Souris
Impact de l’épilepsie sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 083 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Des souris transgéniques Alzheimer reçoivent une injection de kaïnate pour déclencher des crises d'épilepsie, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'électrodes ou d'une pompe sous-cutanée, les crises pouvant provoquer des morsures de la langue et, dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque. Le porteur indique que l'euthanasie est "incontournable" pour étudier le cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif validé pour étudier ensemble épilepsie, neurodégénérescence et déclin cognitif.
Objectifs
L'association entre crise épileptique et mort neuronale (ou neurodégénérescence) a été observé à maintes reprises en clinique. Les sujets épileptiques présentent des troubles de la mémoire, de l’attention, mais aussi des déficits dans les fonctions d’exécution (comme la gestion du temps et de l'espace, l'élaboration de stratégies...). Dans la maladie d'Alzheimer, l’état de mal ou des crises épileptiques mal contrôlées pourraient servir de déclencheur. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles de crises épileptiques avec des modèles de la maladie d’Alzheimer. De plus, aucun mécanisme ou cible pharmacologique n’a été proposé pour limiter la progression de la maladie d'Alzheimer dans le contexte de crises épileptiques. Ce projet permettra de tester les hypothèses suivantes: 1-les crises épileptiques suffisent à déclencher de la neurodégénérescence dans le cerveau. 2-ces effets sont plus sévères avec l’âge (cette exploration est importante, à la vue de l’incidence importante et croissante des épilepsies chez les personnes âgées). 3-les crises épileptiques sont capables d’accélérer la mort neuronal dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Un traitement pharmacologique spécifique et adapté pourrait freiner le développement de la maladie d'Alzheimer associé à l’épilepsie.
Bénéfices attendus
En terme de santé publique, aucune étude n’a encore établi un lien de cause à effet entre une crise épileptique aigue et l’apparition de signes associés à des processus neurodégénératifs chez un même patient. Par contre, il est bien connu, qu’un état de mal épileptique peut entrainer des séquelles neurologiques à long terme. L’absence de connaissances fondamentales sur la prédiction de la trajectoire neurologique et du suivi clinique est un réel problème après l’apparition d’une première crise épileptique sans cause définie. Nous connaissons, néanmoins, l’existence d’un lien entre crises et neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer car l’état épileptique a été démontré comme un facteur de risque chez l’homme. Avec cette étude, nous posons donc l’hypothèse d’un mécanisme reliant l’hyperactivité des neurones aux processus neurodégénératifs associés à la maladie d’Alzheimer. Ce projet nous permettra d’en appréhender les mécanismes fonctionnels et biochimiques sur le long terme et de tester le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules ciblant les principales hormones endogènes anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions selon leur groupe, soit des procédures chirurgicales (< à 35 min), soit des injections intrapéritonéales, soit des analyses comportementales et enfin la mise à mort pour analyses des tissus cérébraux: implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (120 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (288 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate (288 animaux) - implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (160 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (128 animaux). Les animaux seront suivi au maximum pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'induction de l'épilepsie sur la souris engendre des décharges neuronales fortes et incontrolables. Ces crises « épileptiques », comme chez l’homme, peuvent entrainer l'animal à se blesser (morsure de la langue). Dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque peut également survenir. Si les crises devaient perdurer au dela des 2 heures suivant l'induction de l'épilepsie, une injection intrapéritonéale d’un calmant (le diazépam) permettra de diminuer l’apparition des crises. Cette injection induit une somnolence prolongée de l’animal, entrainant une possible déshydratation, qui est anticipée de façon systématique par l’injection intraperitonéale d’une solution saline stérile. Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. La pose d'un implant crânien pour le suivi électroencéphalographique, ou de la pompe osmotique, peut entrainer un inconfort temporaire, et être associé à un grattage plus intense au niveau de la zone de cicatrisation.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier les crises épileptiques, la neurodégénérescence et le déclin cognitif (e.g., maladie d’Alzheimer) dans leur globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaire est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe . Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress le jour de l'expérimentation (en particulier au moment des tests comportementaux), mais également afin de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront leur comportement général, ainsi que leur apparence. Toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmises à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > à 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…). Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. Tous les tests seront réalisés dans une pièce dédiée et les animaux y seront placés au minimum 30 minutes avant les tests. La chirurgie sera réalisée sous anethésie générale et afin de minimiser la douleur liée à la chirurgie, un analgésique sera injecté en amont.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer et de l’épilepsie. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Une première caractérisation sera effectuée à l’âge de 3, 6 et 9 mois sur le modèle de souris Alzheimer. La caractérisation comportementale a déjà été effectuée sur ce modèle dans notre laboratoire et des déficits de mémoire apparaissent dès l’âge de 3 mois. Nous nous baserons donc sur ces résultats obtenus et sur les résultats obtenus aux âges de 3, 6 et 9 mois, pour choisir l’âge le plus pertinent afin de tester des traitements préventifs et/ou curatifs.
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Immunisations de souris pour étudier le role des cytokines IL-2 et IL-15 dans la réponse immunitaire humorale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des souris génétiquement modifiées reçoivent une ou deux injections péritonéales d'un agent immunisant, puis sont anesthésiées pour un prélèvement de sang intracardiaque terminal avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit un stress bref lié à l'injection et affirme que le modèle de culture cellulaire utilisé auparavant n'imite que partiellement ce qui se déroule dans l'organisme vivant. Il présente cette recherche fondamentale comme une étape "indispensable" à la compréhension des immunodéficiences et des cancers.
Objectifs
Notre laboratoire s’intéresse aux lymphomes, des maladies qui se développent à partir des lymphocytes B : cellules du sang qui ont perdu leur capacité à devenir des cellules appelées plasmocytes et dont le rôle est de protéger l’organisme contre les infections par des agents extérieurs. Leur incidence est en constante augmentation et ces maladies restent incurables en dépit de nouvelles thérapeutiques. Notre projet de recherche vise à identifier les étapes critiques et les molécules clefs qui régissent le destin (la différenciation) du lymphocyte B jusqu’au plasmocyte et qui pourraient contribuer au développement ou au maintien de ces lymphomes. Les travaux du laboratoire ont démontré l’importance de molécules, l’interleukine 2 (IL-2) et l’IL-15, dans ce processus par des études menées hors de l’organisme (in vitro). Cependant cela ne permet pas de déterminer quand et comment ces molécules agissent au sein des organes lymphoïdes secondaire où se déroule la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant leur rôle dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Notre objectif est d’étudier le rôle de l'IL-2 et l'IL-15 chez des souris modifiées dans lesquelles les lymphocytes B sont insensibles à ces molécules (souris déficientes pour le gène Il2rb). Pour cela nous immuniserons au maximum 1020 souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Cela nous permettra d’évaluer le rôle de l’IL-2 et IL-15 dans la différenciation des lymphocytes B.
Bénéfices attendus
Ce projet fera avancer les connaissances fondamentales sur la différenciation plasmocytaire normale, étape indispensable à la compréhension des mécanismes à l'origine d'immunodéficiences et de cancers.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections peritonéales de l'agent immunisant, distantes de 28 jours. Le geste est réalisé par une personne experimentée, ce geste rapide et précis ne durera pas plus de 2 minutes. En fin d'étude, les animaux recevront un traitement analgésique et seront anesthesiés pour prélèvement de sang intra-cardiaque (5 minutes maximum) puis euthanasiés selon une méthode reglementaire.
Impact sur les animaux
Nous immuniserons les souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Ces procédures n’entraineront pas de stress, en dehors du stress bref et modéré lie a l'injection péritonéale, sans forte douleur pour les souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prelever les organes et réaliser les analyses sur les différents tissus.
Remplacement
Lors de nos précédents travaux, nous avons utilisé un modèle de culture de cellules. Ce modèle nous a permis de comprendre plus finement la biologie du lymphocyte B au cours de son activation, puis de sa différenciation pour produire des anticorps. Malgré tout, ce modèle n’imite que partiellement ce qui se déroule au sein de l'organisme vivant lors d’une infection et il devient nécessaire pour nous d’étudier ce phénomène dans l'animal. La souris est un modèle de choix pour l'étude des réponses immunitaires. C'est pourquoi nous allons utiliser des animaux transgéniques nous permettant d’invalider de manière contrôlé dans le temps l’expression du récepteur à l’interleukine-2 et 15 et de suivre les réponses immunes suite aux immunisations.
Réduction
Dans l’intérêt de réduire le nombre d’animaux utilisé, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible, en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Enfin les protocoles d'immunisations seront réalisés successivement afin de définir les meilleures conditions expérimentales pour notre étude et uniquement si les résultats obtenus justifient de réaliser un autre type d'immunisation. Pour chaque étude, des groupes de 8 animaux par genotype (sauvage ou muté) nous permettra d'obtenir des statistiques fiables et publiables. Les statistiques seront réalisés à l'aide de tests non paramétriques, le test de Mann et Whitney sera appliqué pour deux échantillons et celui de Kruskal et Wallis pour un nombre quelconque d'échantillons.
Raffinement
Toutes les lignées de souris déjà existantes n'induisent pas de phenotype douloureux. La littérature décrit les protocoles d’immunisation spécifiques aux agents immunogènes qui seront appliqués dans cette étude. Les animaux seront surveillés après immunisation pour détecter l'apparition d'une éventuelle douleur et l'inconfort provoqué sera soulagé. De plus les animaux sont élevés dans des conditions adaptées: locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage.
Choix des espèces
Le modèle animal murin est très utilisé en immunologie. Des protocoles d’immunisation standardisés et des protocoles d’analyses éprouvés sont disponibles. La possibilité d'invalider des gènes spécifiquement dans un type cellulaire et de manière temporelle est importante pour évaluer finement les évènements et les mécanismes impliqués. Les souris avec un potentiel conditionnel pour le gène IL2rb ont été générées. Elles ont été croisées en retour avec la lignée C57BL/6N sur 8 générations. Enfin le croisement avec la lignée CD19-Cre a permis d’inactiver la signalisation IL-2 et IL-15 spécifiquement dans les lymphocytes B. L’acquisition des cellules effectrices étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des études sera effectué sur des animaux adultes (8-12 semaines).
Evaluation de l’activité anticancéreuse de nanomédicaments à base de vecteurs synthétiques biodégradables sur un modèle de greffe sous-cutanée de cellules tumorales
- Recherche appliquée
- Cancers
221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, puis des séances d'imagerie et des administrations hebdomadaires de traitement pendant trois semaines, la tumeur pouvant métastaser et provoquer des douleurs. Les animaux sont tués une fois un point limite atteint, dont un volume tumoral dépassant 1500 mm3. Le porteur affirme que la distribution et la toxicité d'un médicament doivent être analysées dans un "organisme entier" et que les systèmes 3D existants, dépourvus de vaisseaux, ne peuvent pas remplacer l'animal.
Objectifs
Le projet global de l’équipe est de fabriquer de nouvelles formulations galéniques injectables par voie sous cutanée (SC), de type nanoppolymères contenant des molécules à visée thérapeutique dans le domaine du cancer. La plupart des chimiothérapies anticancéreuses actuelles présentent une toxicité systémique importante limitant l’augmentation des doses administrées et donc les résultats thérapeutiques. Les nanomédicaments, qui incorporent des molécules médicamenteuses dans des véhicules de taille nanométrique (milliardième de mètre), représentent un espoir important pour le traitement de cette pathologie de par leur capacité à cibler des tissus ou des cellules malades. Afin de permettre aux patients en oncologie de s'injecter en autonomie par voie sous cutanée leur chimiothérapie (i.e., Paclitaxel, PTX), 6 nanopolymeres ont été développés et ont fait preuve de résultats prometteurs in vitro (cytotoxicité, injectabilité, diffusion sous cutanée, innocuité, relargage du PTX). Des études d’innocuité permettant de vérifier que ces nanopolymères n’ont pas d’effet toxiques au niveau du tissu sous-cutané, ainsi que des études de pharmacocinétiques permettant d’évaluer la biodisponibilité du principe actif dans le sang après injection SC ont également déjà démontré des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude est alors de tester l’efficacité anti-tumorale de ces nouveaux polymères couplés au paclitaxel en comparaison au paclitaxel standard intra-veineux (IV), ainsi que leur biodégradabilité et leur toxicité éventuelle. La définition du schéma d'administration optimal sera guidé par un modèle mathématique de type PK/PD (pharmacocinétique/pharmacodynamique). Des études de biodistribution des nanopolymères pourront être menées en parallèle afin de notamment pouvoir expliquer le différentiel d'efficacité observé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendues sont la définition du nanopolymère et de son schéma d'administration optimaux, permettant l'administration sous cutanée du PTX chez le patient. Bien que ce projet soit effectué sur le cancer du sein, le PTX est indiqué dans bien d'autres types de cancer (bronchopulmonaires non à petites cellules, ovaire, sarcomes de Kaposi associés au sida) et donc ce nanopolymère pourra être bénéfique chez un grand nombre de patients.
Procédures
Greffe de cellules cancereuses murine sur animal anesthésié (1 greffe par animal), Imagerie sur animal anesthesié (1 fois par semaine par animal) Administration des traitements (1 fois par semaine pendant 3 semaines par animal)
Impact sur les animaux
Les animaux seront greffées de cancer du sein pouvant métastaser et donc engendred de la douleur. Les injections des tratitement se font par voie sous cutanée et et voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure quotidienne du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.
Devenir
Pour les deux procédures, les animaux seront mis à mort une fois le point limite atteint.
Remplacement
Le développement de nouveau médicament nécessite la mise en place d’expérience chez l’animal car la distribution du médicament et sa toxicité éventuelle doivent être analysés dans un organisme entier pour tenir compte des mécanismes de défense et de métabolisation qui seront mis en place par l’organisme et qui ne peuvent pas être reproduit in vitro du fait de l’implication de nombreux systèmes biologiques (système immunitaire notamment). Il existe des systèmes 3D mais ils sont construits avec seulement deux/trois types de cellules et ils manquent de vaisseaux. Ils ne permettent pas de mimer l’extravasation des nanomédicaments et leur pénétration dans la masse tumorale. Seule une étude chez l’animal permettra de reproduire l’interaction des nanomédicaments avec les composants du sang, leur passage de la circulation vers les organes et la tumeur et ainsi d’évaluer leur efficacité thérapeutique.
Réduction
Le nombre de souris par groupe expérimental a été calculé avec un test de puissance pour s’affranchir des variations individuelles et pour garantir la validité statistique de l’étude (risque fixé à 5% et puissance à 80%). La variable de jugement principal est la taille de la tumeur avec une moyenne dans le groupe contrôle de 1.3 cm3 et dans les groupes traités de 0,9 cm3 avec un écart-type de 0,3. Le nombre a été évalué à 8 souris. Compte tenu du taux de prise de greffe qui est d’environ 80%, 20% d’animaux supplémentaires seront ajoutés à l’étude. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test Anova avec un post test «Bonferroni». Nous prenons comme controle uniquement les nanopolymères seuls à DMT et non à DMT et 15mg/kg. Notre projet comprend une étape de modélisation mathématique permettant de réduire le nombre de tests à effectuer pour définir les modalités d'administrations optimales. Les études de biodistribution sont faites par imagerie et sont donc longitudinales et non invasives.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - souris hébergées en groupe - enrichissement des cages (dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques/stériles (Cell Nest) (Fournisseur Safe), - prévention de la douleur(40 mg/kg/jour d'ibuprofène , réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, biodistribution) seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne (volume tumoral au-delà de 1500mm3, difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, ou toute autre manifestation de comportement anormal)
Choix des espèces
Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisé ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang. La plupart des études publiées dans la littérature concernant l’évaluation de nouveaux médicaments anticancéreux sont effectuées sur la souris. Nous utiliserons des souris nude athymiques pour la greffe de cellules tumorales humaines (SWISS nude nu/nu). Les souris nude étant dépourvues de réponse immunitaire T, elles seront dans l’incapacité de rejeter les cellules cancéreuses humaines qui seront implantées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 4-6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanopolymères. De plus le cancer touche généralement une population adulte.
Evaluation préclinique sur modèle murin parkinsonien de la fonctionnalité des neurones dopaminergiques, et de l’impact de la photobiomodulation
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'une neurotoxine, le MPTP, destinée à provoquer des symptômes parkinsoniens modérés comme une perte de mobilité et une posture prostrée, puis une illumination proche infrarouge, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur revendique la recherche d'un traitement curatif comme une nécessité tout en renvoyant les résultats de l'essai clinique en cours à quatre ou cinq ans. Il justifie le recours à la souris par le fait que le modèle MPTP est un modèle de référence déjà utilisé dans son laboratoire.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui touche de plus en plus de personnes. Cette maladie se traduit par des tremblements, des difficultés à se mouvoir, des troubles cognitifs et moteurs, des sautes d’humeur ainsi que des troubles de la personnalité. Elle prend naissance à cause d’un dysfonctionnement progressif des ganglions de la base situés dans le cerveau. Les traitements les plus utilisés actuellement pour limiter les symptômes sont une administration de L-Dopa, qui est un substitut de dopamine (neurotransmetteur impliqué dans la maladie), ou encore un implant cérébral (Stimulation Cérébrale Profonde). Ces 2 traitements sont pour le moment symptomatiques et ont une durée d’efficacité limitée dans le temps. Il n’y a aucun traitement curatif permettant à l’heure actuelle de guérir cette maladie. Lors des 10 dernières années, des équipes ont étudié les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est une technique d’illumination de tissus ou d’organes par un rayon proche infra-rouge, sur le cerveau dans un contexte préclinique mettant en place des modèles animaux parkinsoniens. Les résultats sont très encourageants avec des réductions de symptômes observés sur les différentes études menées. Une étude clinique est en cours chez des patients parkinsoniens pour évaluer le potentiel thérapeutique de la PBM pour ralentir l’avancée de la maladie. Ce projet consiste à mieux comprendre les effets de la PBM, sur des souris parkinsoniennes (induits par administration d’une neurotoxine, le MPTP). L’objectif de l’étude est d’évaluer si la PBM permet de préserver la fonctionnalité des neurones impliqués dans le processus de la maladie de Parkinson. En effet, nous ne savons toujours pas si la PBM garde la fonctionnalité de ces neurones intacte. Des neurones peuvent en effet rester en vie mais ne plus fonctionner; les symptômes restent donc présents. A l’inverse, si les neurones préservés conservent ou retrouvent même partiellement une fonctionnalité, traduite par une production de dopamine les symptômes de la maladie diminuent. Pour évaluer les effets de la PBM sur la dégénérescence fonctionnelle des neurones, il est nécessaire d’étudier si les cellules préservées par la PBM sont encore fonctionnelles ou si elles perdent tout de même leur activité. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en œuvre, et donc d’adapter et d’interpréter au mieux les résultats cliniques.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé public. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques possédant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace de cette pathologie est donc une nécessité. Des études préalables ont déjà permis d’identifier la photobiomodulation (PBM) comme une alternative thérapeutique permettant de préserver la survie des neurones dopaminergiques dont la dégénérescence est responsable des symptômes de la maladie. Un essai clinique est en cours et les résultats ne seront connus que d’ici 4 à 5 ans. Néanmoins, son interprétation sur l’évaluation de la maladie et les symptômes associés nécessitera d’avoir des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM, et notamment de savoir si la lumière permet, en plus de la survie des neurones, de préserver leur fonctionnalité. En effet, des neurones vivants mais non fonctionnels ne produisent plus de dopamine ; si la PBM permet de restaurer (même partiellement) la fonctionnalité des neurones, on peut espérer réduire certains symptômes (recul de la pathologie). Le modèle MPTP choisi induit des symptômes modérés, permettant aux animaux de rester autonomes (mais ralentis) le temps du protocole. Ce modèle est représentatif de patients dans les premières années après le diagnostic quand il reste encore 30 à 50% des neurones dopaminergiques à préserver et/ou rendre à nouveau fonctionnels. Si les résultats démontrent que la PBM restaure une partie de la fonctionnalité des neurones, cela ouvrira la porte au traitement de patients plus avancés dans la maladie, auxquels on peut espérer redonner de la mobilité en réduisant les symptômes, et en rendant à nouveau fonctionnels la petite proportion de neurones encore présents. Enfin, cette étude ouvrira des pistes d’applications pour d’autres pathologies neurodégénératives, ou de défaut de fonctionnalité des neurones.
Procédures
Un groupe d’animaux tests de 12 individus maximum sera mis en place au début de l’étude, afin que l’expérimentateur puisse se former aux gestes nécessaires qu’il aura à effectuer lors de la réalisation de ce projet. Ces animaux seront, dans la mesure du possible, des animaux issus de procédures expérimentales précédentes afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la procédure expérimentale. Pour pouvoir être inclus dans cette nouvelle procédure, ces animaux ne devront pas avoir subi de procédures autres que légères. Une fois la procédure réellement commencée, les animaux ne seront pas manipulés avant d’avoir observé une période d’acclimatation à l’expérimentateur ainsi que d’adaptation à l’environnement (habitat et salles dans lesquelles se dérouleront les procédures). Lors de la procédure, les animaux seront soumis à 2 prises de sang sous anesthésie générale gazeuse (le sang sera prélevé dans les deux cas par la veine de la queue), comprenant des prélèvements de 0,15ml maximum, à T=0 avant les premières injections et à J=6 avant la mise à mort. Les animaux seront également soumis à 2 injections (MPTP ou sérum physiologique, d’un volume permettant de rester en dessous du seuil limite de volume d’injection chez la souris, à savoir, 100µl/10g de poids corporel et permettant d’atteindre 25 mg/kg) par voie intrapéritonéale, à T=0 et T=24h. Les volumes d’injections seront calculés pour chaque animal après la pesée de ce dernier. Pour l’illumination, les animaux seront juste maintenus par contention sous le dispositif d’illumination pendant 90 secondes (dispositif allumé ou éteint), cette intervention arrivera 4 fois, à T=0, 6, 24, et 30 h. Pour la ponction du liquide céphalorachidien, les animaux seront sous anesthésie générale et ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris va amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux. Lors des prélèvements sanguins, l'anesthésie gazeuse est brève (quelques minutes), les animaux seront sur une plaque chauffante durant l'anesthésie et la phase de réveil, nous ne nous attendons donc pas à des effets indésirables particuliers sur les animaux. Pour éviter tout stress lors du test de comportement une phase d'habituation va être réalisée et le test Open Field n'est pas un test contraignant pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont obligatoirement mis à mort dans cette procédure, afin de pouvoir prélever les pièces anatomiques qui permettront par la suite d’effectuer les dosages de neurotransmetteurs, de métabolites d’intérêt, et les tissus nécessaires aux coupes histologiques. La mise à mort permet donc de pouvoir prélever les cerveaux des animaux, qui sont essentiels pour pouvoir évaluer la neuroprotection, ainsi que les fonctionnalités préservées ou non par photobiomodulation des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie de Parkinson.
Remplacement
Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris vont amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici, que ce soit dans l’état de l’art ou les travaux sur ce même sujet effectués précédemment. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux.
Réduction
La procédure se déroulera sur un rythme de 12 animaux par semaine (répartis aléatoirement selon les groupes). Pour le traitement des résultats, les données seront confrontées par les tests statistiques appropriés. Au préalable, l’étude de mise au point sera arrêtée dès que les gestes nécessaires à la bonne réalisation des procédures seront acquis ; les dosages seront mis au point sur ces pièces anatomiques. Si des animaux ont été réalisés dans des conditions qui les rendent incluables dans le groupe correspondant (Contrôle + photobiomodulation), cela permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre les 12 animaux par groupes prévus initialement. Le groupe n=12 est donc déterminé en fonction de 2 choses : 1) Avoir assez d’individus au sein de chaque groupe pour pouvoir effectuer les tests mentionnés plus haut dans cet encadré de manière correcte, avec une vraie puissance statistique robuste. Ce nombre est déterminé grâce à l’état de l’art et l’expertise de l’équipe. 2) Au sein des individus, il y a n=2 souris qui sont déclarées dans cette demande d’autorisation de projet pour pallier à d’éventuels soucis d’analyses sur certains animaux au cours de la procédure expérimentale. En effet, il est admis qu’en expérimentation préclinique, la variabilité interindividuelle entre les individus inclus dans l’étude peut parfois amener des situations de non réponse à l’induction de la maladie ou une non réponse au traitement testé. De plus, des conditions d’hébergement et de manipulation identiques peuvent amener de temps en temps un stress ou une réponse de la part des animaux totalement différente ; pouvant entraîner une impossibilité d’inclusion de l’individu en question dans les données traitées. Sans cette marge de n=2 individus, le nombre d’animaux pris en compte dans les résultats peut engendrer un sous-effectif au sein de certains groupes ce qui rendrait caduque les analyses statistiques des résultats, rendant ainsi les données et résultats obtenus inexploitables. Afin de se prémunir de ce scénario, même rare, il est déclaré ici n=12 pour chaque groupe, en accord avec la règle de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Une fois les souris réceptionnées, elles seront transférées dans leurs cages propres, avec un temps d’acclimatation de minimum 7 jours avant le début des protocoles. Les zootechniciens veilleront à leur bien-être au quotidien, à leur adaptation à leur nouvel environnement ainsi qu’à la nourriture et la boisson. Un enrichissement de leur milieu de vie sera mis en place pour assurer le bien-être des souris (tunnels en carton, « nids » en coton etc). Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, ces derniers seront parfaitement habitués aux manipulations et bénéficieront d’une surveillance quotidienne. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination. Par expérience, le protocole envisagé pour rendre les animaux MPTP ne génère pas de douleur et les symptômes moteurs induits permettent à l’animal de rester autonome. Il est recensé que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (diminution de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur seulement certaines souches de souris. Aucune observation de ce genre n’est recensée sur la souche utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Le seul prélèvement effectué sur les animaux impliquant un réveil est une prise de sang à T=0. Elle sera effectuée par veine de la queue selon la méthode préconisée par les instances du bien être animale. Les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse. Les autres prélèvements se font sous anesthésie sans réveil via injection d’anesthésiques appropriés. Le vétérinaire en charge des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle ; une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la SBEA et le vétérinaire si besoin, le tout en accord avec les observations des points limites établis (perte de poids, toilettage, singes de souffrance…)Une intervention appropriée sera prise en compte par le personnel responsable selon la situation.
Choix des espèces
Afin de standardiser nos études nous utiliserons des souris traitées au MPTP, comme dans les publications passées en revue sur ce même sujet d’étude. En effet, ce modèle fait partie des modèles de référence afin de mener des études précliniques sur la maladie de Parkinson. En plus d’être bien référencé dans la littérature, ce modèle détude est déjà utilisé lors des précédentes études sur les effets de la photobiomodulation sur la neurodégénérescence des cellules dopaminergiques de la substance noire compacta. Enfin, le modèle murin est bien connu et maitrisé au sein des laboratoires. Le mécanisme d’action de la photobiomodulation (PBM) semblant générique, les résultats obtenus via l’étude sur les souris devrait, qui plus est, bénéficier à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM dans d’autres maladies neurodégénératives. La bibliographie et les études antérieures sur cette thématique, s’appuyant eux même sur la littérature et l’état de l’art existant sur les modèles murins MPTP démontrent une vraie cohérence entre la souche de souris proposée ici et le modèle d’expérimentation. En effet, avec des injections de 25 mg/kg de MPTP par animaux, sur un modèle Parkinson aigu destiné à ne durer que 6 jours, nous nous trouvons dans une fenêtre de 40 à 60 % de neurones dopaminergiques supprimés, ce qui correspond environ au stade moyen de diagnostic et de prise en charge de la maladie de Parkinson chez l’Homme. Les 2 injections espacées de 24 h à la dose de 25 mg/kg permettent une dégénérescence progressive jusqu’à 7 ou 8 jours en moyenne, avant un recouvrement d’une partie des neurones dopaminergiques. Les animaux étant mis à mort au bout de 6 jours pour le prélèvement des pièces anatomiques, le recouvrement des neurones dans ces délais chez les animaux n’est pas un problème et reste cohérent avec le modèle envisagé ainsi que l’état de l’art sur le sujet. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie. Dans le but d’éviter tout biais dû aux cycles hormonaux, et dans un souci d’homogénéité des résultats, des rongeurs mâles seront utilisés.
Respir’Ante: Etude de l’alvéolisation chez la souris en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au modéré. Les mères gestantes reçoivent un régime appauvri en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance, et une partie des souriceaux subit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant dix jours avant d'être tués pour prélever leurs poumons entiers, d'autres étant anesthésiés puis curarisés pour explorer leur fonction respiratoire. Le porteur affirme que ce régime est le modèle le moins invasif et que l'étude d'un organe aussi complexe que le poumon ne permet pas pour le moment de méthode de remplacement. Les retombées annoncées, un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains, sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir une alvéolisation pulmonaire anormale chez le nouveau-né prématuré. L'alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de souris en étudiant la morphométrie et la fonction respiratoire ii) de mieux caractériser les différents types cellulaires dans le poumon et leur répartition grâce à la technique du Single Cell RNA seq et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des analogues de la voie PPAR ou SREBP (Sterol Response Element Binding Protein) en se basant sur une culture cellulaire en 3D créant in vitro un poumon aussi appelé organoïde alvéolaire.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les souris femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des souriceaux (n=32 sera anesthésiée puis curarisée pour explorer leur fonction respiratoire (âge aux eplorations fonctionnelles: 21 à 60 jours, durée des explorations: 1 jour). Une partie des souriceaux (n=288) recevra du premier jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse de 100µL maximum (injections une fois par jour pendant 10 jours) . Les animaux seront mis à mort ensuite pour analyser leurs poumons entiers en utilisant des organoïdes alvéolaires. Le reste des animaux (n= 200) sera anesthésiée avant mise à mort pour analyse de poumons selon les différentes techniques proposées (ScRNAseq, morphométrie ou organoïdes alvéolaires) (Mise à mort au 120ème jour de vie maximum sans procédure durant leur vivant).
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication observée pour elles-mêmes ou leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur induite par l'injection elle-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les souriceaux seront mis à mort.
Devenir
Les souris gestantes seront gardées en vie à la fin de la procédure 1 (régime) pendant au moins 3 semaines. Les souriceaux recevant les injections (procédure 3) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les souriceaux de la procédure 2 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les animaux seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de l'ensemble des poumons.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation à un modèle de restriction protidique LPD ou à un régime contrôle. Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des souriceaux (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les souriceaux seront euthanasiés. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de plus de 20 % de poids, la souris gestante sera sortie de l'expérimentation et euthanasiée (CO2).
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer chez la souris et aller plus loin dans les analyses moléculaires. En effet, les possibilités d’analyse avec des anticorps sont plus importantes chez la souris et la mise au point de KO est plus développée chez la souris que chez le rat.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur un modèle d’inflammation par injection d’adjuvant complet de Freund chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1800
3 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour le compte de clients pharmaceutiques. Une injection d'adjuvant complet de Freund dans une patte provoque une inflammation douloureuse, certains animaux étant en outre génétiquement modifiés ou injectés deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, avant une mise à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque pour prélèvement d'organes. L'objet est de tester ex vivo des molécules contre la douleur. Le porteur reconnaît que l'adjuvant provoque des douleurs et que les animaux modifiés ne peuvent échapper à leur phénotype, tout en jugeant l'organisme vivant nécessaire.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. Par ailleurs, pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-Clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de douleurs induit par une inflammation périphérique. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule a des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies de douleur du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), chaque animal peut être son propre contrôle puisque une seule patte est lésée; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Durée : injections deux fois par jour (6min/injection), trois mois au maximum. Les animaux vigiles seront injectés pour assurer une exposition in vivo. Les contentions répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Durée : Hébergés trois mois maximum. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Durée : une seule injection (6 min) Ils seront tous injectés, une seule fois, par une solution d’un agent inflammatoire, en sous cutanée dans une patte postérieure. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge : durée instantanée par décapitation rapide après anesthésie gazeuse ou par perfusion intracardiaque (durée = 3 min) sous anesthésie gazeuse au plus tard 48h après le déclenchement de l’inflammation.
Impact sur les animaux
Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection d’adjuvant inflammatoire provoque des douleurs ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress pre-mortem important.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, la possibilité que chaque animal soit son propre contrôle diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes ou 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et au maximum un mois de temps d’hébergement avant le début de la procédure. Il se fera en en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des adultes ou plus âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (douleurs chroniques ou aigues). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.
Etude d’un modèle murin de myélofibrose primitive
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
891 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. Souris doubles mutantes prédisposées aux tumeurs à partir de six mois, elles subissent des prélèvements sanguins réguliers sous anesthésie, une irradiation létale suivie d'une greffe de moelle osseuse, ou des traitements par inhibiteurs, avant d'être mises à mort. Le projet étudie un modèle de myélofibrose primitive, une maladie du sang du sujet âgé. Le porteur indique n'avoir pas réalisé de calcul statistique du nombre d'animaux, l'ayant estimé d'après son expérience, et affirme qu'il faut replacer la cellule souche dans son contexte par le recours aux modèles murins.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit des défauts fonctionnels au cours du vieillissement, provoquant des maladies du sang comme la myélofibrose primitive (MFP). LA MFP se développe chez les personnes âgées et est caractérisée par une moelle osseuse défectueuse en raison de la présence anormale de fibres, un nombre anormal de cellules dans le sang et une splénomégalie. Dans 90% des cas, cette maladie résulte de mutations connues, alors que dans 10% des patients, l’origine de la maladie reste inconnue. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons développé un modèle de souris porteuses d'une double mutation (des gènes Cdkn2a et PLZF , Cf projet #5645 joint) basé sur nos travaux antérieurs ayant validé que PLZF (codé par le gène Zbtb16lu/lu ) est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin, et par ailleurs il est connu que les souris Cdkn2a-/- sont prédisposées à l’apparition de tumeurs. Ces dernières années, nous avons donc pu analyser le phénotype associé à cette double mutation et montré que les animaux doubles mutants présentaient une proportion très augmentée de néoplasmes sanguins ayant toutes les caractéristiques de la MFP. Il apparaît donc important maintenant d'étudier l'effet de la double mutation sur les différents acteurs de la maladie et de définir les voies de régulation altérées. Nous souhaitons pour cela étudier en détail les différents types de cellules sanguines ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Nous attendons des résultats de ce projet qu’ils révèlent de nouveaux acteurs dans le développement de la myélofibrose primitive, qui pourraient potentiellement être utilisés comme cibles thérapeutiques et / ou marqueurs de la production anormale de cellules sanguines dans cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins tous les 15 jours, sous anesthésie, le temps de la procédure. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation léthale et une transplantation de moelle osseuse . Les animaux de la procédure 3 seront soumis à des traitements inhibiteurs (durée 4 semaines, injections 3 fois / semaine)
Impact sur les animaux
Les principaux effets délétères attendus correspondent à l'apparition spontanée de tumeurs liée à la mutation Cdkn2a-/-. Nos souris Cdkn2a-/- et Cdkn2a-/- Zbtb16lu/lu sont donc prédisposées à l’apparition de tumeurs au delà de 6 mois d'âge. Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment par le suivi des formules sanguines grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire disponibles au sein de l’animalerie. Lors des transferts adoptifs, l'irradiation et la greffe reconstitutive qui s'ensuit entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie (amoxicilline fournie dans l'eau de boisson) maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Lors des traitements par les inhibiteurs des potentiels candidats, nous prendrons soin de nous assurer de la bonne tolérance des animaux à ces drogues et d'optimiser les doses administrées.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus conduisant à certaines pathologies sanguines. Ces pathologies sont le fait de mécanismes propres aux cellules souches du système sanguin , mais aussi d'une communication avec des facteurs microenvironnementaux dans la moelle osseuse. Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules sanguines et les cellules de soutien de la moelle. Il est donc nécessaire de replacer la cellule souche dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, dans la mesure du possible, nous testerons in vitro les inhibiteurs candidats retenus, en nous assurant au préalable de leur absence de toxicité aux doses recommandées dans la littérature sur des lignées cellulaires.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules du sang par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Par ailleurs, nos souches murines génétiquement altérées ont été «backcrossées» sur un fond pur afin d’atteindre un nombre de générations suffisant pour considérer que les animaux issus de ces croisements puissent être utilisés comme contrôles, ceci dans un souci de réduction. Nous avons estimé le nombre d’animaux à produire pour les 4 génotypes d’intérêt sur la base de notre expérience passée du modèle, c’est la raison pour laquelle nous n’avons pas réalisé de test statistique.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment par le suivi des formules sanguines grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire disponibles au sein de l’animalerie, les prélèvements étant réalisés sous anesthésie. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique.
Choix des espèces
Bien que des formes ancestrales de systèmes sanguins aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés, parmi lesquels la souris est l'un des modèles génétiques les mieux caractérisés. La disponibilité des modèles souris dans l’étude des pathologies sanguines ainsi que notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes: Les souris des 4 génotypes d'intérêt seront âgées de 6 à 12 mois, ce qui correspond à la fenêtre d'apparition des hémopathies dans notre modèle Cdkn2a-/- Zbtb16lu/lu. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 agés de 8 à 10 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe.
Évaluation de l’administration d’immunostimulants sur l’infection par le parasite protozoaire intestinal Cryptosporidium chez la souris.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.
Objectifs
Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.
Bénéfices attendus
En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.
Impact sur les animaux
Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.
Effets de la perturbation du rythme circadien sur le fonctionnement de l’axe reproducteur chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
217 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les femelles peuvent subir jusqu'à deux frottis vaginaux par jour pendant treize semaines au plus, ainsi que neuf prélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours. Elles sont aussi soumises à trois semaines de décalage horaire chronique, des avances et des retards successifs de la phase d'obscurité qui perturbent leur sommeil, pour imiter le travail posté. Le porteur prévoit le stress de l'isolement pour les femelles gestantes, une irritation modérée du vagin due aux frottis répétés et une douleur modérée due à l'incision du bout de la queue, et indique que 170 souris seront tuées, les 47 autres étant gardées en vie pour d'autres expériences ou tuées à défaut. Les retombées pour les femmes en travail posté sont renvoyées au "plus long terme", sous la forme de recommandations auxquelles l'étude doit seulement "ouvrir la voie".
Objectifs
La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.
Bénéfices attendus
A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 170 animaux. 47 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.
Etude de l’impact d’une nouvelle molécule anti-inflammatoire sur le phénotype et les marqueurs cellulaires de la neurodégénérescence de souris modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Ces souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique reçoivent une molécule anti-inflammatoire dans un gel, sont suivies par des tests de force musculaire, agrippement à une grille et soutien du poids, et 80 d'entre elles subissent sous anesthésie une laminectomie et une dissection du nerf sciatique de huit heures avant d'être mises à mort. Le porteur fixe un point limite à un score de paralysie modérée. Il affirme que l'effet d'une maladie aussi complexe ne peut s'étudier que sur l'animal entier vivant, et renvoie les essais cliniques à une perspective conditionnelle.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Elle se déclare à l’âge adulte, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif et l'issue de la maladie est fatale. La découverte de causes génétiques chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Toutefois, les mécanismes conduisant à la dégénérescence des neurones moteurs restent mal connus à ce jour. Nous savons toutefois que l'étiologie de la SLA comprend une composante inflammatoire qui contribue fortement au développement des symptômes conduisant au décès des patients. Or, une molécule récemment découverte, que nous nommerons PY, inhibe puissament la voie Il23/Il17 de la réponse inflammatoire. Cette molécule a d'ores et déjà montré des effets bénéfiques sur des animaux modèles de maladies inflammatoires (goutte, polyarthrite rhumatoide). Comme PY franchit la barrière hémato-encéphalique, on peut espérer qu'elle ait aussi un effet bénéfique sur la SLA. Des expériences préliminaires ont produit des résultats encourageants, suggérant que PY ralentit le développement des symptômes, mais les effets dépendent du sexe de l'animal. Par ailleurs des travaux récents montrent que la réponse neuroimmunologique peut être différente aux stades présymptomatiques et symptomatiques ce qui suggère que l'effet de PY sur la SLA pourrait dépendre du temps auquel on commence le traitement. Dans ce projet, nous étudierons à quel moment l'administration de PY doit démarrer pour produire un effet sur l'apparition des symptomes et la survie, l'inflammation de la moelle épinière, et sur les marqueurs cellulaires et électrophysiologiques de la dégénérescence des neurones moteurs. Les expériences seront menées sur le modèle animal bien établi de la SLA: les souris SOD1 G93A. La molécule sera administrée par voie orale (molécule additionnée à une gelée alimentaire grignotée par les souris). Le traitement sera démarré à différents temps: dès la gestation des animaux (traitement administré à la mère), au sevrage 21 jours après la naissance, après l'apparition des symptômes chez les animaux témoins (80 jours après la naissance). On étudiera séparément les animaux des deux sexes pour tenir compte du fait que la maladie progresse plus vite chez les mâles que chez les femelles.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet apportera des preuves que PY ralentit l'évolution de la maladie sur un modèle animal standard de la SLA. Si c'était le cas, et compte tenu du caractère incurable à ce jour de cette maladie, nous proposerons alors aux centres SLA nationaux de procéder à des essais cliniques de phase I/II sur les patients (des contacts préliminaires en ce sens ont déjà été pris). S'il s'avérait que cette molécule permettait de ralentir l'évolution de la maladie chez les patients qui vivraient plus longtemps sans déficits moteurs, nous aurions grandement progressé dans la prise en charge clinique de cette maladie dramatique.
Procédures
Tous les animaux mangerons quotidiennement un gel alimentaire contenant ou pas la molécule d'intérêt dont nous testons les effets. La prise alimentaire dure cinq minutes environ dès que les animaux s'intéressent au gel. Tous les animaux seront pésés trois fois par semaine et leur score clinique sera établi par observation de leur locomotion et de leur réflexe lorsqu'ils sont soulevés par la queue. Pour chaque animal, la pesée dure une minute et l'observation de la locomotion et des réflexes dure cinq minutes. Chez 384 animaux, la force musculaire sera appréciée par un test d'agripement à une grille (une fois par semaine, durée totale vingt minutes par animal en comptant les temps de repos) et par un test de soutien de poids (une fois par semaine, durée totale dix minutes par animal en comptant les temps de repos). Ces tests seront effectués sur les animaux vigiles. Dans une des procédures, 100 animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque de PFA d'une durée de 15 minutes sous anesthésie générale et analgésie profonde pour examen post-mortem de leurs tissus (moelle épinière, muscles). Dans une autre procédure, une étude des pertubations électrophysiologiques des neurones moteurs sera effectuée sur 80 animaux pour étudier l'effet du traitement sur ces marqueurs fonctionnels. Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde, implique une laminectomie des vertèbres lombaires et une dissection de branches du nerf sciatique. L'étude électrophysiologique dure huit heures au total pendant lesquelles les souris sont maintenues sous anesthésie générale et anesthésie profonde. Ces 80 animaux ne seront pas réveillés et seront mis à mort par un agent euthanasiant administré à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
La modalité d'administration de la molécule dans un gel alimentaire ne provoque en elle-même aucune nuisance ni effet indésirable. En ce qui concerne l'action de la molécule par elle-même, nos données préliminaires sur les souris SOD1 indique que cette molécule soulage le phénotype des animaux en ralentissant l'apparition des symptômes.
Devenir
Procédure 1: Mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation de CO2. Procédure 2: Mise à mort par perfusion transcardiaque de PFA sous anesthésie et analgésie profonde. Procédure 3: Mise à mort par administration d'un agent euthanasiant (Exagon) sous anesthésie générale et analgésie profonde.
Remplacement
L'étude des cibles moléculaires de la molécule PY et de la voie de signalisation impliquée sera faite sur des systèmes de culture cellulaire, réduisant ainsi le nombre d'animaux vivants utilisés, et est hors champ de cette DAP. Toutefois, il reste à déterminer si la molécule a un effet sur l'évolution d'une maladie maladie aussi complexe que la SLA. Cette autre partie, qui constitue l'objet de la présente DAP, nécessite d'utiliser des animaux vivants. En effet, la SLA résulte d'interactions pathogènes entre les neurones moteurs, les autres constituants cellulaires de la moelle épinière (en particulier les cellules microgliales et les astrocytes, mais aussi les neurones supraspinaux et les interneurones spinaux), et les constituants périphériques (cellules de schwann, jonctions neuromusculaires, fibres musculaires). Les effets de la molécule d'intérêt PY sur la pathogénèse de la SLA ne peut donc s'étudier que sur l'animal entier vivant.
Réduction
Chaque procédure est conçue pour apporter le plus possible de résultats avec des lots dont les effectifs ont été réduits au minimum pour obtenir des résultats fiables. Dans chacune des procédures, la taille de chaque lot, a été établie par un calcul de puissance pour atteindre une valeur alpha 0,8. Les données obtenues dans chaque procédure seront soumises à des analyses multivariées de la variance (MANOVA) et à des ANOVA dans lesquelles l'âge du début du traitement, la dose de PY et le sexe seront des variables indépendantes, pour déterminer s'il existe une association significative avec au moins une des variables observées. Ces analyses seront suivies de tests post-hoc de comparaisons multiples pour déterminer l'influence des variables indépendantes sur les variables observées dans chacune des procédures.
Raffinement
Les expériences sont conçues pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. A cette fin, une réflexion éthique a présidé au choix de la modalité d'administration de la molécule d'intérêt sur une période de temps longue (environ 120 jours). L'administration intrapéritonéale a été éliminée à cause du risque accru de péritonéite si ces injections étaient répétées quotidiennement pendant une période de temps aussi longue. La méthode du gavage ne parait pas acceptable non plus à cause du risque, non négligeable, de perforation de l'oesophage surtout si ce geste était répété quotidiennement pendant 120 jours. L'injection IP et le gavage présentent tous les deux un risque de mortalité que nous ne voulons pas prendre. Malheureusement, l'administration dans l'eau de boisson (qui serait la méthode la plus simple) n'est pas praticable car la molécule est très peu soluble dans l'eau. De plus, ce mode d'administration nécessiterait de grandes quantités de la molécule, or, pour des raisons logistiques et financières, nous ne pouvons avoir accès qu'à de petites quantités. De plus, l'administration dans l'eau de boisson ne nous permettrait pas de contrôler la prise quotidienne de chaque souris. Nous avons donc opté pour une administration de la molécule dans de petites portions d'une gelée grignotable, méthode que nous avons validée notre étude préalable. Il est important de noter que cette méthode n'induit aucune mortalité ni stress de l'animal. Il arrive toutefois que les souris ne mangent pas la totalité de la gelée. Mais ceci n'est pas un inconvénient car nous pouvons quantifier la proportion absorbée par examen de la gelée restante et tenir compte de cette variable dans nos statistiques pour faire ressortir un éventuel effet dose-réponse. Cette variabilité est prise en compte dans nos calculs de puissance pour définir la taille des groupes. Par ailleurs, toujours dans le souci de réduire l'inconfort des animaux au minimum, nous avons défini un point limite (neuroscore 3 sur une échelle de 4) où la paralysie est modérée et a peu d'impact sur la vie de l'animal. Toutefois, par souci de précaution, nous disposerons de l'hydrogel et des croquettes au fond de la cage dès que les souris atteindront le score clinique 2 afin de s'assurer qu'elles s'alimentent et boivent confortablement.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique dans certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris dans lesquelles un gène humain muté SOD1 (G93A) a été inséré par transgénèse dans le génome des souris. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones corticospinaux moteurs, reproduisant l’atteinte spinale et corticale caractéristique de cette maladie. Il a par ailleurs été démontré dans ces souris une atteinte neuroinflammatoire (comme chez les patients humains) qui détermine le décours temporel de la maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet sur la maladie de molécules qui agissent sur l'axe inflammatoire. Les animaux seront utilisés à trois stades de leur développement pour étudier à quel stade PY doit être utilisé pour produire le meilleur effet protecteur. Les trois stades de démarrage du traitement sont les suivants: 1°) Dès la gestation: le traitement est administré à la mère (gelée à consommer oralement) pendant la gestation puis après la naissance jusqu'au sevrage des animaux de la portée. Les animaux sevrés consomment ensuite la gelée une fois par jour jusqu'à l'atteinte du score 3 qui survient chez l'adulte. 2°) A partir du sevrage 21 jours après la naissance jusqu'à l'atteinte du score 3 chez l'adulte. 3°) Chez l'adulte à partir du 80 ème jour jusqu'à l'atteinte du score 3.
Identification de nouveaux traitements pour le cancer de la prostate.
- Recherche appliquée
- Cancers
416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, une castration chirurgicale et un traitement hormonal quotidien pendant trois semaines, puis sont euthanasiées. Le projet cherche de nouveaux traitements du cancer de la prostate résistant à la castration. Le porteur indique que les mâles hébergés ensemble peuvent se battre jusqu'à se blesser, et affirme que l'usage d'animaux est le "seul moyen" de répondre à ses questions, la culture cellulaire ne mimant pas la pathologie humaine.
Objectifs
Le cancer de la prostate se situe au troisième rang des décès par cancer chez les hommes en France, avec 8100 décès en 2018. La thérapie conventionnelle est la castration chimique par chimiothérapie, ou la castration chirurgicale, traitements de base pour les hommes atteints d'un cancer de la prostate avancé et très efficace. Cependant, la progression de la maladie vers un cancer métastatique et résistant à la thérapie conventionelle est inévitable. Ils sont alors traités par chimiothérapie. Nous avons identifié des nouvelles cibles impliquées dans la résistance. Nous souhaitons démontrer qu'un traitement visant ces nouvelles cibles en combinaison avec la chimiothérapie conventionelle favoriserait l'effet anti-tumoral et améliorerait la réponse au traitement.
Bénéfices attendus
Si notre nouveau traitement est efficace nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète de la tumeur. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre l’implication de ces nouvelles cibles dans la résistance au traitement du cancer de la prostate. A terme ce projet permettra de proposer une nouvelle ligne de traitement pour les cancers de la prostate résistant à la castration et ainsi augmentera les chances de survie des patients atteints de ce cancer.
Procédures
Les souris seront soumise à une greffe de cellules par injection sou cutanée (20 secondes /souris y compris contention), à une castration chirurgicale (10min/ souris y compris anesthésie). Elles seront traitées quotidiennement pendant 3 semaines par voie orale (10 secondes /souris y compris contention) ou par injection intrapéritonéale (5 secondes /souris y compris contention) avec une hormonothérapie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont la présence d'une masse tumorale, d'une chute hormonale et une possible perte de poids (mais pas obligatoire) d'une fatigue et d'une déshydratation suite à la chirurgie.
Devenir
A la suite de l'étude, les animaux seront euthanasiés car le traitement subi ne leur permettront pas d'intégrer d'autres études.
Remplacement
L’alternative possible à l’utilisation d’animaux est l’utilisation de cellules en culture, notamment la culture de cellules en 3D qui comprend plusieurs types cellulaires (comme les cellules tumorales avec les cellules immunitaires). Nous utilisons ce type de modèles au laboratoire, ce qui nous permet de réaliser beaucoup d’experimentations préliminaires sur ces cultures de cellules, et d’éviter, autant que nous le puissions, les experimentations in vivo. Cependant cette alternative ne permet pas de connaitre les effets de nos traitements sur un organisme complexe vivant, ni de mimer la pathologie existante chez l’homme. Ainsi l’utilisation d’animaux est le seul moyen de répondre aux questions scientifiques de notre projet sur le cancer de la prostate résistant à la castration.
Réduction
Les biostatisticiens nous conseillent de travailler avec 8 à 10 animaux. Ce nombre d’animaux par groupe ne doit pas être vue comme une augmentation de la quantité d’animaux nécessaires, mais au contraire comme une réduction, car si l’expérience est concluante, les données statistiques seront solides, et donc il n’y aura pas la nécessité de reproduire l’expérience.
Raffinement
Les mesures destinées à réduire la contrainte, la souffrance et l’angoisse des animaux prévus sont: -Contact social: Le contact social entre congénère constitue la meilleure stimulation. L’hébergement par groupe de 4 ou 5 animaux par cage sera effectué. Il faut savoir que notre projet necessite l’utilisation de males (cancer de la prostate) il pourra donc arriver que les animaux se battent jusqu’à se blesser. Nous devrons donc les séparer si tel est le cas. - Contact humain: Les animaux seront visités tous les jours, et seront manipulés avec précaution lors des traitements et du changement des cages. - La présence de coton ou « petites maisons » afin de créer un enrichissement de l’hébergement. - Les souris seront hébergées en zone SOPF, cette zone permet au statut dommageable de ne pas apparaitre - Le milieu sera enrichi à l’aide de litière (sciure de peuplier dépoussiérée) mélangée à des copeaux et de matériel de nidification (coton compactée) et des rouleaux pour se cacher. Les mesures destinées à réduire la douleur mises en place sont : - Un suivit quotidien afin de surveiller l’état général des animaux. - L’administration d’analgésiques afin de soulager la douleur. - Une anesthésie générale par inhalation d’isoflurane avec une injection d'analgesique sera nécessaire lors de la castration.
Choix des espèces
Les souris sont le meilleur modèle représentatif de l’homme pour ce type d’expérience, et le moins onéreux. Nous utilisons des souris agées d'au moins 7 semaines pour qu'elles soient sexuellment mature. Nous utilisons des souris immunodépripmées afin d'éviter le rejet de la greffe de cellules tumoarles humaine.