitera 1380 animaux au maximum. Ceci est une estimation haute qui sera surement réduite en fonction des résultats. Ce nombre d’animaux comprend la mise en place de six modèles au sein de notre laboratoire, ce qui est essentiel pour la suite des études et permet de générer à long terme un savoir-faire pour tous nos projets présents et futurs en cancérologie. Pas de tests statistiques seront nécessaires durant l’étape #0 et #1 du projet, le nombre d’animaux est donc réduit à 4 par condition. Idéalement, l’entrainement à la chirurgie du modèle du cancer du Pancréas (étape #0) sera effectué sur des souris recyclées de l’animalerie issue d’élevage (animaux surnuméraires ou issu du tri génétique ; pas de réutilisation d’animaux) afin de maitriser le geste. Autrement, les entrainements seront effectués sur des souris C57BL6 issues d’un élevage commercial. Au total, 156 animaux maximum sont estimés pour ces étapes de mise au point. Pour l’étape #2, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 960 animaux en considérant que six modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. En réalité, nous pensons avoir besoin que de 1 à 4 modèles. Pour l’étape #3, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 264 animaux, en considérant que maximum quatre modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. Cette étude sera menée si et seulement si un effet thérapeutique a été observé à l’étape #2. Les étapes #2 et #3, un nombre de 5 souris sera utilisé pour le groupe contrôle et 7 souris seront utilisées pour les traitements. Ces étapes nécessitent des résultats statistiques pour démontrer l’efficacité du produit thérapeutique. Ce nombre d’animaux a été estimé par des tests statistiques d’échantillonnage. Dû à la variabilité de la prise tumorale et de l’effet de thérapeutique interindividuelle, ce nombre est nécessaire pour avoir une bonne reproductibilité et obtenir des résultats statistiquement fiables. L’étude statistique choisie est le test de Mann-Whitney (ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est de 2) qui repose sur l’analyse de données non paramétriques déterminée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 3 jours minimum pour les souris issues de l’élevage sur site et de 5 jours minimum pour les souris commerciales sera respectée avant inclusion dans des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et un enrichissement frisottis pour s’enfouir et se cacher. Un enrichissement supplémentaire sera ajouté chez les mâles (dôme ou tunnel) afin de prévenir de potentielles agressions. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements (frisottis + dôme/tunnel). Nous avons aussi mis en place une procédure non invasive pour visualiser par imagerie de bioluminescence la croissance de la tumeur. Cette technique nous permet d’exploiter au mieux les résultats et ce, sans souffrance pour l’animal. Le suivi des animaux sera quotidien une fois que le protocole est considéré comme sévère et la gestion de la douleur maîtrisée le plus adéquatement possible afin d’apporter les soins nécessaires le plus rapidement aux animaux. Comme décrit dans les paragraphes des procédures expérimentales ci-dessous, des analgésiques seront utilisés avant et après chirurgie. Pour limiter l’inconfort de l’anesthésie, les animaux seront anesthésiés dans une boîte à induction placée sur tapis chauffant. Enfin des points limites ont été mis en place afin de réagir rapidement en cas d’inefficacité des traitements ou de souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la lignée de souris PD-1 humain Knock In (hPD-1KI) dont le fond génétique C57BL/6 est une référence pour la recherche fondamentale/préclinique et pour lequel plusieurs modèles tumoraux ont été établi au sein du laboratoire (APAFIS15700) ou par la communauté scientifique. Ces souris hPD1KI exprimant la version humaine du gène PD-1 se développent normalement et présentent les mêmes fonctions immunitaires que les souris sauvages C57BL/6. Ce modèle est donc très relevant d’un point de vue clinique car nous pouvons tester directement les effets thérapeutiques et biologiques de nos traitements anti-PD-1 bispécifique humain dans des modèles de tumeurs sans passer par un anticorps substitutif ciblant la molécule PD-1 de souris. Des souris C57BL/6 pourront être utilisées pour mettre en place certains modèles tumoraux et maitriser la chirurgie associée. Des adultes de 6 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.
Etude de la toxicité éventuelle et de la pharmacocinétique de composés à visée antipaludique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage forcé unique et jusqu'à cinq prélèvements sanguins, puis sont mises à mort pour des analyses histologiques, afin de tester la toxicité et la pharmacocinétique de composés antipaludiques. Le porteur indique que le gavage cause un stress transitoire et un risque de fausse route, l'effet réel des molécules restant imprévisible. Il affirme qu'un test sur "organisme entier" est "nécessaire", les cultures cellulaires ne détectant pas la toxicité des organes.
Objectifs
Le paludisme, dû au parasite Plasmodium falciparum, est la première cause de mortalité parasitaire dans le monde. Les traitements actuels à base d'artémisinine font face à des échecs suite au développement de résistances, de sorte que de nouveaux traitements basés sur de nouvelles cibles du parasite sont nécessaires afin de contenir le risque de dispersion des résistances. Ces dernières années, la famille des quinazolines a été identifiée parmi les nouvelles entités chimiques démontrant des propriétés antiplasmodiales prometteuses. Le projet global financé par l'ANR concerne la synthèse et l'évaluation anti-paludique de composés originaux de cette famille. Le projet d'expérimentation animale décrit ici concerne une étude de la toxicité aiguë éventuelle des composés identifiés comme ayant les meilleures activités lors de tests in vitro. Cela permettra de déterminera si les composés testés peuvent poursuivre un développement pré-clinique, puis clinique plus poussé.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point de nouveaux antipaludiques. Il permettra de déterminer si les produits étudiés (dont l'activité antipaludique in vitro est démontrée) peuvent être administrés par voie orale sans toxicité particulière, et avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles avec le développement d'un principe actif. En cas de réponse positive, cela permettrait ultérieurement de pouruivre le développement de ces molécules, à commencer par un test d'efficacité chez la souris infectée par le parasite Plasmodium. Le but final étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l'efficacité des médiaments existant actuellement décroit rapidement.
Procédures
Le animaux seront soumis à un acte de gavage forcé, une fois. Ils seront également soumis à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles u sous anesthésie, une fois pour 50% des animaux, trois fois pour 17% des animaux, et 5 fois pour les 33% restants. Tous les actes ont une durée inférieure à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Le but est précisément de déterminer l'effet de composés potentiellement antipaludique sur l'organisme. Ces molécules étant nouvelles, et bien que les tests de toxicité in vitro aient été effectués, nous ne pouvons prévoir le réel effet à l'echelle de l'organisme entier. Néanmoins, l'administration par gavage en elle-même cause un stress transitoire à l'animal, et un risque de "fausse route" ne peut être totalment exclu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort : en effet, des analyses histologiques sur organe prélevés doivent être réalisées ultérieurement.
Remplacement
Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : efficacité antipaludique par tests biochimiques, tests de toxicité sur culture cellulaire (lignée et/ou primaire), premier test de métabolisation sur microsomes de souris. Cela a permis de réduire l'étude à seulement 5 composés parmi les nombreux synthétisés. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant détecter une éventuelle toxicité organique.
Réduction
Nous avons décidé de n'étudier qu'une seule dose de produit, la dose maximale tolérée, sur des groupes de 12 souris. Nos expériences précédentes ont montré que cela permet d'obtenir une réponse statistiquement exploitable. D'autre part, la détrermination de la dose de travail se fera par administration séquentielle des doses envisagées, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Le projet nécessite des prises de sang régulières. Pour limiter l'inconfort, nous utiliserons des souris swiss de 8 semaines, possédant un volume de sang de l'ordre de 2ml. Une prise de sang sera effectuée une semaine avant le début. En ce qui concerne la phamacocinétique sur 24h, nous effectuerons la moitié des prises de sang sur quatre souris, et l'autre moitié sur les quatre autres souris. Cela permettra de prélever un volume sanguin raisonnable en termes de nuisance pour chaque animal. D'autre part, afin d'éviter l'emploi de solvant organique souvent toxique, nous administrerons les composés en solution dans de l'huile alimentaire. Par ailleurs, les animaux seront très observés (toutes les deux heures pendant les 12 premières heures), et seront mis à mort s'ils montrent des signes de souffrance. Une réutilisation n'est pas prévue car l'effet sur l'organisme de ces composés n'est pas connu. Les animaux seront hébergés dans les conditions réglementaires avec eau et nourriture à volonté, et enrichissement par des abris en matière plastique et du coton.
Choix des espèces
Nous avons choisi les souris, ce qui correpond aux recommandations de l'OCDE pour les tests de toxicité de produits chimiques administrés par voie orale (fiche 423). L'espèce préférée est le rat, mais les autres espèces de rongeurs peuvent être utilisées. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 semaines, conformément aux recommandations de l'OCDE pour ce type d'étude.
Evaluation in vivo d’un nouvel agent immunothérapeutique dans les cancers de la vessie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent chaque semaine, jusqu'à six semaines, une injection intra-uréthrale sous anesthésie et des prélèvements d'urine, pour tester un agent immunothérapeutique contre le cancer de la vessie. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une inflammation urinaire et un affaiblissement de l'état général. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", aucun autre modèle n'évaluant les effets à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Le cancer de la vessie se classe au 10e rang des cancers les plus courants selon le Centre international de recherche sur le cancer. Les malades sont traités via une approche multidisciplinaire (chirurgie avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie). En particulier, l’immunothérapie par instillation intravésicale du Bacillus Calmette-Guerin (BCG), initiallement utilisée pour la vaccination contre la tuberculose, est fréquente. Elle a des effets prouvés sur la réduction des récurrences et de progression de la tumeur. Ces effets du BCG résultent d'une interaction entre les effets directs sur les cellules tumorales du BCG et de la réponse immunitaire de l'hôte conduisant à la production de cytokines et à la destruction des cellules tumorales. Néanmoins, ce traitement a encore des effets cliniques insatisfaisants, justifiant le développement de nouvelles thérapies. Ainsi, ce projet de recherche vise à établir une preuve de concept pour une stratégie immunothérapeutique anticancéreuse à partir de vésicules de membranes externes (ou VME en abrégé) naturellement produites par des souches d’E. coli. Des expériences ont été menées dans des lignées cellulaires modèles humaines de cancer de la vessie et dans une lignée cellulaire contrôle de vessie peu transformée afin de mesurer l'impact du traitement par les VME sur la prolifération et la survie cellulaire. Il est maintenant indispensable de vérifier l'innocuité et l'efficacité des VME par des expériences in vivo dans un modèle murin car les expériences sur cultures cellulaires ne prennent pas en compte toute la complexité d’un organisme intégré. Nous évaluerons l’innocuité du traitement en instillant des VME dans la vessie de souris saines (même protocole que pour le BCG, cette technique est maitrisée par notre équipe). Si ce traitement s’avérait toxique (ce qui est peu probable au vu des résultats obtenus avec le BCG et étant donné que le traitement est purement local), nous pourrions alors utiliser une souche bactérienne beaucoup moins toxique et disponible au laboratoire. Cette dernière souche est à réserver en dernier recours, car étant moins toxique, elle est aussi bien moins immunostimulante et est donc moins susceptible d'être efficace contre les tumeurs. Puis, en utilisant deux modèles de cancer de la vessie (induits soit par l'ingestion d'un agent carcinogène soit par une infection par un agent uropathogène), nous évaluerons l'impact d'un traitement par les VME sur les cancers de la vessie.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre d'établir une preuve de concept concernant l’efficacité d’un traitement par des VME sur les cancers de la vessie en évaluant d'une part leur inocuité sur l'animal sain et d'autre part leur(s) effet(s) sur le développement de lésions cancéreuses peu évoluées et sur la régression de tumeurs établies.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés une fois par semaine par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane), pendant au maximum 6 semaines, afin de réaliser l'injection de VME ou de produits contrôles (liquide physiologique, etc...) par voie intra-uréthrale via un catheter adapté. Chaque injection durera 1 à 2 minutes. Des prélèvements d’urine par miction spontanée (quelques gouttes recueillies dans un tube eppendorf) seront réalisés une fois par semaine pendant au maximum 6 semaines.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues génèrent chez la souris un développement tumoral pouvant entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets locaux (inflammation au niveau de l'appareil urinaire par exemple) et des effets systémiques (affaiblissement de l'état général par exemple).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles, notamment au niveau de la vessie (réalisation de scores macro- et microscopiques)
Remplacement
Nous avons déjà réalisé de nombreuses validations in vitro et in cellulo de manière à garantir la qualité des VME utilisées à des fins de stratégie anti-cancéreuses. Nous allons continuer à étudier leur effet sur des lignées cellulaires modèles. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer les répercussions d’un tel traitement à l’échelle d’un organisme (évaluation de l’éventuelle toxicité systémique – non attendue-, et de l’efficacité sur la régression tumorale). Une veille scientifique sera mise en oeuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. Ce projet nécessite l’utilisation de 610 souris âgées de 6 semaines car il est indispensable de réiterer les expériences 3 fois de manière indépendante pour garantir la robustesse des résultats. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) et une méthode non invasive d'échographie sera appliquée pour suivre la progression tumorale au cours du temps et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les cages possèdent des cabanes dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées de manière à apaiser les animaux. Le change de la litière sera effectué toutes les semaines. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du cancer de la vessie. En particulier, les lésions néoplasiques liées aux cancers de la vessis développées dans cette espèce animale sont très similaires à celles développées chez l'homme, ce qui rend ce modèle particulièrement intéressant pour l'étude de cette maladie. Nous utilierons des souris de 7 à 8 semaines. Dans la littérature, les souris soumises au carcinogène (BNN) sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.