Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 18/03/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-110679)
Un score de douleur relevé lors des examens cliniques déclenche la mise à mort des souris qui atteignent les points limites terminaux. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l’issue pour prélever la moelle osseuse et la rate. Elles reçoivent une alimentation modifiée qui invalide les gènes Asxl1 et Asxl2, subissent jusqu’à douze prises de sang sous anesthésie générale et une injection d’une molécule qui s’intègre dans leur ADN. Le projet, ouvert en 2016, est prolongé pour consolider des résultats déjà obtenus, et l’effectif de 220 animaux n’est appuyé que sur un renvoi aux études publiées.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La mégacaryopoïèse est le processus qui conduit à la formation des plaquettes. Elle a lieu dans la moelle et est régulée par de nombreux facteurs dont des facteurs de transcription et épigénétiques. Les facteurs épigénétiques permettent de modifier l’état de la chromatine (l’ADN) et ainsi d’influencer la transcription. Parmi ces facteurs, nous nous sommes intéressés aux protéines ASXL1 et ASXL2 qui sont mutées dans des maladies hématologiques. L’objectif global de notre projet est d’étudier leurs fonctions dans la mégacaryopoïèse. Nous avons pu démontrer que l’invalidation de ces gènes chez la souris conduit à des anomalies de la mégacaryopoïèse, avec le développement de macrothrombopénies (diminution du nombre de plaquettes dans le sang, associée à la présence de grosses plaquettes), une diminution des progéniteurs mégacaryocytaires dans la moelle osseuse, des anomalies structurales et du contenu en ADN des mégacaryocytes. Par ailleurs, les plaquettes générées sont moins efficaces et donc moins capables de jouer leur rôle dans l’hémostase. Ce projet a été initié en 2016 et nous demandons une nouvelle autorisation pour le finaliser : consolider nos résultats et ajouter de nouvelles expériences visant notamment à étudier le cycle cellulaire des progéniteurs mégacaryocytaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre étude permettra de mieux comprendre le rôle des protéines ASXL1 et ASXL2 dans la mégacaryopoïèse. Nous rechercherons en parallèle si ces facteurs épigénétiques sont altérés chez des patients atteints de thrombopénies et pourront ainsi associer la thrombopénie observée à une cause génétique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : – alimentation spécifique pour induire les pertes de fonction des gènes Asxl1 et Asxl2 – prise de sang bi-mensuelle ou mensuelle sous anesthésie gazeuse pour récupérer et étudier les plaquettes (n=6 à 12, durée 5 minutes, sous anesthésie générale)- injection unique d’une molécule qui s’intègre dans l’ADN des cellules en cycle pour les études de cycle cellulaire (durée 1 minute, sous anesthésie locale).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Lors de nos précédentes expériences, nous n’avons pas constaté de nuisances spécifiques ou effets indésirables associés à la délétion des gènes étudiés. La macrothrombopénie observée n’est pas profonde et n’a donc pas de conséquence clinique. Les nuisances seront donc courtes et légères (légère douleur) et liées aux gavages, aux prises de sang (sous anesthésie générale) et à l’injection unique d’une molécule permettant l’étude du cycle cellulaire).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de chaque procédure, il est prévu de prélever les organes où s’effectuent la production des cellules du sang (moelle osseuse, rate) afin d’étudier les cellules progénitrices des plaquettes, ce qui nécessite l’euthanasie des animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le processus de formation des plaquettes a lieu dans la moelle osseuse et est fortement influencé par l’environnement médullaire (autres cellules environnantes, architecture médullaire) qui est impossible à reproduire in vitro. Par conséquent, un modèle in vivo nous a semblé indispensable, afin de pouvoir étudier le rôle des facteurs épigénétiques dans ce processus. Par ailleurs, ce projet vise à finaliser les résultats obtenus lors d’une demande précédente, l’utilisation du même modèle est donc indispensable. Les approches in vitro ne permettent pas d’obtenir suffisamment de cellules pour les analyses de cycle, ni le maintien pendant plusieurs jours des cellules à l’état de cellules immatures. Enfin, la formation des plaquettes se fait sous l’action du flux sanguin, que nous n’avons pas dans nos systèmes de culture.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous étudions en parallèle les 4 groupes d’animaux d’intérêt (sauvage, délété pour Asxl1, délété pour Asxl2, délété pour Asxl1/Asxl2), afin de n’avoir qu’un seul groupe contrôle. L’étude des plaquettes sur les prélèvements sanguins sera couplée aux analyses médullaires afin de minimiser le nombre d’animaux. Le nombre nécessaire d’animaux a été estimé afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant, en accord avec les études publiées.
3. Raffinement
Les animaux sont observés tous les jours. Un score de douleur est établi en observant le comportement des animaux lors des examens cliniques. Les points limites en découlant et les mesures prévues seront strictement appliquées. Si un signe de douleur est observé, un analgésique pourra être administré et un enrichissement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage (point limite précoce non terminal). Si un amaigrissement est observé, un aliment adapté, plus riche et plus préhensile sera mis à disposition. En cas d’atteinte des points limites terminaux, les animaux seront euthanasiés. Les souris seront anesthésiées lors des différentes interventions procédurales (anesthésie locale ou générale dépendamment des actes).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les modèles murins sont adéquats pour notre étude, car ils nous permettent d’explorer les différentes étapes de la mégacaryopoïèse, dans un modèle mammifère qui reflète en général ce qui se passe chez l’homme. Par ailleurs, les modèles animaux développés nous permettent d’invalider les gènes d’intérêt spécifiquement dans les cellules produisant les cellules du sang. L’invalidation de ces gènes dépend de l’expression d’une enzyme que nous pouvons induire par l’alimentation des souris. Etant donné que nous souhaitons étudier la mégacaryopoïèse adulte, nous induirons les délétions de ces gènes chez les souris autour de 2 mois et étudierons les souris à partir de 5 semaines après induction, soit à partir de l’âge de 3 mois (âge adulte).