Enseignement supérieur et formation professionnelle

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour un enseignement et l'entraînement de doctorants et de personnels. Ils sont d'abord soumis à des tests cognitifs de détection de la nouveauté et de localisation, puis utilisés pour l'apprentissage par tutorat d'injections et de chirurgies stéréotaxiques du crâne. Le porteur indique que la chirurgie stéréotaxique peut provoquer douleur et hébergement en cage individuelle, avant la mise à mort pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'acquisition de ces gestes techniques est "nécessaire" et ne peut se faire que sur des rats.

Objectifs

Ce projet constitue la partie pratique d’un enseignement portant sur les méthodes d’études de capacités cognitives cher le rat. Ces capacités sont illustrées dans deux tâches comportementales, une tâche de détection de la nouveauté et une tâche de localisation d’un lieu. Ces animaux pourront ensuite être utilisés pour la formation par tutorat de doctorants, post-doctorants et personnels statutaires ayant suivi les formations réglementaires, conformément à l’arrêté du 1er février 2013, afin d’acquérir les gestes techniques requis pour la réalisation des procédures expérimentales des projets de recherche dans lesquels ils seront impliqués. Cette formation par tutorat pourra porter sur la pratique d'injections périphériques et d'interventions chirurgicales stéréotaxiques. Elle sera assurée par des personnels experts de ces domaines au sein du laboratoire et validée par la responsable du suivi des compétences.

Bénéfices attendus

En permettant aux étudiants d’assister à la passation de tests comportementaux dans les conditions réelles d’un laboratoire, ce projet contribue de manière essentielle à leur formation et à leur sensibilisation aux bonnes pratiques en matière d’utilisation des animaux à des fins scientifiques. La formation par tutorat est nécessaire à l’acquisition des gestes et au maintien des compétences requises pour la réalisation des procédures expérimentales.

Procédures

Les animaux qui seront utilisés pour la formation par tutorat seront soumis au maximum à une injection pendant cinq jours consécutifs, une intervention chirurgicale et une injection pour leur mise à mort.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut induire de la douleur et une altération de l’état de santé des animaux. Elle peut également nécessiter un hébergement temporaire en cage individuelle.

Devenir

La mise à mort des animaux de la procédure est nécessaire au prélèvement de leur cerveau.

Remplacement

Les objectifs du projet ne peuvent être atteints qu’en utilisant des animaux (évaluation de fonctions cognitives ; acquisition de gestes techniques ou maintien de compétence sur le modèle rat).

Réduction

Le nombre d’animaux (24 par an) a été déterminé de manière à permettre d'assurer cet enseignement pour 12 binômes/trinômes d'étudiants par an.

Raffinement

A leur arrivée au laboratoire, l’état général des animaux est rapidement évalué au sortir de la boîte de transport, ils sont pesés puis placés en binômes dans des cages enrichies avec deux bâtonnets de bois à ronger. Après deux semaines d’acclimatation, ils sont pesés régulièrement et familiarisés à la manipulation par les porteurs du projet. La diffusion d’un bruit de fond dans l’animalerie (station musicale pendant la phase lumineuse) permet de diminuer leur réactivité aux bruits soudains auxquels ils sont sensibles et qui peuvent accompagner par exemple le changement des cages. La visite quotidienne permet de détecter rapidement des signes de mal-être et une prise en charge adaptée (alerte au responsable de projet et à la Structure Bien-Etre Animal et sollicitation du vétérinaire désigné si nécessaire). Des points limites adaptés à chaque étape du projet ont été définis. La chirurgie stéréotaxique est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique systémique et locale. Pendant la semaine qui suit la chirurgie, le suivi quotidien est renforcé.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces les plus utilisées en neurosciences comportementales et l'une des espèces utilisées au laboratoire. Les animaux, peu réactifs vis-à-vis de l’homme, se familiarisent très rapidement aux manipulations nécessaires à la passation d’un test comportemental. Leur coopération, associée à la richesse de leur répertoire comportemental, en fait des sujets particulièrement adaptés à l’enseignement. A leur arrivée au laboratoire, les rats sont âgés de 4-5 semaines, un âge auquel notre expérience montre que les binômes constitués cohabitent très bien à l’âge adulte. Les tests comportementaux sont réalisés lorsqu’ils sont âgés de 10-12 semaines, ce qui correspond à un âge auquel leur système nerveux est complètement développé. Les animaux sont mis à mort au plus tard à l’âge de 6 mois, un âge auquel ils ne présentent qu’exceptionnellement des pathologies

100 souris vont être utilisées, gardées en vie pour être réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque souris respire de l'air enrichi en dioxyde de carbone puis de l'azote, avant de recevoir une injection d'une molécule du système sympathique, pour un travail pratique d'étudiants sur la respiration. Le porteur décrit un objectif de formation aux métiers de l'expérimentation animale et affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet cet apprentissage. Il indique que la contention et l'injection provoquent stress et douleur.

Objectifs

Dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé". En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". C’est dans le cadre de ces enseignements que ces travaux pratiques (TP) ont lieu. Ainsi, cette séance de TP chez la souris est destinée à des étudiants, dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. D’autre part, cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces TP sont de plusieurs ordres: 1) d'un point de vue physiologique: mettre en évidence les régulations principales de la fonction respiratoire (dioxyde de carbone, oxygène, système nerveux sympathique) et évaluer le mode d'action d'une molécule de référence du système nerveux sympathique; 2) d'un point de vue expérimental chez l'animal: préhension de la souris, mettre en application les points clefs de surveillance d'un animal anesthésié vus lors du précédant TP (Anesthésie chez le rat), réaliser une injection intrapéritonéale (IP) chez la souris anesthésiée, appliquer des éléments de raffinement lors des procédures (lampe chauffante, gel lubrifiant et hydratatnt oculaire), apprendre à observer les réactions de l'animal d'un point de vue respiratoire suite aux différents tests pour savoir identifier les points limites, savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de notre formation à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, ce diplôme est réglementé au niveau national et le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé". En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : 1) Apprentissage de la manipulation de la souris anesthésiée : préhension, injection IP, suivi d'anesthésie, mesure de la ventilation pulmonaire; 2) Apprentissage du déroulé d’une étude en physiologie in vivo : recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats; 3) Mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale (mise en évidence de la règle de bien-être animal au cours du TP) et des réflexes à surveiller pour une bonne anesthésie (vus dans le précédent TP anesthésie chez le rat). L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect du bien-être animal dans ce protocole; 4) Réflexion sur les points limites à appliquer pour stopper certaines étapes de la procédure au besoin pour chaque animal. Enfin, ce TP participe à la bonne formation de nos étudiants dans le domaine de l'expérimentation animale et favorise donc à mettre sur le marché du travail des personnes avec des compétences solides dans ce domaine.

Procédures

Chaque souris recevra une injection intrapéritonéale (IP) d'un mélange anesthésique / analgésique, puis elle recevra sous anesthésie, 1 à 3 IP pour prolonger l'anesthésie/ analgésie : le site d'injection IP sera alterné à chaque fois. La profondeur de l'anesthésie sera évaluée pendant toute la durée de celle-ci en vérifiant la fréquence respiratoire et les réflexes cutanés (pincement des pattes postérieures et de la queue). Sous anesthésie, chaque souris respirera pendant 1 min de l'air enrichi en dioxyde de carbone, suivi de 20 min de récupération, puis elle respirera de l'azote gazeux pendant 5-10s, suivi de 20 min de récupération et enfin elle recevra une IP pour injecter la molécule de référence du système nerveux sympathique.

Impact sur les animaux

La contention et la manipulation des souris entrainent du stress, l'injection en intrapéritonéal pour induire l'anesthésie et l'analgésie engendre une légère douleur au site d’injection. Aucune douleur pour les autres injections intrapéritonéales n'est prévue, car elles seront faites sous anesthésie/analgésie.

Devenir

Toutes les souris seront gardées en vie à la fin du TP, car la procédure globale a été conçue de façon à ce que les animaux aient récupéré leur respiration basale après leur réveil. Elles pourront alors être réutilisées dans le cadre de procédures hors champ au sein de notre établissement. Cette réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux au moment de la réutilisation et donc de l'avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit dans la compétence "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé", que les étudiants apprennent à "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP aura lieu. Ce TP doit permettre d’une part d’évaluer in vivo les effets de variations de la composition en gaz de l'air inspiré et d'une molécule de référence du sytème adrénergique sur la respiration et d’autre part l’apprentissage par nos étudiants de la surveillance d'un animal anesthésié et de l'administration par voie intrapéritonéale (IP) chez un animal anesthésié. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan technique (manipulation de l’animal anesthésié, administration de substance chez l’animal anesthésié…) que sur le plan physiologique/pharmacologique (observation des effets induits par l'air modifié ou par la substance étudiée, pratique des méthodes d'évaluation des effets). Enfin pour favoriser l'apprentissage des étudiants et éviter d'intégrer des animaux d'entraînement, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, placement du capteur de pression, pose des masques, injection IP) leur seront présentées avant le début du TP. L'enseignant mimera les gestes à faire avant chaque étape de la procédure sur une des 4 souris de chaque TP. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections IP en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge).

Réduction

Les étudiants, répartis en trinôme ou quadrinôme, travailleront avec une souris par trinôme ou quadrinôme. Cette répartition permettra aux étudiants de surveiller l'animal aisément tout en réalisant les enregistrements et les analyses des tracés de la respiration et l'injection de la molécule. Ce fonctionnement lors de ce TP permettra d'utiliser un nombre réduit d’animaux tout en garantissant un apprentissage de qualité des étudiants. Chaque année, 4 groupes de 14 étudiants au maximum réaliseront ce TP. A chaque séance de TP un enseignant encadrera 1 groupe d’étudiants. Comme les gestes à réaliser sont relativement simples, leurs démonstrations seront réalisées au début du TP grâce à des vidéos et seront mimées lors du TP sur les animaux des étudiants, évitant ainsi l'utilisation d'un animal de démonstration. De même au cours du TP, les étudiants pourront s'entraîner à réaliser les injections IP en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge). Ainsi, pour chaque groupe de 14 étudiants maximum, 4 souris seront donc nécessaires. Soit un total de 4x4 = 16 souris par an et 4 souris supplémentaires seront prévues par an afin de remplacer éventuellement une souris ne pouvant pas entrer dans le protocole pour cause de santé, soit 100 souris sur 5 ans pour 280 étudiants au maximum. Chaque année, ce nombre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'étudiants par groupe est inférieur à 14 étudiants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe socialement harmonieux en présence de deux éléments d’enrichissement (papier absorbant et une petite maison ou tunnel soit en polycarbonate soit en carton). Les souris seront anesthésiées et analgésiées tout au long du TP. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée avant de commencer le protocole, mais également tout au long du TP, par les étudiants et l'enseignant. Tout signe de réflexe de l’animal induira l’administration immédiate d’une demi-dose supplémentaire d’anesthésique/analgésique (un quart de dose à la dernière étape de la procédure). Pendant la durée du TP, les animaux seront placés sous une lampe afin d’éviter toute hypothermie et un gel lubrifiant et hydratant oculaire sera déposé afin d'éviter la dessication de leurs yeux. L'enregistrement des paramètres de respiration se fera grâce à un capteur de pression situé à la surface de la cage thoracique et maintenu en place grâce à une ceinture velcro. Ce dispositif est donc non invasif. Les points limites spécifiques du projet seront appliqués : tout animal présentant des signes de stress ou de maladie (tels que poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids telle qu'attendue à l'âge de ces animaux) ne sera pas inclus dans le TP et sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référent; les procédures de variations de la qualité de l'air inspiré en dioxyde de carbone ou en oxygène ou l'injection d'adrénaline par voie intrapéritonéale se feront sous le strict contrôle de l'enseignant et les temps d'application choisis courts permettront la récupération d'une respiration basale en 1 à moins de 10 min pour l'animal. Par ailleurs préalablement au TP, les animaux auront été manipulés régulièrement, afin de diminuer leur stress lors de l’injection intrapéritonéale destinée à l'anesthésie/analgésie et une récompense (de type vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt, billes de céréales, pop corn, gâteau sec…) leur sera donnée afin d'augmenter leur familiarité. De plus, toujours pour diminuer le stress des souris, leur répartition dans leur cage d’hébergement sera conservée à l’issue du TP et une nouvelle récompense leur sera donnée après leur réveil. Enfin, le fait que les étudiants aient déjà vu les procédures en image ou en démonstration améliore leur travail sur les animaux et garantit une meilleure réussite des différentes procédures et donc de l'ensemble de ce TP.

Choix des espèces

La souris est bien connue des points de vue physiologique et pharmacologique et c'est aussi l'une des espèces les plus utilisées en recherche et pharmacologie. De plus, sa taille permet une surveillance aisée de l’animal entier anesthésié et un enregistrement facilité des paramètres basiques de la respiration/ventilation pour des étudiants. Les souris devront peser entre 30 et 45g. Ce poids est adapté à la taille des capteurs et des ceintures que nous avons à disposition et qui permettent d’enregistrer les paramètres de respiration.

107 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une intervention neurochirurgicale sous anesthésie de 30 à 45 minutes, avec un risque de douleur, d'infection et de perte de poids, pour cartographier l'organisation des fibres de matière blanche du cerveau. Les retombées annoncées pour l'humain, une meilleure compréhension du cerveau normal et pathologique, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que seuls les modèles mammifères conviennent et conclut que le recours à la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif global de notre projet est de faire progresser nos connaissances anatomiques sur la manière dont le cerveau est connecté. Pour ce faire, nous étudierons l'organisation de la matière blanche (qui contient les voies qui relient les différentes régions du cerveau) dans le cerveau de la souris. Les techniques non invasives actuellement disponibles pour étudier ces voies sont incapables de révéler de manière fiable l'organisation des structures complexes telles que les faisceaux de fibres et manquent de la précision par rapport à la neuroanatomie de référence. Par conséquent, nous visons à améliorer la précision avec laquelle nous pouvons étudier l'anatomie de ces voies en utilisant une approche multimodale avancée. En fin de compte, les connaissances et la méthodologie développées dans ce projet serviront de d'étape clé pour une approche similaire appliquée à d'autres espèces, y compris le cerveau humain, et contribueront à une meilleure compréhension de l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau humain, qu'elle soit normale ou pathologique. A termes, notre étude conduira également au développement des modèles informatiques et algorithmes prédictifs qui permet d'éventuellement remplacer certaines études impliquant les animaux.

Bénéfices attendus

La matière blanche du cerveau est impliquée dans un certain nombre de maladies humaines. Une meilleure compréhension de son organisation structurelle et fonctionnelle dans des conditions normales est nécessaire pour identifier et comprendre les différences qui peuvent survenir dans des conditions "anormales" ou pathologiques. En améliorant la précision de nos connaissances sur la neuroanatomie de la matière blanche du cerveau, notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau. En outre, les méthodes et approches techniques que nous innoverons dans notre projet d'étude du cerveau de la souris contribueront au développement d'une nouvelle approche qui permettra une étude fiable de la neuroanatomie de la matière blanche dans le cerveau humain.

Procédures

Les animaux subiront une seule intervention neurochirurgicale sous anesthésie d'une durée de 30 à 45 minutes, qui n'aura lieu qu'une seule fois dans la vie de la souris.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une brève intervention chirurgicale sous anesthésie. Cet acte comporte un faible risque de douleur, d'infection, d'inconfort et de perte de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Comme nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur les cerveaux humains, un modèle mammifère est préférable en raison de la plus grande similitude de l'organisation des structures neuronales. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possible. A notre connaissance, seuls les modèles mammifères, et plus particulièrement la souris (grâce à sa petite taille permettant la visualisation de son cerveau entier lors des approches de microscopie à lumière), répondent à l'ensemble de ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre projet car des procédures invasives sur le tissu vivant soient nécessaires pour effectuer le marquage par vecteurs viraux. Cela empêche l'utilisation des tissus port mortem humains. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.

Réduction

Le projet vise à contribuer à la validation et au développement d'outils de prédiction et de modèles cérébraux in silico. Il contribuera au développement d'une ressource réutilisable à la disposition de la communauté scientifique qui pourra à terme réduire et même remplacer les études sur les animaux. De par sa nature même, il contribuera directement aux objectifs de réduction prévus par les principes des 3Rs et la législation européenne. Le succès de notre projet repose sur des aspects techniques : la capacité de cibler des zones cérébrales de faible volume et nécessitant une grande précision, la capacité de réaliser un marquage intense des neurones nécessitant une optimisation de notre approche expérimentale. Plusieurs facteurs sont susceptibles d'influencer les résultats obtenus. Pour ces raisons, il est très difficile d'estimer a priori le nombre d'animaux nécessaires. Cependant, nous sommes et resterons très attentifs à l'objectif de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. C'est pourquoi nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale qui nous permettra d'analyser nos données au fur et à mesure (c'est-à-dire des expériences réalisées sur de petits lots de 2 à 5 animaux). Cela nous permettra de modifier notre stratégie expérimentale et d'arrêter les expériences dès que le résultat obtenu sera satisfaisant. Comme notre stratégie expérimentale dépend de ces facteurs techniques, nous ne sommes pas en mesure de proposer des tests statistiques pour estimer la taille de l'échantillon nécessaire.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal pendant la période précédent l'intervention chirurgicale conformément aux critères généraux. iii) Intervention immédiate et appropriée (si nécessaire) - les mesures conservatrices doivent être privilégiées. iv) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance v) Lors de la chirurgie : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation des produits anti-douleurs adaptés. Respect des principes d’hygiène et d'asepsie. Surveillance continue, application d'une procédure de "nursing" si nécessaire. vi) Formation appropriée et actualisée des expérimentateurs aux techniques chirurgicales pertinentes. vi) Adaptation des conditions d'hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Etant donné que nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur le cerveau humain, un modèle mammifère est préférable puisque l'organisation des structures neuronales est grandement similaire. Bien que nos recherches initiales utilisent des animaux sains, nous avons l'intention d'effectuer des recherches semblables sur des modèles de pathologie humaine. À ce jour, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible de modifier le génome de manière routinière et constitue donc le modèle idéal pour nos recherches. La petite taille du cerveau de la souris permet de l'adapter à la fois à l'appareil d'IRM et au microscope optique, qui sont tous deux des dispositifs essentiels à notre étude. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (âgés de 4 à 6 semaines), premièrement car les circuits neuronaux concernés sont stables à cet âge par rapport à des souris plus jeunes, mais aussi car il sera plus facile de nettoyer le cerveau pour l'imagerie. En effet, ce processus d'élimination des lipides du cerveau de la souris devient techniquement plus difficile chez les adultes plus âgés. Il s'agit d'une étape cruciale pour préparer le cerveau à la visualisation de structures spécifiques et, par conséquent, un jeune adulte est l'âge optimal pour faciliter une procédure réussie. Le choix de la souris est également motivé par nos données antérieures et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà développés, qui garantissent le succès de notre étude.