Souris
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence induite aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une dégénérescence de la rétine leur est provoquée, puis elles reçoivent sous anesthésie une injection dans l'œil et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, avant d'être tuées de 4 à 72 heures plus tard pour analyse de la rétine. Le porteur cherche à réveiller les capacités de régénération de la rétine en modulant l'inflammation, en s'appuyant sur ce qui s'observe chez le poisson. Les retombées pour les patients atteints de dégénérescence rétinienne sont renvoyées au conditionnel, le porteur jugeant la souris "indispensable" malgré un modèle d'explants qu'il utilise en amont.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation (e.g. les cytokines de la famille du TNF-α ou de l'interleukine 6 (IL-6)) favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux: (i) anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii)- injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 5 minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection. (iii) injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra entre 2 (MNU, puis EdU) et 5 injections intrapéritonéales (MNU, puis de façon journalière 1 à 4 injections d'EdU) selon le nombre de jours nécessaires à la procédure. (iv) alimentation formulée : de P45 à la fin de l'expérience (P60+4h, P61, P62, ou P63).
Impact sur les animaux
(i) Les phénotypes des animaux utilisés dans nos expériences sont restreints à la rétine. (ii) Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la forme humide de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie un certain temps (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthnasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée de souris sauvages C57BL/6JRj choisie ne présente aucune mutation induisant une dégénérescence rétinienne contrairement à la lignée C57BL/6NRj qui développe spontanément une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Les souris de la lignée C57BL /6J seront utilisés à partir de P45 quand la rétine est totalement mature pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation formulée. Il faut un minimum d'une dizaine de jour pour obtenir une diminution significative du nombre de microglies. Afin d'induire la dégénérescence rétinienne, le MNU sera injecté à P59 puis la suite des actes expérimentaux aura lieu 16h après (temps nécessaire à l'enclenchement du processus de dégénérescence).
Mécanismes immuno-régulateurs des pathologies cardiométaboliques et de leurs comorbidités: récepteurs nucléaires et membranaires (1/2 ET 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système respiratoire
25 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Elles servent à reproduire une dizaine de pathologies comme l'anaphylaxie, l'asthme, le psoriasis, la septicémie ou le diabète de type 2, au moyen d'injections répétées, de gavages, de nébulisations et de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la douleur, inhérente à certains de ces modèles inflammatoires, ne peut pas être prise en charge dans certaines procédures sans interférer avec les résultats. Il affirme que la complexité des interactions entre organes rend l'expérimentation in vivo "indispensable", les retombées thérapeutiques restant formulées comme de simples perspectives.
Objectifs
But : Ce projet a donc pour but d’étudier la contribution des cellules immunes dans les pathologies immuno-inflammatoires et métaboliques et dans l’aggravation des unes par les autres. Il s’agira notamment de déterminer comment certains facteurs régulent le développement et la fonction des cellules immunes dans le contexte des maladies métaboliques. Ces facteurs sont d’une part, certains récepteurs nucléaires, activateurs ou répresseurs transcriptionnels activés par un ligand (un lipide ou un dérivé d’acide gras) ou des récepteurs membranaires.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental: meilleure connaissance du rôle des récepteurs nucléaires dans les processus pathophysiologiques impliquant le système immuno-inflammatoire Sur le plan appliqué: les mécanismes mis en évidence pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les récepteurs nucélaires peuvent être ciblés pharmatologiquement par de petites molécules
Procédures
P1 Anaphylaxie. 1. Injection intraveineuse, intrapéritonéale et intradermique. 2. Prélèvement sanguin. 3. Injection intraveneuse ou intradermique. 4. Gavage. 5. Injection intraveineuse. 6 Prise de témpérature (2h). 7 Prélèvement sanguin. P2 Athme. 1. Prélèvement sanguin. 2. Sensibilisation (3-5 nébulisation, injection intransale, intrapéritonéale, ou intratrachélae). 3. Nébulisation (20min). 4. Pléthysmographie (30 min). 5. Prélèvement sanguin. P3 Dermatite atopique. 1. Prélèvment sanguin. 2. Rasage. 3. Application topique. 4. Pose de "" (5X 3-4 jours). 5. Nébulisation (20min) ou injection intranasale. 6. Pléthysmographie. 7. Prélèvement sanguin. P4 Psoriasis. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Rasage. 4. Application topique (5). 6 Prélvement sanguin. P5 Hypersensibilité. 1. Prélèvmeent sanguin. 2. Application topique (3). 4. Rasage. 5. Application topique (2). 6 Prélèvement sanguin. P6 Septicémie et P7 Endotoxémie. 1. Prélèvement sanguin. 2. Gavage. 3. Injection intrapéritonéale ou sous cutanée. 4. Prélèvement sanguin. P8 Inflammation stérile. 1.Prélèvement sanguin. 2. Injection intrrapéritonéale. 3. Gavage (3). 4. Injection sous-cutanée. 5. Prélèvement sanguin. P9 Athérosclérose et P10-13 Diabète de type 2 (DT2). 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Prélèvement sanguin (6). P10-11 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Gavage. 4. Gavage ou injection intrapéritonéale. 5 Prélèvement sanguin (9). P10-12 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Cathétérisation (30 min). 4. Clamp (2h). 5. Prélèvement sanguin. P14 Exercice. 1. Exercice sur tapis de course (4X1h) 2. Prélèvement sanguin. 3. Exercice sur tapis de course (80X1h) 4. Prélèvement sanguin. P15-11-18 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation biliaire (1h). 15-11-19 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation canal thoracique (1h). P16 Colite. 1. Prélèvement sanguin. 2. Injection Intrapéritonéale ou intrarectale. 3. Prélèvement sanguin. P17 Immunisation. 1. Prélevement sanguin. 2. Injection intrapéritonéale (3). 3. Gavage (8). 4. Prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
La douleur faisant partie de certains processus patholgiques, notamment pour l'inflammation intestinale et les processus allergiques, celle-ci ne peut être prise en charge dans certaines procédures sauf à interférer avec les résultats
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la suite des procédures ou enchaînement de procédures
Remplacement
Les pathologies métaboliques et/ou immunes impliquent de nombreux organes du corps et de nombreux types cellulaires circulant entre ces organes. Comme il est impossible de reproduire la complexité de ces interactions in vitro, l’expérimentation animale in vivo est indispensable pour reproduire de manière aussi réaliste que possible ces pathologies.
Réduction
L’utilisation de conditions les plus standardisées possibles (conditions d’hébergement, âge et sexe des animaux, groupes contrôles appariés, horaires de réalisation des expériences…) et l’entraînement et la dextérité du personnel impliqué dans l’expérimentation permettent de diminuer la variabilité individuelle des réponses des animaux et par voie de conséquence le nombre d’animaux nécessaires par groupe pour obtenir des résultats significatifs. De
Raffinement
L’hébergement dans des conditions sanitaires optimales (exemptes d’organismes -opportunistes etpathogènes spécifiques), l’enrichissement de l’environnement dans les cages (abris et « jeux »), le maintien des interactions sociales, l’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress durant toute la vie des animaux y compris durant l’expérimentation. Une surveillance quotidienne est également pratiquée.
Choix des espèces
En raison du grand nombre de lignées génétiquement modifiées disponibles et de la facilité relative avec laquelle il est possible d’en créer de nouvelles, la souris a été choisie comme modèle d’étude. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines), âge à partir duquel le système immunitaire est mature. De plus les pathologies cardiométaboliques sont des pathologies de l'adulte.
Validation de l’efficacité antitumorale du ZZW-115 et ses dérivées dans des modelés du cancer pancréatique spontané
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer du pancréas vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant huit semaines pour tester une molécule anti-tumorale, la ZZW-115, et ses dérivés. Le porteur décrit des signes possibles de cyphose, de prostration, de poil hirsute et de perte de poids, et prévoit la mise à mort avant l'apparition d'un phénotype trop dommageable. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle proche de l'humain est indispensable et qu'il ne peut se passer de l'animal vivant.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer très meurtrier. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents efficaces basés sur la nanotechnologie pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, un analogue de la trifluopérazine (ZZW-115) et des dérivées sont été développé et s'ont avéré très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs ont été obtenu in vitro qui montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire de plus de 50 lignées cellulaires différentes. De plus, nous avons obtenu des résultats prometteurs in vivo qui montrent une réduction significative de la croissance tumorale de xénogreffes obtenues après implantation de cellules tumorales humaines (MIAPaCa2 ou Hep3B) sur des souris NUDE. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique, NUPR1. Cependant, nos résultats ont été basés sur des modèles de xénogreffes et jamais sur des modèles spontanés, qui se rapprocheraient davantage de la réalité du patient. En ce sens, nous avons deux objectifs avec ce projet, d'une part évaluer le pouvoir de cette famille de molécules comme agent préventif, pour cela nous utiliserons des souris avec la mutation Pdx1-Cre;KrasG12D/+, qui développent des lésions précancéreuses : les PanINs. Notre objectif est d'évaluer si le traitement à partir de l'âge de 5 semaines réduit l'apparition de ces lésions chez les souris traitées avec le ZZW-115 ou ses dérivés. D'autre part, notre objectif est d'évaluer si ce groupe de molécules a un effet curatif dans des modèles d'adénocarcinome pancréatique spontané. À cette fin, nous utiliserons le modèle KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), l'un des modèles les plus précis qui récapitule le plus fidèlement la carcinogenèse telle qu'elle se produit chez les patients. Dans ce cas, nous allons évaluer si le ZZW-115 et ses dérivés ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, notre objectif est de déterminer si le ZZW-115 (et deux de ses dérivés) est efficace dans le traitement de l'hypertension artérielle. 1) prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. Par le passé, notre groupe de recherche a démontré que l'apparition des PanINs était liée à la présence de NUPR1, c'est-à-dire que chez les souris KO de NUPR1, même en présence de l'oncogène Kras, les lésions précancéreuses n'apparaissaient pas. En ce sens, notre objectif est de démontrer qu'avec des inhibiteurs pharmacologiques, nous pourrions prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. 2) étudier l'effet du ZZW-115 et de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) dans des modèles animaux de cancer pancréatique spontané. Dans le passé, nos études ont toujours été réalisées dans des modèles animaux avec des xénogreffes, cependant, ce modèle, bien qu'il présente de nombreux avantages, est insuffisant à plusieurs égards. Avec le modèle animal KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), un modèle qui récapitule plus fidèlement la carcinogenèse pancréatique chez les patients, nous pourrons déterminer si l'inhibition de NUPR1 par des inhibiteurs pharmacologiques a un effet anti-tumoral dans un modèle spontané et immunocompétent. 3) d'évaluer quel traitement, le ZZW-115 ou l'un de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) a un plus grand pouvoir antitumoral. Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.
Procédures
Les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution (véhicule ou traitement, 60 microlitres) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 8 semaines (chaque jour). L’intervention dure 15-20 secondes.
Impact sur les animaux
Les premiers signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, poil hirsute, diminution du poids de l’animal. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris NUDE dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que le ZZW-115 n'a montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse (4% isoflurane, 3 - 5 minutes). Le sang, les tumeurs et les organes seront ensuite prélevés en vue des analyses biochimiques et histologiques pour l’évaluation de l’effet anti-cancer et la toxicité éventuelle. Les cadavres seront stockés dans un congélateur à -20°C en attendant leur évacuation par la société spécialisée dans le traitement des déchets biologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le ZZW-115 et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 96 individus (4 groupes de 12 souris KIC et 4 groupes de 12 souris KC) conformément à la règle de réduction.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution contenant le ZZW-115 sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%. Aucun animal ne faisant pas partie de l'étude n'est maintenu avec un phénotype dommageable. Les souris sont sacrifiées avant l’apparition de ce phénotype dommageable
Choix des espèces
Les souris sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées. Les animaux KC seront utilisés à 6 semaines, juste avant l'apparition des lésions précancéreuses, pour évaluer l'effet protecteur du ZZW-115 et de ses analogues. Les animaux KPC seront utilisés à partir de 10 semaines, lorsque des lésions précancéreuses se seront développées, pour évaluer si le ZZW-115 et ses analogues sont efficaces pour inhiber la progression des tumeurs.
Etude du remodelage structurel et fonctionnel de la barrière épithéliale digestive et de la barrière urothéliale après lésion médullaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière qui paralyse ses membres inférieurs, puis des instillations vésicales, des gavages et des prélèvements de sang, pour étudier les troubles digestifs et urinaires qui suivent une atteinte médullaire. Le porteur anticipe 15 à 20 % de pertes liées à la chirurgie et signale un risque d'infections urinaires. Sur le remplacement, il affirme que la corrélation entre in vitro et in vivo est insuffisante et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
En France, les lésions de la moelle épinière représentent 10 à 80 cas/million d’habitants/an, soit environ 1000 nouveaux patients/an. Les troubles du transit après lésion médullaire sont majeurs, et notamment les troubles de motricité colique. Les troubles urinaires sont également invalidants. La compréhension de ces troubles apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo. Lors d’une 1ère étude, nous avons soulevé le rôle de médiateurs lipidiques dans les processus physiopathologiques affectant à la fois les fonctions de la barrière intestinale et vésicale ainsi que le Système Nerveux Entérique (SNE). Parmi ces médiateurs, figurent les médiateurs lipidiques dérivés des acides gras. En effet, les dérivés d'acides gras polyinsaturés (AGPI), peuvent réguler une multitude de réponses cellulaires, notamment la croissance et la mort cellulaire, l'inflammation. Cependant, leur impact sur le SNE et les dysfonctionnements de la barrière intestinale et vésicale reste inconnu. Les objectifs de cette étude seront de développer un modèle murin de lésions médullaires chroniques et de tester l’effet de différents médiateurs lipidiques sur la barrière urothéliale et digestive. Ce projet sera réalisé en tenant compte du principe des 3R. Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable (Réduire). Afin de limiter toutes sources d'angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale et les animaux recevront de l'analgésique avant et après l'opération. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé quotidiennement, avec un remplacement de la litière et un enrichissement par frisottis, et en évaluant l'état général des animaux, et des points limites seront mis en place (Raffiner). La corrélation in vitro-in vivo n'étant pas satisfaisante, le recours à l'utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement. Les expériences seront réalisées en plusieurs fois et ce projet nécessitera 416 animaux (souris C57Bl6) dont 32 souris de «réforme».
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices sont attendus suite à ces expériences : - Démontrer les changements suite à une lésion médullaire haute, de la motilité et des fonctions de barrière dans des souris SCI (Spinal Cord Injury) par rapport à des souris contrôles -Identifier le rôle de dérivés de certains médiateurs lipidiques sur les fonctions de la barrière urothéliale et les processus associés (prolifération cellulaire, mort cellulaire, …) ainsi que leur implication suite à une lésion médullaire - Identifier les cibles moléculaires clés sous-jacentes à ces changements fonctionnels grâce aux tissus murins collectés à la fin des expériences
Procédures
Lésion médullaire: Les animaux seront anesthésiés dans un 1er temps afin d’effectuer la lésion médullaire ; et cette procédure dure 15 minutes par animal ; au début de l’expérimentation. Les instillations de médiateur lipidique (ou de son solvant) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, que ce soit par instillation transuréthrale ou par voie sus-pubienne sous contrôle échographique. Les souris seront anesthésiées 3 minutes au maximum ; à partir de J14 et 3 fois/semaine soit 6 fois au total. L’étude du transit colique, du transit total et de la perméabilité intestinale sont réalisées en même temps ce qui permet de limiter les manipulations. Les souris seront gavées au début. Il y aura un prélèvement de sang (15 µl ± 5 µl) pour la perméabilité intestinale. L’endroit de l’incision sera ensuite comprimé avec une compresse afin de stopper le saignement. Ces 3 techniques seront réalisées 2 fois au total ; à J7 et J21. Pour le transit colique distal, les souris seront anesthésiées très rapidement (1 min), le temps de mettre la bille dans le colon. Cette procédure sera réalisée à J8 et J22. Pour l’open field, les animaux seront placés individuellement au centre d’une enceinte carrée et leurs mouvements seront enregistrés. Nous effectuerons cette procédure 2 fois au total : à J8 et J25.
Impact sur les animaux
La lésion médullaire induit une mobilité réduite des animaux. Les souris ont les membres inférieurs paralysés mais peuvent toujours se déplacer. Il peut y avoir des risques d’infections urinaires et pour éviter cela, nous changerons la litière quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Suite à la chirurgie, les animaux recevront du Metacam associé à de la buprénorphine pendant 3 jours afin de réduire au maximum la douleur. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique.
Devenir
Procédures 1, 2 et 3 : les procédures 1 et 2 serviront à la mise au point du modèle (cathétérisation transuréthrale ou instillation sus-pubienne) tandis que la procédure 3 sera la manip complète. Dans les 3 procédures, les animaux auront une chirurgie de lésion médullaire et ceci est classé en procédure sévère.
Remplacement
La compréhension des troubles du transit observés chez les patients ayant une atteinte de la moelle épinière apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir à la fois des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo, et également sur des études plus fondamentales protéiques ou transcriptomiques des régulateurs de motricité digestive au niveau du SNE, ou bien en immunohistochimie. Par conséquent, le recours à l'utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable. 2 types d’analyses statistiques seront réalisés : A- "one way anova (Kruskal Wallis test)" pour comparer les différents groupes entre eux à un instant donné, suivi d'un post test de Dunn (qui permettra de comparer 2 conditions données) B- Un two way repeated measure ANOVA suivi d’un post test de Bonferroni pour comparer l'évolution des groupes entre eux au cours du temps Dans ce nombre d’animaux, nous avons inclus les pertes liées à la chirurgie qui est une procédure sévère. Nous estimons entre 15 et 20 % de perte malheureusement (échec de la chirurgie, euthanasie de l’animal si atteinte de points limites, …) Nous avons prévu 24 animaux/condition afin d’être sûre d’en avoir 20/condition.
Raffinement
Afin de limiter toutes sources d'angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale. Les animaux du modèle recevront de l'analgésique avant l'opération, puis 1 fois par jour pendant 3 jours, pour éviter toute souffrance. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude tous les jours, avec un remplacement journalier de la litière et une mise en place d'un enrichissement par frisottis. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique. Des points limites seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris présente un temps de transit idéal pour les études de motricité et de perméabilité in vivo. Les souris seront âgées de 6-8 semaines. A ce stade, les souris sont adultes et ont des fonctions digestives assez développées pour nos études.
Développement d’une sonde théranostique ciblant les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.
Procédures
Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.
Devenir
L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.
Evaluation du potentiel thérapeutique d’un nanomédicament enzymatique pour un traitement anti-tumoral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections du composé et des prélèvements sanguins, la tumeur étant tolérée jusqu'à un volume de 1 500 mm3, pour tester un nanomédicament censé affamer les cancers. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu pour ne pas fausser les résultats de l'expérimentation. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de système alternatif et que ces expériences ont une valeur prédictive supérieure aux tests de laboratoire.
Objectifs
Il s’agit d’un projet visant à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement contre le cancer. Les cellules cancéreuses ont besoin d’un apport continu en nutriments pour leur croissance rapide. Les acides aminés sont essentiels à la survie des cellules cancéreuses. Le traitement que nous développons exploite cette vulnérabilité et a pour but d’affamer les tumeurs en les privant de ces ressources essentielles. En effet, la molécule active de notre médicament est une enzyme, une molécule qui détruit les nutriments en les découpant. Le développement de ces nouveaux médicaments s’appuie sur une technologie novatrice qui permet 1) d’améliorer le temps d’action de l’enzyme (pour affamer la tumeur) et 2) d’être invisible par le système immunitaire, dont le rôle est de préserver l’organisme en détruisant les corps étrangers (pour éviter le rejet du traitement par l’organisme). Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules cancéreuses ont montré que notre médicament peut les affamer et donc les éliminer. Cependant une caractérisation plus approfondie de l’efficacité de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) De confirmer l’efficacité anti-tumorale du médicament chez des souris porteuses de tumeur. 2) D’évaluer la capacité du médicament à se localiser dans la tumeur (à trouver son site d’action). 3) De démontrer la capacité de notre médicament à échapper à sa destruction par le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient confirmer l’efficacité anti-tumorale de nos nouveaux médicaments et nous permettre de sélectionner le type de cancer pour lequel le traitement sera le plus efficace. De plus, en démontrant que nos médicaments sont efficaces et échappent à la surveillance du système immunitaire, nous validerons notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.
Procédures
Ce projet requiert l’utilisation de deux modèles murins : des souris sans système immunitaire (1-3, 5) et des souris avec système immunitaire (4-7). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Greffe sous-cutanée de cellules tumorales (10-15 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, 1 seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 2) Injection intra-tumoral d’un agent antinéoplasique (5-10 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles lorsque le volume tumoral aura atteint la taille souhaitée. Ce geste sera réalisé une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 480 et 768 (min-max). 3) Mesure de la taille des tumeurs (20 - 30 secondes). La croissance des tumeurs sera suivie par mesure au pied à coulisse sur les animaux vigiles. Ces mesures seront réalisées 2 fois par semaines pendant la durée de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 4) Injection intra-péritonéale de l’enzyme (3 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Deux injections seront réalisées par souris, espacées de 14 jours. . Le nombre d’animaux concernés est entre 120 et 264 (min-max). 5) Injection intraveineuse d’un agent anti-tumoral (20-30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Une seule injection par souris sera réalisée sur la durée de l’étude. Les deux modèles murins utilisés dans notre étude sont concernés. Le nombre de souris sans système immunitaire nécessaire est entre 96 et 240 (min-Max), et celui avec système immunitaire entre 120 et 264 (min-max). 6) Prélèvements sanguins dans la veine caudale (30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Un maximum de trois prélèvements par souris sera effectué sur l’ensemble de la durée de l’étude. Les volume et fréquence de prélèvements sanguins ont été établis de manière à ne pas prélever plus de 20% du volume sanguin total de la souris sur une durée de 2 semaines. Le nombre d’animaux concernés est entre 128 et 272(min-max). 7) Imagerie par SPECT/CT (20 minutes). Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiées par inhalation de 4% d’isoflurane dans une boite à induction puis de 2,5% au masque. L’acquisition des images sera réalisée à différents temps après injection du nanomédicaments : 4h, 24h, 3 jours, 7 jours, 10 jours et 15 jours. Le nombre d’animaux concernés est entre 96 et 240 (min-max).
Impact sur les animaux
Tout au long du déroulement des expériences précédemment décrites, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par les animaliers ou l’expérimentateur. L’évolution de la taille des tumeurs sera notamment suivie. Le volume tumoral maximal toléré de 1500 mm3 n’induit pas de problèmes de locomotion ou de contrainte mécanique chez la souris. La tumeur est située en sous-cutanée sur le flanc de l’animal. La manipulation de l’animal n’implique pas de palpation de la tumeur mais simplement une mesure au pied à coulisse, minimisant ainsi la douleur. On détermine la longueur (L, en mm) puis la largeur de la tumeur (l, en mm), le volume tumoral et alors calculé selon la formule suivante : volume en mm3 = Lx(lxl)x0,52. Au-delà d'un volume tumoral de 1500 mm3, l’expérience sera arrêtée. Il n'y a pas de douleur prévisible associée à ce protocole expérimental d'injection de lignées cellulaires en sous-cutanée. Concernant les études d’immunisation des souris, nous appliquerons des protocoles établis et décrit dans la littérature. Il n’y a pas de douleur prévisible associée à cette procédure expérimentale d’immunisation.
Devenir
Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera induite de manière réglementaire par insufflation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie/analgésie chimique.
Remplacement
Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Les processus de développement des cancers ainsi que les interactions du système immunitaire avec les médicaments sont des processus complexes qui résultent de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe.
Raffinement
Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal (critère non applicable pour les souris porteuses de tumeurs), d'une difficulté à se mouvoir ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément et les animaux seront euthanasiés. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas biaiser les résultats de l'expérimentation en cours.
Choix des espèces
Notre projet nécessite l’utilisation de deux modèles murins : - Modèle de souris dépourvue de système immunitaire : ces souris sont les modèles animaux les plus utilisés pour les études concernant le développement tumoral car le taux de prise de greffe est le plus élevé. Ces souris sont couramment utilisées puisque l’absence de système immunitaire empêche le rejet des cellules humaines et favorise leur développement de la tumeur. - Modèle de souris avec système immunitaire : ces souris sont des modèles animaux qui ont la capacité de développer une réponse immunitaire rapide et efficace 14 à 21 jours après immunisation. Dans le cas de notre étude, des travaux ont été publiés utilisant ce modèle de souris avec une immunisation avec notre enzyme d’intérêt . Les souris utilisées seront des souris adultes de 6 à 8 semaines. Ce choix est motivé par les nombreuses études utilisant des modèles murins semblables à ceux utilisés dans notre étude.
Rôle d’une protéine impliquée dans l’activation des cellules souches musculaires en réponse à des lésions musculaires induites par l’exercice chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des séries d'injections intrapéritonéales et subit un protocole d'électrostimulation des muscles du mollet sous anesthésie, censé imiter une déchirure musculaire, avant d'être tué pour analyser le tissu musculaire. Le porteur attribue le niveau modéré au cumul des injections, des électrostimulations et des anesthésies. Sur le remplacement, il affirme que l'électrostimulation est impossible à reproduire in vitro et que seule l'analyse du tissu entier révèle l'effet recherché.
Objectifs
Le maintien de la quantité et de la qualité des muscles est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à se réparer après une lésion musculaire (par exemple un claquage ou contusion musculaire). Les muscles possèdent des cellules de réserve, appelées cellules souches, qui ont une contribution importante à cette capacité de réparation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires lésées. Il a été démontré qu’une protéine X impliquée dans l’activation des cellules de réserve joue un rôle clé dans la réparation du muscle in vitro et in vivo dans un modèle murin de lésion toxique (i.e., injection d’un venin de serpent). Toutefois le rôle de la protéine X dans la réparation du muscle lésé en réponse à un exercice n’est à ce jour pas connu. Le projet étudie le rôle de la protéine X dans l’activation des cellules de réserve et ses conséquences fonctionnelles en utilisant un modèle d’exercice mimant une déchirure musculaire chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant l’activation des cellules de réserve en réponse à une blessure musculaire. L’amélioration des connaissances sur la réparation du muscle après une lésion permettra à termes de proposer des stratégies thérapeutiques efficaces aussi bien pour le muscle sain (par exemple, athlètes de haut niveau) que pour le muscle pathologique (par exemple, arthroplastie totale de hanche, patients atteints de dystrophie, personne âgée). Une meilleure réparation du muscle est essentielle pour les performances des sportifs mais également pour la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux recevront des injections en intra péritonéales (lot n°1 : 4 injections sur 4 jours, puis 2 semaines plus tard 3 injections en 3 jours. Lot n°2 ; 4 injections sur 4 jours). La durée de chaque injection est inférieure à 30 secondes. Les animaux sont soumis à un protocole d’exercice réalisé sous anesthésie générale (électrostimulations des muscles du mollet). La durée d’anesthésie générale est inférieure à 15 minutes. La durée du protocole d’exercice est de 5 minutes
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées. Après le protocole d'exercice, qui concerne un seul muscle de la patte arrière, les animaux ne présentent aucun signe de souffrance et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater dès leur réveil. Aussi, il a été démontré que les anesthésies à l’isoflurane liées au protocole d’exercice et à la mesure de force n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Ce projet est l'aboutissement des études in vitro et ex vivo qui ont été menées auparavant. Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe.
Réduction
Le modèle d'exercice utilisé est totalement non-invasif et permet de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux, et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales incluent un recours à l'anesthésie générale profonde. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable, bien que non attendu.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans la régénération du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux sont donc utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.
EU2/2 Suivi longitudinal en IRM du dymorphisme sexuel de la connectivité cérébrale chez la souris dKI, modèle de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris génétiquement modifiées, modèles de la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent jusqu'à cinq anesthésies pour des séances d'IRM entre deux et douze mois, puis la plupart sont tuées par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau tandis que d'autres sont gardées vivantes et transférées vers le laboratoire d'origine. Le porteur nomme des tests comportementaux fondés sur l'exploration spontanée pour étudier les différences entre mâles et femelles. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit assez fidèlement les processus cognitifs et juge le recours au modèle animal nécessaire.
Objectifs
La variété de profils cliniques observés dans la maladie d’Alzheimer plaide en faveur d’une prise en charge personnalisée de la prévention, du diagnostic et du traitement de cette affection. Le sexe est un facteur critique à prendre en compte car les femmes ont un déclin cognitif plus marqué que les hommes à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer. Des travaux suggèrent que les interactions entre certaines régions cérébrales sont plus affectées chez les femmes que chez les hommes lors de l’émergence d’une maladie d’Alzheimer. Dans un nouveau modèle de souris de la maladie d’Alzheimer, les femelles peinent à reconnaitre un objet au bout de 24h à un âge où les mâles n’ont pas ce problème. Or cette forme de mémoire s’instaure pendant les phases de sommeil. Ainsi, une perturbation des cycles veille sommeil, comme celle observée chez le patient Alzheimer, pourrait contribuer aux déficits observés des femelles. Quelques mois plus tard, les deux sexes ont des difficultés à reconnaître une association objet-place. Notre but dans cette étude, est donc de vérifier que dans un premier temps, la connexion impliquée dans la reconnaissance d’objet à 24h est effectivement perturbée chez les femelles mais pas chez les mâles. Par la suite, la communication sous-tendant la mémoire d’association objet-place serait à son tour altérée, cette fois chez les deux sexes. Pour mettre en évidence ces altérations différentielles de la connectivité en fonction du sexe et du développement de la maladie dès les stades les plus précoces, nous étudierons l'évolution au cours du temps de la connectivité entre différentes régions cérébrale à la fois fonctionnelle et structurelle, des souris modèle de la maladie d’Alzheimer via une approche en Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM). Les données d'imagerie seront ensuite corrélées a des investigations histopathologiques, ainsi qu'à des approches comportementales visant à étudier l'efficacité de difféntes connexions dans des tâches de mémoire. Nos travaux devraient donc contribuer à mieux comprendre l’origine des différences liées au sexe au début d’une pathologie Alzheimer et plaideront en faveur de la mise en place de diagnostic et/ou de traitement personnalisés en fonction du sexe.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre l’origine des différences homme-femme au début de la MA et plaideront en faveur de la mise en place de traitements personnalisés en fonction du sexe.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie sous cutanée (par médétomodine) et gazeuse (isoflurane) à 2, 4 et 12 mois lors de l'IRM. Les animaux subiront au maximum 5 anesthésies de 1h30 correspondant au maximum 5 examens IRM de 1h30, espacés d'au minimum de 2 semaines entre chaque IRM. Ils seront également soumis à une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour le prélèvement du cerveau à raison de 5 souris par groupe à 2 mois (n=20), 5 souris par groupe à 4 mois (n=20) et toutes les souris à 12 mois (n=140). Cette perfusion intracardiaque se fait sous anesthésie et la durée totale de l’intervention est de 15min.
Impact sur les animaux
L’apparition éventuelle de signes de détresse seront surveillés, tels qu’une difficulté à récupérer de l’anesthésie, observable par des déplacements lents, l’absence de toilettage, l’aspect du pelage, une posture voutée, une diminution de l’abreuvement et de l’alimentation de l’animal, une potentielle altération des yeux en dépit du gel oculaire utilisé au cours de l’examen IRM, ainsi que l’état du point d’insertion de la voie d’infusion sous-cutanée.
Devenir
Les animaux non concernés par la perfusion seront gardés en vie et transférés dans le laboratoire d’origine EU1/2 pour la poursuite de l’étude. Les animaux concernés par la perfusion seront gardés dans les locaux de l’EU 2/2 pour le prélèvement des cerveaux. Si ces locaux ne sont pas prêts pour ces prélèvements, les souris seront gardées en vie et retournées dans l'EU1/2 pour réaliser ces prélèvements.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la maladie d'Alzheimer est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible de nos jours de modéliser les processus cognitifs de façon assez fiable et complète dans un modèle in silico de la pathologie. Il est donc nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie, la connectivité cérébrale et les performances cognitives.
Réduction
Les résultats obtenus précedemment montrent une grande variabilité inter-individuelle en comportement et en IRM fonctionnelle. En conséquence nous voudrions augmenter la puissance statistique par l’augmentation du nombre d’animaux. 200 souris seront finalement nécessaires dans cette étude. Le projet étant une étude longitudinale impliquant des procédures non-invasives, il permet donc le suivi d'un même animal plusieurs fois et par conséquent une réduction du nombre d'animaux à inclure. Le nombre de souris est donc réduit au minimum d’animaux nécessaire afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables en fonction des expériences réalisées: optimisation de l’anesthésie pour l’IRM, suivi IRM et analyse histopathologique.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler dans la cage), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Ellesseront maintenues en groupe sociaux sauf pour la durée des tests de comportement. Tous les tests comportementaux sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris. Un suivi plus spécifique sera réalisé pour chaque procédure avec des points limites adaptés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L’IRM préclinique 7T est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. A ce jour, les modèles animaux de la Maladie d'Alzheimer ont essentiellement été créés chez la souris. Le modèle utilisé dans l'étude présente un dimorphisme sexuel dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui est réminiscent de celui trouvé au stade préclinique de la Maladie d'Alzheimer, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le diagnostic. Les souris seront utilisées à 2, 4 et 12 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire. Cela permettra de réaliser une évaluation longitudinale des différences mâles versus femelles.
Biodistribution et validation pharmacologique de vecteurs médicaments in vivo
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit des injections de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tué par une dose létale d'anesthésique pour prélever sang et organes et mesurer la distribution des composés. Le projet, mené par une société, prévoit d'utiliser environ 1 200 souris par an pour valider ses candidats-médicaments. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune modélisation prédictive ne remplace le modèle murin et le présente comme "l'idéal" et le plus facile à mettre en place.
Objectifs
Plusieurs stratégies sont en cours d’exploration pour faciliter le passage et l'adressage de biomolécules vers les tissus et organes cibles. Parmi ces stratégies, on trouve le développement de molécules-vecteurs qui améliorent la biodisponibilité et le passage d’agents thérapeutiques, notamment à travers la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) du cerveau. Ainsi, grâce à la reconnaissance spécifique d’un partenaire ou d’un récepteur (protéine), le complexe vecteur-médicament pourra reconnaître sa cible et franchir cette barrière pour agir dans le parenchyme nerveux. Le réseau sanguin irrigant étroitement la totalité de l’organisme, ce principe de délivrance pharmacologique peut s’appliquer à tout type de tissu ou organe périphérique. Notre société développe de peptides vecteurs (peptides, fragments d’anticorps), conjugués avec différentes classes de molécules (agents d'imagerie, drogues thérapeutiques, siRNA) et proposés comme potentiels candidat-médicaments VHH. Dans notre cas, des peptides, drogues, ou dernièrement de petits ARN interférents (siRNA), dont la finalité sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de certaines protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Les études sur sujets sains permettent notamment de mieux comprendre et appréhender leurs disfonctionnements, sans que pour autant elles n’aient à court termes d’effets sur la santé et le bien-être animal. Dans ce projet (procédure 1) nous proposons d’étudier à différents temps d’incubation, la biodistribution de nos vecteurs conjugués (VHH) et/ou leurs efficacités, par mesure des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. L'assurance de l'innocuité de nos conjugués VHH par des études d'immunogénicité, nous amène à doser certaines protéines plasmatiques et, rapporté à une gamme de référence (procédure 2), à quantifier et identifier toute apparition d'une inflammation.
Bénéfices attendus
Parmi les avantages de nos procédures, on retrouve la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (posologies), qui seront de fait dans ce projet, revues à la baisse par rapport aux autres thérapies plus lourdes, actuellement utilisées (3R : raffinement). Egalement, qui dit doses moindres, dit, risques de toxicités moindres pour les animaux. Le potentiel de ciblage thérapeutique et l'innocuité de nos Vecteurs médicaments constituent en soit les principaux objectifs de nos recherches, dont les conséquences, par le bénéfice thérapeutique, peuvent jouer un rôle considérable dans le milieu médical et surtout, à terme, sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours des 2 procédures, nous allons manipuler les animaux en vigile, au cours des administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) et des prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement codal ≤50 µl). Puis, dans un deuxième temps; en post-mortem, pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. -Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou bolus répétés. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. -De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois, sur un temps intermédiare : L'animal sera placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes 20 microlitres de sang. Nb : Seuls les temps longs nécessitent un prélèvement intermédiaire. Par la suite, les prélèvements (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié en post-mortem : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm) environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Les composé VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité avérée. En cas de souffrances, choc, ou effets indésirables en cours de cinétique (les animaux sont quotidiennement suivits et annotés), une procédure spéciale d'euthanasie à forte dose d'anesthésiques est prévue (cf. 5.6.1). Pour notre 2ème procédure, les quantités de LPS administrées sont largement inférieures au quantitiés rapportées comme toxiques voire létales dans la bibliographie et ces tests communs et standardisés restent significativements en dessous de la DL50, de 10mg/kg.
Devenir
A l'issue de la procédure (fin cinétique d'incubation des vecteurs médicaments ou de cinétique d'endotoxémie) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm)
Remplacement
Pour mener à bien notre modèle préclinique, nous envisageons après validation in vitro de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, indispensable pour l’étude de ces mécanismes (3R : remplacement). Actuellement, le modèle murin ne peut pas encore être remplacé par des modélisations prédictives ou autres alternatives de remplacement. Seul le modèle animal mammalien et proche de l'homme permets de prendre en compte les mécanismes physiologiques pour prédire du comportement d'un médicament, d'un modèle thérapeutique et de son efficacité. Dans ce contexte, le modèle murin, ici la souris, reste l'idéal et surtout, le plus facile à mettre en pace pour ce genre de procédures.
Réduction
Procédure : Le nombre d’animaux ou groupe expérimental nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique (Réduction, règle des 3Rs) se fera sur de petits groupes (n=4 à raison de 1200 souris/an en procédure 1 et 240 souris/an en procédure 2), suffisant pour appréhender un effet des conjugués sur les souris. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec.
Raffinement
Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclisée (12h/12h), insonorisée, ventilée, sous température et hygrométrie contrôlée, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage, litières et raffinements (dômes, tunels). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires.
Choix des espèces
Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos VHH ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 1200 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations (Article R. 214-105, code rural et pêche maritime) et cahier des charges.
Formation du personnel et des nouveaux entrants au sein de notre établissement à la mise en œuvre des méthodes de prélèvements sanguins
- Formation professionnelle
Rats : 500
750 animaux non-humains, 250 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil. Chaque animal enchaîne plusieurs techniques de prélèvement sanguin apprises par le personnel, de la queue à la veine sous-maxillaire puis au sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal au cœur ou à l'aorte sous anesthésie. Ce projet ne produit pas de connaissances mais entraîne les expérimentateurs, avec des animaux surnuméraires d'élevages. Le porteur présente cette formation comme un moyen de "participer au bien-être animal" et affirme que le remplacement par un modèle in vitro n'est pas possible.
Objectifs
Ce projet porte sur la formation technique et la formation continue du personnel amené à utiliser les animaux dans les procédures expérimentales, sur l’apprentissage de nouvelles techniques et la mise à niveau des techniciens déjà formés. Les formations utilisant les animaux visent à améliorer les méthodes expérimentales, à assurer la qualité scientifique et à réduire les dommages subis par les animaux. Toutes les techniques réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis avec le vétérinaire seront respectés. Les conditions suivantes devront être respectées : - Les animaux seront en bon état général - Ce sont les animaux non-utilisés dans des procédures (animaux surnuméraires provenant d’élevages non génétiquement modifiés).
Bénéfices attendus
L’expérimentation animale nécessite une maitrise de différentes techniques de prélèvements. Il est important que les expérimentateurs connaissent parfaitement les techniques et puissent effectuer les prélèvements de façon précise et rapide afin d’éviter tout stress et douleur à l’animal. La formation de toutes les personnes concernées par ces processus est cruciale Cette demande de projet est faite pour fournir des informations correctes, complètes, à jour et pertinentes, accompagnée d’instructions adéquates afin de former de la meilleure façon le personnel et donc participer au bien-être animal. Dans cette demande de projet nous détaillerons les différents prélèvements effectués au sein de notre animalerie. Ces procédures seront appliquées lors des séances de formation et enseignées aux utilisateurs de l’animalerie afin de s’assurer de la bonne formation des personnes et donc de s’assurer que les prélèvements seront faits correctement et n’entraineront pas de douleur ou de stress chez l’animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang en respect avec la réglementation animale. Toutes les souris seront intégrées à la procédure 1« prélèvement sanguin au bout de la queue chez la souris et le rat » , procédure légère sans anesthésie, 5 prélèvements à une semaine d'écart. Elles intégreront ensuite la procédure 2« prélèvement sanguin à la veine submandibulaire chez la souris » légère sans anesthésie, 2 prélèvements à une semaine d'intervalle, puis la procédure 3 " prélèvement sanguin au sinus rétro orbital chez la souris et le rat »modérée avec anesthésie, 4 prélèvements avec une semaine d'intervalle puis la procédure 4 « prélèvement sanguin intracardiaque chez la souris et le rat » sans réveil sous anesthésie, 1 prélèvement terminal. Un premier lot de 250 rats intègreront la procédure 2 «prélèvement sanguin à veine submandibulaire chez la souris » , modérée sous anesthésie et ensuite la procédure sans réveil 4 « prélèvement sanguin intracardiaque chez la souris et le rat »sous anesthésie, un deuxième lot de 250 rats intègreront la procédure 1« prélèvement sanguin au bout de la queue chez la souris et le rat » , légère sans anesthésie puis la procédure sans réveil 5 « prélèvement sanguin à l’aorte abdominale chez le rat » sous anesthésie, 1 prélèvement terminal. Les prélèvements décrits dans les procédures 1,2 et 3 sont des prélèvements courts d'environ 30 secondes par prélèvement. Les prélèvements dans les procédures 4 et 5 sont des prélèvements terminaux d'environ 1 minutes.
Impact sur les animaux
Afin de diminuer au maximum tout stress à l’animal, toutes les procédures sans réveil seront faite sous anesthésie générale faite par un une personne formée et validée (enseignant)
Devenir
Les animaux seront utilisés dans une des autres procédures du projet en premier et seront ensuite utilisés dans une des procédures de classe sans réveil du projet.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de former les utilisateurs aux différentes techniques de prélèvements. Le remplacement des animaux par un model in vitro n’est pas possible
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a était réduit au maximum pour qu’un utilisateur puisse maitriser une technique
Raffinement
Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ces formations. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (maximum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies. Toutes les manipulations sont effectuées dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Toutes les manipulations et anesthésies se font dans une pièce dédiée et non pas dans la pièce d’hébergement.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisés dans l’expérimentation animales et sont les deux seules espèces hébergés au sein des animalerie du CSGA Les animaux auront un âge différent selon les procédures effectuées. L’âges des animaux doit varier afin de former les utilisateurs aux manipulations et aux prélèvements sur des animaux de tailles, de poids et de morphologies différentes.
Etude de l’importance relative de Slc44a2 exprimé par les plaquettes et par les neutrophiles dans le processus de thrombose veineuse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 225 d'entre elles et sans réveil pour 150. Les 225 premières subissent une chirurgie de la veine cave sous anesthésie pour provoquer la formation d'un caillot, les 150 autres un prélèvement de sang terminal, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la thrombose veineuse. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance grâce à l'analgésie maintenue tout au long des procédures. Sur le remplacement, il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne répond à l'objectif, sans autre précision.
Objectifs
Les thromboses veineuses représentent la 3ème cause de mort par maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Les thromboses veineuses, incluant les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires ont une incidence de 1/1000. Des stratégies thérapeutiques existent et sont en place afin également de contrôler le risque de récidive chez ces patients. Or, ces traitements ne suffisent pas car malgré ceux-là le taux de mortalité à 1 an est de 20%, et 25 à 50% des survivants auront des séquelles portant gravement atteinte à la mobilité et à la qualité de vie. Un polymorphisme affectant la protéine CTL-2 a été identifié par le laboratoire comme pouvant moduler le risque de thromboses veineuses de 30% chez l’homme. Cette protéine n’a été que peu étudiée, et aucune fonction dans la thrombose n’a été décrite à ce jour. Cette protéine est exprimée à la surface des cellules vasculaires notamment à la surface des neutrophiles et des plaquettes. Or les neutrophiles adhèrent aux sites inflammatoires des parois vasculaires lésées et interviennent dans les étapes précoces de la TV contribuant au recrutement plaquettaire conduisant à l’occlusion des vaisseaux. Les neutrophiles jouent un rôle majeur dans l’inflammation, cependant, les mécanismes par lesquels les neutrophiles exercent leurs fonctions pro-thrombotiques restent encore mal connus. Il semble ainsi essentiel de mieux caractériser les mécanismes impliquant le recrutement et l’activation des neutrophiles à la paroi vasculaire médiés par CTL-2 suite à une stase afin de pouvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les phénomènes inflammatoires et/ou thrombotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser les mécanismes impliqués dans la thrombose veineuse mais aussi dans les maladies thrombo-inflammatoires.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera effectuée sur 225 animaux destinés à la procédure 1 (durée=30 minutes de chirurgie initiale + 6h ou 48h de réveil en fonction des groupes + 10 minutes d'anesthésie pour récupérer le thrombus formé; soit un total de durée de 6 ou 48h +40 minutes). Les 150 animaux destinés à la procédure 2 seront soumis à un prélèvement terminal de sang sous anesthésie générale (durée=15 minutes).
Impact sur les animaux
Pas de souffrances attendue pour les animaux car l’analgésie sera maintenue tout le long des procédures. Nous veillerons au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux issus de la procédure 1 (225) seront sacrifiés après la procédure. Les autres animaux (150) seront soumis à la procédure 2 qui est sans réveil. Nous utiliserons un total de 375 animaux.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de satisfaire l'objectif de remplacement à notre connaissance.
Réduction
Concernant l'objectif de réduction nous avons limité nos travaux aux expériences indispensables pour répondre à notre question scientifique. (avec risque alpha de 5% et une puissance atteinte de 80%).
Raffinement
L’objectif de raffinement a été pris en compte : nous ferons notre possible afin de diminuer les contraintes imposées aux animaux en renforçant leur confort: hébergement avec milieu enrichi (igloo de cages, enrichissement foisonnant à base de frisure de papier, nid végétal à base de fibres courtes de coton), anesthésie et analgésie pour supprimer la douleur et le stress, diminution du stress en séparant animaux lors de l'hébergement et l'expérimentation. Nous avons établi des points-limites, et nous avons prévu de maximiser les données obtenues en mesurant un maximum de paramètres pour chaque animal (i.e: formation d’un thrombus, poids et taille du thrombus, étude
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille facile à manipuler et à reproduire. De plus, les souris sont des mammifères et les données obtenues à partir de cette espèce sont beaucoup plus extrapolables à l’homme et la pathologie humaine que celles obtenues à partir d’espèces évolutivement inférieures. La souche C57Bl/6 a été choisie car les lignées conditionnelles knock-out (KO), et totales KO ont été créées dans cette dernière. De plus les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés chez la souris principalement dans cette souche, par de nombreuses équipes dont la nôtre. Cette étude vient s'inscrire dans la continuité de notre travail sur CTL-2 déjà effectué chez la souris. Les animaux seront âgés de 9 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés car le diamètre de la veine cave doit être de taille similaire à ce qui est habituellement publié dans ce modèle pour pouvoir comparer nos résultats à ceux d’autres équipes. Une souris trop jeune aurait une veine cave inférieure trop petite et le ratio de rétrécissement du diamètre de la veine comparé à son diamètre initial s’y retrouverait ainsi plus important comparé à une souris plus vieille et avec une veine cave plus grosse.
L’optogénétique pour restaurer les fonctions motrices dans un modèle murin de la maladie de Parkinson : validation d’un nouveau dispositif miniaturisé, implantable et autonome.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
628 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit, par chirurgie stéréotaxique, une lésion chimique des neurones dopaminergiques reproduisant la maladie de Parkinson et l'implantation de fibres optiques, d'électrodes et d'un implant miniaturisé, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, activité locomotrice, coordination sur tige tournante et épreuve en milieu aquatique, et reconnaît des déficits moteurs induits par la lésion. Sur le remplacement, il affirme que ces déficits ne peuvent être étudiés ni sur des organismes moins évolués ni in vitro et juge le recours à la souris nécessaire.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester in vivo l’efficacité d’un implant miniaturisé (de quelques μm3) permettant à la fois de moduler par optogénétique l'activité des neurones d’intérêt au niveau des circuits des ganglions de la base, d’enregistrer les activités neuronales et de libérer des nanovolumes de différentes substances (L-DOPA, anti-inflammatoire) chez les souris vigiles sans contention et de valider ses effets bénétifiques sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et à terme permettre de développer un outil technologique innovant pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxie sous anesthésie générale réalisée une seule fois (durée 30-45 min selon le type d’implantation, grade de séverité: modérée) pour induire la lésion unilatérale des neurones dopaminergique et implantater en même temps des fibres optiques, des électrodes d’enregistrement et/ou un implant miniaturisé, suivit, 2) d'un exemen neurologique (series de 6 tests comportmentaux, grade de séverité: légère) ) pour évaluer les effets bénéfiques de la stimulation optogéntique sur les fonctions motrices et motivationnelles (3-5 semaines d’analyses avec 1 à 2 jours séparant deux tests comportmentaux successifs durant 30 sec-30 min en fonction du test), 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.puis 3) une perfusion intracardiaque (5 min) pour effectuer des analyses complémentaires au niveau cellulaire.
Impact sur les animaux
1) Les animaux seront soumis à la lésion des neurones dopaminergique qui induit certains déficits moteurs. La lésion 6-OHDA a été largement caractérisée par la communauté scientifique et induit certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) de la maladie de Parkinson. 2) Une manipulation lors de la connexion des fibres optiques ou des électrodes d’enregistrent. 3) une exposition à des tests comportementaux évaluant les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et motivationnelles. Ces tests impliquent une mesure de l’activité locomotrice exploratoire spontanée dans differents environnements et une évaluation des capacités de coordination motrice sur une tige tournante et dans un milieu aquatique. L’inconfort généré par chacun de ces tests est réduit au minimum en habituant les animaux au préalable et en raccourcissant la durée d’exposition. 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses au niveau cellulaires
Remplacement
Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des ganglions de la base qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche. L'implant prototype doit également être caractérisé chez l’animal vigile avant l’approche chez l’homme.
Réduction
Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 628 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 6 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Cet effectif tient compte de notre expérience de nombreuses années dans ce type d’expérimentation et il est basé sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5%. Cependant, il pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux et du nombre de dispositifs à tester. En effet, au vu de la difficulté technique du projet, nous pourrons être amenés à tester moins de prototypes qu’anticipés. En fonction de leur taille finale, ils pourront être implantés dans d’autres structures telles que le cortex moteur ou le striatum également impliquées dans le contrôle du mouvement. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et permettre à terme de développer une technologie nouvelle pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.
Raffinement
La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Rimadyl dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique (Annexe 1) est mise en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour cela, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.
Choix des espèces
Le modèle de Parkinson chez le rongeur (injections 6-OHDA) est le plus utilisé au niveau international et considéré comme un bon modèle. L’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à la réalisation de notre projet et permet de cibler slectivement des propulations neuronales d'intêret et elucider leurs contributions dans le developpment des déficits moteurs de la maladie de Parkinson. L'ensemble des études est mené sur des animaux adultes à partir de12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et ceux de la litterature.