Souris
Etude in vivo de l’impact de la colonisation des bactéries filamentaires segmentées sur l’activation immunitaire et sur la flore intestinale de l’hôte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent gavages, injections répétées, greffes de moelle osseuse et prélèvements de sang et de fèces, une partie recevant du busulfan qui supprime l'immunité et peut provoquer des hémorragies sévères. Le porteur mène une recherche fondamentale sur des bactéries intestinales et écrit ne prévoir "aucune perte" et juger "négligeable" l'effet de l'hébergement en cage. Il conclut à la nécessité de la souris pour reproduire ces interactions entre hôte et bactéries.
Objectifs
Les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries naturellement présentes dans la flore intestinale de nombreuses espèces dont l’Homme. Ces bactéries sont attachées à la paroi intestinale de manière spécifique à l’espèce hôte. Ces bactéries peuvent entrainer une réponse immunitaire au niveau de l’intestin de leur hôte. Chez la souris, la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées protège l’hôte de certaines bactéries infectieuses. Cette colonisation peut également accentuer la gravité de certaines maladies ayant pour cause un dysfonctionnement du système immunitaire de l’hôte. Pour ces raisons les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries clés à la fois dans l’évolution de la santé et de la maladie. Cependant de nombreux impacts de la colonisation d’un hôte par les bactéries filamentaires segmentées restent à définir. Au cours de notre projet nous tenterons de définir les impacts de la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées sur l’activation de la réponse immunitaire. Nous étudierons également les mécanismes de détection des bactéries filamentaires segmentées par le système immunitaire de l’hôte. Nous évaluerons ensuite l’impact de la colonisation de l’hôte par les bactéries filamentaires segmentées sur l’évolution de la flore intestinale, mais également lors d’infection par des entéropathogènes.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est une meilleure compréhension des premiers évènements survenant pendant la colonisation des bactéries filamentaires segmentées chez l’hôte. De plus, nous comprendrons mieux comment la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées a un impact sur l’évolution de la flore intestinales et la résistance aux infections bactériennes intestinales. Ces connaissances fondamentales constitueront la base d’une application des bactéries filamentaires segmentées dans l’amélioration de la santé intestinale dans le futur.
Procédures
Au cours de notre projet les animaux subiront différentes interventions en fonctions des procédures expérimentales. En ce qui concerne la colonisation et l’inoculation de bactéries, un gavage ponctuel sera réalisé sur 3456 animaux éveillés, 2 gavages ponctuels et distant de 21 jours seront réalisés sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne les traitements par injection, sur une période de 6 jours, 2 injections ponctuelles distantes de 5 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 7 jours, 3 injections ponctuelles distantes de 3 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, 1 injection ponctuelle par jour sera réalisé sur 288 animaux éveillés. Sur une période de 5 jours, 1 injection ponctuelle par jours sera réalisé sur 1728 animaux éveillés. En ce qui concerne la greffe de moelle osseuse, 1 injection ponctuelle sera réalisée sur 1728 animaux sous anesthésie générale. En ce qui concerne le traitement administré par l’eau de boisson, sur une période de 4 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de fèces, sur une période de 5 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les jours sur 1728 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les 2 jours sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de sang, 2 prélèvements sanguin distant de 60 jours seront réalisés par ponction sur 1728 animaux éveillés.
Impact sur les animaux
Durant notre projet certaines procédures entraineront des nuisances et effets secondaires sur les animaux. La procédure de gavage bien que non douloureuse pour l’animal entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation de l’animal. L’inoculation de bactérie aura pour effets indésirables des troubles gastriques sans gravités dus au changement de la flore intestinale. L’injection entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation. Toutes les substances injectées ou administrées à l’animal à l’exception du busulfan n’auront pas d’effets indésirables sur les animaux. Le traitement au busulfan aura comme effets indésirables attendus une suppression des cellules responsables de l’immunité. Nous pourrons observer également comme effets secondaires, des troubles de la nutrition, diarrhée, inflammation au niveau du site d’injection, ainsi que de manière exceptionnelle des hémorragies sévères dues à une diminution du nombre de plaquettes. En ce qui concerne les prélèvements effectués chez l’animal, seul le prélèvement sanguin entrainera une nuisance après le prélèvement. Cette nuisance se caractérisera par une fatigue transitoire après le prélèvement.
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale la totalité des animaux sera mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par la nécessité à la fin de chaque procédure de procéder au prélèvement d’organe tel que la rate, le foie, le ccum, le colon ainsi que les ganglions lymphatiques. Ces organes sont des organes vitaux ce qui exclut pour des raisons éthiques leur prélèvement sur animaux éveillés. Les animaux qui ne seront pas prélevés en raison de leur exclusion d’un lot expérimentale afin de ne pas compromettre les résultats d’une expérience seront également mis à mort par dislocation cervical ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par l’impossibilité de réutiliser, replacer ou adopter ces animaux à la fin de nos procédures expérimentales.
Remplacement
La culture en laboratoire des bactéries filamentaires segmentées reste très difficile et limitée dans le temps. Ceci limite l'utilisation de système artificiel. Les systèmes artificiels seuls ne nous permettrons pas d'atteindre les différents objectifs de recherche décris dans ce projet. Afin de caractériser en détail les interactions complexes entre bactéries filamentaires segmentées et son hôte, nous devons avoir recours à un modèle animal pouvant reproduire ces types d'interactions en laboratoire et ce dans différentes conditions avec des paramètres contrôlés. La souris est la solution que nous avons retenue pour atteindre nos objectifs. La grande variété de modèle disponible pour cet animal et ça similarité anatomique et physiologique avec l'humain en font un modèle adapté pour atteindre les objectifs de notre projet.
Réduction
Dans un principe de réduction nous avons conçu nos expérimentations en réduisant au minimum le nombre de procédure expérimentale. Ainsi chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre spécifiquement un des objectifs précédemment décrits. Nous nous sommes assurés d’exclure toute répétition et de garantir l’obtention de résultats originaux. Pour l’ensemble de nos procédures et afin d’obtenir des résultats significatifs nous avons fixé un niveau de risque suffisamment faible et une puissance élevée afin d’obtenir avec un minimum d’animaux des résultats expérimentaux incontestables. Les animaux seront hébergés en groupe de 5. Nous ne prenons pas en compte l’effet lié à l’hébergement en cage que nous jugeons négligeable durant nos expériences. Lors de la réalisation de nos expérimentations nous ne prévoyons aucune perte. Nous décidons d’utiliser 12 animaux par groupe. Ce nombre nous permettra d’obtenir lors de nos analyses statistiques des résultats significatifs. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu et indépendante de nos protocoles expérimentaux.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les animaux seront hébergés en groupe. Le nombre d’animaux par cage ne pourra être supérieur à 5. En conditions d’hébergement sans microorganisme les animaux seront hébergés dans les mêmes conditions. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par un personnel correctement formé et limité au maximum dans le temps. Afin de diminuer les désagréments et les douleurs lors de certaines expérimentations les animaux seront anesthésiés. Toutes les expérimentations incluant un traitement avec une substance chimique pouvant potentiellement induire des effets secondaires, ont été conçues afin de réduire au maximum la posologie du traitement tout en garantissant l’induction des effets souhaités chez l’animal. Des points limites généraux et spécifiques à chaque procédure, suffisamment prédictifs ont été mis en place. Si aucun moyen efficace n’est disponible afin de supprimer la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal sans compromettre les résultats de nos expériences, l’animal sera mis à mort. Le bien-être animal sera une priorité lors de notre projet de recherche et ce dernier sera régulièrement évalué et optimisé au cours de notre projet.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser cette espèce car elle présente de nombreux avantages pour notre projet d'étude. Cette espèce peut nous fournir un grand nombre de modèle génétique et d'individu dépourvus de flore bactérienne nécessaires pour notre projet. Cette espèce possède également une grande similarité anatomique de son système digestif avec l'Homme. Il en est de même du point de vu immunitaire. Cette espèce est également facile à manipuler en laboratoire ce qui participera de limiter les risques liés aux manipulations expérimentales. L’hébergement séparé des mâles et des femelles est également possible. Des souris mâles et femelles de chaque espèce, âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisées. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris adultes dont le système immunitaire et la flore intestinale sont pleinement développés. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage et l'injection sont plus faciles à réaliser chez les souris adultes, ce qui minimise les douleurs inutiles dues aux manipulations.
Approche régénérative pour restaurer les fonctions après une lésion traumatique du système nerveux : de l’étude fondamentale à l’étude translationnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1170
1 104 souris et 1 170 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, en majorité dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit de une à quatre chirurgies, dont des sections ou contusions de la moelle épinière entraînant une paralysie des pattes postérieures, ou des lésions du nerf sciatique, avant d'être euthanasié pour analyses post-mortem. Le porteur souligne que cette paralysie est chez le rongeur partiellement réversible, à la différence de l'humain. Il affirme que les études sans animaux ne permettent pas d'étudier le contrôle moteur et conclut que trouver une solution thérapeutique est "indispensable".
Objectifs
Les lésions traumatiques (médullaires et crâniennes) et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière chez l’homme induisent en général un handicap sévère et qui peut être permanent. Par leur importante prévalence, ces pathologies ont un fort impact sociétal et économique. Analyser l’évolution de la lésion du système nerveux central et, en parallèle, élucider comment le neurone répond à ces changements constitue un grand défi pour concevoir des stratégies thérapeutiques visant à stimuler la régénération et la réparation du réseau neuronal affecté. Cela s’applique également aux lésions sévères des nerfs périphériques où la régénération axonale est limitée pour atteindre les cibles périphériques appropriées. Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénérescence versus la régénération des fibres nerveuses, avec l'objectif de contribuer à l'élaboration de stratégies de réparation, basée sur l’ingénierie tissulaire. L’utilisation des rongeurs, rat et souris, constitue le modèle animal adapté pour ce projet. Ces modèles inclus les lésions médulaires : la transection bilatérale dorsale ou la contusion, au niveau thoracique qui entraine une paralysie des pattes postérieures, mais qui est suivie d’une récupération partielle. De même, la lésion du nerf sciatique est le modèle de lésion périphérique couramment utilisé. Enfin pour obtenir une preuve de concept de notre stratégie d’ingénierie tissulaire du trauma au niveau du cerveau, le modèle de contusion corticale contrôlée sera adapté. La règle des 3R a été́ considérée tout au long de l'élaboration de ce projet et sera appliquée au quotidien.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est de déterminer quand et comment, après la lésion de la moelle épinière, la combinaison de l'implantation du biomatériau avec les traitements cités montrerait une efficacité. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Grâce aux preuves de concept obtenues au préalable, notre projet de recherche préclinique démontre qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Les animaux sont soumis à 1 à 4 procédures chirurgicales, de durées inférieures à 30 min chacune pour les souris et inférieures à 45 min pour les rats. La durée entre 2 chirurgies soumises à un animal s’étale entre 24h et 8 semaines. Toute procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie. Aucun prélèvement n’est effectué sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Nos procédures sont, pour la plupart, classées sévères. Cependant chez le rongeur, les modèles expérimentaux utilisés, entrainent une paralysie (paraplégie) qui, à la différence de l’homme, est réversible partiellement. Les traitements utilisés ne sont pas nocifs, au contraire, ils améliorent la récupération fonctionnelle. Ils sont biocompatibles et résorbables. Ils pourront aussi être envisager dans le cas de trauma ou dommages du système nerveux des animaux domestiques comme le chien ou le chat. Enfin, la réglementation est strictement respectée et appliquée.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tel que le contrôle moteur latéralisé. D’autre part, le système nerveux traumatique est complexe et évolutif ; l’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études ni de développer des stratégies à visées thérapeutiques pour obtenir des preuves de concepts pour une application translationnelle. Néanmoins, dans notre projet, des études in vitro sont menées en parallèle pour des questions fondamentales de mécanistiques à l’échelle moléculaire ainsi que des tests de criblage sont développés en amont de l’expérimentation animale.
Réduction
Les expériences antérieures nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Ainsi, les analyses comportementales et biochimiques ou anatomiques sont réalisées sur les mêmes animaux, pour des raisons de rigueur d’analyse et pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. A cette fin, les groupes d’animaux sont créés au fur et à mesure, avec les contrôles à l’intérieur de chaque groupe. 2274 animaux seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. outes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie (isofluorane au masque) et analgésique. Les animaux sont regroupés dès le lendemain après chirurgie pour limiter la période d’isolement et un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Ces contrôles, enregistrés et validés par le SBEA local, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’euthanasiant. (ces injections sont réalisées après une brève anesthésie ; induction à l’isoflurane). Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre SBEA et en interagissant avec le vétérinaire référant.
Choix des espèces
Rat et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptés. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez le rat et de nombreux tests sensori-moteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion. Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi la majorité de nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit 30g et 250g respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes. Par ailleurs, dans le cadre du développement d’une stratégie thérapeutique après traumatisme, nous projetons de combiner l’implantation de biomatériaux biocompatibles et biodégradable avec une greffe de cellules : des neurones issus d’embryons à E12-14 de rongeurs et des cellules de Schwann issues de rat adulte. Cette greffe homotypique sera réalisée uniquement chez le rat.
Dépendances génomiques du myélome multiple surexprimant MYC
- Recherche appliquée
- Cancers
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois modèles de myélome leur sont greffés par injection de cellules tumorales, suivie de traitements administrés chaque jour pendant quatre semaines, l'animal étant tué en cas de détresse vitale ou quand la tumeur atteint deux centimètres cubes. Le porteur revendique l'importance de valider ces cibles thérapeutiques "in vivo" pour reconstituer le microenvironnement tumoral. Il affirme que l'utilisation des animaux est "essentielle" pour produire des données précliniques fiables.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence de ces dépendances géniques in vivo. Objectif. Etablir des approches thérapeutiques à partir de modèles précliniques in vivo pour cibler le MM surexprimant MYC. a. Etudier in vivo les stratégies de létalité synthétique dans des modèles murins de xénogreffes de MM surexprimant MYC. b. Etudier in vivo les stratégies thérapeutiques ciblant les dépendances géniques dans le modèle murin transgénique Vk*MYC
Bénéfices attendus
En utilisant le concept de dépendance génomique, nous avons pu prouver l'importance élevée du métabolisme de la glutamine dans les cellules MYC+, que nous étudions en tant que nouvelle stratégie de traitement. Notre travail vise à mettre en évidence la possibilité d'orienter précisément la thérapie vers certains types de cancers grâce à l'identification de leurs vulnérabilités.
Procédures
Trois modèles murins differents seront utilisés: 1-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injectées en intraveineux avec 3.5 millions de cellules des lignées de MM exprimant la luciférase disponibles dans le laboratoire (MM1S luc-GFP). Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 2-Modèle syngénique à partir de souris C57BL/6J injectées en intraveineux avec 3.5 millions des cellules disponibles dans le laboratoire vk*myc, les prises de sang se feront toutes les semaines pour suivre le pic monoclonal. Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 3-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injection sous-cutanée dans le flanc droit de 5millions cellules U266-CT ou U266-MYC dans du Matrigel. Le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains).
Impact sur les animaux
Les toxicités: Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume). CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels des souris sera surveillé pour identifier une éventuelle toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison
Devenir
Les souris sont sacrifiées par inhalation de CO2 pendant 5 minutes, suivi d’une dislocation cervicale. Les souris sont sacrifiées en cas de signe de souffrance ou de détresse vitale et en cas de volume tumorale atteignant 2cm3
Remplacement
L'utilisation des animaux dans cette étude est essentielle afin de valider l'efficacité de thérapies ciblées sur des tumeurs de myélome surexprimant MYC. Cette étape de validation in vivo est déterminante afin de produire des données pré-cliniques fiables, avec la reconstitution du microenvironnement tumoral, y compris du système immunitaire interagissant avec les cellules tumorales. Ces données pourraient permettre de développer par la suite des essais cliniques de phase précoce.
Réduction
A fin de respecter le principe de réduction, les experiences ont été conçues afin de coordoner plusieur paramètres d'analyse à partir d'expériences individuelles et permettent une analyse longitudinale. Cela réduit la nombre total d'animaux requis. De plus, si les premiers résultats obtenus sont statistiquement signifiatifs et suffisamment homogènes, le nombre d'animaux et de répétitions d'expérimentations sera diminue. Des groupes de 7 souris seront étudiés, permettant une puissance de 80% en projetant une différence de 1.5 déviation standard en utilisant un t test avec un risque alpha de 0.05. Chaque groupe sera exposé à des traitements en combinaisons de différents inhibiteurs d’intérêt ou aux inhibiteurs seuls ou à du DMSO
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions standards et auront une période d'acclimatation dans l'animalerie de 7 jours avant toute manipulation. Ils seront manipulés tous les jours avec douceur et calme par du personnel expérimenté. Les signes de souffrances seront activement recherchés. Lors des procédures (injections IP, SC ou mesure du volume tumoral), les souris seront maintenus sous anesthésie par inhalation d'isoflurane (2% d'isoflurane) afin de les maintenir immobile et d'empêcher l'angoisse des animaux. Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume) et CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels seront surveillés pour l’indication de toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison.
Choix des espèces
Les modèles murins sont adaptés aux lignées cellulaires utilisées dans le myélome multiple et permettant de générer les données in vitro. Deux modèles sont utilisés dans ce projet, un modèle de xénogreffe à partir des souris génétiquement modifiées SCID, injectées avec les lignées cellulaires MM.1S luc/GFP et U266. Ces deux lignées cellulaires sont des lignées de référence dans le myélome multiple. Afin de valider les données du modèle de xénogreffe, un modèle syngénique sera utilisé avec des souris BL6 injectées avec la lignée cellulaire murine Vk*MYC. Ce modèle permet une analyse de l’efficacité des thérapeutiques dans un contexte immunocompétent, plus représentatif des conditions biologiques humaines. La pertinence de ces modèles de xénogreffe et syngénique a été démontré dans de nombreuses études pré-cliniques, ce qui en fait le modèle de choix des analyses in vivo. Les souris SCID et C57BL/6J seront injectées entre 6 et 8 semaines d'âge, ce qui coorespond au modèles les plus fréquemments utilisés dans la litérature.
Etude par télémétrie des adaptations musculaires chez un modèle animal de simulation de la microgravité
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées comme impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie un capteur enregistrant l'activité musculaire, puis sont maintenues trente jours dans un dispositif simulant l'absence de gravité par suspension, avant d'être tuées par injection létale. Le porteur présente ce modèle comme "indispensable" pour préparer les vols spatiaux vers Mars et le décrit comme maîtrisé depuis vingt-cinq ans. Il minimise les atteintes, évoquant une perte de poids inférieure à 15 % et une "angoisse modérée de courte durée", alors que la procédure est elle-même déclarée sévère.
Objectifs
L'envoi d'animaux dans les véhicules spatiaux est indispensable pour mieux comprendre les effets de l'absence de gravité sur l'organisme. Cette connaissance est le préalable obligatoire à un voyage de plusieurs années sur Mars. Afin de bien préparer ces vols spatiaux, nous utilisons un modèle animal mimant les effets de l'absence de gravité (Hypodynamie-hypokinésie ou HH).
Bénéfices attendus
Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude du système musculaire squelettique et ses altérations lors de situations de dysfonctionnement ou de non-utilisation. Parmi les critères permettant de déceler les altérations musculaires, l’étude de l’activité électromyographique (EMG) peut fournir des indications précieuses sur le bon fonctionnement ou non du muscle squelettique. Notre projet consiste à affiner une technique d’enregistrement de l’EMG par télémétrie chez la souris en condition de non-utilisation (HH) .
Procédures
Les animaux seront équipés par voie chirurgicale d'un capteur télémétrique permettant d'enregistrer l'électromyogramme, caractéristique de l'activité électrique musculaire. La méthode télémétrique permettra d’enregistrer en continu (pendant 30 jours) à la fois l'électromyogramme et la température chez un animal vigile, non contraint et dans son environnement habituel. Après l’implantation des capteurs (opération d’1h maximum, anesthésie comprise) et le suivi post-opératoire (d'une durée de 24h), les animaux ne sont plus soumis à aucune manœuvre susceptible d’induire de la souffrance ou de la douleur.
Impact sur les animaux
Seule la procédure de simulation de microgravité peut engendrer quelques nuisances. Cette procédure est appliquée depuis 25 ans dans notre laboratoire et elle est bien maîtrisée. Nous surveillons chaque jour la prise alimentaire et la prise de boisson pendant les 30 jours de la procédure. Les souris sont pesées tous les 2 jours en début de procédure puis tous les 3 jours pendant la suite de restriction sensorimotrice. On observe une perte de poids les 2-3 premiers jours du fait d’une angoisse modérée de courte durée, mais elle est
Devenir
Les animaux du lot "contrôles" et HH seront euthanasiés en fin de protocole (après 40 jours d'enregistrement) par injection létale de produit anesthésiant (doléthal, ip, 180 mg.kg-1) par voie intrapéritonéale.
Remplacement
il s'agit d'un projet portant sur l'inactivté physique et ses effets sur les propriétés éléctriques musculaires. Un tel projet ne peut etre mené avec des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
l'ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l'accomplissement de ces études requiert un nombre total de 80 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention derésultats satisfaisants (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles).
Raffinement
dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales seront réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites.
Choix des espèces
Ces travaux viennent en prolongement d’études réalisées depuis plusieurs années au laboratoire. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les études antérieures, il est important de conserver la même espèce animale, à savoir la souris. La souche mutante choisie, la C57BL/6J, est un modèle polyvalent utilisé dans de nombreux domaines d’application. Les fournisseurs standardisent l’élevage de cette souche en conformité avec les procédures d’élevage et le programme de qualité génétique de The Jackson Laboratory, ce qui nous permet de travailler avec les mêmes animaux que nos collègues russes qui organisent le vol spatial. Arrivée des animaux à l’animalerie à 8 semaines. Après 1 semaine d’acclimatation, les implantations auront lieu à 9 semaines d’âge, ce qui constitue un état stable mature de développement (âge adulte).
VaccinoLIV : Étude de l’immunogénicité et de l’efficacité chez la souris de candidats vaccins recombinants
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Toutes tuées à la fin de chaque procédure, 3 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer des candidats vaccins et des virus de la rougeole modifiés contre le cancer. Une partie est infectée par des virus humains ou par le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei, une infection qui peut entraîner selon le porteur fièvre, prostration, perte de poids et paralysie, avec une mise à mort dès le score 2 de sa grille de douleur. D'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et des injections de vaccins une à deux fois par semaine pendant dix semaines au plus. Pour la virothérapie des cancers, le porteur invoque un "besoin médical" et un "marché" qu'il dit "également immenses".
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.
Procédures
Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.
Impact sur les animaux
Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).
Raffinement
Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.
Rôle de DYRK1A dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour préciser le lien entre la protéine DYRK1A et les lésions de la maladie d'Alzheimer, 240 souris issues de croisements entre des lignées qui développent des lésions amyloïdes ou tau et des lignées portant une ou trois copies du gène Dyrk1a vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sans anesthésie cinq prises de sang à la veine sous la mâchoire, de 2 à 6 mois, puis un labyrinthe en Y, un test de reconnaissance d'un nouvel objet et la piscine de Morris, où elle doit retrouver à la nage une plateforme immergée. Toutes sont tuées à 6 mois, 128 pour l'extraction du cerveau et 112 par perfusion cardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie. Le porteur affirme que la souris est tenue pendant la prise de sang "sans que l'animal n'exprime ou montre des signes de détresse", et cite un risque d'hémorragie dans la bouche et d'hématome au visage.
Objectifs
Les personnes atteintes du syndrome de Down présentent des niveaux accrus de DYRK1A dans le tissu cérébral et de plasma. Une expression accrue des transcrits DYRK1A a été signalée dans des échantillons d'hippocampe provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, bien que les niveaux de protéine DYRK1A dans des homogénats de cortex frontal se soient avérés similaires entre les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et les témoins. Récemment, il a été demontré que les personnes âgées souffrant de troubles de la mémoire et présentant une imagerie amyloïde positive présentaient des taux plasmatiques de DYRK1A plus faibles que celles présentant une imagerie amyloïde négative. En outre, il a éte également observé que les adultes âgés cognitivement normaux et sans dépôts amyloïdes présentaient des niveaux plasmatiques de DYRK1A plus élevés que les individus plus jeunes, ce qui pourrait suggérer que l'augmentation de DYRK1A associée à l’âge protègerait de la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous cherchons à préciser le lien entre les niveaux cérébraux et plasmatiques de DYRK1A et les deux neuropathologies de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à mieux comprendre le rôle de la surexpression/downregulation de DYRK1A dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer, en particulier les pathologies amyloïdes et tau. Ce projet contribuera également à une meilleure compréhension de l'apparition précoce de la neuropathologie de la maladie d'Alzheimer chez les personnes atteintes du syndrome de Down, étant donné que le gène codant pour la DYRK1A est situé sur le chromosome 21 et qu'il est donc surexprimé dans cette population. L'étude de biomarqueurs plasmatiques capables d'identifier les individus à haut risque pour la maladie d'Alzheimer de manière rapide et efficace permettrait d'initier un traitement pré-symptomatique de cette maladie, en particulier dans les populations à haut risque. Enfin, les efforts visant à élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies amyloïdes et tau pourraient également ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques visant à modifier le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront effectué at 2, 3, 4, 5, 6 mois sur chacune des 240 souris (5 échantillons/animal; 1 échantillon/mois; durée de la procédure: 2 à 3 minutes). Nous prélèverons le sang dans la veine submandibulaire, un procédé rapide, simple et reconnu, qui permet aux chercheurs de prélever rapidement 0,2 à 0,3 ml de sang sans recourir à l'anesthésie. Ensuite, les souris effectueront des tests comportementaux: Y maze, reconnaissance de nouvel objet et piscine aquatique de Morris. Le labyrinthe Y est basé sur une session de 8 minutes. La reconnaissance d'objets nouveaux est basée sur quatre sessions : deux sessions d'habituation, une session de familiarisation et une session de test. Chaque session a une durée de 10 minutes. Le test du labyrinthe aquatique de Morris est basé sur des épreuves d'apprentissage qui se dérouleront sur 5 jours, à raison de 4 épreuves par jour (intervalle inter-épreuves : 60 min), et d'un "test de sonde" le 7ème jour (48 h après le dernier jour d'entraînement). Pendant les essais d'apprentissage, l'animal doit localiser une plate-forme cachée immergée sous la surface de l'eau en 90 secondes. Pendant le “probe test”, les souris sont autorisées à nager librement pendant 60 secondes. Les souris auront une semaine de repos entre les tests afin de réduire les effets de transfert des tests précédents. Chaque souris sera testée pour tous les paradigmes comportementaux, et l'ordre des tests sera le même pour chaque souris. Chaque souris effectuera chaque test une fois. A l'issue de ces tests, 128 souris seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin d'extraire les cerveaux pour les analyses biochimiques (durée de la procédure: 3 à 5 minutes pour chaque souris). Les 112 souris restantes recevront une perfusion cardiaque de parafolmaldéhyde afin d'éliminer le sang du cerveau pour les études immunohistochimiques (durée de la procédure: 10 à 15 minutes pour chaque souris).
Impact sur les animaux
Pendant le prélèvement de l’échantillon de sang (étape 1), l'animal est retenu avec précaution par la peau du cou et du dos afin d'immobiliser la tête, sans que l'animal n’exprime ou montre des signes de détresse. Les personnes effectuant les prélèvements de sang sont familiarisées avec la technique de prélèvement. Le sang s'écoule rapidement après la ponction, et une fois la contention de la souris relâchée, le saignement s'arrête rapidement. Une ponction trop profonde peut entraîner la pénétration du sang dans la cavité buccale et un risque d'hémorragie. Un hématome sur le côté du visage peut se produire occasionnellement. Les souris seront observées pendant 30 minutes après le prélèvement de sang pour vérifier leur comportement normal et leur hémostase. Les tests comportementaux (étape 2) sont basés sur les comportements spontanés de l’animal avec une procédure graduelle d’habituation-familiarisation aux dispositifs de test. Pour limiter le stress durant les tests, les souris seront habituées à l’expérimentateur/la manipulation et seront transférées de leur cage à la salle de comportement au moins une heure avant le test. En général, les tests comportementaux utilisés dans ce projet peuvent causer un stress léger. Pour tous les tests, on prendra soin de placer et de retirer délicatement l'animal de l'appareil de test et, entre les animaux, l'appareil sera nettoyé des débris. Pour les tests dans l'eau (Labyrinthe aquatique de Morris), les souris sont surveillées en permanence pendant qu'elles sont dans l'eau, et à la fin du test, les souris sont essayer avec un torchon et placé dans une cage avec un autre torchon avant de les remettre dans leur cage d'origine. Enfin, le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (perte de poids, pelade, agressivité, prostration, agitation, les petits yeux, les oreilles en arrière, etc). La perfusion transcardiaque (étape 3) de souris est une procédure définitive. Cette procédure se déroule avec un animal complètement anesthésié (vérifier l’absence de réflexe de retrait et palpébral). Si l'animal réagit à la coupe pendant la procédure chirurgicale, un anesthésique supplémentaire sera administré immédiatement.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées (euthanasie réglementaire ou perfusion transcardiaque de souris) pour prélever le cerveau afin d’étudier les lésions de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau).
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de maladie d'Alzheimer et aux croisements avec des souris surexprimant ou sous exprimant DYRK1A, pour atteindre les objectifs du projet: analyses de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau) ainsi que des déficits d'apprentissage et de mémoire.
Réduction
Réduction: le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées, notamment des études du laboratoire. Des groupes de 10 à 12 souris seront nécessaires afin d’atteindre un poiuvoir statistique suffisant permettant de détecter des variations significatives dans les données comportementales. Nous utiliserons sur 3 ans un total de 240 souris.
Raffinement
Raffinement: les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec le comité de bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris APP23 sont un modèle de maladie d'Alzheimer développant une pathologie amyloïde étendue. Les souris PS19 sont un modèle de tauopathie, qui développent des enchevêtrements neurofibrillaires, une perte neuronale et une atrophie cérébrale caractéristiques de la pathologie tau retrouvée dans la maladie d'Alzheimer. Ces deux modèles murins de la maladie d'Alzheimer présentent des déficits cognitifs. Le modèle de souris mBACtgDyrk1a porte trois copies du gène Dyrk1a de la souris comme dans la trisomie 21, alors que les souris DYRK1A+/- KO portent une seule copie de ce gène. Dans ce projet, nous analyserons les effets de la surexpression du gène Dyrk1a, ainsi que sa sous-expression sur les pathologies amyloïde et tau en croisant ces différentes lignées de souris. Des échantillons de sang seront prélevés sur des souris adultes âgées de 2 à 6 mois afin de détecter différents biomarqueurs. Les performances cognitives seront évaluées à l'âge de 4 mois, et des tissus cérébraux seront prélevés sur les souris à l'âge de 6 mois.
Etude sur modèle murin du rôle des streptocoques dans la prévention des pneumonies à bacilles à Gram négatif (BGN)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
2 907 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des bactéries par voie intratrachéale sous anesthésie, par voie intranasale et par gavage, puis sont euthanasiées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique une perte de poids transitoire et modérée après l'infection respiratoire. Il affirme que les paramètres étudiés ne peuvent aujourd'hui être "remplacés par des procédures in vitro" et que le recours au modèle animal est "indispensable".
Objectifs
Les BGN comme Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa sont fréquemment responsables de pneumopathies en Réanimation et l’évolution très préoccupante des résistances aux antibiotiques chez ces bactéries complique la prise en charge de ces infections.Elles peuvent conduire à des situations d'impasse thérapeutique, rendant nécessaire le développement de nouveaux traitements curatifs et/ou préventifs. La présence de certaines espèces au niveau pulmonaire (streptocoques, bactéries anaérobies) pourrait avoir un effet protecteur contre le développement de pneumopathies, mais les interférences entre cet écosystème et les bactéries pathogènes ont été peu explorées et les effets de ce microbiote sur la muqueuse pulmonaire et les défenses immunitaires locales ne sont pas encore bien compris. Notre projet vise à étudier dans un modèle murin, les effets de streptocoques oraux commensaux (S. mitis, S. oralis, S. salivarius) sur la muqueuse pulmonaire et les populations cellulaires résidentes, et à analyser les conséquences d’une colonisation pulmonaire par streptocoque sur l’implantation/infection secondaire àBGN.
Bénéfices attendus
Notre travail devrait permettre de décrire les effets de streptocoques oraux sur la muqueuse pulmonaire, l’immunité locale, et la prolifération pulmonaire de BGN pathogènes. De récentes études cliniques rapportent que l'administration de probiotiques (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus) chez des patients de réanimation, serait associée à une diminution du risque de pneumopathie. Cependant, les niveaux de preuve actuels ne permettent aucune recommandation. Le travail que nous proposons devrait fournir un rationnel pour leur utilisation ou non.
Procédures
Tous les animaux (mis à part les controles) seront soumis à une administration intra-trachéale de streptocoques en probiotique ou de PBS sous anesthésie générale par inhalation en continu d’isoflurane (3% débit de gaz frais0.8L/min). Le geste de l’injection intratrachéale, en tant que tel, dure au maximum 1 minute et le réveil est presque instantané Procédures 2, 3 et 4 : Tous les animaux de ces procédures (sauf les animaux contrôles) recevont une ou plusieurs adminitrations de supsensions bactériennes ou de PBS par voies intra-nasale et orale (gavage). Ces gestes durent quelques minutes et sont réalisés sur animaux vigiles. Procédure 4 : Tous les animaux de cette procédure (sauf les animaux contrôles) recevont une 2eme adminitration de supsensions bactériennes ou de PBS par voie intra-trachéale sous anesthésie. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections SC de 30µl de buprénorphine (0.05 – 1 mg/kg) pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Les modèles d’inflammation respiratoires aigues (partie 3) sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne en IT, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, les effets indésirables suivants : Poils hérissés et perte de poids.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Lesvariables seront considérées comme non-paramétriques. Elles seront exprimées en médiane et comparéesen utilisant le test de Mann-Whitney. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages enrichies en frisottis, de taille suffisante et dont la litière est changée une fois par semaine. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place (annexe 2). Les procédures sont de courtes durées et n’entrainent pas de douleur résiduelle. Pour chaque procédure nécessitant une anesthésie générale, le réveil complet des souris s’effectue en cage sous surveillance jusqu’à reprise d’un comportement normal. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) afin d’anesthésier localement la trachée.
Choix des espèces
Les modèles murins de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Potentiel vaccinal de souches de virus du Nil Occidental atténuées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections de virus, une souche atténuée candidate au vaccin puis la souche pathogène, et subit jusqu'à sept prises de sang. Le porteur indique que l'infection par le virus du Nil occidental peut provoquer paralysie, prostration, dos voûté et perte de poids d'au moins 20 %, l'animal étant tué dès l'apparition d'un signe sévère. Il affirme que l'étude d'une réponse protectrice "ne peut être effectuée qu'in vivo".
Objectifs
Le virus du Nil Occidental (West Nile Virus) est un flavivirus pouvant conduire à des cas sévères d’encéphalite virale (dans 1 infection sur 150 environ chez l’homme). Cela pouvant conduire à la mort de la personne infectée. Il n’existe à ce jour que des traitements symptomatiques et il n’existe aucun vaccin efficace chez l’homme. La mise en place d’un vaccin atténué contre le WNV est donc d’intérêt clinique. Nous avons décrit dans les dernières années différentes mutations permettant d’atténuer le virus WNV. Ainsi des mutations dans la protéine de membrane réduisent significativement la production virale par rétention réticulaire. De plus une mutation dans la protéine d’enveloppe abrogeant la glycosylation de la protéine E conduit également à une souche atténuée. Cependant ces virus ne sont pas complètement atténués, et la probabilité de réversion est théoriquement importante. Notre objectif est de générer un virus vivant atténué comportant simultanément plusieurs des mutations décrites, et tester la capacité de ce virus à répliquer, et à éliciter une réponse immunitaire protectrice contre une infection d’épreuve. En un premier temps, nous testerons l’atténuation du virus in-vivo, i.e. l’absence de symptômes sévères et l’absence de mortalité. Nous confirmerons que chez l’animal aucun virus révertant n’émerge (i.e. les mutations sont maintenues). Enfin nous testerons l’efficacité de ce virus à induire une protection contre une infection secondaire par le virus WNV sauvage (challenge).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier un triple mutant du virus WNV (1 mutations dans la protéine E, deux mutations dans la protéine M) qui pourrait constituer un virus atténué, sûr et au potentiel vaccinal. Les 3 mutations étudiées dans ce projet ont déjà été décrites indépendamment dans la littérature mais mis en évidence une atténuation partielle ou pourraient muter et redevenir pathogène.
Procédures
Chaque animal sera soumis à deux injections de virus (souche vaccinale puis souche pathogène ; quelques minutes par injections), et à 7 prises de sang au maximum (alternance veine caudale et rétro-mandibulaire ; quelques minutes par prise de sans).
Impact sur les animaux
Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort.
Devenir
Les souris ont reçu du virus et un traitement potentiellement vaccinal, elles ne peuvent donc ni être réutilisées ni replacées ni adoptées, et sont donc mises à mort.
Remplacement
L’étude de la capacité d’un virus atténué à induire une réponse protectrice ne peut être effectuée qu’in vivo. Nous aurons au préalable confirmé que le virus est capable de réplication efficace et incapable de réverter in vitro. Le modèle souris (Balb/c) est un modèle précédemment utilisé pour les essais vaccinaux précliniques contre les infections à WNV.
Réduction
Nous commencerons par une expérience préliminaire sur 18 souris femelles, qui permettra de valider le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences suivantes pour atteindre la significativité. Les groupes contrôles pour lesquels on connait bien la mortalité en réponse au virus WT, est nécessaire pour tester l’inoculum viral ; nous aurons dans ce groupe 3 animaux. Les expériences ne seront réalisées sur les mâles que si les résultats sont concluants chez les femelles. Nous commencerons par travailler chez les femelles car elles sont plus faciles à gérer. Bien que des différentes immunologiques entre mâles et femelles peuvent être décrits dans certains, cas, il n’y a eu aucune différence observée au cours les études antérieures.
Raffinement
Les souris seront suivies 3 fois par semaine (quotidiennement à partir de J7 post challenge). Pour réduire les risques de souffrance inutile, les animaux seront mis à mort selon les critères de suivi. Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort. En cas de problèmes de motricité, la nourriture et du gel d’hydratation seront déposés directement dans cage. En cas de symptômes légers, davantage de coton dentaire sera ajouté.
Choix des espèces
La souris Balb/c est un modèle à la fois simple et bien décrit de mammifère pour évaluer la capacité vaccinale de virus atténués WNV. S’ils sont positifs, les résultats chez la souris constitueront une première preuve de l‘efficacité vaccinale de ce virus atténué, permettant alors d’envisager la conduite d'autres essais précliniques. En règle générale, les jeunes animaux sont plus sensibles aux Flavivirus neurotropes et sont donc préférentiellement utilisés. Nous utiliserons dans cette étude des animaux âgés de 3 à 4 semaines, afin que les souris soient âgées de 8 à 9 semaines au moment de l’épreuve.
Elevage de lignée transgénique pour la protéine Tau à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 étant transférées vers un autre établissement et 150 reproducteurs tués pour prélèvement du cerveau. La lignée porte un phénotype décrit comme "dommageable", une paralysie progressive des membres postérieurs que les animaux développent à partir de cinq mois et demi. Le porteur précise qu'il faut maintenir ces souris en vie jusqu'à un stade avancé de paralysie, en les aidant alors à s'alimenter et à s'hydrater, car c'est à ce stade que la pathologie visée s'étend dans le cerveau. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que l'étude in vivo est "indispensable".
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage de souris transgénique avec phénotypage dommageable dans le but de générer des animaux nécessaires pour répondre à des questions scientifiques avec des enjeux de santé public majeurs. Pour mener à bien notre projet de recherche, nous aurons recours à des souris transgéniques pour la protéine Tau humaine qui présentent l’avantage d’être un modèle robuste d’induction et de propagation de la tauopathie. Les avancées de notre projet scientifiques, de par l'utilisation de ces animaux à phénotype dommageable, permettront de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie d'Alzheimer aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cet élevage a pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à nos deux projets de recherche tout en surveillant l'apparition du phénotype dommageable et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.
Procédures
Il s'agit d'un élevage de souris à phénotype dommageable. 450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par CO2, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C afin d'être analysés pour les besoins des projets de recherche.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable attendu sera une paralysie des membres inférieurs qui sera détectable cliniquement à partir de 22 semaines d’âge (5,5 mois) chez les souris homozygotes et entre 9 et 12 mois d’âge (36-48 semaines) pour les souris hétérozygotes. Les premiers signes de développement de la paralysie observables seront une perte d’équilibre lors de la marche et un affinement progressif du bas du corps. Les animaux à ce stade peuvent encore se déplacer et se dresser sur les pattes arrières pour accéder aux croquettes et à l’eau de boisson. Il faut bien suivre le développement de la paralysie à partir de ce stade. Il va progresser vers un stade avancé en un mois pour les souris homozygotes et en 2-3 mois pour les hétérozygotes. A ce moment-là il faudra aider ces animaux à s’alimenter et à s’hydrater en leur mettant à disposition des croquettes en poudre mouillées et en ajoutant de l’eau gélifiée. Pour les besoins des différents projets nous devons garder les animaux en vie jusqu’à un stade avancé de paralysie car c’est à ce moment que la pathologie de Tau s’étend dans l’hippocampe, région de grand intérêt pour notre recherche.
Devenir
450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par une méthode réglementaire, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l'euthanasie de ces animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre projet les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.
Réduction
Nous utiliserons 600 animaux, nombre minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif afin de pouvoir aboutir à des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des travaux. Le nombre d'animaux a été établi grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées. Nous avons défini un ensemble de points limites pour la procédure d’élevage. De plus, un programme d’enrichissement sera appliqué en ajoutant dans la cage, une petite maison en carton et de matériel pour la nidification (coton compacté).
Choix des espèces
Nous aurons recours à une lignée de souris transgénique pour la protéine Tau qui représente un modèle de tauopathie robuste et fiable car la cinétique de développement de la tauopathie est prédictible. Les animaux seront utilisés à des stades adultes (à partir de 6 semaines) leur permettant de pouvoir être mis en accouplement.
Mécanismes, traitements et conséquences à long terme des atteintes rénales aigües
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
3 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée par ischémie-reperfusion ou par injection d'agents néphrotoxiques, avec un taux de mortalité de 20 à 30 % lié à cette induction, puis des traitements sont testés pour bloquer la fibrose du rein. Le porteur affirme que cette pathologie complexe est "impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés". Il indique retenir la souris comme celle "la moins susceptible de ressentir de la douleur", formulation générique accompagnant le choix de l'espèce.
Objectifs
Etudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’insuffisance rénale aiguë (IRA) induite par des agents néphro-toxiques et sa progression vers l’insuffisance rénale chronique.
Bénéfices attendus
Meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d'une agression rénale aigue et recheche d'acteurs potentiels dans la mise en place de fibrose rénale.
Procédures
L'IRA sera induite par ischémie-reperfusion ou injection d'agents néphrotoxiques (glycérol ou PHZ). Après caractérisation des modèles, les souris seront exposées à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la fibrose rénale. Avant leur sacrifice, les animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale (diurèse, débit de filtration glomérulaire). Des prélèvements de quelques gouttes de sang au niveau de l'artère caudale (volume inférieur à 50µl) pourront être effectués à H6 (Rhabdomyolyse) et J2 après l'induction d'IRA pour évaluer la fonction rénale.
Impact sur les animaux
Procédure #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #2: stress transitoire lié à l'injection du glycerol, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #3: apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #4: léger stress transitoire lié à l'irradiation Procédure #5: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Procédure #6: léger stress transitoire lié aux cages métaboliques
Devenir
Procédures #1, #2 et #3 : gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 5 à 7. Procédure #4 : gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 1 à 3 puis 5 à 7.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés. (ex : cultures cellulaires).
Réduction
Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à l'induction d'IRA (ischémie reperfusion ou l'injection d'agents nephrotoxiques (glycerol ou PHZ)), 5-6 animaux par groupe avec 3 à 4 protocoles seront suffisants. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. adultes de 8-20 semaines
Validation de la spectroscopie ultrasonore quantitative comme technique d’imagerie non invasive des tumeurs solides chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales osseuses ou cartilagineuses, puis des séances d'échographie sous anesthésie, avant d'être tuées même si aucune tumeur ne s'est développée. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur osseuse implantée près du tibia peut être douloureuse et provoquer un boitement, et que la tumeur cartilagineuse sous-cutanée peut s'ulcérer. Il affirme qu'après des essais in vitro il est "indispensable" de tester la méthode d'imagerie chez l'animal pour l'amener en clinique.
Objectifs
Le projet a pour objectif de valider une nouvelle technique d’imagerie la spectrosocpie ultrasonore quantitative. Actuellement, la caractérisation du type et du grade d’une tumeur passe par la biopsie. Cet examen, est cependant invasif, local et une source de stress pour le patient. Il y a donc un besoin de développer de nouvelles techniques de caractérisation non-invasives, globales et rapides du cancer afin de déterminer à la fois la nature d’une tumeur et le type de cancer. Les tumeurs présentent des différences dans leurs microstructures tissulaire et vasculaire avec les tissus sains et entre elles : différences de propriétés mécaniques à l’échelle cellulaire, différences morphologiques , et structurelles (répartition plus compacte ou désordonnée des cellules) Des biomarqueurs de la microstructure tissulaire peuvent être évalués par ultrasons par la technique de spectroscopie ultrasonore quantitative. Ce projet a donc pour premier objectif d’évaluer la spectroscopie ultrasonore pour la caractérisation de tumeurs solides
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo dans des modèles mimant des évolutions cliniques de tumeurs osseuses, une méthode de détection et de suivi des tumeurs non invasive. Cette validation permettra de poursuivre le développement de cette imagerie et servira à l'amener vers les étapes de validations cliniques pour bénéficier aux patients.
Procédures
Les animaux vont tous etre soumis à une implantation de cellulles tumorales soit en position sous cutanée soit en position paratibiale. Cette implantation se fait par injection des cellules et est réalisée une fois en début de procédures, les animaux étant maintenus sous anesthésie gazeuse (5 min) et ayant reçu de la buprénorphine en préopératoire dans le cas des injections paratibiales. En fin de procédure, les animaux vont etre soumis à 2 examens d'imagerie: échographie et spectroscopie ultrasonore quantitative. Ces deux examens sont réalisés de manière consécutive les animaux étant sous anesthésie (20 et 2 min, respectivement).
Impact sur les animaux
L'ostéosarcome est une tumeur osseuse ; le modèle utilisé est implanté en position paratibiale (entre l'os et le muscle). De ce fait la croissance tumorale peut être douloureuse. Le boitement peut survenir ce qui est surveillée et est un des points limites. En cas de boitement douleureux, de la buprénorphine pourra être administrée (0,05mg/kg). A noter que nous choisissons la buprénorphine comme analgésique car le carprofène est un antiinflammatoire non stéroïdien qui peut influencer l’environnement inflammatoire des tumeurs osseuses. Le chondrosarcome est une tumeur cartilagineuse ; le modèle utilisé est implanté en position sous cutanée. C’est une tumeur de progression lente qui du fait de sa position d’implantation pourrait ulcérer. Ce point est particulièrement surveillé et est d’ailleurs un point limite.
Devenir
A l'issue de chaque procédure tous les animaux, même ceux n'ayant pas développé de tumeur à J25 ou atteints de point limite, seront mis à mort.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées sur des culots cellulaires et des sphéroides et ont montré l’intérêt de la spectroscopie ultrasonore quantitative pour détecter les différences dans les structures cellulaires (zones de nécrose par exemple). Cette approche in vitro a permis de remplacer des études in vivo. Maintenant afin de pouvoir valider la spectroscpie ultrasonore quantitative et de l’emmener en clinique il est indispensable de tester cette méthode d’imagerie dans des modèles animaux mimant la clinique humaine.
Réduction
Des études in vitro préliminaires ont été réalisés et ont déjà permis de repousser le passage chez l’animal et de réduire le nombre d’animaux à inclure. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum mais dans des mesures satisfaisantes pour pouvoir conclure sur l’efficacité de la spectroscopie ultrasonore quantitative pour détecter, caractériser les tumeurs musculosquelettiques et leurs changements en réponse à des thérapies.
Raffinement
Tout au court de ce projet, les précautions seront prises pour ne pas stresser l’animal. En cas de douleurs, les médicaments contre la douleur seront administrés par la voie intra-péritonéale ou intra-veineuse. L'administration des médicaments et de l'anesthésie pendant l'epxérimentation est effectuée seulement par un personnel formé à ces actes. A note que ce cas de figure ne s'est jamais présenté dans nos précédentes expérimentations. De l'enrichissement est ajouté dans les cages (nids, croquettes déposée dans la cage en cas de difficulté d'accès à la grille de croquettes).
Choix des espèces
Parmis les modèles d'ostéosarcome, le plus représentatif est un modèle murin obtenu par greffe de cellules aussi murines chez des souris immunocompétentes. L’évolution de ce modèle et sa réponse à des thérapies conventionnelles sont bien connues au niveau macroscopique et histologique. Ce modèle a déjà servi dans des études d’évaluation de thérapies et d’imageries. De part toutes ces caractéristiques et connaissances, il se prête donc parfaitement à une validation de technique d’imagerie nouvelle. Quant au chondrosarcome, peu de modèles sont disponibles. Pour des études d’imagerie, le modèle obtenu par greffe sous cutanée de cellules humaines sur des souris immunodéprimées est bien caractérisé et permettra d’avoir un accès facile à la tumeur pour assurer son suivi et réaliser la prouve de concept de l’utilisation de la spectroscopie ultrasonore quantitative. Cette technique serait utilisée pour le suivi de ces tumeurs cartilagineuses pour lesquelles aucune méthode d’imagerie ne permet à l’heure actuelle un suivi optimal.
Imagerie de l’activité neuronale chez des souris en mouvement libre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois chirurgies puis une dizaine de séances où il porte un microscope miniature fixé sur la tête pendant qu'il se déplace, avant d'être tué par perfusion intracardiaque pour analyse du cerveau. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des lésions osseuses et tissulaires pouvant s'accompagner de douleur, de perte de poids et d'immobilité, et que le port du dispositif peut d'abord induire un stress. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car il s'agit d'un système intégré "non modélisable".
Objectifs
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. À cette fin, nous utiliserons des microscopes miniatures pour visualiser l'activité neuronale d'animaux au comportement libre. (1) Notre objectif est de comprendre la structure dynamique du réseau de neurones d'orientation spatiale et comment il est influencé par les stimuli visuels. L'activité des populations de cellules sera enregistrée pendant que les animaux marchent librement dans une arène ronde avec des repères visuels proéminents. Pour examiner comment l'entrée visuelle régit le circuit neuronal de direction de la tête, nous allons faire varier l'entrée sensorielle de l'animal en enregistrant en présence de repères visuels proéminents, puis en éteignant la lumière et en la rallumant. (2) Notre deuxième objectif est d'étudier le rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre. Le cervelet est l'une des régions clés du cerveau impliquées dans la coordination motrice. On sait que le microcircuit cérébelleux traite les informations sensori-motrices et réalise des modifications immédiates des pattes correspondant au mouvement en cours. Les bases cellulaires d'une telle intégration demeurent largement inconnues. Le but de ce projet est d'examiner le rôle des neurones du cervelet dans la coordination des mouvements. Nous proposons d'étudier le rôle du réseau chez la souris éveillée en mouvement libre en utilisant l'imagerie calcique nous informant sur l'activité neuronale sous-jacente. La tâche pour cette étude consiste pour les animaux à traverser librement une échelle horizontale - avec des barreaux - reliant deux plateformes. Une telle tâche nécessite une intégration sensorimotrice qui implique le cervelet.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement de des pathologies neurologiques liées.
Procédures
Les souris de cette étude subiront 2 procédures : Procédure n°1: Rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre (6-8 semaines au total) et Procédure n°2: Dynamique du réseau neuronal d'orientation spatiale dans le présubiculum (6-8 semaines au total). Les animaux de la procédure n°1 (100 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les animaux de la procédure n°2 (230 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les deux procédures se terminent par la mise à mort des animaux par perfusion intra-cardiaque.
Impact sur les animaux
Les chirurgies invasives prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. Le fait de porter le microscope miniature sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Avant d'imager l'activité neuronale à l'aide du miniscope, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer à porter l'appareil d'imagerie.
Devenir
Tous les animaux suivant les procédures 1 et 2 sont sacrifiés comme indiqué à l'étape E. Ils sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques. L'étude histologique post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones enregistrés.
Remplacement
L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant en libre movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. Le remplacement n'est pas possible car il s'agit d'une étude d'un système intégré, non modélisable
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants permanents. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de plusieurs sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement et à réduire le nombre d’animaux. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible
Raffinement
Tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance quotidienne de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.
Choix des espèces
La souris a été choisie car en combinant souris transgénique et injections virale de GCaMP nous serons en mesure de mesurer l’activité calcique dans des populations neurales spécifiques pendant le mouvement libre. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures..