Enseignement supérieur et formation professionnelle
Formation aux actes techniques réalisés sur les animaux utilisés en cours de procédures expérimentales
- Enseignement supérieur
Rats : 515
Cochons d'Inde : 475
Hamsters dorés : 150
Lapins : 635
635 lapins, 515 rats, 475 cochons d'Inde, 225 souris et 150 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du "sans réveil" au sévère. Ils sont utilisés pour entraîner le personnel aux gestes techniques, injections, prélèvements, intubations et chirurgie, non pour produire des connaissances mais pour maintenir des compétences. Le porteur reconnaît une douleur et un stress lors des procédures, un hébergement isolé après chirurgie et un risque infectieux. Il présente l'entraînement préalable sur mannequins et sur animaux déjà tués comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet a pour but de maintenir et de compléter les compétences acquises au cours des formations initiales et réglementaires (formation en chirurgie et formation spécifique à l'expérimentation animale) et de ce fait, d'assurer à la fois le bien-être animal et la pertinence scientifique des résultats obtenus lors de ces procédures.
Bénéfices attendus
La maîtrise des actes techniques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, en assurant la pertinence scientifique des modèles expérimentaux et en limitant le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire pour obtenir les résultats escomptés. De plus, ce haut niveau de maîtrise permet de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse que peuvent subir les animaux au cours de leur utilisation.
Procédures
1/Les administrations seront effectuées sur animaux vigiles : injection intradermique, sous cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale et per os. Le temps estimé pour réaliser 1 administration hors intubation est de moins d’1 min. Ajouter 2 min environ pour mettre en évidence le site d’administration à l’aide d’une contention adaptée et 5 min si une tonte de la zone. Les intubations seront réalisées sur animaux anesthésiés. Le temps estimé pour mettre sous inhalation, implique une prémédication (1 min), action des molécules 15 à 20 min, mise sous gaz anesthésique (environ 4 min). Procédure complète : 25 à 30 min. 2/Les animaux seront soumis à des administrations intraveineuses, effectuées vigiles. Le temps estimé pour réaliser 1 administration ou un prélèvement est d’environ 1 min. Ajouter 2 min pour mettre en évidence le site et 5 min si tonte. Procédure complète : 5 à 10 min. 3/Les administrations / prélèvements seront réalisées sur animaux anesthésiés. Le temps estimé pour réaliser 1 administration / prélèvement est de moins d’1 min. Ajouter l’anesthésie (prémédication 1 min) action des molécules 15 à 20 min puis mise sous gaz anesthésique (4 min). Procédure complète : 25 min. 4/Les administrations / prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés. Le temps estimé pour réaliser 1 administration / prélèvement est d’environ 1 min. Ajouter l’anesthésie avec la prémédication (1 min), action des molécules 15 à 20 min, réaliser la tonte et l’aseptie. Procédure complète : 25 à 30 min. 5/Les applications seront effectuées vigiles. Le temps estimé pour réaliser 1 application est d’environ 1 min. Ajouter 2 min pour mettre en évidence le site d’administration et 10 min si une tonte de la zone est nécessaire. Procédure complète : entre 5 et 15 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - douleur et stress lors de la réalisation des procédures expérimentales. - en phase post-opératoire, les animaux pourront être hébergés individuellement de façon temporaire, ce qui peut également causer un stress à l’animal chez les espèces sociables. - effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours : perte de poids ou d’appétit, baisse d’activité, comportements atypiques... - risque infectieux suite à la chirurgie.
Devenir
Utilisation des animaux en continue jusqu’à la mise à mort pour des formations de prélèvements d’organes, de tissus.
Remplacement
Des méthodes de remplacement sont mises en place pour l’acquisition de certaines compétences : par exemple, entrainement sur mannequins ou sur animaux euthanasiés (contention, injection intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvement sanguin intraveineux, administration orale, suture...). Cependant, certains actes nécessitent malgré tout le recours à des modèles animaux pour finaliser la formation des opérateurs dans des conditions les plus proches possible des situations réelles..
Réduction
Le recours aux mannequins ou l’utilisation d’animaux euthanasiés provenant d’autres procédures permet également de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour l’entraînement et la formation du personnel. De plus, la réutilisation d’animaux permet de réduire encore le nombre d’animaux utilisé pour la formation.
Raffinement
Grâce à l’entrainement préalable sur mannequins et sur animaux euthanasiés permettant des gestes plus assurés de la part des opérateurs, les manipulations des animaux provoquent moins de stress. En cas de signes de stress ou de douleur, ou en amont lorsqu’ils sont prévisibles, une analgésie associée si besoin à une anesthésie sera réalisée.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce animale se fera conformément au besoin de la formation, et en adéquation avec les exigences de compétence pour la mise en œuvre des projets. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée.
Modèle expérimental de néovascularisation rétinienne
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 2450
Lapins : 2400
2400 lapins, 2450 souris et 2450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection dans l'œil déclenchant une néovascularisation de la rétine, des instillations, des injections et parfois la pose chirurgicale d'un implant oculaire, avant évaluations après mise à mort. Le porteur affirme que les maladies vasculaires de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l'animal, et décrit démangeaisons et rougeurs comme de simples gênes. Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet de reproduire l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".
Objectifs
L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, d’un modèle expérimental de néovascularisation rétinienne chronique chez le lapin et le rongeur afin de tester l'efficacité de traitements potentiels dans cette maladie. Nous nous baserons sur les données de la littérature, en utilisant un composé qui induit les mécanismes similaires à ceux impliqués dans les complications néovasculaires chez l'homme.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les atteintes vasculaires impliquées dans différentes pathologies est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection intravitréenne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (dans la majorité des cas 6 à 8 administrations maximum par jour). Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin. Les administrations de produit par pose d’implant nécessitent une anesthésie et éventuellement des points de sutures au niveau des conjonctives, de la sclère ou de la cornée. Cet acte chirurgical dure cinq minutes tout au plus et sera réalisé généralement une seule fois, puisque l’implant à vocation à délivrer son contenu sur une longue période. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Si des prélèvements de sang doivent être effectués, ils se feront par ponction et basés sur les recommandations du Gircor et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les maladies vasculaires de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l'animal. Un des effets indésirables attendu dans ce modèle expérimental devrait entrainer une altération de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. Dans le cas où traitement devrait être administré par chirurgie, il s'agira d'une chirurgie permettant l'insertion d'un implant oculaire de taille réduite, une inflammation peut être observée dans les heures suivant l’intervention. La manipulation et l’immobilisation des animaux au cours des différents examens et des différentes administrations devraient engendrer un léger stress malgré toutes les précautions mises en place. Il en va de même pour les lapins lors de la sortie des animaux et leur placement en salle d’expérimentation. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress physique/thermique est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces. Une légère perte de poids peut survenir à la suite de certaines manipulations ou actes invasifs (anesthésie…). Un point terminal est fixé à -20% par rapport au poids du début de l’étude. Elle ne devrait pas être supérieure à 20% d’autant plus que l’accès à l’eau et à la nourriture ne sera pas limité lors de leur stabulation. Des démangeaisons, des sensations de brûlures, des rougeurs palpébrales, des gonflements des paupières sont autant de nuisances attendues et imputables à la composante inflammatoire de la maladie induite par ces procédures. Elles n’occasionneront pas de douleur tout au plus une légère gêne ou un léger inconfort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l'œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l'œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statitiques, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et abris. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilitées. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme.
FORMATION DES CHIRURGIENS A LA REALISATION DE MODELES DE RONGEURS OPERES
- Formation professionnelle
Rats : 1250
2 500 animaux non-humains vont être utilisés, moitié souris moitié rats, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil ou modéré. Chaque animal subit une chirurgie unique de trente minutes à une heure et demie sous anesthésie, avec parfois des injections répétées et un hébergement isolé jusqu'à 21 jours, pour entraîner des techniciens à produire des modèles chirurgicaux standardisés. Le porteur présente cette formation comme un moyen de fournir aux chercheurs des modèles prêts à l'emploi et de mieux prendre en charge la douleur des animaux opérés. Il indique commencer l'entraînement sur cadavres et simulateurs quand la technique le permet, mais juge l'apprentissage sur animal vivant nécessaire pour valider la viabilité du modèle dans le temps.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’assurer le développement et le maintien des techniques du personnel dédié à la réalisation de modèles de rongeurs opérés pour répondre aux besoins des chercheurs dans le cadre de leurs études et protocoles de recherche. Ces formations s’adressent à des techniciens habilités et dédiés aux activités de chirurgie. Les techniciens sont considérés comme habilités après avoir participé à la formation réglementaire en chirurgie expérimentale et avoir reçu, en interne, la formation théorique commune à tout modèle chirurgical par le formateur du service ou le vétérinaire désigné: anatomie générale du rongeur, formation à l’anesthésie et l’analgésie et leur gestion per opératoire, formation à l’asepsie.
Bénéfices attendus
La formation de chirurgiens, selon des procédures et des protocoles prédéfinis, permet de proposer à la communauté scientifique, des modèles d’intérêts prêt à l’emploi, leur permettant d’accroître leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines (mécanismes physiologique, physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention…) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal. Elle permet aussi de proposer des modèles standardisés et homogènes dont la communauté scientifique a besoin pour leurs études. La formation initiale du chirurgien à un modèle cible est nécessaire au préalable à toute mise à disposition d’un modèle chirurgical permettant une bonne anticipation de la procédure, une meilleure reproductibilité par la suite du modèle ainsi qu’une meilleure prise en charge per opératoire de l’animal, contribuant à son bien-être et à la minimisation des nuisances subies.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet analgésiés, anesthésiés et non réveillés ou analgésiés, anesthésiés puis réveillés seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure et demi sous anesthésie général. Selon le modèle et en cas de besoin (douleur, récupération post oépratoire difficile), les animaux pourront être soumis à des injections sous cutanées ou intra péritonéales (maximum 10 injections par jour). Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 21 jours.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids pouvant être provoqué par les contentions, les procédures chirurgicales, la présence du matériel implanté pour les modèles de cathétérisation et d’implantation et la récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel jusqu’à 21 jours si besoin selon le modèle (par exemple : cathétérisation vasculaire couplé à un harnais, partie externe pouvant être dégradée par un congénère).
Devenir
Les animaux sont mis à mort.
Remplacement
La formation des chirurgiens a pour objectif d’acquérir des gestes techniques permettant de mettre à disposition des modèles rongeurs opérés reproductibles et standardisés prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Avant tout entraînement sur un modèle animal, une formation théorique basée sur l’utilisation de supports papiers et vidéos est effectuée. Lorsque cela est possible, l’entrainement pour certains gestes techniques pourront être réalisés sur des supports inertes (simulateur de suture, mannequin de formation). Pour les différents modèles, la validation du chirurgien sera évaluée sur la technique dans un temps imparti, sur la viabilité et la fonctionnalité du modèle dans le temps : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux défini dans notre procédure et utilisé pour la qualification et la requalification de chaque modèle est basé sur la criticité et la technicité du modèle (faible / moyen / forte) ainsi que les expériences précédentes Ce nombre est composé d’un minimum (3 pour la formation, 1 pour la reformation) et d’un maximum (de 25 pour la formation, 10 pour la reformation) afin de pouvoir qualifier le chirurgien lorsque la technique est maîtrisée, dès lors que le nombre minimum est atteint. Cela nous permet également d’avoir un nombre maximum au-delà duquel le technicien n’est pas considéré comme formé. La formation ou reformation s’arrête dès lors qu’un taux de réussite de 100% est atteint pour un lot de 3 ou 1 animaux respectivement, même si le nombre maximum d’animaux n’a pas été effectué. Lors d’une qualification ou requalification sur cadavre ou sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé, nous pouvons utiliser un animal pour l’entraînement de plusieurs gestes techniques de plusieurs modèles, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces animaux peuvent être les surnuméraires non opérés de commandes ou surplus de stock, ce qui contribue aussi à la réduction.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, et dans un milieu enrichi et des points limites en fonction des spécificités du modèle en formation seront appliqués. La première phase de qualification sera effectuée sur des cadavres frais, dès lors que la technique le permet puis sur des animaux analgésiés, anesthésiés et non réveillés. Après les gestes maîtrisés, les chirurgiens effectueront une phase d’entraînement sur animaux analgésiés, anesthésiés et réveillés. Après évaluation de la douleur possible induite par le modèle, le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin (signes d’inconfort ou de douleur, absence de fécès). L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire (ouverture invasive, ouverture de la cavité abdominale, ouverture au niveau de la région crâniale). Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux avant réveil. Pour nos modèles chirurgicaux dont le taux de survie est inférieur ou égal à 80%, une habituation par la manipulation des animaux est effectuée dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche pour ce projet est directement lié au modèle chirurgical ciblé pour la formation. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Ne sont concernés ici que les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec le modèle d’intérêt en formation, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Enseignement pratique de physiologie et d’expérimentation animale sur rongeur (rats et souris)
- Enseignement supérieur
Rats : 200
675 animaux non-humains vont être utilisés, 475 souris et 200 rats, en majorité tués et 25 souris proposées à l'adoption, dans des procédures allant du sans réveil au léger. Les étudiants s'entraînent à la contention et aux injections, mesurent la glycémie après injection de glucose et prélèvements de sang à la queue, tandis que d'autres souris sont euthanasiées pour prélever l'intestin et que les rats sont canulés puis tués sans réveil pour prélever le cœur. Le porteur décrit une formation à la physiologie couplée à la formation réglementaire, réservée aux étudiants volontaires ayant validé leurs examens, et affirme utiliser surtout des animaux de réforme déjà destinés à l'euthanasie. Il revendique le maintien de travaux pratiques sur animaux non-humains comme nécessaire à l'apprentissage des gestes, malgré des simulations numériques employées en amont.
Objectifs
Le projet que nous proposons est un projet de formation des étudiants à la physiologie animale et s'inscrit dans la troisième année de notre parcour. Afin de réduire l'utilisation d'animaux pour la formation d'un étudiant à la physiologie nous avons modifié notre programme de cours afin qu'il soit couplé à la formation réglementaire d'applicateur des procédures et de soins aux animaux décernéé par notre établissement et habilitée par le ministère de l’Enseignement supérieur et la CNEA. Notre formation nécessite la réalisation de travaux pratiques sur des rongeurs pour compléter les connaissances acquises pendant les enseignements par des études expérimentales et pour initier aux techniques de l’expérimentation animale (préhension, contention, anesthésies des animaux, prélèvements d’organes, études de mécanismes in vitro et in vivo). Le maintien des travaux pratiques permet d’augmenter les chances de réussite des étudiants à leur arrivée sur le marché du travail. Ils permettent aussi de maintenir une confrontation directe des étudiants avec l’expérimentation animale et de les conforter dans leur plan de formation ou au contraire de leur laisser la possibilité d’une réorientation afin d’éviter des prises de conscience trop tardive, source d’échec et de difficultés pour les étudiants. Tous les étudiants de la formation n'effectuent pas ces travaux pratiques nécessitant l'apprentissage des techniques d'expérimentation animale. Seul les étudiants volontaires et ayant validés les enseignements de physiologie avec une note supérieure à 10/20 et un examen éthique et réglemantaire avec une note supérieure à 12/20 peuvent réaliser les procédures décrites dans cette saisine. Les autres étudiants réalisent des travaux pratiques sur des logiciels de simulations.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de maintenir une confrontation des étudiants destinés à la recherche médicale avec la manipulation et l'expérimentation animale. Cette confrontation de l'étudiant à la réalité de l'expérimentation animale permet de conforter ou à l'inverse d'infirmer les choix d'orientation des étudiants. Ce projet est aussi nécessaire pour l'initiation des étudiants à la physiologie animale. Avec ce projet, chaque étudiant qui travaille en trinôme aura utilisé en tout 1 animal pour apprendre la contention d'animaux vigiles, les injections sur rongeurs, pour étudier la régulation de la glycémie, la régulation de la pression artérielle, la régulation de la fonction digestive et cardiaque, l’analyse électrocardiographique du cœur, la réalisation d’une culture primaire, mais aussi l’anesthésie d’une souris. Avec un animal (majoritairement des animaux de réformes qui étaient destinés à l'euthanasie pour tri génétique par exemple), les étudiants volontaires, sélectionnés sur leur maitrise de l'éthique et la réglementation en expérimentation animale et ayant les prérequis académiques necessaires à la poursuite de leur cursus en physiologie pourront valider leur diplome de physiologie et la formation réglementaire d'application des procédures et de soins aux animaux. Le couplage de notre formation avec la formation réglemantaire agréeé par la CNEA permet de former directement les étudiants aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et à l'utilisation de méthodes alternatives quand cela est possible. Pour les laboratoires de recherche, cela permet de recruter dès le master 1 des étudiants formés aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et detenteur d'une habilitation d'applicateur des procédures.
Procédures
Durant nos trois procédures les animaux seront soumis à différentes interventions. Dans la première procédure , les animaux seront manipulés par les étudiants afin d'apprendre la préhension, la contention, l'injection intrapéritonéale et la mesure de glycémie. Dans cette procédure ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose suivie de 5 prélevements de 3µl de sang au bout de la queue afin de mesurer la glycémie. Dans la seconde procédure, les souris recevront une injection d'anésthésiant et une injection intrapéritonéale soit d'un régulateur sympathique soit d'un régulateur parasympatique. Certaines souris seront euthanasiées afin de prélever l'intestin et du tissu adipeux dans l'objectif d'étudier la physiologie intestinale et de réaliser une culture primaire d'adipocytes. Dans la troisième procédure les rats reçoivent une injection de morphinique suivie d'une anesthésie sans réveil. Pendant l'anesthésie, les rats sont canulés sur la jugulaire et la carotide afin de mesurer la pression arterielle et de recevoir une injection en intraveineux d'un régulateur sympathique et parasympathique. Ensuite le coeur de ces animaux est prélevé afin de réaliser un TP la physiologie cardiaque.
Impact sur les animaux
Afin d'éviter toute nuisance pour les animaux, les travaux pratiques sont réalisés par trinôme d'étudiants dans un box isolé en présence d'un enseignant. Lors de nos protocoles la préhension des animaux pourra générer du stress. Afin de le limiter, la préhension sera réalisée avec un tube et les animaux seront habitués à être manipulés. Ensuite lors de la contention et des injections intrapéritonéales qui dureront moins d’une minute les animaux ressentiront du stress et la douleur d’une piqure d’aiguille. Pour le protocole de mesure de glycémie comme pour le protocole de mesure d’un électrocardiogramme les nuisances attendues seront aussi du stress lié à la manipulation des animaux et la douleur d’une piqure d’aiguille. Cette nuisance sera très courte et durera moins d’une minute. Pour la mesure de glycémie le protocole nécessite aussi le retrait de la nourriture pendant 6h. Pendant ces 6 heures les animaux pourront néanmoins boire à volonté. Pour les deux protocoles, suite à l’injection qui générera la douleur d ‘une piqure d’aiguille nous gardons la souris sous surveillance pendant 1 heure afin d’observer les signes cliniques et de comportement. Si le comportement de la souris est anormal après l’injection (souris prostrée, qui évite les interactions avec les congénères, saignements apparents) nous procédons immédiatement à son euthanasie. Pour le protocole sur les rats les nuisances attendues seront aussi un stress lié à la préhension et la douleur d’une piqure d’aiguille. Sinon pendant la période d’hébergement le projet n'aura aucun impact sur les 5 libertés individuelles de l'animal. Nos animaux pourront s'alimenter à leur convenance ce qui n'induira aucune sensation de faim ou de soif. Comme nos conditions d'élevages seront adaptées à la physiologie des animaux, nos souris ou nos rats n'auront aucune sensation de peur, de détresse, de stress physique ou thermique et de manque d'interaction sociale. Enfin, notre surveillance régulière aura pour but de prévenir toute douleur, lésion ou maladie sur nos animaux.
Devenir
Quand cela sera possible nous essaierons de placer à l'adoption des souris. Par expérience nous arrivons à faire adopter tous les ans quelques souris aprés l'accord de la vétérinaire responsable de notre animalerie en lien avec la ddpp. Les autres souris seront euthanasiées car non replaçable dans d'autres procédures. De plus dans la plupart des cas, il s'agira de souris qui étaient déja destinées à l'euthanasie et reutilisées pour nos séances de travaux pratiques. Pour les rats il s'agit d'une classe sans réveil ou le coeur est prélevé
Remplacement
Afin de remplacer les animaux nous avons arrété tous les travaux pratiques qui utilisaient des animaux jusqu'en fin de deuxieme année de notre formation. Nous les avons remplacés par des expériences de simulation numérique ou par des vidéos (par exemple pour le comportement). En trosième année de notre formation nous utilisons des logiciels de simulations afin de remplacer au maximum l'utilisation d'animaux. L'utilisation de logiciels de simulation permet parfaitement aux étudiants avec des prérequis académique trop faible , ou n'ayant pas validé les examens sur l'éthique et la réglemantion avec une note supérieure à 12 /20, ou ne désirant pas utiliser d'animaux d'acquerir les compétences en physiologie animale. Pour les autres étudiants le maintient de travaux sur animaux et l'apprentissage des techniques d'expérimentation (contention, préhension, injection ...) l'utilisation d'animaux est necessaire pour l'obtention du niveau d'applicateur des procédures et de soins aux animaux. Cependant pour remplacer les animaux vivants, les étudiants commencent l'apprentissage sur des souris de substitutions en Latex.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés nous avons remplacé des séances de TP initialement pratiquées sur des animaux par des méthodes alternatives utilisant par exemple des logiciels de simulation en expérimentation animale, mais aussi par des supports vidéos que nous avons réalisés. L’enchainement des travaux pratiques est effectué de façon séquencée, cad que nous commençons par les expériences in vivo, puis après mise à mort nous récupérons les organes pour les expériences ex-vivo. Enfin, concernant les souris nous utilisons quand cela est possible des souris de réforme, normalement destinées à l’euthanasie pour tri génétique ou fin de protocole. Pour terminer, afin de réduire le nombre de rats et de souris utilisés dans l'étude, les groupes sont constitués en fonction du nombre strict nécessaire d’animaux pour chaque groupe de TP (il y a 5 trinômes dans chaque groupe d’étudiants et il y a 6 à 8 groupes en moyenne chaque année). Nous prévoyons pour la formation d’un étudiant qui dure 3 ans qu’il utilisera 1 animal. Enfin, pour réduire nous permettons seulement aux étudiants volontaires, avec des prerequis académiques solides et validant des compétences en éthique et reglementation de réaliser les TP necessitant l'utilisation d'animaux. Par cette approche quand dans le passé tous les étudiants utilisés environ 3 souris et 3 rats pour leur formation, aujourd'hui seulement 60 à 70% des étudiants vont utiliser des animaux à raison de 1 animal par étudiant.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, infligées aux animaux nous avons réorganisé complétement nos programmes de physiologie pour intégrer des nouveaux enseignements sur la réglementation, l’éthique, les modèles murins, la prise en charge de la douleur, etc ... Cela permet de sensibiliser et de former les étudiants avant toute manipulation. Concernant l’hébergement, tous nos animaux sont dans un environnement enrichi de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour réaliser des nids. Afin de réduire le stress et la souffrance des animaux au maximum, nous utiliserons un prétraitement avec un morphinique avant l’anesthésie. Les animaux sont manipulés dans des petits box isolés pour réduire tout le stress pouvant venir de l'environnement. Enfin pour terminer l'entrainement des étudiants est d'abord réalisé sur des souris en latex permettant d'apprendre le geste avant d'utiliser des animaux vivants.
Choix des espèces
Nous adaptons les espèces en fonction des besoins. Les rats présentent l’avantage de pouvoir être manipulés plus facilement pour les expériences in et ex vivo. Les souris sont parfaites pour apprendre aux étudiants à manipuler un animal avec moins d’appréhension. Enfin, notre formation d'applicateur des procédures et de soins aux animaux est agréée sur rongeurs souris et rats. Pour les rats nous utilisons une lignée non-consanguine (Srague-Dawley) de 10-14 semaines c’est l’âge idéal d’utilisation des animaux et celui le plus utilisé dans la littérature. Pour les souris : nous utiliserons des souris adultes et quand cela est possible de réforme. L'âge précis n'a pas d'importances dans notre cas. Pour la souche elle peut varier avec les animaux de réforme mais dans la majorité des cas nous aurons des souris de lignée consanguine (C57BL6) et quand nous les commandons nous achetons des souris non consangunes (Swiss) de 10 semaines.
Évaluation de la Sécurité préclinique des candidats médicaments chez les rongeurs génétiquement modifiés ou non (rats et souris) et les non rongeurs (chiens, mini-porcs et primates non humains)
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 4800
Chiens : 540
Cochons : 540
Macaques à longue queue : 1250
13 530 animaux non-humains vont être utilisés, en très grande majorité tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 6 400 souris, 4 800 rats, 1 250 macaques à longue queue, 540 chiens et 540 cochons. Ils reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments, des prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal et, pour les non-rongeurs, la pose chirurgicale d'implants de télémétrie, dans des études de toxicité réglementaire. Le porteur indique qu'une analyse terminale des organes est le plus souvent nécessaire, seuls 10 à 15 % des non-rongeurs pouvant être réutilisés et certains proposés à l'adoption. Il justifie l'emploi de deux espèces, dont un non-rongeur, par les lignes directrices internationales et l'extrapolation à l'humain, aucune méthode ne remplaçant selon lui l'"organisme entier".
Objectifs
Un médicament n’est mis sur le marché pour les patients qu’après plusieurs années de Recherche et Développement. Les études précliniques, en amont des essais chez l’Homme, sont indispensables à l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un candidat médicament. Celles visant à qualifier la sécurité du candidat médicament sont réalisées en accord avec la réglementation qui impose cette évaluation sur deux espèces mammifères, un rongeur (rats ou souris) et un non rongeur (chiens, mini-porcs ou primates non humains) (sauf cas particulier, par exemple pour les anticorps si une seule espèce est pertinente). L’objectif de ce projet est de réaliser des études de sécurité préclinique afin d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments. Pour cela, les procédures mises en œuvre concernent le suivi clinique et biologique des animaux suite à l’administration unique ou répétée du candidat testé, par des voies, la plupart du temps, identiques à celles prévues chez l’Homme, avec des prélèvements de fluides biologiques (par exemple : sang, urines) permettant de mieux caractériser les effets observés. Cela permettra d’avoir des informations essentielles (choix de dose et index thérapeutique) avant la première administration chez l’Homme ou bien de stopper le développement d’un candidat ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité. Ce projet fait partie des prérequis indispensables à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’Homme, efficaces, plus sûrs et mieux tolérés et participe aux progrès scientifiques et biomédicaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter les éléments d’information nécessaires aux prérequis toxicologiques en évaluant la sécurité et les effets indésirables des candidats médicaments chez l’animal vivant. Les avantages attendus sont la protection de l’Homme, d’une part en stoppant le développement de composés pour lesquels la toxicité est rédhibitoire et/ou innocuité insuffisante et d’autre part en fournissant les informations essentielles avant les administrations en clinique (par exemple calcul des index thérapeutiques, caractérisations des effets secondaires attendus, biomarqueurs).
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle par exemple. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. La mise en place d’implants vasculaires par chirurgie provoquera une contrainte de courte durée (douleur légère, baisse d’appétit par exemple).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Le projet est réalisé sur animal vivant car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. Il n’existe pas de méthode substitutive pour remplacer l’ensemble des études menées pour l’évaluation des risques en sécurité préclinique. Cependant, l’utilisation de méthodes in silico (modélisation informatique) et in vitro (par exemple organ-on-chip) mimant la structure et la fonction d’un organe (par exemple : foie, cœur, rein) permet un premier criblage des futurs candidats ou de mieux caractériser l’atteinte de telle ou telle fonction.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance, un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l’utilisation d’animaux contrôles n’est pas systématique et est soumis à réflexion en fonction des objectifs de l’étude. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Pour certains gestes techniques, une phase de désensibilisation/habituation est faite en amont de l’étude pour diminuer le stress de l’animal. L’administration est associée à une récompense physique (caresses, félicitations avec la voix) et/ou alimentaire. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie et avec l’utilisation d’une analgésie multimodale. Le suivi clinique, au moins quotidien des animaux, permet la détection précoce de toute douleur, inconfort ou détresse et la mise en application de critères d’arrêt anticipés supervisée par le Directeur d’étude, le Vétérinaire clinicien et la Structure en charge du Bien-Etre Animal, afin que les animaux ne subissent pas plus qu’une contrainte modérée.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par : -les lignes directrices internationales (ICH) définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique (par exemple, les primates non humains pour les biologiques). Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.
Formation initiale des étudiants de Master Biodiversité, Ecologie et Evolution à l’abord des espèces piscicoles
- Enseignement supérieur
100 poissons d'eau douce vont être utilisés, sans mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des étudiants de master s'exercent sous anesthésie au marquage par puce intramusculaire ou marque externe sur des cyprinidés et des percidés, et à l'échographie de reproduction sur des esturgeons du Danube. Le porteur reconnaît que l'injection de la marque dans le muscle dorsal correspond à une plaie cutanée pouvant pénétrer les fibres musculaires selon le geste de l'étudiant. Les poissons marqués sont ensuite relâchés ou remis dans leur bassin, une partie des esturgeons pouvant être réutilisée l'année suivante, et le porteur affirme qu'il est difficile de remplacer entièrement l'animal vivant dans cette formation.
Objectifs
L’objectif du projet est de faire acquérir aux étudiant(e)s la démarche pratique du biologiste aquacole. Dans un premier temps, les étudiant(e)s observent les différentes espèces de poissons d’eau douce vivant en canal ou bassins sur la station d’expérimentation, puis assistent à leur capture (deux méthodes montrées : la pêche à l’électricité et le guidage manuel vers une bâche de contention, méthode adaptée aux spécimens de grande taille) avant de réaliser quelques manipulations de base, nécessaires pour mettre en œuvre des contrôles et suivis biologiques. Après des démonstrations vidéos des gestes attendus, il s’agit, à l’occasion de deux ateliers, de faire pratiquer les étudiant(e)s sur poisson vivant et leur permettre ainsi l’apprentissage des gestes et bonnes pratiques d’échantillonnage/manipulations. L’identification des espèces, l’anesthésie du poisson et un marquage “simple” (injection intramusculaire d’une micropuce électronique de 12mm ou insertion d’une marque visuelle (spaghetti) externe) font l’objet de l’atelier “Marquage” effectué sur des espèces communes d’eau douce, essentiellement des Cyprinidés et des Percidés. Anesthésie, biométrie, contrôle d’identification (lecture du pit-tag porté par l’animal) et examen échographique de l’avancement de la maturité font l’objet de l’atelier “Echographie” effectué chez l’esturgeon du Danube Acipenser ruthenus conservé à la station. Dans le 3ème et dernier atelier, les méthodologies de suivi des espèces aquatiques par biotélémétrie sont présentées et les étudiant(e)s s’initieront à la pratique d’un suivi manuel par télémétrie radio ou acoustique sans utilisation d’animaux (attachement du capteur sur objet inerte téléguidé).
Bénéfices attendus
Ce projet permet aux étudiant(e)s d’aborder le poisson vivant et d’utiliser les anesthésiques en balnéation qui en facilitent l’approche, ainsi que de s’initier à des méthodes de marquage et de contrôle (pit-tag, échographie) peu ou non invasives couramment utilisées dans les suivis biologiques terrestres ou aquatiques en laboratoire ou milieu naturel. Etant en dernière année de leur cursus d’études en M2 Pro-Parcours Biodiversité et suivis environnementaux (BSE), les étudiant(e)s seront amené(e)s à effectuer leur stage dans des structures (laboratoires de recherche, ONG, associations de protection animale et environnementale, conservatoires des espaces naturels, bureaux d'études, ...) mobilisant fréquemment ces compétences, en particulier avec le développement croissant des pratiques de biotélémétrie (qui feront l’objet du 3ème atelier où les étudiant(e)s s’exerceront, sans utilisation d’animaux, aux technologies existantes pour le milieu aquatique). Bien que leurs enseignements théoriques soient plutôt orientés vers l’écologie terrestre, certain(e)s étudiant(e)s seront amené(e)s à côtoyer des espèces aquatiques dans leur pratique professionnelle. La formation sera particulièrement axée sur le bien-être animal (BEA) lors des manipulations, l’objectif étant bien l’apprentissage sur du vivant dans une démarche éthique. Aussi, des documents sur le raffinement des méthodes (« Marquage, bonne pratique et bien-être ») étayé par de nombreux cas d’études chez le poisson seront-ils fournis à chaque étudiant(e), complétés par un cours (1.5h) qui leur sera donné dans la même semaine sur la règlementation en matière de BEA en expérimentation animale.
Procédures
Pas de manipulations sur animaux vigiles, ni de procédures chirurgicales intrusives, ni de prélèvements tissulaires. Les procédures sont rapides, peu ou non invasives et concernent des individus différents (pas d’enchaînement des actes). – Atelier Marquage : les poissons cyprinidés et percidés pêchés à l’électricité dans le canal de la station sont placés en bassin pour observation et détermination des espèces par les étudiant(e)s avant d’être mesurés et marqués. Les poissons seront marqués une fois. Deux types de marque sont implantés : la marque spaghetti (au niveau des rayons de la nageoire dorsale) et le pit-tag (en intramusculaire entre la tête et la nageoire dorsale). Une seule marque est utilisée par poisson. Les repères anatomiques sont présentés aux étudiants avant marquage (vidéo) et ils peuvent s’entrainer au maniement de l’injecteur sur des objets inertes (bananes). L’ensemble des interventions sur l’animal (hors pêche) durent moins de 5 minutes et se font sous anesthésie. Après marquage (un poisson par binôme d’étudiant(e)s), l’animal est placé en bassin de réveil pour observation puis relâché dans le canal à la fin du TP. – Atelier Echographie : des géniteurs d’esturgeon du Danube conservés en bassins d’élevage sont placés 2 à 3 jours avant le TP dans un bassin de stabulation spécifique d’où ils sont ensuite prélevés un à un manuellement par les soigneurs. Le poisson (un pour 2 binômes) est transféré par les étudiant(e)s dans le bain anesthésiant situé à proximité, à l’aide d’une bâche de transport. Une fois anesthésié, l’animal est mesuré, identifié (lecture de sa marque pit-tag), observé (état sanitaire) et échographié (examen des gonades et autres organes). Les poissons seront manipulés une fois et sous la surveillance des soigneurs pour aider à la reconnaissance/interprétation des images de l’échographie et fiabiliser la pré-sélection (ou pas) des individus pour de futures reproductions. L’ensemble des interventions durent moins de 15-20 minutes et se font sous anesthésie. Après l’échographie, l’animal est replacé dans le bassin de stabulation (dans un compartiment dédié au réveil) pour observation jusqu’à recouvrement de sa pleine capacité de nage et de prospection, et libéré (cloison amovible) à la fin du TP.
Impact sur les animaux
Les procédures sont rapides, peu ou non invasives (soit respectivement, l’injection dorsale d’une marque de petite taille ou l’échographie) et concernent des individus différents (pas d’enchaînement des actes). Dans chacun des 2 ateliers, toutes les manipulations pratiquées se font sous anesthésie générale (par balnéation) puis les poissons sont replacés dans le canal ou le bassin d’origine après leur réveil. Il n’y a donc que peu d’effets indésirables attendus. Malgré tout, la nuisance de l’injection d’une marque (même petite) dans le muscle dorsal correspond à une blessure tissulaire de type plaie cutanée au point d’entrée pouvant se prolonger dans les fibres musculaires de façon plus ou moins importante selon le diamètre et la profondeur de pénétration de l’aiguille dans la musculature du poisson. L’injection par voie intramusculaire a été néanmoins privilégiée en première approche pour les étudiant(e)s car elle est adaptée par rapport à la taille des poissons sélectionnés vis-à-vis des marques utilisées et semble la moins risquée pour l’animal, même si le geste de l’étudiant(e) manque de précision (contrairement au marquage abdominal plus complexe pour des néophytes et plus dangereux pour le poisson, avec un risque de perforation des viscères). Donc en plus de la vidéo présentée et de l’entraînement proposé (injection sur bananes), le marquage du poisson sera surveillé de près et de bout en bout par les formateurs qui guideront les étudiants dans leurs gestes techniques à chaque étape pour limiter au maximum la sévérité de la blessure occasionnée.
Devenir
En fin de procédure 1 (pêche à l’électricité suivie d’un marquage dorsal par pit-tag ou marque visuelle spaghetti), les animaux endormis sont placés en eau claire dans un bassin de réveil pour que les étudiant(e)s puissent observer les différentes étapes du réveil. Tous les poissons marqués qui ont un comportement de nage normal à l’issue du réveil seront relâchés dans le canal d’origine. Le relâcher de l’ensemble des animaux (marqués ou non) ne sera effectué qu’à la fin du TP pour éviter tout risque de recapture lors de la seconde séquence de pêche électrique. S’agissant d’un TP prévu annuellement sur une durée de projet de 5 ans, tous les poissons capturés chaque année dans le canal (exclusivement pour le TP) seront systématiquement contrôlés, visuellement et/ou avec un lecteur de marque pit-tag, pour pouvoir être écartés (s’ils sont déjà marqués) des ateliers Marquage ultérieurs. En fin de procédure 2 (biométrie et échographie sur esturgeon du Danube), les animaux endormis sont replacés en eau claire dans leur bassin d’attente. Ils y sont maintenus isolés en compartiment de réveil (séparation par cloison amovible) pour pouvoir être observés jusqu’au recouvrement de leurs pleines capacités de nage et de prospection. La cloison amovible n’est retirée qu’à la fin du TP pour éviter tout double emploi des poissons entre groupes d’étudiant(e)s. Ensuite, les individus dont les indicateurs semblent favorables pour la reproduction seront conservés en bassin d’attente où ils resteront 2.5 mois (mi-janvier à début avril) jusqu’au contrôle final de leur maturation ; les autres, non pré-sélectionnés, seront remis dans le bassin d’élevage par les soigneurs à la fin du TP. En conséquence, ces poissons non pré-sélectionnés en année N et replacés avec le stock peuvent être de nouveau échographiés par des étudiant(e)s l’année suivante (même si la probabilité est faible en raison de la petite taille de l’effectif examiné en TP (n=7 individus/an maximum) par rapport au stock de géniteurs (n≈200 actuellement)). Enfin, les esturgeons qui se sont déjà reproduits ne seront pas ré-impliqués (gestion génétique et démographique du stock captif) et donc pas mis à disposition des étudiant(e)s.
Remplacement
Les étudiant(es) du Master Pro BSE disposent d’assez peu d’enseignements pratiques relatifs aux suivis biologiques terrestres ou aquatiques qu’ils pourront être amenés à faire en tant que biologistes dans leur pratique professionnelle, et il est difficile de remplacer (totalement) les animaux vivants par d’autres outils pédagogiques dans le cadre de leur dernière année de formation. Une vidéo a été réalisée pour expliquer et montrer aux étudiant(e)s la démarche et les gestes techniques inhérents à chaque atelier pour qu’ils voient déjà ce qu’il faut faire avant la séance ; cela remplace l’usage d’un poisson par séance pour la démonstration. Dans l’atelier 3, après présentation des méthodologies de biotélémétrie utilisées en milieu aquatique (vidéos), les étudiant(e)s s’initieront à la pratique d’un suivi manuel par télémétrie radio ou acoustique sans utilisation d’animaux (attachement du capteur sur objet inerte téléguidé).
Réduction
Les étudiants travaillent en binôme, un poisson est utilisé pour 2 étudiants pour réduire le nombre de poissons impliqués. Pour l’atelier “Echographie” sur l’esturgeon du Danube, ce sont 2 binômes qui travaillent simultanément sur le même poisson.
Raffinement
Toutes les manipulations se font sous anesthésie générale par balnéation pour limiter le stress des animaux. De plus, - pour les marquages, les animaux sont pêchés à l’électricité par des opérateurs habilités avec un appareil réglé pour une électrotaxie rapide des poissons sans tétanie. Après stabulation en bassin (eau du canal en circuit ouvert) de courte durée pour déterminer les espèces, les poissons choisis (taille suffisante, comportement/aspect normal : absence de lésions, calme, nage régulière) sont anesthésiés par balnéation (environ 4-5 min jusqu’à perte totale de l’équilibre) puis marqués en moins de 5 min par injection d’un pit-tag de 12mm en intramusculaire ou d’une petite marque visuelle externe (type spaghetti) sur leur nageoire dorsale. En routine, les marquages de ce type utilisés pour identifier les poissons, rapides et peu invasifs, sont réalisés sous anesthésie légère (dose sédative) mais ici, une anesthésie un peu plus profonde est privilégiée pour limiter le risque de souffrance animale durant l’apprentissage du geste par les étudiant(e)s. Injecteurs et zone d’implantation des marques sont tous désinfectés et les bains anesthésiants renouvelés et aérés (bulleur) si nécessaire. Enfin, avant de commencer, chaque étudiant(e) peut s’entrainer au maniement de l’injecteur sur des objets inertes (bananes) et les repères anatomiques qui leur ont été présentés au préalable (vidéo) sont rappelés à chaque marquage, surveillé par le(s) formateur-trice(s). - pour les échographies, les esturgeons sélectionnés de la même manière (état physique, comportement, nage) et placés en bassin de stabulation d’attente (eau de rivière ; débits, température et oxygène surveillés quotidiennement) 2 à 3 jours avant l’échographie pour faciliter la surveillance et l’accès aux animaux (densité de poissons réduite : 3-3.5 kg/m2), sont d’abord mis à jeun 24h (pour réduire les risques de régurgitation/contamination fécale) puis transférés un à un dans un bain anesthésiant à l’aide d’une bâche de transport (pour éviter de possibles lésions par frottements et conserver les animaux dans le noir afin de réduire le stress). En routine, le contrôle de pré-sélection d’esturgeons matures par simple échographie se fait sur animaux vigiles, en moins d’1 min par poisson sans provoquer d’altération du comportement. Mais pour le TP, tous les actes sont pratiqués sous anesthésie profonde pour supporter une durée d’intervention a priori de 15-20 min sous la surveillance des soigneurs.
Choix des espèces
Les espèces choisies pour l’atelier 1 (pêche à l’électricité/marquage) sont des cyprinidés et des percidés provenant de la rivière alimentant la station d’expérimentation, qui sont entrés à l’état larvaire et qui grandissent dans le canal approvisionnant les bassins extérieurs. Ces espèces d’eau douce sont communes en France, et sont donc les plus susceptibles d'être rencontrées par les futurs biologistes dans leur pratique professionnelle. L’espèce choisie pour l’atelier 2 (échographie) est l’esturgeon du Danube Acipenser ruthenus, une espèce élevée sur notre site pour des essais de biologie de la conservation. Les poissons utilisés dans l’atelier 1 sont au stade adulte pour faciliter la reconnaissance des espèces, les manipulations et les marquages (ratio poids marque/animal adapté), soit des individus d’environ 20 à 25 cm selon l’espèce considérée. Les esturgeons utilisés dans l’atelier 2 sont des adultes géniteurs des deux sexes, de suffisamment grande taille pour faciliter l’examen échographique et déterminer l’état d’avancement de leur maturité (soit des individus de 80 à 100 cm et de 3 à 5 kg).
Formation et entrainement aux gestes techniques chez le rongeur de laboratoire (souris et rats)
- Formation professionnelle
Rats : 400
2 500 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce sont des animaux de surplus d'élevage, déjà destinés à la mise à mort, sur lesquels des personnes en apprentissage s'entraînent aux injections, aux prélèvements sanguins et aux perfusions, chaque animal subissant jusqu'à deux administrations et un prélèvement. Le porteur admet que des gestes encore mal maîtrisés peuvent rendre la contention plus longue et le geste plus douloureux. Il affirme que les réactions de l'animal vigile restent "indispensables" et ne peuvent être reproduites par des méthodes de remplacement, et présente le projet comme une réduction puisqu'il utilise des animaux voués à la mort.
Objectifs
L'utilisation d'animaux dans la recherche est parfois nécessaire, la recherche sur les cellules ou les modèles informatiques ne suffisent pas et il est parfois nécessaire de travailler sur organisme entier notamment en raison des nombreuses intéractions qui existent entre les différents organes. Ainsi l'utilisation des animaux de laboratoire permettent l'amélioration des connaissances de maladies complexes et la mise au point de traitement. L'espèce la plus utilisée étant la souris pour plusieurs raisons. La souris partage 90% de ses gènes avec l'Homme, peut souffrir des mêmes maladies (obésité, diabète, cancer...), supporte bien la consanguinité (lots d'animaux homogènes d'un point de vue génétique) et peut être modifiée ganétiquement (OGM avec par exemple invalidation d'un gène d'intérêt), peut aussi être modifiée au niveau de son microbiote (souris axéniques) et il existe de nombreux outils d'analyse (anticoprps par exemple). L'avantage aussi est la petite taille, elles est facile à héberger sous statut sanitaire défini, à élever et à manipuler. Il est important de savoir manipuler l'espèce dont on a besoin dans son projet scientifique, la réglementation demande à ce que le personnel soit formé et compétent. Les établissements utilisateurs accueillent le personnel des équipes de recherche qui va être amené à travailler sur les espèces souris et/ou rats dans le cadre de leurs projets de recherche. Le personnel de l'établissement utilisateur a pour rôle d'accompagner les utilisateurs et certains utilisateurs ont besoin d'être formés aux gestes techniques sur les animaux. Hormis la formation réglementaire (applicateur et concepteur), les utilisateurs ont parfois besoin de se former et s'entrainer en interne en fonction des besoins de leurs projets. Le personnel de l'établissement est formé, compétent et titulaire des formations réglementaires (concepteur ou applicateur et chirurgie expérimentale) et également à jour pour la formation continue. Le programme de ces formations en interne et la validation des gestes est assuré par le responsale du suivi des compétences de l'établissement. Le présent projet a pour but de lister certains gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme dans le cadre d'apprentissage ou de training. Le projet global va utiliser au maximum 2300 animaux mâles et femelles de tout âge ne présentant pas de gène d'intérêt, n'ayant pas de phénotype dommageable et dont l'état de santé a été jugé satisfaisant.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de former les nouveaux entrants (zootechniciens nouvèlement recrutés ou personnels d'équipes de recherche utilisateurs du service de zootechnie) et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie. La formation permet aussi d'éviter les biais et les erreurs, si la personne ne maitrise pas totalement les gestes, lors de la réalisation des projets scientifiques.
Procédures
Les gestes enseignés et/ou pratiqués seront diverses injections (intra-péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse...), des prélèvements sanguins sous anesthésie et des perfusions. Des tests d'anesthésie pourront également être faits lors de la mise en place d'un projet incluant de la chirurgie ou dans le cadre du raffinement des procédures d'anesthésie. Chaque animal pourra faire l'objet au maximum 2 administrations (gavage ou injection) et d'un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Ce projet est réalisé pour valider ou former aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins des personnes pouvant être novices, il est donc possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…).
Devenir
Après utilisation de ces animaux, ils seront mis à mort, comme cela était intialement prévu puisqu'il s'agit d'animaux non-utilisés (surplus d'élevage).
Remplacement
Pour l'apprentissage de l'approche de l'animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l'animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d'aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d'élevage, qu'il est prévu de mettre à mort dans la semaine. Nous réduisons également au maximum le nombre d'animaux utilisés pour chaque personne. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal 3 animaux par participant sont nécessaires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages de portoir ventilé, en groupe, avec de l'eau et de la nourriture ad libitum et de l'enrichissement (une maison + de quoi faire un nid). Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel compétent qui vérifie l'état des animaux, le niveau du biberon et de la mangeoire. En cas de signes cliniques détectés, l'information est remontée et des points limites adaptés sont appliqués.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les animaux de laboratoire utilisés dans le service de zootechnie Les animaux seront utilisés en fonction de leur disponibilité. Le critère d'âge n'est pas restrictif sur l'utilisation de ces animaux.
Acquisition et maintien des compétences techniques en chirurgie expérimentale et analyse comportementale
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter un dispositif de mesure, puis des tests d'équilibre, de motricité et des mesures auditives et vestibulaires dont le nystagmus post-rotatoire. Ces procédures ne visent pas à produire des connaissances mais à maintenir les compétences techniques du personnel, dont la validité expire tous les six mois dans l'établissement. Le porteur décrit le remplacement comme "difficilement applicable" puisque l'objectif est l'entraînement au geste lui-même.
Objectifs
La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Ce projet est dédié au maintien des compétences des personnels maîtrisant les gestes techniques impliqués dans ces 2 procédures. Ceux-ci ayant une durée de validité de 6 mois dans notre établissement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux spécifiquement pour ce maintien de compétence. Ainsi, la bonne formation du personnel permet 1) d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués, et 2) d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Cette demande d’autorisation de projet a un double objectif : 1. Former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permettra une montée en compétence des expérimentateurs et donc in fine une diminution probable des mauvaises manipulations pouvant conduire à des mises à morts inutiles ou à des reproductions d’expérimentation. 2. Raffiner les procédures expérimentales, notamment évaluer la possibilité de réaliser diverses procédures fonctionnelles et comportementales sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures afin 1) d’améliorer la santé et le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal pratiqués et 2) d’optimiser les procédures expérimentales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Procédure 1 : Mesure de l'activité cérébrale et analyse comportementale de la fonction motrice chez le rat. La procédure comporte une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispostif de mesure de l’activité du cerveau. Ensuite, des tests de comportement (30min au total) sont effectués pour évaluer la motricité et l’équilibre de l’animal. Procédure 2 : Mesure du nystagmus post-rotatoire et évaluation des fonctions vestibulaire et auditive. La procédure inclut une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispositif de fixation pour réaliser le test du nystagmus post-rotatoire (10min). Ensuite, des tests de comportement (10min au total) sont effectués pour évaluer l’équilibre de l’animal. Enfin, des mesures auditives sous anesthésie médicamenteuse sont pratiquées (20 secondes de mesure ; 1h pour le reveil de l’animal dans une armoire chauffante).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux chirurgies crâniennes.
Devenir
La totalité des animaux prévus dans ce projet sont mis à mort à la fin de la procédure les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.
Remplacement
Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale. Les mesures fonctionnelles, comportementales et de mises à mort n’offrent pas cette possibilité.
Réduction
Ce projet vise à former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permet une montée en compétence des expérimentateurs et donc une diminution probable des mauvaises manipulations. Une approche de formation « centralisée » sera mise en œuvre afin que plusieurs personnes puissent assister simultanément aux procédures. L’utilisation de chaque animal est optimisée autant que possible pour réaliser à la fois des explorations fonctionnelles et comportementales : - Les animaux dont l'activité cérébrale est mesurée sont également utilisés pour les tests comportementaux et mis à mort pour l’analyse histologique. - Les animaux dédiés à la mesure du nystagmus post-rotatoire sont également utilisés pour les tests comportementaux, la mesure des produits de distorsion acoustiques, les dosages sanguins et mis à mort pour l’analyse histologique. Ceci permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures.
Raffinement
- Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Après chaque procédure invasive, un suivi renforcé des animaux sera réalisé afin d’identifier toute forme de souffrance ou d’atteinte de point limite ; - Les animaux seront hébergés à plusieurs par cage à chaque fois que cela est possible ; - Un enrichissement varié (tunnel, éléments de nidification, briquettes en bois) leur sera apporté ; des friandises issues de fournisseurs d'aliments pour animaux de laboratoire leur seront données après la réalisation des gestes ; - Si possible, les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins une semaine avant le début des tests.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal s’est porté sur le rat Long Evans. Le rat est un des modèles recommandés dans les lignes directives de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques, domaine d’expertise du laboratoire. La souche Long Evans a été choisie car il est possède une oreille interne plus proche de l’Homme que celle des rats Albinos. Les procédures sont réalisées sur des rats adultes afin que la croissance du crâne soit terminée, et permettre ainsi les chirurgies crâniennes.
Infestation des souris avec des vers de taenia à des fins de tests comportementaux et physiologiques
- Enseignement supérieur
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à des fins d'enseignement universitaire. Chaque animal est infesté chirurgicalement par le ver Taenia crassiceps, gardé 70 jours, puis soumis à des tests comportementaux (open field, planche à trous, boîte claire-obscure, néophobie, rotarod) avant la mise à mort et le prélèvement des parasites. Le porteur décrit un projet pédagogique servant de "fil rouge" sur trois années de licence pour 200 à 250 étudiants. Il affirme qu'une partie des résultats repose sur une "approche pédagogique alternative" par analyse bibliographique.
Objectifs
Taenia crassiceps est un parasite à cycle complexe qui possède comme hôte définitif un canidé sauvage ou domestique et comme hôte intermédiaire un rongeur. Chez l’hôte intermédiaire la souris, le parasite réalise une multiplication asexuée intense. L’augmentation de la charge parasitaire est associée à une modification des taux d’hormones sexuelles chez les souris. Les souris femelles voient leur taux d’œstrogène augmenter très significativement. Les souris mâles arrêtent de produire de la testostérone et produisent des œstrogènes ce qui conduit à une féminisation des mâles hormonalement parlant. Ces changements hormonaux s’accompagnent de modifications profondes de la réponse immunitaire et des comportements des souris parasitées. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir étudier l’ensemble de ces modifications et du fonctionnement de cette interaction hôte parasite au travers de plusieurs enseignements réalisés en Licence de biologie en Licence 1ère année sera étudiée la multiplication asexuée par bourgeonnement du parasite, en licence 2ème année seront quantifiés les taux d’hormones sexuelles dans le sang de souris mâles et femelles, en licence 3ème année sera étudiée la réponse immunitaire des souris saines et infectées par le parasite ceci par l’intermédiaire de numérations lymphocytaires sur frottis sanguins et les comportements des souris saines et parasitées seront analysés en focalisant sur des comportements de stress et de mesure de la capacité physique des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet pédagogique permet aux étudiants d’aborder dans un modèle d’interaction hôte parasite de nombreux concepts écologiques, physiologiques, endocrinologiques et moléculaires. L’idée de ce projet est un fil rouge que les étudiants analysent tout au long de leurs trois années de licence et qui leur permet de comprendre comment un parasite peut prendre le contrôle de son hôte à son profit, ceci leur permet de développer des analyses intégratives des molécules aux populations pour comprendre comment cette prise de contrôle s’opère. Ceci est déterminant pour les apprentissages que l’équipe pédagogique souhaite que les étudiants maîtrisent en fin de Licence afin de les former au mieux pour leur poursuite d’étude en Master.
Procédures
Infestations expérimentales de souris par les larves du cestode Taenia crassiceps par chirurgie. Une seule intervention chirurgicale est pratiquée chez les animaux, l'acte chirurgical dure environ 8 minutes / animal. Les animaux sont ensuite gardés à l'animalerie 70 jours avant euthanasie et prélèvement de sang et des parasites. Les animaux sont soumis à des tests comportementaux réalisés par les étudiants sur souris saines et infectées (openfield, planche à trous, boite claire/obscure, néophobie, rotary road), pour chaque souris, chaque test comportemental est réalisé pendant 60 secondes d'observation.
Impact sur les animaux
Les nuisances qui peuvent être attendues sur les animaux sont liées à la chirurgie pratiquée pour l’infestation. L’infestation est réalisée par une incision extrêmement réduite (3 mm), un seul point de suture est réalisé pour refermer l’incision. De plus, la gestion de la douleur post-opératoire est assurée par une injection sous-cutanée de Buprénorphine toutes les 12h pendant 24h. Le développement des larves dans la cavité péritonéale ne provoque pas de nuisances sur les tissus des rongeurs. Les larves du parasite sont libres dans la cavité péritonéale et ces larves se nourrissent par osmotrophie trans-tégumentaire sans aucun effet direct sur les tissus de leur hôte. A 70 jours, la charge parasitaire est faible chez les animaux et ces derniers sont euthanasiés avant que le parasite n’induise de potentielles souffrances chez l’animal.
Devenir
Le but du projet est de produire des parasites de l'espèce Taenia crassiceps et de récupéré du sang chez la souris souris, ainsi que d'étudier les comportements des animaux. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites et le matériel biologique afin d'assurer l'ensemble des approches pédagogiques envisagées.
Remplacement
IImpossible, on ne peut pas réaliser le cycle du parasite in vitro. Il n'existe pas non plus de culture cellulaire permettant de mener des approche similaires in-vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte intermédiaire pour être maintenu et la souris est connue pour être l’hôte intermédiaire privilégié pour cette espèce de cestode. La technique d’infestation chirurgicale permet de maintenir en laboratoire le parasite par transfert des parasites de souris à souris et donc en ne manipulant exclusivement que le stade larvaire du parasite, sans ne jamais passer par le stade adulte. Dans la stratégie 3R , le nombre d'animaux utilisé est le plus faible possible car nous veillons à ce que ce soit les mêmes animaux qui soient utilisés pour les tests comportementaux et pour ensuite la récupération des échantillons biologiques utilisés par les étudiants. Pour limiter également l'utilisation des animaux, une partie des analyses et des résultats exploités par les étudiants sont acquis à partir d'une approche pédagogique alternative reposant sur l'analyses bibliographiques de la litérature scientifique existante sur le sujet des modifications physiologiques et comportementales induites par les parasites chez leurs hôtes.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été pensé pour réduire au maximum les animaux utilisés tout en maintenant un travail statistiquement et scientifiquement robuste de la part des étudiants. Un total de 360 souris sera utilisé dans ce projet et cela permet de travailler avec les étudiants de 3 années de Licence dans 4 matières d’enseignement ce qui représente un contingent total d’environ 200 à 250 étudiants selon les années. La souris permet de produire des parasites et le matériel biologique nécessaire à l’ensemble des approches proposées sans ressentir de souffrance ou mortalité précoce. Le nombre d’animaux est basé sur 6 lots de 6 souris mâles ou femelles saines et parasitées. 6 lots car les étudiants en TP sont répartis en 6 groupes de 3 étudiants (trinômes) qui pourront chacun travailler avec 6 souris par conditions expérimentales afin d’avoir un nombre suffisant de réplicas biologiques pour mener des approches statistiques robustes. Pour les tests comportementaux les mêmes lots de souris sont utilisés. Le sang récupéré chez les souris à 70 jours d’infection est suffisant pour faire travailler l’ensemble des autres groupes d’étudiants de licence 1ère, 2ème et 3ème année toujours dans ce même objectif de réduire le nombre de souris qui sont utilisées. Ainsi le besoin annuel en animaux s’élève à 72 souris par an.
Raffinement
Nous avons fixé le nombre optimal de parasites qui sont utilisés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de cestodes et d’induire les modifications physiologiques et comportementales sans engendrer de mortalité chez la souris. Le temps de développement au sein de l’animal a également été optimisé pour récolter les parasites et les échantillons biologiques avant que la pathologie induite par le parasite soit dommageable pour la souris hôte. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Pendant le développement du parasite chez l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu. La mortalité ne survient jamais suite à l’infestation. L’infestation par chirurgie pour le transfert des larves du cestode peut être une source d’inconfort pour l’animal, mais des soins post-opératoires sont prévus afin de palier à ces potentielles souffrances, le protocole a été pensé pour éviter tout signe de souffrance. Cependant, durant cette période de développement parasitaire, tout rongeur retrouvé en souffrance, score de 3 dans les points limites (voir annexe 1), est euthanasié par un personnel habilité. L’euthanasie peut également être effectuée par le RBEA. Les points limites sont : la pâleur de l’animal, la perte de contacts sociaux, le dos vouté, le poil hérissé, les yeux mi-clos, diminution ou arrêt de l’alimentation, l’immobilité ou le museau gonflé ; le pointage pour chacun de ces points limites est de 1 ou 2. Chaque animal ayant un score égal ou supérieur à 3 est euthanasié au CO2. Aucune médication n’est donnée car l’infestation par le parasite n’est pas réversible ; aucune médication ne peut être donnée car elle interfère avec le développement du parasite. Le point d’arrêt a été fixé à 70 jours post-infestation. Avant chaque séance de travaux pratiques l'enseignant responsable et le technicien animalier (titulaires du niveau 1 et chirurgie) informent les étudiants sur la réglementation et l'éthique sur l'utilisation des animaux en science. Les bonnes pratiques en terme de manipulation des animaux leur sont présentées afin d'éviter tout stress pour les animaux en particulier dans les tests comportementaux pratiqués par les étudiants.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est l’hôte intermédiaire le plus souvent retrouvé en milieu naturel pour ce cestode parasite Taenia crassiceps. La souris apparaît donc comme le modèle principal pour maintenir les larves du cestode Taenia crassiceps en laboratoire. La souris permet de produire les parasites et le matériel biologique parfaitement adaptés aux tests envisagés en minimisant la souffrance et en utilisant le moins d’animaux possible. Animaux adultes. Les animaux infestés sont âgés de 8 à 9 semaines.
Enseignement de la toxicologie expérimentale : exemple du Test de toxicité Embryo-Fœtale du Bleu Tripan
- Formation professionnelle
162 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélever les fœtus in utero et une trentaine réutilisées. Les femelles sont accouplées, soumises à des frottis vaginaux puis à trois injections de bleu trypan, un colorant connu pour ses effets sur le développement embryonnaire. Le porteur indique que la substance colore les téguments en bleu sans effet manifeste sur la mère et que la manipulation par des étudiants inexpérimentés peut stresser les animaux. Il présente ce test réglementaire comme un exercice de formation d'agronomes et affirme qu'il ne peut être remplacé par une méthode sans animaux.
Objectifs
Pour initier les étudiants (formation professionalisante en agronomie bac+3) aux procédures expérimentales permettant de tester les effets toxiques et écotoxiques des molécules chimiques, nous avons décidé de réaliser un test de toxicité embryo-foetale tel que décrit dans les directives de l’OCDE (essai n° 414 : « Test de tératogénicité d’une substance ») et repris dans le règlement 2023/464 du 3 mars 2023 de la commission européenne sous la dénomination « test B.31 ». Ce test a été choisi car il reste peu invasif et ne présente pas d’effet délétère sur la femelle à la dose testée. D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques et enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement. De plus, les données générées lors de ce travail pratique seront utilisées pour évaluer les connaissances en analyse de données acquises par les étudiants au cours de leur formation. Enfin, ces tests réglementaires de toxicité embryo-fœtale sont contextualisés dans la nécessité de s’assurer, avant obtention de mise sur le marché de produits phytopharmaceutiques, de leur innocuité vis-à-vis de la santé des populations humaines et de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les étudiants que nous formons.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus en terme de formation, pour nos futurs techniciens, sont principalement une amélioration de leur compétences techniques par la réalisation de gestes variés en milieu contrôlé (travail en animalerie conventionnel avec le respect des procédures et règles sanitaires ; mise en œuvre de Bonnes Pratiques de Laboratoire ; mise en œuvre des enseignements du suivi du bien-être des animaux; apprentissage de nouveaux gestes techniques). Toutefois, ce travail sera aussi l’occasion d’introduire certains concepts et de faire le lien avec de nombreux autres enseignements : importance mais aussi limites des tests sur animaux dans la cadre de tests de toxicité, notamment dans le contexte de mise au point de nouveaux produits phytopharmaceutiques ; analyses statistiques de données complexes à l’aide d’outils informatiques dédiés ; rappel de biologie de la reproduction et du développement.
Procédures
Les animaux seront mis en accouplement jusqu’à 5 jours successifs et seront soumis à la réalisation d’un frotti vaginal (entre 1 et 5 pour une durée maximale de réalisation d’une minute). Les animaux retenus subiront ensuite 3 injections successives (voie intrapéritonéale, sous-cutanée, per os ou intra rectale) de la mocécule testée. Chaque administration devrait durée moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. La seule manifestation évidente est une coloration bleue des téguments. La douleur anticipée de l'injection est modérée et de courte durée.Il est cependant à noter, que les animaux pourraient être soumi à du stress lié à la manipulation par des étudiants qualifiés mais encore inexpérimentés.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans la procédure seront mis à mort car il est nécessaire de prélever les foetus in utéro afin de ne pas sous-estimer le nombre de foetus atteints d'anomalie congénétale. Néanmoins, il est toujours possible que certains femelles ne se soient pas accouplées (estimation de 5 à 6 femelles par année) et n’aient pas été intégrées dans la procédure. Le cas échéant, elles seront mises à disposition d’autres procédures autorisées au sein de notre structure d’enseignement ou permettront de tester une voie d’administration moins invasive que l’intrapéritonéale.
Remplacement
Les tests de toxicité sur le développement sont destinés à livrer des informations générales concernant les effets de l'exposition prénatale d'une femelle gravide à une substance chimique, sur elle-même et sur l'organisme en développement qu'elle porte en elle. Par conséquent, ils ne peuvent être remplacés par d’autres méthodes ne faisant pas appel à des modèles animaux.D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement mais aussi de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les futurs agronomes que nous formons.
Réduction
Un test de toxicité embryo-fœtal nécessite le recours à deux espèces de mammifères (une espèce de rongeur et une espèce non-rongeur) et 4 à 5 lots (3 doses différentes et 1 ou deux témoins -conditions zootechniques et le cas échéant, véhicule de la substance testée-) d’un minimum de 20 femelles gravides chacun. Compte tenu de la visée pédagogique de ce travail, le nombre d’animaux sera réduit au strict minimum. Seul le lot correspondant à la dose d’intérêt chez une espèce, le rat, sera réalisé. Aussi, metterons nous 30 femelles en reproduction pour avoir au moins 25 femelles gravides par année (soit 30*5=150 femelles) ce qui correspond, d'une part aux exigences du test réglementaire et d'autres part aux effectifs de nos promotions (50 étudiants, 1 rat par binôme). Les résultats obtenus seront comparés à des données simulés informatiquement à partir de données de la littérature (les fréquences spontanées des principales anomalies congénitales et des résorptions sont en effet connues chez le rat). Dans un souci de raffinement, 12 rats supplémentaires seront utilisée pour tester une voie d’administration moins invasive. Soit 162 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Le test de toxicité sera simplifié par rapport aux directives réglementaires pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Les étudiants participants ont au préalable obtenu la qualification à l’expérimentation animale pour Applicateur et ont acquis un certain nombre de gestes techniques. La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. Le suivi est réalisé conjointement par les étudiants, le personnel de l’animalerie et le personnel enseignant à l’aide d’une grille d’évaluation mise en place par la Structure en charge du Bien-Etre Animal de notre structure. Chaque manipulation conduit à l’attribution d’une amande donnée par l’étudiant ayant réalisé l’intervention à titre de renforcement positif. Nous proposons de mettre en place une étude pilote permettant de définir une voie d’administration la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 dans des conditions conforment à la réglementation avec un enrichissement varié et adapté ainsi qu'un contrôle quotidien.
Choix des espèces
Le rat est le modèle le plus utilisé après le lapin dans les études de toxicité embryo-fœtale. La forte prolificité de cette souche permet avec un nombre réduit de femelles d’obtenir une grande quantité d’information sur les fœtus. En outre la biologie de la reproduction de cette souche est parfaitement caractérisée facilitant la mise en place de la procédure mais aussi la simulation informatique du lot témoin (les fréquences spontanées des résorptions et des principales anomalies congénitales sont en effet connues). Seules des femelles primipares seront utilisées afin de ne pas confondre les résorptions précoces imputables au traitement avec des traces d’implantation d’évènements de reproduction ultérieurs. Les femelles devront atteindre un poids d’environ 300g pour augmenter les chances de fécondation lors des accouplements.
Travaux pratiques en écologie et évolution des interactions hôte-parasite chez le pigeon urbain (Columbia livia)
- Enseignement supérieur
150 pigeons des villes vont être capturés puis relâchés, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque oiseau est maintenu deux à trois semaines en volière, pesé, épouillé, soumis à une prise de sang et à une injection sous-cutanée d'un mitogène, dans le cadre de travaux pratiques de master. Le porteur indique que ces gestes n'occasionnent qu'un stress transitoire et que les individus, marqués, sont ensuite suivis pour d'autres programmes de recherche. Il affirme que les objectifs pédagogiques, dont l'apprentissage de la manipulation d'un animal vivant, ne peuvent être atteints avec des vidéos ou des cadavres.
Objectifs
Dans le cadre de la formation en Master, nous avons mis en place une session de travaux pratiques (en automne) sur la découverte des ectoparasites, des parasites intestinaux et des parasites sanguins du pigeon urbain en relation avec le phénotype (poids, sexe, couleur, immunocompétence) et l'environnement (degré d'urbanisation) de celui-ci. L'objectif de ces travaux pratiques est quadruple. Le premier est d'observer la diversité des parasites du pigeon dans différents tissus (plumes, intestin et sang) et leurs cycles de vie. Le deuxième est fondamental et vise à faire comprendre aux étudiants le rôle des facteurs phénotypiques et environnementaux sur les paramètres épidémiologiques (prévalence et intensité). Le troisième vise à leur apprendre à manipuler et à mesurer des vertébrés vivants ainsi que de réaliser une prise de sang sur ce vertébré. Le quatrième est de les sensibiliser à l'éthique en expérimentation animale en leur enseignant les rudiments en éthique animale (les 3R, la douleur, les points limites, la législation etc...). Dans ce contexte, les étudiants seront invités à manipuler un pigeon, le peser, lui mesurer les tarses, l'aile, lui peigner les plumes pour collecter les ectoparasites du plumage, lui prélever une goutte de sang afin d'identifier les parasites sanguins et lui injecter un mitogène en sous-cutané pour mesurer une valeur de l'immunocompétence.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ces travaux pratiques sont, comme décrit précédemment, multiples. Le premier est d'observer la diversité des parasites du pigeons dans différents tissus (plumes, intestin et sang) et leurs cycles de vie. Le deuxième est fondamental et vise à faire comprendre aux étudiants le rôle des facteurs phénotypiques et environnementaux sur les paramètres épidémiologiques (prévalence et intensité). Le troisième vise à leur apprendre à manipuler et à mesurer des vertébrés vivants ainsi que de réaliser une prise de sang sur ce vertébré. Le quatrième est de les sensibiliser à l'éthique en expérimentation animale en leur enseignant les rudiments en éthique animale (les 3R, la douleur, les points limites, la législation etc...).
Procédures
Les pigeons seront capturés en condition naturelle avec une épuisette raquette, placés en volière 2 semaines avant la procédure et seront soumis à 3 interventions sur animaux vigiles: la première constitue des mesures morphométriques et un épouillage par une contention spécifique (20 minutes), la deuxième est une prise de sang unique par individu (5 minutes) et la troisième est une injection unique en sous-cutané d'un mitogène (5 minutes). Ces interventions seront effectuées les unes après les autres et dureront moins de 30 minutes par individu. A l'issue de cette procédure (2 jours de TP) et donc après moins de 3 semaines en volières, les pigeons seront relâchés à l'endroit où ils ont été capturés.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent principalement le stress de la capture de la manipulation, du brossage, de la prise de sang et de l'injection et d'un environnement non adapté lors du transport. Ces nuisances ne durent que le temps de la manipulation ou du transport et n'engendrent aucun effet indésirable. En effet, dans nos précédentes études, les pigeons se remettent rapidement de telles interventions et reprennent des comportements normaux (alimentation, lissage des plumes, reproduction et interactions sociales).
Devenir
A la fin de la procédure, les pigeons seront replacés dans les volières avant d'être relâchés dans leur milieu de capture. En effet, l'ensemble des procédures étant légères, elles n'impactent pas la survie et la reproduction des individus en conditions naturelles. De plus les individus sont marqués, cela nous permet de suivre ces individus dans le temps afin d'estimer leurs survies pour nos programmes de recherche sans avoir à en recapturer. Nous mutualisons donc ces animaux à des fins de recherche.
Remplacement
Afin d'atteindre les objectifs pédagogiques qui se focalisent sur une population de vertébré en conditions naturelles, le recours à des animaux est nécessaire et il n'y a pas moyen de le remplacer. En effet, il est impossible d'estimer la variabilité entre individus en prévalence et abondance de parasites et en immunocompétence à l'aide de vidéos, de mannequins ou de cadavres. De plus, l'objectif pédagogique vise également l'apprentissage de la manipulation d'un animal vivant. Ces objectifs ne sont atteignables qu'en utilisant des animaux vivants. Dans ce contexte, le pigeon biset Columba livia apparaît comme étant un modèle animal idéal pour étudier les mécanismes écologiques et évolutifs en milieu urbain. En effet, c’est un oiseau issu d’élevage domestique relâché par l’homme par le passé qui s’est installé dans les zones urbaines et qui est, a priori, soumis à de fortes pressions évolutives. De par ses grandes facilités d’adaptation, il constitue le modèle vertébré « sauvage » le plus répandu en zone urbaine. Son étude permet d’une part de dégager des principes généraux et fondamentaux en écologie urbaine et en évolution en milieu urbain et d'autre part d'étudier les différents parasites qu'il héberge. La variabilité individuelle des pigeons peut être caractérisée facilement par des étudiants (coloration, comportement, immunocompétence, mesure morphométrique) grâce à des protocoles mis au point dans notre laboratoire et l'identification de nombreux parasites est accessible. Toutes ces caractéristiques en font un modèle idéal pour enseigner de manière pratique toutes les approches évolutive, écologique et éco-épidémiologique. De plus, cette espèce est très répandue et ne constitue pas une espèce menacée d’extinction.
Réduction
Nous échantillonnerons 30 pigeons par an (30 par TP sur 5 ans donc 150 au total) que nous maintiendrons en captivité dans les volières. Les promotions d'étudiants sont autour de 20 pour les TPs. Cet effectif nous permettra d'avoir au moins un pigeon par étudiant. En mutualisant les données, il sera également possible de tester des relations entre les variables individuelles et les variables épidémiologiques avec une bonne puissance statistique. En nous basant sur les TPs précédents, les tests de puissance révèlent par exemple qu'un effectif de 30 permet de détecter une corrélation significative entre la couleur mélanique et l'immunocompétence. Ceci correspond donc à un effectif minimum permettant à la fois d'avoir une puissance statistique pour détecter les relations et de faire manipuler l'ensemble des étudiants.
Raffinement
Pendant ces 3 semaines, les pigeons seront hébergés en volière extérieure en grillage galvanisé, divisée en 16 compartiments et couverte en partie par un toit en tôle. Les compartiments sont plus longs que larges, ce qui permet aux individus d’effectuer de brefs vols. Chaque compartiment est enrichi de 6 nichoirs, de 4 perchoirs en bambou, une mangeoire, un abreuvoir d’eau et une baignoire. Tous ces enrichissements permettent de réduire le stress de la captivité. Aucune médication n'est prévue dans le cadre de cette procédure (pas d'acte invasif) mais une surveillance attentive permet de suivre les animaux de manière ciblée. De plus, cette procédure repose sur une équipe technique et pédagogique ayant une expérience sur le pigeon de plus de 15 ans. Lors du déroulement du projet, nous avons également identifié des points limites. En effet, dans le cas où nous détectons un comportement anormal, des signes d'infection, une perte de masse de plus de 30 pourcent, ou une blessure conséquente à la procédure (ces informations sont donc les points limites), les individus seront alors exclus des procédures et isolés en quarantaine. Le vétérinaire sera alors contacté pour soigner ou euthanasier l'individu.
Choix des espèces
Le pigeon biset Columba livia apparaît comme étant un modèle animal idéal pour étudier les mécanismes écologiques et évolutifs en milieu urbain. En effet, c’est un oiseau issu d’élevage domestique relâché par l’homme par le passé qui s’est installé dans les zones urbaines et qui est, a priori, soumis à de fortes pressions évolutives. De par ses grandes facilités d’adaptation, il constitue le modèle vertébré « sauvage » le plus répandu en zone urbaine. La variabilité individuelle des pigeons peut être caractérisée facilement par des étudiants (coloration, comportement, immunocompétence, mesure morphométrique) grâce à des protocoles mis au point dans notre laboratoire et l'identification de nombreux parasite est accessible. Toutes ces caractéristiques en font un modèle idéal pour enseigner de manière pratique toutes les approches évolutive, écologique et éco-épidémiologique. De plus, cette espèce est très répandue et ne constitue pas une espèce menacée d’extinction. Les pigeons échantillonnés seront tous adultes (jeunes adultes entre 4 et 8 mois ou adultes de plus de 8 mois). Les adultes sont, d'une part, moins sensibles au stress de la procédure que les juvéniles et, d'autre part, présentent une variabilité en parasites plus importantes que les juvéniles. Ils sont donc plus adaptés à l'objectif scientifique du TP qui vise à expliquer la variabilité de la prévalence et l'abondance des parasites par différentes variables individuelles.
Clearence du potassium par des astrocytes dans le cerveau de souris normale et épileptique.
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Une partie subit un état de mal épileptique provoqué par injection, maintenu trente minutes, que le porteur reconnaît douloureux et impossible à réaliser sous anesthésie, avant que le cerveau ne soit prélevé pour des analyses ex vivo. Les souris qui ne se réalimentent pas ou perdent plus de 15 % de leur poids sont exclues et tuées. Le porteur présente la modélisation informatique comme une piste future tout en concluant que seul l'animal permet aujourd'hui d'étudier l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet de recherche découle d'un projet plus vaste que notre équipe mène depuis cinq ans, visant à comprendre comment les rythmes naturels du corps influent sur le fonctionnement normal et anormal du cerveau. Cette question revêt une importance particulière pour la santé humaine, car toutes les fonctions de notre organisme suivent un rythme quotidien, et ces rythmes sont perturbés en cas de maladies telles que l'épilepsie, la deuxième maladie neurologique la plus répandue après la migraine. Environ 30% des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux actuels. Les recherches sur l'épilepsie ont traditionnellement ciblé les neurones, mais notre projet se concentre sur les cellules gliales, en particulier les astrocytes, qui jouent un rôle crucial dans le soutien métabolique du cerveau. Les études ont montré des fluctuations importantes dans les concentrations d'ions essentiels (sodium, potassium, chlorure) chez les sujets épileptiques, en particulier une augmentation du potassium. Notre objectif est de comprendre pourquoi cette régulation est perturbée, si elle est liée au dysfonctionnement des astrocytes, et quels mécanismes astrocytaires de la clairance du potassium sont affectés. Nous cherchons à répondre à ces questions pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Lors des crises épileptiques, on observe une augmentation temporaire du potassium à l'extérieur des cellules du cerveau, aussi bien chez les patients que dans des modèles animaux (rats, souris) et des préparations du cerveau de rongeurs en laboratoire. Cette élévation de potassium est ainsi un marqueur universel de la crise épileptique. Bien que les mécanismes précis de cette perturbation puissent varier entre différentes espèces, son origine commune semble être les astrocytes, des cellules gliales du cerveau. En étudiant comment les astrocytes éliminent le potassium dans les tranches du cerveau de souris, nous cherchons à comprendre comment cette fonction est normalement assurée dans le cerveau humain et comment elle est altérée lors de l'épilepsie. Actuellement, aucun traitement antiépileptique ne cible spécifiquement les astrocytes. Les résultats de notre projet ouvriront des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre collaboration avec l'équipe des Neurosciences Théoriques est essentielle. Ces chercheurs modélisent l'activité des réseaux neuronaux dans différentes parties du cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. La régulation du potassium extracellulaire est une variable clé dans leurs modèles. Pour que leurs simulations reflètent la réalité, elles doivent s'appuyer sur des données expérimentales. Les expériences que nous prévoyons dans le cadre du projet fourniront ces données, permettant d'améliorer la précision des modèles. Ces modèles améliorés offriront ensuite la possibilité de prédire le comportement du réseau neuronal dans différentes conditions, y compris en réponse à des médicaments, sans recourir à des expérimentations sur des animaux de laboratoire. Ainsi, notre projet contribuera à développer et exploiter une approche informatique (in silico) pour mieux comprendre et traiter l'épilepsie.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs injections intrapéritonéales : 1 à 3 injections d'une molécule pro-convulsante ou de sérum physiologique dans le cas des souris témoins, et une injection d'une molécule anti-convulsive.
Impact sur les animaux
Le projet s'appuit sur l'utilisation du modèle animal d'épilepsie généralisée qui reproduit les caractéristiques principales de l'épilepsie du lobe temporal (ELT) chez les humains, y compris les crises épileptiques et les problèmes de mémoire. Malheureusement, pour induire cette épilepsie, nous devons provoquer un état convulsif initial chez les souris non affectées, appelé "status epilepticus". Cet état est douloureux, mais nous ne le laissons durer que 30 minutes, puis nous l'arrêtons en administrant un médicament anti-convulsivant. Il n'est pas possible d'anesthésier les animaux pendant cette induction, car le status epilepticus est défini par des mouvements et des comportements spécifiques qui seraient complètement supprimés par une anesthésie. La classification de la gravité de cet état de mal est cruciale, car elle nous permet de déterminer précisément quand il commence, nous donnant ainsi un contrôle sur sa durée. L'induction de l'épilepsie en déclenchant cet état de mal est la seule méthode disponible pour créer un modèle animal de l'épilepsie du lobe temporal.
Devenir
Après le déclenchement du "status epilepticus" les souris deviennent épileptiques et elles seront utilisées pour les expérimentations ex vivo qui cible à étudier la clairance du potassium dans les tranches de cerveaux épileptiques et sains.
Remplacement
Les dernières décennies ont été marquées par d'importants progrès dans le domaine de la modélisation des fonctions cérébrales. Des projets internationaux tels que The Virtual Brain et le Human Brain Project ont considérablement enrichi nos connaissances sur les mécanismes de la mémoire et du traitement de l'information dans le cerveau humain. Les nouvelles procédures informatiques permettent aux médecins neurologues d'extraire davantage d'informations de l'EEG et de l'imagerie cérébrale. Les modèles mathématiques récents peuvent décrire certains aspects du fonctionnement d'une cellule nerveuse ou d'un réseau neuronal. Cependant, aucun outil informatique ne permet de modéliser l'ensemble du répertoire de l'activité cérébrale, qu'elle soit physiologique ou pathologique, car les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ne sont pas encore connus. La seule voie pour les découvrir passe par l'exploration du modèle animal. Le foyer de la crise épileptique est localisé dans une région du cerveau, mais une fois déclenchée, la crise peut se propager et envahir plusieurs régions, voire l'ensemble du cerveau. Étant donné que le cerveau contrôle toutes les fonctions de l'organisme, son dysfonctionnement peut affecter d'autres organes vitaux tels que le cœur ou l'estomac, qui à leur tour influent sur le fonctionnement du cerveau. Ainsi, l'épilepsie dépasse le cadre d'une pathologie purement neurologique, c'est pourquoi son exploration requiert l'accès à l'organisme entier, une possibilité que aucune autre approche ne nous offre pour l'instant.
Réduction
Un cerveau (une souris) sera utilisé pour la préparation de plusieurs tranches (4-6) qui seront ensuite utilisées simultanément sur deux postes expérimentaux ce qui permettra soit d'obtenir lors de la même session les données de deux types (deux protocoles expérimentaux différents, un par poste), soit de cumuler plus de données d'un type (le même protocole appliqué sur deux postes expérimentaux).
Raffinement
Ce projet présente des approches pertinentes visant à réduire la douleur, la souffrance, le stress et l'inconfort chez les animaux de laboratoire, en particulier les souris. Une procédure d'induction du statut épileptique individualisée a été mise en place. Après la première injection d'une substance épileptogène, ne représentant qu'un tiers de la quantité totale, le comportement de chaque souris est surveillé. La décision d'administrer les injections suivantes est basée sur la réaction individuelle de la souris à la première injection, réduisant ainsi le temps de souffrance et accélérant le rétablissement post-induction. Le suivi quotidien des animaux est également adapté à chaque individu. Les souris qui ne parviennent pas à se nourrir se voient fournir de la nourriture par l'expérimentateur jusqu'à ce qu'elles puissent le faire elles-mêmes. Si une souris n'est pas capable de se nourrir seule dans les deux jours suivant l'induction du statut épileptique, elle est exclue du projet et euthanasiée par inhalation de CO2. Le bien-être des animaux est privilégié en ce qui concerne leurs conditions d'hébergement. Ils sont regroupés par 3 à 5 selon la taille de la cage, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. L'environnement est enrichi de maisonnettes et d'objets divers. Des observations indiquent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu'ils sont hébergés en groupe (DOI: 10.1523/ENEURO.0179-18.2019). Pour minimiser le stress, les animaux sont manipulés et pesés 3-4 fois par semaine avant la procédure d'induction de l'épilepsie et pendant la phase latente. Cependant, une fois devenus épileptiques, toute manipulation non nécessaire est évitée, car elle peut augmenter leur niveau de stress et déclencher des crises épileptiques. Les animaux sont observés quotidiennement, leur état étant évalué à l'aide de la grille d'expression faciale (DOI: 10.1038/nmeth.1455). Une souris présentant des signes de souffrance de niveau 1 ou 2 est pesée. Si son poids a diminué de plus de 15 % par rapport à celui observé pendant la phase latente, elle est exclue du projet et euthanasiée. Si le poids reste constant mais que la souris montre des signes de souffrance de niveau 2 pendant plus de deux jours consécutifs, elle est également exclue du projet et euthanasiée.
Choix des espèces
Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail. Ce projet utilise les souris comme modèle animal, qui, avec le rat, sont l'espèce le plus pertinentes car des nombreuses études montrent que les régions cérébrales impliquées dans l'épilepsie sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Parce que ce modèle reproduit les caractéristiques principales de l’épilepsie, les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cette pathologie chez l’Homme. Les modèles d'épilepsie chez les souris sont déjà validés par les travaux antérieurs de notre équipe (doi: 10.1126/sciadv.aat5979, doi: 10.1073/pnas.2013972118) Nous utiliserons les animaux adultes, à partir de 5 semaines. Nous allons étudier l'épilepsie de l’adulte, donc il nous faut utiliser les animaux qui ont passé la phase de croissance rapide qui dure, selon la documentation technique de Charles River les cinq premières semaines de vie (www.criver.com/products-services/find-model/fvb-mouse?region=29www.criver.com /products-services/findmodel/fvb-mouse?region=29). Donc nous allons utiliser les souris âgées de plus de 5 semaines.