Souris
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence spontanée lente chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une dégénérescence rétinienne, elles reçoivent sous anesthésie des injections dans l'œil de molécules inflammatoires et des injections dans l'abdomen, pour tester si l'inflammation réveille les capacités de régénération de la rétine. Le porteur qualifie les atteintes de légères et limitées à la rétine, et compare l'injection intraoculaire à une pratique clinique courante chez l'humain. Il indique valider d'abord ses hypothèses sur des explants de rétine puis affirme le recours à l'animal "nécessaire", l'œil étant un organe complexe.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux : (i) Anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii) Injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en cinq minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal anesthésié pour réaliser l'injection. (iii) Injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra selon la procédure entre une et quatre injections intrapéritonéales d’un analogue de nucléotide permettant de révéler la prolifération cellulaire. (iv) Alimentation formulée : de 15 à 18 jours.
Impact sur les animaux
Les conséquences sur les animaux des procédures utilisées dans nos expériences sont restreintes à la rétine. Le modèle de souris que nous utilisons présente une dégénérescence rétinienne lente non préjudiciable pour l’animal (Annexe I). Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère (i.e. « entraînant une douleur, une souffrance ou une angoisse légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l'état général des animaux »), et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthanasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Le modèle de souris que nous avons choisi développe spontanément et progressivement une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Des souris de six semaines ayant une rétine totalement mature seront utilisées pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation contenant une molécule qui inhibe les cellules immunitaires rétiniennes. Il faut un minimum d'une dizaine de jours d’alimentation pour obtenir une inhibition suffisante. Les injections intraoculaires d'agents pro- inflammatoires seront donc réalisées à 8 semaines.
Importance physiologique de la modulation nutritionnelle dans le traitement des désordres métaboliques du foie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.
Objectifs
Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.
Procédures
L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.
Impact sur les animaux
D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.
Devenir
Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.
Choix des espèces
Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.
Travaux pratiques de Master 1ère année en Physiologie Animale : Impact d’un régime hyperlipidique sur le métabolisme énergétique de la souris.
- Enseignement supérieur
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, non pour la recherche mais pour des travaux pratiques de master. Soumises dix à douze semaines à un régime gras, elles subissent une calorimétrie et un test de tolérance au glucose avec incision de la veine de la queue, avant d'être tuées pour le prélèvement d'organes. Le porteur indique que le régime gras peut provoquer une forte prise de poids, altérer les capacités motrices au point d'empêcher l'accès à la nourriture, et induire un état dépressif et de l'anxiété. Il affirme qu'un organisme vivant entier est "indispensable" pour ces travaux pédagogiques, tout en précisant recourir en priorité à des souris déjà destinées à l'euthanasie.
Objectifs
Initier les étudiants à la réalisation d’un protocole expérimental de type "recherche" impliquant le modèle souris depuis le stade de la conception jusqu'à l'interprétation et la présentation des résultats en passant par l’application de techniques de physiologie et de biochimie. En s’appuyant sur les résultats expérimentaux obtenus et sur la littérature, les étudiants approfondiront leurs connaissances concernant le métabolisme énergétique et particulièrement les dérégulations métaboliques liées à l’obésité.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet devrait permettre à l’étudiant d’acquérir ou de renforcer les compétences suivantes : - capacités à se familiariser avec l’animal et à réaliser des expérimentations sur ce modèle. - capacités à appliquer un protocole expérimental (dosage enzymatique, protéique, sanguin, spectrophotométrique…) - capacités à travailler en équipe (binôme / promotion) - capacités à analyser la littérature scientifique, - capacités à exposer les résultats de travaux en français ou en anglais. - capacités à respecter des bonnes pratiques de laboratoire et des règles d’hygiène et de Sécurité D’un point de vue théorique, l’étudiant approfondira ses connaissances concernant le métabolisme énergétique et particulièrement les dérégulations métaboliques liées à l’obésité. Le fait d’analyser différents paramètres et plusieurs organes lui permettra d’avoir une approche intégrative de la régulation de l’homéostasie énergétique.
Procédures
Dans ce projet, les animaux sont tout d’abord soumis soit à un régime standard soit à un régime hyperlipidique (60% lipides à base de lard) pendant 10 à 12 semaines. On réalise ensuite des mesures de dépense énergétique par calorimétrie indirecte puis on pratique un test de tolérance au glucose. Enfin, les animaux sont mis à jeun 12h avant d’être anesthésiées puis mises à mort en vue de prélèvements d’organes.
Impact sur les animaux
En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Lors du test de tolérance au glucose, le prélèvement d’une goutte de sang nécessite de réaliser une petite incision à la veine caudale pouvant générer une infection.
Devenir
Le sang, le foie et le tissu adipeux prélevés seront analysés ultérieurement afin de déterminer certains paramètres caractérisant le métabolisme glucido-lipidique (dosages de lipides, mesures d’activités enzymatiques, dosages plasmatiques par kits colorimétriques...) et de mettre en évidence les dérégulations métaboliques liées à l’obésité.
Remplacement
Dans ce projet qui vise d’une part à initier les étudiants à l’expérimentation scientifique et d‘autre part à améliorer leur connaissance du métabolisme énergétique, le modèle souris a été privilégié. Afin d’étudier les conséquences d’un régime hyperlipidique sur le métabolisme et de mettre en évidence les interrelations existantes entre les organes, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant entier ce qui justifie de réaliser des expérimentations in vivo. Dans ce cas, aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à l’utilisation du modèle animal. Toutefois, en préambule du TP une explication détaillée du déroulement de l’expérience est donnée aux étudiants en s’appuyant sur des documents audiovisuels. L’anatomie des animaux et des techniques de canulation sont par exemple présentées sous forme de films ou diaporamas illustrés. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro est privilégiée dans d’autres UEs afin d’étudier les mécanismes à l’origine des modifications observées.
Réduction
Dans ce projet à but pédagogique, nous limiterons le nombre d’animaux à une souris par binôme en veillant toutefois à ce que l’effectif total soit suffisant pour permettre une analyse statistique (soit 5 souris de chaque groupe minimum). Ainsi lorsque le nombre d’étudiants suivant l’UE sera faible, chacun se verra attribuer une souris. Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisé, les résultats de l'ensemble des étudiants seront groupés afin qu'une exploitation statistique puisse être réalisée.
Raffinement
Afin de réduire le nombre d’animaux et par la même occasion le coût des TPs, les animaux seront utilisés dans plusieurs UEs de Master. En effet, dans un 1er temps des mesures de dépense énergétique en calorimétrie indirecte seront réalisées dans une UE puis l’étude du métabolisme sera réalisée dans le cadre d’une autre UE. De plus des échantillons de foie seront également conservés à -20°C en vue d’une analyse protéomique et moléculaire qui sera réalisée à l’occasion des TP d’une troisième UE). Les TP de cette dernière UE ont été ainsi repensés pour que la mise à mort d’aucun animal ne soit nécessaire. Les animaux utilisés pour ce projet seront dans la mesure du possible des souris non utilisées par les équipes de recherche locales (issues de l’entretien de lignées ou réformées) destinées à l’euthanasie.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche il est donc important que les étudiants (dont certains vont s’orienter en Master 2 Recherche) soient formés à manipuler cette espèce. De plus, le métabolisme glucido-lipidique de la souris est adapté à la mise en évidence de phénomènes physiologiques proches de ceux que l'on peut observer chez l'Homme au cours de l’obésité. Les organes prélevés sont ceux qui jouent un rôle majeur dans le métabolisme glucido-lipidique (le foie, le sang et le tissu adipeux). La souris fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui permet de s’appuyer sur la littérature pour justifier certaines hypothèses au lieu de faire une expérience, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Rôle des macrophages dans le cancer du foie et la réponse aux immunothérapies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections induisant des tumeurs du foie et un suivi par échographie sous anesthésie, pour étudier le rôle des macrophages dans le cancer hépatique et la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique qu'un quart des animaux peut développer une encéphalopathie foudroyante deux à quatre semaines après l'invalidation d'un gène. Il affirme que les lignées cellulaires ne permettent pas d'appréhender le foie dans sa globalité et présente le recours à Crispr comme une réduction du nombre d'animaux.
Objectifs
Notre objectif est d’étudier comment les macrophages du foie sont impliqués dans le développement du cancer du foie dépendant de la beta-caténine et modifient la réponse aux traitements d’immunothérapie dans des modèles murins de CHC (carcinome hépatocellulaire) relevants. Ce projet est divisé en 3 grands axes: 1) déterminer de manière cinétique au cours du processus tumoral comment une activation oncogénique de la beta-caténine dans les hépatocytes remodele le paysage immunitaire à son voisinage et notamment les macrophages embryonnaires. 2) comprendre comment les macrophages embryonnaires sont progressivement perdus au cours du processus tumoral pour être remplacés par des macrophages dérivés des monocytes et comment des événements oncogéniques associés à l'activation de la beta-caténine modifient ce remodelage macrophagique et 3) déterminer comment la réponse aux immunothérapies de ces cancers est modifié selon le remodelage des macrophages.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie en s'intéressant à une population immunitaire qui fut longtemps peu étudiée et dont la diversité des sous-populations a récemment été mise en lumière grâce à l'utilisation du single RNAseq (scRNAseq), ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeants ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre.
Procédures
1) Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles durant 10 secondes, 2) Injection intraveineuse sous anesthésie durant 30secondes 3) échographie hépatique sous anesthésie durant 10minutes si l'animal ne présente pas de tumeurs jusqu'à 25minutes si les tumeurs sont nombreuses 4) prélèvement sanguin sous anesthésie durant 30secondes
Impact sur les animaux
Les modèles de CHC décrits dans ce projet sont des modèles créés au laboratoire et que nous utilisons depuis plusieurs années. Entre la 2ème et la 4ème semaine après invalidation d’Apc un phénotype délétère lié à une encéphalopathie foudroyante peut être observé chez 25% des animaux, sans perte de poids. Ce phénomène est aussi observé dans le modèle de déletion de l'exon 3 de la beta-catenine par Crispr/Cas9 mais un mois et demi à deux mois après édition du gène du fait du temps de latence plus long pour que la machinerie Crispr soit pleinement efficace. Les autres traitements sont sans nuisances sur les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront euthanasiés pour analyse de leurs tissus hépatiques et leurs tumeurs afin de comprendre les événements génétiques et immunitaires à l'origine du développement de ces tumeurs et si nos traitements ont pu modifier leurs caractéristiques (invasion, prolifération)
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales...). L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité, d’autant plus que les CHC mutés pour la beta-caténine sont peu proliférants et donc difficiles à maintenir en culture. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous optons pour la technique des ciseaux moléculaires ou crispr/cas9. 1290 animaux sur les 2650 nécessaires au projet suivent ce protocole, le quadruple ayant été nécessaire sans l’utilisation de cette stratégie. Nous suivrons le développement des tumeurs par suivi échographique, un appareil ayant été acquis récemment au sein de l'animalerie, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral évitant d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à nos expériences précédentes et à un calcul de puissance pour obtenir des résultats robustes : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Nous suivrons le développement des tumeurs par échographie, ce qui permet un suivi longitudinal depuis les phases précoces du développement tumoral évitant la souffrance des animaux liée à un développement tumoral trop important. Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée - les animaux étant euthanasiés si le score de souffrance est trop élevé. Les injections stressantes et les échographies seront réalisées sous anesthésie et les animaux mis sur tapis chauffant pour limiter l’hypothermie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum.
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèle murin. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les CHC humains. Pour toutes les procédures, des souris mâles âgées de deux mois seront utilisées pour induire les délétions géniques d'intérêt (par Cre/lox ou Crispr/cas9) afin de réaliser un suivi longitudinal de l’initiation et du développement tumoral chez la souris adulte jeune et de les traiter avec les immunothérapies
Evaluation de la survie de souris présentant une pneumonie à Pseudomonas aeruginosa avec ou sans prophylaxie à Porphyromonas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie nasale, sous anesthésie, une bactérie responsable de pneumonie grave, puis leur survie est suivie pendant sept jours pour tester l'effet protecteur d'un probiotique. Le porteur indique que les souris infectées sans protection peuvent perdre du poids et présenter douleurs, mobilité réduite voire inactivité, une analgésie étant administrée en cas de douleur effective. Il affirme ne pas pouvoir répondre à la question par des cultures cellulaires et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer la survie à l’infection, en complément des diminutions de charge bactérienne, avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse, La durée de chaque instillation dure moins d'une minute. A la suite de quoi, une courbe de survie sera réalisée sur 7 jours.
Impact sur les animaux
L’installation intranasale de bactérie peut induire un stress chez les animaux. L’utilisation d’anesthésie gazeuse lors de l’instillation permet de diminuer significativement le stress chez les animaux, par ailleurs un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec un score validé par une publication et l’administration d’un antalgique en cas de dégradation de l’état des animaux permettent également une diminution de ces effets. Lors de la réalisation de la courbe de survie, le groupe témoin recevant seulement PA peut être sujet à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec le score choisi, induisant une antalgie en cas de douleur effective. Pour les groupes essais et témoin PC recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
A l'issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin d'analyser les différents groupes, réaliser les courbes de survie et procéder aux tests statistiques permettant de démontrer le bénéfice thérapeutique d'une proxylaxie par Porphyromonas lors d'une infection à Pseudomonas aeruginosa.
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer sa persistance dans le poumon après instillation. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
L’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7eme jour. Dans l’hypothèse d’une mortalité de 100% dans le groupe des souris infectées par Pseudomonas aeruginosa (souche PA01) et d’une mortalité de 60% dans le groupe des souris ayant reçu une administration prophylactique de Porphyromonas cationae clinique (PC 103) et infectées par PA01 (Groupe PC 103+PA 01) ; le nombre de souris nécessaire par groupe est de 20 souris (risque alpha=0.05, puissance du test 1-béta=90%) Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de limiter le groupe contrôle (Sérum physiologique) à 10 souris car nous n’attendons pas de mortalités Le nombre total de souris sera donc de (3*20) + (1*10) soit 70 souris. Par ailleurs, nous nous limitons à une seule souche de Porphyromonas (P. catoniae ou PC) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon. La souche PC103 utilisée lors de ce projet a été préalablement sélectionnée parmi les 7 autres souches cliniques isolées lors d’une précédente étude menée au laboratoire. PC103 a été sélectionnée sur sa capacité à réduire in vitro la croissance de PAO1, sa production d’acides gras à chaines courtes, et son action sur des macrophages, également in vitro.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en cas de dépassement du score M-CASS 11 (de la buprénorphine pour réduire la douleur). Une mise à mort par CO2 sera pratiquée en cas de besoin au cours du suivi ou à la fin du protocole pour les animaux ayant survécus. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats. Les animaux seront utilisés après 1 semaine d’acclimatation à l’animalerie.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Certaines reçoivent dès la naissance trois injections dans l'estomac ou l'abdomen en trois jours, d'autres, adultes, dix injections abdominales de tamoxifène en deux semaines. Une partie subit ensuite une prise de sang derrière l'œil et des mesures de pression artérielle par brassard sur la queue, après deux semaines d'accoutumance. Le projet doit établir le rôle d'une protéine des vaisseaux, ARHGEF18, et renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'anévrisme intracrânien. Des souriceaux sont tués à six et à quatorze jours de vie pour l'analyse de leur rétine.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4 Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Décryptage de l’activité neuronale et astrocytaire induite par l’ocytocine dans l’amygdale centrale – AstrOT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, et celles soumises au conditionnement de peur reçoivent chacune deux à quatre chocs électriques de 0,4 à 0,6 milliampère, associés à un son. Une chirurgie d'une heure leur implante des canules dans le cerveau pour y injecter des molécules qui agissent sur le récepteur de l'ocytocine, et toutes sont tuées pour l'étude de tranches de leur cerveau. Le projet doit comprendre comment la peur s'acquiert et s'éteint, ce qui permettrait selon le porteur d'"ouvrir des voies thérapeutiques" contre le stress post-traumatique. Il décrit lui-même une douleur, une peur et "une angoisse liée à la répétition du choc en l'absence d'échappatoire", qu'il dit inévitable car elle est "l'essence même du conditionnement de peur".
Objectifs
"Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle". Parmi ces troubles, on trouve une dérégulation du système de stress et une résurgence importante des souvenirs traumatisants, rendant la personne anxieuse face à des situations normalement non anxiogènes. Au sein du cerveau, la peur nait de l'interaction de plusieurs régions, parmi lesquelles l'amygdale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Dans l'amygdale, l’ocytocine (OT) a été récemment identifiée comme étant un candidat pour le traitement de la peur pathologique. Ainsi, l’OT est un candidat de choix pour agir sur la modulation des réponses émotionnelles face à la peur ou son souvenir. Par ailleurs, un intérêt croissant émerge sur l'implication des cellules non neuronales tels que les astrocytes dans la régulation des circuits neuronaux. De plus, il a été récemment démontré que l'OT pouvait agir sur les astrocytes de l'amygdale via son récepteur présent sur ces cellules. Ce projet vise à élucider l’effet de l’activation des récepteurs à l’ocytocine (OTR) de l’amygdale via l’application de molécules modifiant l'activité de ce récepteur. Lors des études ex vivo, nous évaluerons l'activité des neurones et des cellules gliales sur des tranches de cerveau comportant l'amygdale centrale. Elles apporteront de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, en observant particulièrement si une interaction neurone-glie est requise. Les études in vivo se feront à l’aide d’un modèle de TSPT et les observations seront menées sur l'expression de la peur conditionnée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place au cours de l'acquisition et de l'extinction de la peur ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 principales interventions: A. Une biopsie du cerveau suivant une anesthésie dissociative. B. L'implantation de canules intracérébrales permettant d'administrer des agents pharmacologiques dans les structures cérébrales étudiées. Nos nous limiteront à 1 chirurgie (1h) et 1 injection intracérébrale (5 minutes) par animal. C. Le conditionnement de peur se dérouleras sur 3 jours. Elle dureras 20 minutes le premier jour puis 60 minutes les deux jours suivants.
Impact sur les animaux
Pour les expériences ex vivo (point A), la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter l'anesthésique. La procédure étant sans réveil, aucune autre nuisance n'est attendue. L'implantation de canules intracérébrales (point B) peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision sont attendues après l'opération. Pour limiter au maximum ces effets indésirables, nous prendrons des dispositions pré-opératoires (injection d'analgésiques locaux ansi que d'anti-inflammatoires), pendant l'opération (gel hydrolique pour empêcher la déshydratation des yeux, couverture chauffante pour l'hypothermie) et en post-opératoire (suivi du poids et de l'apparence des souris, anti-inflammatoire dans l'eau de boisson). Enfin, pour le protocole de conditionnement de peur, le concept de cette expérience est de créer une peur à un son en associant ce dernier à un choc électrique ; la nuisance liée au choc ne peut donc pas être évitée. Celle ci comprend une douleur, une réaction de peur (liée au caractère aversif et imprédictible de l'apparition du choc) ainsi qu'une angoisse liée à la répétition du choc en l'absence d'échappatoire. Dans ce protocole, même si nous comptons réduire au maximum cette angoisse, elle ne peut être évitée car elle est l'essence même du conditionnement de peur. Les souris recevront 2 à 4 chocs d'une intensité de 0,4 à 0,6mA sur une session de 20 minutes. Ces valeurs seront déterminées lors d'expériences préliminaires visant à estimer quels sont les paramètres minimums permettant l'installation d'une peur conditionnée.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo. Ainsi, les animaux sont toujours utilisés pour une procédure "sans réveil" à la fin des expériences.
Remplacement
Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Dans l'objectif de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous comptons réaliser les expériences ex vivo (électrophysiologie et imagerie calcique) sur les animaux utilisés lors du fear conditionning. Ces expériences ex vivo étant "sans réveil", cela n'apportera d'inconforts surnuméraires aux individus utilisés. Pour toutes les expériences, la normalité des données sera évaluée puis une ANOVA (ou son équivalent non paramétrique) et des tests post hoc seront effectués. Toutes les comparaisons seront faites à une seuil de significativité de 5%. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Ce chiffre est une estimation du nombre d'animaux nécessaires pour obtenir 10 à 20 enregistrements, représentant une unité statistique robuste. L'utilisation d'un nombre d'animaux plus faible pourrait induire un biais et ainsi affaiblir les conclusions. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef.
Raffinement
Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives avec de l'enrichissement. Cet enrichissement comportera de la frisure et du coton pour qu'elles se fassent des nids de toute splendeur. Des bâtons à ronger seront aussi mis à disposition dans les cages d'hébergement. De plus, nous ajouterons des tunnels afin de rendre le change de cages moins stressant. Enfin, les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées par cage de 2 à 5. Au cours des chirurgies, nous nous assurerons de la présence d'une couverture anesthésique et analgésique. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin d'éviter la diminution de la température corporelle due à l'anesthésie. De l'ocrygel sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, du Gel Diet seras placé dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le conditionnement de peur, nous comptons réaliser des tests préalables sur : 1) le nombre de choc et 2) la l'intensité de ces derniers. Nous comptons essayer d'appliquer peu de choc (2) de faible intensité (0,4mA) et tester si cela suffit à produire un robuste conditionnement de peur. Si ce protocole s'avère être trop faible, nous augmenterons le nombre de choc jusqu'à un maximum de 4 et si cela n'est toujours pas suffisant, nous augmenterons l'intensité des chocs, le tout sans jamais dépasser 0,6mA, correspondant aux valeurs hautes observées dans la bibliographie du domaine.
Choix des espèces
Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.
Caractérisation cellulaire de l’horloge circadienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les 96 souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, conçues pour que l'équipe puisse éteindre l'activité électrique ou l'horloge moléculaire de cellules précises de leur cerveau. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une injection dans la profondeur du cerveau sous anesthésie générale, puis un hébergement en cage individuelle équipée d'une roue, pour mesurer leur rythme d'activité sous alternance de jour et de nuit, puis dans l'obscurité constante. L'effet recherché est une perte ou un décalage de leur rythme circadien, qui peut provoquer selon le porteur une fatigue liée à des troubles du sommeil. Toutes sont tuées en fin de procédure pour vérifier au microscope l'emplacement de l'injection, et une souris qui perdrait 15 % de son poids serait tuée avant, par dislocation cervicale.
Objectifs
En France, environ 15% de la population active est concernée par le travail de nuit. Ce mode d'organisation du travail augmente les risques de troubles du sommeil et du métabolisme, de cancer ou de problèmes cardiovasculaires et psychiques. Pour répondre à cet enjeu de santé publique, il convient de mieux connaitre l'horloge interne qui régule nos rythmes biologiques en adéquation avec le cycle jour-nuit de 24 heures. Cette horloge circadienne (= "autour du jour") est localisée dans une petite structure du cerveau profond, appelée les noyaux suprachiasmatiques (NSC). Les NSC contiennent environ 10000 cellules nerveuses, douées d'une rythmicité circadienne autonome reposant sur un petit ensemble de gènes, appelés gènes de l'horloge. Alors que les interactions entre ces gènes de l'horloge sont maintenant bien connues et définissent les rouages moléculaires de l'horloge, le rôle des différentes cellules des NSC reste mal connu. Pour répondre à cette question, notre approche expérimentale vise à éteindre l'activité électrique ou à inactiver le mécanisme de l'horloge moléculaire dans des populations cellulaires spécifiques des NSC chez des souris génétiquement modifiées. Notre objectif sera de cibler une dizaine de populations cellulaires différentes et d'identifier lesquelles participent au rythme de locomotion circadienne, mesurée à l'aide d'une roue d'activité dans la cage des animaux.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d'identifier les cellules régulant les rythmes circadiens, et selon quelle modalité (phase, amplitude, période?). Cette dissection cellulaire de l'horloge circadienne des Mammifères est une étape essentielle pour comprendre le fonctionnement physiologique de l'horloge et son dérèglement pathologique dans le cadre de notre société moderne, active 7 jours sur 7, 24 heures sur 24. A terme, les cellules ainsi identifiées pourraient constituer la cible de traitements adaptés pour accompagner les travailleurs de nuit et les voyageurs souffrant de jetlag. Un autre bénéfice attendu consiste dans l'obtention de nouvelles données sur le rôle du canal NALCN que nous ciblerons pour éteindre l'activité électrique des cellules des NSC. Ce canal ionique est associé à des maladies génétiques rares. Les enfants touchés par ces maladies développent très souvent des troubles du rythme veille-sommeil. Comprendre le rôle précis de NALCN dans l'horloge circadienne serait une avancée majeure pour alléger les conditions de vie de ces jeunes patients et de leur famille, déjà confrontés à des situations très sévères.
Procédures
Injection intra-cérébrale sous anesthésie générale. Hébergement en cage individuelle (avec contact visuel avec des congénères) pour mesure du rythme de lcomotion volontaire dans une roue d'activité.
Impact sur les animaux
L'effet attendu des manipulations réalisées est une perturbation de l'horloge circadienne : diminution ou perte totale de la rythmicité circadienne, ou déphasage entre le rythme interne et le cycle jour-nuit extérieur. La perte de rythme n'est a priori pas dommageable sur la durée du protocole. Le déphasage peut provoquer une fatigue liée à des troubles du sommeil. Sur le long terme, le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité) ou au contraire un amaigrissement est possible, ainsi qu'un risque accru de cancer est possible. Cependant, ces effets extrêmes ne sont pas envisageables en quelques semaines. La nuisance potentiellement causée par la procédure chirurgicale d'injection stéréotaxique sera traitée par anesthésie/analgésie et surveillance des animaux
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour réaliser une vérification histologique du site d'injection.
Remplacement
Le fonctionnement moléculaire de l'horloge a déjà été largement étudié in vitro. Mais comprendre l'impact de ce mécanisme dans des cellules spécifiques au sein d'un organisme nécessite le recours aux modèles animaux. Ici, nous regarderons comment une manipulation cellulaire dans le cerveau profond modifie le rythme repos-activité chez la souris. Les résultats expérimentaux que nous obtiendrons révéleront la complexité fonctionnelle de l'horloge circadienne. Ces données pourront servir de base pour une modélisation réaliste de ce système.
Réduction
Pour chaque groupe expérimental, la quantité totale d'activé sera mesurée en condition d'éclairage jour-nuit, puis d'obscurité constante. Les paramètres du rythme d'activité locomotrice, directement liés à l'horloge, seront évalués sous ces conditions d'obscurité constante (= conditions de libre cours) : 1. Analyse qualitative : le rythme circadien d'activité est-il préservé ou aboli? 2. Analyse quantitative : si une rythmicité est préservée, la période du rythme en conditions de libre cours sera le paramètre limitant. Nous avons réalisé une étude statistique (programme G-Power) pour estimer la taille nécessaire de nos groupes expérimentaux.
Raffinement
L'injection stéréotaxique de petits volumes (1 µl) dans les NSC est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil, avec utilisation d'analgésiques et per- et post-opératoire. La mesure de l'activité locomotrice implique l'hébergement en cage individuelle, équipée d'une roue d'activité. Pour limiter l'isolement social, les animaux garderons un contact visuel avec leurs congénères. D'autre part, l'accès à la roue constitue un enrichissement des conditions d'hébergement très apprécié. Les animaux seront observés visuellement de façon quotidienne. En plus des signes de souffrance couramment recherchés (prostration, poil hérissé, amaigrissement), nous utiliserons la mesure d'activité locomotrice comme point limite spécifique à la procédure mise en œuvre : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par des souris contrôles sera pesée et observée plus en détail. En fonction des signes cliniques observés, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un analgésique adapté. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% au poids avant l'opération, alors elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère de choix, donnant accès à un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. Ici les lignées Bmal1-flox et Nalcn-flox sont uniques et particulièrement adaptée pour répondre à la question posée. D'autre part, la mesure de l'activité locomotrice volontaire dans des cages à roue est un outil très largement utilisé en chronobiologie pour évaluer le fonctionnement de l'horloge circadienne des rongeurs. Souris jeunes adultes (7-8 semaines), lorsque la croissance est terminée pour des coordonnées stéréotaxiques fiables.
Détermination de l’implication du système sympathique dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Équipées par chirurgie d'un capteur implanté de pression artérielle, 212 souris sont enregistrées à plusieurs âges, et 106 d'entre elles doivent aussi marcher sur un tapis roulant "à vitesse soutenue". 274 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour des prélèvements de tissus, la moitié portant une mutation semblable à celle de la sclérose latérale amyotrophique humaine, qui provoque des atteintes motrices. Le projet cherche si la régulation de la pression artérielle se dérègle avant les premiers symptômes moteurs. Le RNT ne dit pas jusqu'à quel stade de la maladie les souris sont gardées, et ses effectifs ne concordent pas : 212 souris opérées et 168 autres gardées jusqu'au vieillissement font 380, pour 274 déclarées.
Objectifs
La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homéostasie corporelle, responsable du contrôle d'un grand nombre d'activités automatiques de l'organisme. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones qui sont moléculairement extrêmement proches des neurones qui commandent les muscles striés : les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caractérisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et à leur décès par insuffisance respiratoire. Les causes précises de la dégénérescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette dégénérescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau du muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du contrôle vasculaire musculaire à la dégénérescence du muscle et des MNs. L’objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoces (avant l'apparition des symptômes moteurs) de la régulation de la pression artérielle sur un modèle murin de la SLA.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dont l'issu est aujourd'hui toujours fatale chez l'homme (dans les 3 à 5 ans suivant les premiers symptômes).
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie (n=212) et certains d'entre eux marcheront aussi sur un tapis roulant à vitesse soutenue (n=106). Les 168 autres animaux seront maintenus en vieillissement pour des prélèvements post-motem uniquement.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)
Devenir
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immuno-histologiques
Remplacement
Des études préliminaires sur tissus ont été faites afin d'orienter le projet. De plus, une grosse partie du projet se fera ex-vivo grâce à des techniques d'histologie et d'immuno-histologie. Il n'existe pas de modèle mathématique simulant les modifications induites par SLA sur les paramètres cardiovasculaires car les connaissances de cette maladie sont aujourd'hui limitées. De plus, le suivi de paramètres physiologiques au cours de la vie d'un animal n'est pas possible en dehors d'un système intégré comme un organisme entier. Il n'est donc pas possible de faire cela sur des tissus ex-vivo. C'est à cause du manque de connaissance de notre modèle (la SLA) que nous avons recours à l'utilisation d'animaux présentant cette maladie.
Réduction
Afin de déterminer au mieux le nombre d'animaux, nous avons calculé le n à l'aide de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté. Ainsi, chacun des animaux sera enregistré à chaque temps permettant de ne pas multiplier le nombre d'animaux par le nombre de temps d'enregistrement. Une étude pilote sur très peu d'animaux (16) sera faite et conditionnera l'utilisation des autres animaux.
Raffinement
Les individus porteurs de la mutation seront suivi régulierement et l'évaluation des signes moteurs sera faite toutes les semaines, puis 2 fois par semaine, puis tous les 2 jours puis quotidiennement afin de ne jamais laisser un animal en souffrance. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (analgésie, antibiothérapie si nécéssaire sur avis vétérinaire, tapis chauffant pour le réveil), les conditions d'asepsies seront respectées (autoclavage, stérilisation à froids, matériels à usage unique stérile) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé (formation réglementaire et spécifique auprès d'un centre de formation dédié).
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les animaux de l'étude pilote seront implantés à P50 pour être enregistrés à partir de P60 Les animaux de l'étude complémentaire seront implantés à P21 (minimum 22gr) pour être enregistrés à partir de P29
Impact de la modulation β3-adrénergique sur la fonction vasculaire dans le choc septique expérimental
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Une ligature et une ponction du cæcum leur provoquent un choc septique : 178 sont tuées dix-huit heures plus tard, après une échographie cardiaque et la pose d'un cathéter dans la carotide sous anesthésie, et 110 sont suivies cinq jours dans une étude de survie, sauf mise à mort anticipée au point limite. Le projet évalue si agir sur un récepteur des vaisseaux, le récepteur β3-adrénergique, améliorerait la fonction vasculaire des patients en choc septique. Une partie des souris est dépourvue du récepteur β1, une lignée rare que le porteur dit avantageuse puisque "les animaux sont déjà connus des expérimentateurs".
Objectifs
Le choc septique est défini comme la forme la plus sévère d’une infection caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Le choc septique est un problème majeur de santé publique, responsable de 15% des admissions et de 40% de mortalité en réanimation. Le choc septique est associé à une dysfonction du système cardiovasculaire et immunitaire. En effet, afin de combattre l’infection, l’organisme active une série de phénomènes au niveau vasculaire notamment pour permettre l’arrivée des globules blancs sur le site inflammatoire. L’activation excessive de ces mécanismes conduit entre autre à un phénomène d’hypotension (chute de la pression dans les vaisseaux) menant à un défaut d'apport en oxygène aux organes. La présence des récepteurs β3-adrénergiques (β3-ARs) au niveau vasculaire, dont la concentration croît durant une infection (inversement aux β1, β2-ARs), pourrait jouer un rôle dans l'hypotension. La vasodilatation excessive, responsable de l'hypotension, est contrée par l’organisme grâce à une modulation de la vitesse et de la force de contraction du cœur. L'utilisation de ligands β-adrénergiques, des β1-bloquants, permet ainsi de moduler la fonction cardiovasculaire dérégulée pendant l’état de choc septique via le système nerveux. En effet, il a été prouvé que l’administration de β1-bloquants lors du choc septique améliorait expérimentalement la réactivité vasculaire à un vasoconstricteur de vaisseaux de gros et petits calibres. Parallèlement, la quantité de sang éjectée par le cœur, était améliorée alors que les animaux présentaient la même fonction cardiaque et le même volume de fluide perfusé témoignant peut-être d’une moindre fuite liquidienne au niveau vasculaire induite par le choc septique. Les β1-ARs étant très peu présents dans les vaisseaux, notre hypothèse est que, durant le choc septique, la modulation des β3-ARs au niveau vasculaire modifie la vasoréactivité. L'hypothèse de ce travail est qu'en agissant sur les β3-ARs, les fonctions vasculaires et cardiaques des patients septiques pourraient être améliorées.
Bénéfices attendus
En mettant en évidence un effet de la modulation des β3-ARs sur la perte de la vasoréactivité dans le choc septique, il est attendu un bénéfice sur la prise en charge clinique du choc septique. En effet, un traitement modulant les β3-ARs pourrait améliorer la chute de la contraction vasculaire et diminuer la vasodilatation excessive conduisant à l’hypotension lors du choc septique.
Procédures
Les animaux (n=288) seront soumis à une procédure chirurgicale, la ligature et ponction caecale, de type sévère conduisant à un état de choc septique. C’est 18 heures après cette intervention que les analyses in vivo et ex vivo (procédure 2) débuteront pour les animaux de la première série (n=178). Les animaux de la première série seront soumis à une évaluation hémodynamique par échocardiographie pendant 15 minutes et par l'implantation d'un cathéter carotidien pour une durée d'environ 15 minutes sous anesthésie. La mise à mort des animaux sera effectuée à la fin de la procédure de cathétérisme carotidien et permettra le prélèvement des organes et du sang permettant les analyses ex vivo (myographie, rapport poids humide/sec pulmonaire) et biochimiques. Les animaux de la deuxième série (n=110) traités pendant 24 heures seront soumis à une étude de survie sur 5 jours.
Impact sur les animaux
La ligature et ponction caecale, notre modèle, est une procédure chirurgicale sévère qui induit un choc septique chez l'animal. Cette procédure va induire une douleur chez l'animal qui sera traitée grâce à l'administration d'un analgésique, la buprénorphine à la posologie de 0,2mg/kg une heure avant la chirurgie, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois/jour. Le stress et la douleur engendrés chez les animaux de la première série sont limités dans le temps avec des analyses in vivo et des prélèvements suite à la mise à mort 18h après la chirurgie. Une observation de l'état général des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour et dans le cas où un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être décidée.
Devenir
Tous les animaux (178) de la première série seront mis à mort après la pose de cathéter carotidien (procédure 2) analysant la pression artérielle. Tous les animaux de la deuxième série (n=110) seront mis à mort à la fin de l'étude de survie soit 5 jours après la chirurgie ou seront mis à mort avant le cinquième jour dans le cas où un point limite est atteint. Tous ces animaux seront mis à mort pour prélévement d'organes.
Remplacement
Tout d'abord, ce modèle est choisi par rapport à sa proximité avec les situations cliniques humaines. En effet, on ne peut pas modéliser le choc septique avec d’autres types de modèles, par exemple in vitro, puisqu’on étudie plusieurs fonctions biologiques et leurs interactions : fonction cardiaque, fonction vasculaire, et le métabolisme. De plus, il n’existe pour l’heure nulle autre expérimentation que le modèle animal afin de remplacer l’utilisation des souris pour les procédures expérimentales prévues dans ce projet (ligature et ponction caecale, échocardiographie, cathéter carotidien). Enfin, ce modèle est le plus utilisé dans la littérature (modèle de choc septique multi-microbiens) et il est maîtrisé par le laboratoire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les mâles et les femelles seront utilisés. Dix animaux par groupe sont nécessaires afin de ne pas compromettre les objectifs du projet et de pouvoir réaliser de bonnes analyses statistiques.
Raffinement
Pour le raffinement, les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris sont hébergées à 5 maximum par cages individuellement ventilées de 500 cm². Elles auront de l'eau et de la nourriture à volonté. L’enrichissement du milieu se fera avec des petits abris, des tunnels, du sizzle pad ou des bâtons à ronger. Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus rapide conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Plusieurs types de mesures seront effectués sur un même animal en traitant la douleur induite par injection sous-cutanée d’analgésique (buprénorphine) une heure avant, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois par jour. Les chirurgies se feront sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Enfin, la durée de l’étude est courte (18 heures) pour la première série d'animaux en post-opératoire afin de limiter les souffrances. Une observation des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour, et dans le cas où un point limite est atteint la mise à mort pourra être décidée.
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est une espèce fréquemment retrouvée dans la littérature sur le choc septique. Nos résultats seront ainsi plus facilement comparables avec la littérature. Le modèle animal dont nous avons accès au laboratoire est un modèle de souris rare KO pour le β1-AR, ce qui est un avantage pour les expérimentations puisque les animaux sont déjà connus des expérimentateurs. Les évaluations hémodynamiques, vasculaires et inflammatoires de ces souris KO pour le β1-AR subissant la CLP ou non permettront de mettre en évidence des effets modulatoires des β3-ARs en l’absence du β1-AR. Des souris de 20g-30g seront utilisées pour comparer avec les autres résultats dans la littérature, qui utilisent cette gamme de poids. Ces souris auront entre 12 et 16 semaines et les mâles et les femelles seront utilisés. Ce stade de développement a également été utilisé précédemment dans nos études.
Interactions douleur et prise excessive de sucre ou d’alcool chez la souris : analyses comportementales et moléculaires
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Opérées sous anesthésie générale pour leur provoquer une douleur neuropathique, puis suivies jusqu'à huit semaines sans traitement contre la douleur, une partie des souris a aussi accès à du sucre ou à de l'alcool, dont le projet mesure la consommation excessive. 1 008 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, isolées en cage pour mesurer ce qu'elles consomment, soumises à des prises de sang jusqu'à tous les quinze jours, et toutes tuées à l'issue. Le projet teste l'hypothèse que des prises excessives de nourriture sucrée jouent un rôle dans les douleurs décrites chez des personnes dépendantes à l'alcool. Le porteur écrit qu'il ne peut "pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux", et qualifie l'enchaînement des tests de "compatible avec le bien-être de l'animal".
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire semble être motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. Ce phénomène, qui consiste à consommer un aliment pour son goût agréable (appétissant), apparaît préoccupant puisqu’il peut devenir la cause de maladies comme l’obésité. Les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation pourraient partager des similitudes avec celles mises en place dans l’addiction à l'alcool. Notre programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la consommation d'alcool. En particulier, l’apparition de douleur chez des patients souffrant d’addiction à l’alcool a été décrite mais n’est pas bien comprise. Nous faisons l’hypothèse que les troubles de l’alimentation pourraient jouer un rôle dans le développement de douleur, et nous étudions les mécanismes sous-jacents. Les objectifs sont donc dans un premier volet de (1) mesurer les réponsesà la douleur dans nos modèles, et d'effectuer des mesures du bien-être ; (2) caractériser les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau. Dans un deuxième volet, nous souhaitons (3) étudier les effets d’une douleur neuropathique sur la consommation de sucre ou d’alcool.
Bénéfices attendus
En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires et dans l’addiction en général, et en particulier dans le cadre de douleur neuropathique.
Procédures
-Prélèvement sanguin, au maximum tous les 15j, après le début des régimes, en PE2, PE3 et PE5; -Chirurgie, PE5, Modèle douleur neuropathique, 1 fois pour chaque animal, suivi sur 8 semaines maximum
Impact sur les animaux
Nous utilisons des modèles de consommation excessive qui nécessitent l’isolement des animaux pour une précision des mesures. Nous surveillons les animaux quotidiennement. Un modèle de douleur neuropathique sera utilisé dans le deuxième volet de l’étude, pour lequel une chirurgie est effectuée sous anesthésie générale. Dans ce modèle, les souris présentent des seuils nociceptifs abaissés, qui sont aussi des symptômes de neuropathie observés en clinique. Cependant nous ne pouvons pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux car cela risquerait d’interférer avec les mécanismes que nous étudions.
Devenir
PE1 à PE5: Les animaux sont tous mis a mort ( lots détaillés dans chaque PE)
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou d’alcool, ou d’une douleur, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques, soit 12 souris/groupe pour le comportement et les approches moléculaires et 18 souris/groupe pour le modèle de neuropathie. Des tests statistiques paramétriques seront effectués sur les données (ANOVA multifactorielles suivies de tests post-hoc de type Newman-Keuls lorsque les comparaisons multiples sont nécessaires). Mais si les données ne présentaient pas la normalité attendue après vérification par le test de Kolmogorov-Smirnov, nous basculerions sur des analyses non paramétriques (tests de Kruskall-Wallis, Mann-Whitney et Wilcoxon des rangs signés). L’effectif est plus important pour l’expérience de neuropathie, pour prévenir des aléas expérimentaux ainsi qu'une éventuelle variabilité et garantir les 12 animaux finaux. Les expériences seront menées sur les deux sexes. Pour l’expérience 1 de binge sucrose, nous pourrons determiner le temps minimum permettant de mesurer l’apparition d’une neuroinflammation. Nous comparons 2, 4 et 8 semaines d’exposition. Si nous pouvons réduire la durée des expériences à 4 semaines, au lieu de 8, ceci est souhaitable. De plus, dans l’expérience 2, nous faisons des mesures nociceptives, et les mesures moléculaires pourraient être impactées par cette étude comportementale. Nous préférons faire une mise au point dans les meilleures conditions (expérience 1) pour ensuite déterminer nos paramètres de travail pour la suite des études.
Raffinement
La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (sucre ou alcool), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours le choix de consommation (sucre ou alcool) avec de l’eau. Les souris, habituées au dispositif expérimental avant le début des mesures, peuvent se soustraire à la stimulation nociceptive. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Les procédures regroupent plusieurs tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire l’effectif.De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires et de la dépendance aux drogues.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffes de lignées humaines de myélome multiple (MM) pour étudier l’impact de molécules à visée thérapeutique dans le MM.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Conditionnées par chimiothérapie à l'hydroxyurée ou au busulfan, ou par irradiation, puis greffées de cellules humaines de myélome dans le fémur ou dans une veine, 664 souris sévèrement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la deuxième semaine après la greffe, elles subissent une prise de sang chaque semaine et des séances d'imagerie par bioluminescence, et reçoivent par voie intraveineuse ou par gavage des inhibiteurs de la protéine PIM2 ou une thérapie par ARN. Le cancer peut provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé, selon le porteur. Chaque souris passe jusqu'à douze mois en expérimentation, gardée en vie pour la procédure suivante ou tuée.
Objectifs
Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang (hémopathies) parmi les plus fréquents, en deuxième position après les lymphomes. Il représente 1% de la totalité des cancers et environ 10% des hémopathies. Malgré l’apparition de nouveaux traitements, le MM reste aujourd’hui une maladie incurable avec une médiane de survie moyenne à 6 ans (Rapport InVS 2018). Des travaux ont montré que la surexpression de la proteine PIM2 dans les cellules tumorales du MM était associée à une maladie plus agressive et à une survie réduite pour les patients. Le ciblage thérapeutique de la protéine PIM2 ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie. Des tests in vitro ont été réalisés au sein du laboratoire montrant l’efficacité de molécules pour inhiber la protéine PIM2 dans les cellules de MM et induire la mort des cellules. L'expérimentation animale est cependant rendue indispensable du fait de l'impossibilité de reproduire le microenvironnement tumoral in vitro et de mener ce type d'exploration directement chez l'Homme. Notre projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de xénogreffe de lignées de MM pour tester différentes molécules ciblant la protéine PIM2. Les traitements que nous voulons tester sont d’une part des inhibiteurs chimiques de la protéine PIM2 (utilisés seuls ou en association avec d'autres inhibiteurs) et, d’autre part, une thérapie de type ARN qui inhibe le gène PIM2. Globalement, ce projet consiste à implanter, chez des souris immunodéprimées, des cellules de lignées de myélome multiple (MM) humaines dans le but de pouvoir étudier la progression tumorale après injection de molécules à visée thérapeutique dans le MM.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’établir de nouveaux modèles murins de myélome pertinents pour reproduire la pathologie humaine et pour tester de nouvelles thérapeutiques dans le MM. La première étape permettra de déterminer les meilleures conditions d’implantation des cellules de MM chez une souris immunodéficiente avec une prise de greffe permettant un développement tumoral durable, et la deuxième étape caractérisera précisement la progression et dissémination tumorale dans les conditions définies comme optimales à l’étape 1. Enfin, grâce à ces étapes d'optimisation, nous pourrons évaluer à l’étape 3, l'impact de traitement inhibant la protéine PIM2 sur la progression tumorale. Nous testerons deux nouvelles possibilités de traitement ciblant cette protéine, soit au moyen d'association d'inhibiteurs chimiques, soit au moyen d'une thérapie ARN originale, toutes deux jamais testés à ce jour dans le MM. Ces stratégies thérapeutiques pourraient trouver leur place dans la prise en charge des patients atteints de MM.
Procédures
Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes des myélomes humains, les souris devront recevoir un conditionnement (traitement chimique par hydroxyurée ou busulfan, ou irradiation) puis une greffe de cellules tumorales humaines dans un site reproduisant au mieux la pathologie humaine (dans la moelle par voie intra-fémorale ou à défaut, dans le sang par voie intraveineuse). Les traitements évalués seront administrés soit par voie intraveineuse soit par gavage. Enfin dans le cadre du suivi de ces animaux greffés, des prélèvements de sang hebdomadaires à partir de la 2eme semaine post-greffe seront réalisés ainsi que des analyses par imagerie bioluminescence (méthode non invasive) dès l'étape 2, au plus tôt une semaine après la greffe et au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Le maintien de ces souris en hébergement protégé permettra de prévenir tous les risques d’infection. Egalement le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de myélome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, chaque souris sera gardé en vie afiin de subir la procédure suivante ou sera euthanasiée.
Remplacement
Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'efficacité de nos différentes molécules (inhibiteurs chimiques et oligonucléotide) pour induire la mort des cellules de MM (cellules de lignées de MM et cellules primaires de patients atteints de MM). Le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro du fait de sa complexité, de nombreux acteurs impliqués dans le développement tumoral et la résistance aux traitements. Il est par ailleurs impossible de conduire ce type d’expérimentation chez l’Homme rendant indispensable le recours à des modèles murins.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Aussi, avant de mener les expérimentations à visée thérapeutique nécessitant des lots d’animaux importants (10 animaux par lots), les choix des conditions expérimentales seront étudiés en amont sur des lots réduits mais suffisants (6 animaux par lots) afin de trouver la technique la plus optimale en termes de prise de greffe : choix du type de souris (NSG, RagGC ou BRGS), du type de conditionnement (hydroxyurée, busulfan ou irradiation) et enfin du type d’injection (intra-veineuse ou intra-fémorale). Des combinaisons de conditions vont être testées successivement à l'étape 1 (en commençant par les plus relevantes au regard de notre expérience) et si une s'avère pertinente et validée, nous ne testerons pas les autres. Les tailles des groupes de souris sont choisies de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Les statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques car la normalité de la loi sur la population considérée n'est pas certaine. Pour les échantillons indépendants, le test de Mann-Whitney sera appliqué. Pour les échantillons appariés, le test de Wilcoxon sera utilisé. Pour les comparaisons de plus de 2 groupes, les tests non-paramétriques de Kruskal-Wallis (pour les échantillons indépendants) ou de Friedman (pour les échantillons appariés) seront utilisés avec le test de comparaison multiple de Dunn pour comparer chaque groupe par rapport à un groupe contrôle.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Enfin, au cours de nos expérimentations, la caractérisation précise de la propagation/dissémination des cellules de MM dans l’organisme murins au cours du temps sera fait par bioluminescence ; technique non invasive, sans aucun prélèvement, et sans sacrifice des animaux en cours d'expérimentation.
Choix des espèces
Seul un modèle à l'échelle d'un organisme vivant peut reproduire la complexité des interactions entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement et permet d'être au plus près de l'effet obtenu chez l'homme lors du test de nouvelles thérapeutiques. Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de souris sévèrement immunodéprimées pour permettre la prise tumorale. Plusieurs lignées murines sont parfaitement adaptées à ce type de greffes, notamment les RagGC (RAG2-/- IL2 gammaC-/-), les NSG (NOD SCID IL2gammaC-/-) ainsi que les BRGS (BALB/c RAG2-/- IL2gammaC-/- SIRPA.NOD) que nous testerons à l’étape 1. L’espèce avec laquelle nous obtenons la meilleure prise de greffe sera alors utilisée pour l’ensemble des expérimentations aux étapes 2 et 3. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 6 semaines jusqu'à 5 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.