Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-624549)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif principal de ce projet est de comprendre comment les motifs d’activité neuronale évoluent au cours du développement postnatal dans l’hippocampe. Pour cela, nous analyserons, grâce à l’imagerie in vivo, l’émergence des séquences et des assemblées neuronales dans la région CA1 de l’hippocampe à partir de la troisième semaine post-natale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet de recherche est essentiel car il permet de décrypter les mécanismes fondamentaux anatomique et fonctionnel par lequel les neurones glutamatergique excitateurs et les neurones GABAergiques inhibiteurs contribuent à la mise en place de la dynamique des réseaux corticaux. Cette recherche fondamentale est indispensable pour comprendre, par exemple, ce qui dysfonctionnerait dans des pathologies neurodéveloppementales tels que les Troubles du Spectre Autistique (TSA).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Nos expériences s’effectuant sur des nouveaux-nés issus majoritairement de lignée murine transgénique hétérozygote, il est nécessaire de pouvoir identifier les individus ET de les caractériser d’un point de vue génétique. Pour cela, nous utiliserons l’ablation de phalange comme méthode d’identification et de caractérisation génétique. Nous suivrons les recommendations émises par le Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale du 03/02/2021. Cette ablation est très rapide (moins de 10s) et se fera à P0, juste avant l’injection de virus. Les expériences d’imagerie calcique seront réalisées sur des animaux âgés entre P13-P40. La raison est de décrire les dynamiques neuronales à partir de la troisième semaine postnatale au stade adulte. Les animaux seront injectés entre P0-P1 avec des Adéno-Associé Virus (AAV) permettant l’expression de sondes calciques (GCaMP6s, jRGECO1a….) ou des marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..) dans le ventricule latéral (temps de l’intervention moins de 15 min). Une fenêtre optique sera placée sur le crâne de la souris à P13 ou P18 (temps de l’intervention moins de 90 min). Deux jours plus tard, les expériences d’imagerie in vivo débuteront et se poursuivront sur plusieurs jours. Un total de 357 animaux est prévu.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux subiront des injections stereotaxiques intraventriculaires à P0 suivies 13 ou 18 jours plus tard d’une chirurgie pour placer une fenêtre optique sur le crâne permettant d’imager l’activité neuronale in vivo. Dans les deux cas, le stress et la douleur seront contrôlés deux fois par jour ; la douleur sera minimisée, si besoin par l’administration d’analgésiques (burprenorphine, 0.1mg/kg/SC). Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin des les expériences d’enregistrement en imagerie calcique, la vérification histologique de la position des neurones enregistrés et de la fenêtre d’imagerie se feront après perfusion intracardiaque d’une solution fixative (4% paraformaldéhyde). Après une analgésie (burprenorphine 6,6ml/kg d’une solution 0.015mg/ml; 0.1mg/kg, SC) suivie 30 min plus tard d’une anesthésie profonde (Domitor à 0.9mg/kg et Zoletil 60mg/kg), la cage thoracique de l’animal est ouverte et une canule est insérée dans le coeur, la solution fixative est alors administrée (1 ml/g). Une fois la perfusion terminée, le cerveau sera prélevé et préparé en fonction des expériences neuroanatomiques suivantes. Les animaux de la portée, âgé de P21 et n’étant pas sélectionnés pour leur profil génétique seront euthanasiés par les zootechniciens par excès de dioxyde de carbone selon le protocole mis en place dans l’animalerie de l’institut.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude des réseaux corticaux, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d’étudier l’organisation morpho-fonctionnelle de la mise en place des activités corticales de l’échelle cellulaire à l’échelle du réseau.
2. Réduction
Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie calcique in vivo permet l’enregistrement d’un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par animal, . De plus, une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs, les nouveau-nés transgéniques non utilisés pour les études développementales seront utilisés dans le cadre d’études menées chez l’adulte et mâles et femelles seront utilisés. L’ensemble de ces points permettent donc de diminuer le nombre d’animaux générés
3. Raffinement
Le bien-être des animaux, qu’il s’agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict postchirurgie des nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d’igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids. Les animaux plus agés seront hébergés et contrôlés dans les mêmes conditions.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les raisons de l’utilisation de modèle murin sont multiples. Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. L’existence de nombreuses et différentes lignées transgéniques permettent de cibler telle ou telle sous-population de neurones comme par exemple les neurones générés tôt. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neuroscience rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. Les expériences seront réalisées sur des animaux âgés entre P13-P40. La raison est de décrire les dynamiques neuronales à partir de la troisième semaine postnatale au stade adulte. Les animaux seront injectés entre P0-P1 avec des Adéno-Associé Virus (AAV) permettant l’expression de sondes calciques (GCaMP6s, jRGECO1a….) ou des marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..) dans le ventricule latéral. Une fenêtre optique sera placée sur le crâne de la souris à P13 ou P18. Deux jours plus tard, les expériences d’imagerie in vivo débuteront et se poursuivront sur plusieurs jours.