Enseignement supérieur et formation professionnelle
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies d’origine auto-immune et diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 365
2 043 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une partie subit une chirurgie d'induction de neuropathie, une électrophysiologie du nerf sciatique sous anesthésie et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, avec trois tests comportementaux répétés, pour évaluer des candidats médicaments contre des neuropathies auto-immunes et diabétiques. Le porteur décrit des douleurs neuropathiques, une baisse sévère de la mobilité au pic de la maladie et les effets du diabète induit, obésité, hyperglycémie et retard de cicatrisation. Parmi les bénéfices avancés figurent une banque de tissus, des publications et une mise sur le marché "prévue d'ici 2035".
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé au niveau des pattes arrière permettant à la fois leur motricité mais aussi de ressentir des sensations perçues à leur niveau (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une enveloppe autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire) ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie d’origine auto-immune lors de laquelle le système immunitaire s’attaque à la myéline. Dans ce projet nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques acquises qui touchent 4% de la population mondiale et pour lesquelles les traitements actuels ne ciblent pas spécifiquement la démyélinisation pathologique dans ces maladies. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements agissant directement sur la démyélinisation pathologique dans les modèles rongeurs transgéniques de ces maladies. Ils seront donc complémentaires de ceux déjà employés en clinique. Les résultats seront publiés auprès de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - Démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - Sélectionner les produits efficaces pour un futur passage en clinique. - Créer une banque de tissus. - Publier des résultats. Avantages à long terme : -Thérapies complémentaires de celles sur le marché pour les patients. -Une autorisation de mise sur le marché prévue d’ici 2035.
Procédures
- La chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum. - Le modèle de rat Guillain Barré sera induit par une réaction immunitaire. -Les prélèvements de sang via le sinus rétro-orbital et celui du liquide dans lequel baigne le cerveau (liquide céphalo-rachidien) seront effectués au maximum sur 914 animaux, une fois par animal et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances -Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. -Douleurs post-opératoires (4 jours) -Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (durée 5 semaines) entre-coupée d’une diminution sévère de la mobilité lors du pic de la pathologie (durée de 5 jours entre le 15ème et 19ème jour) puis réversibilité progressive des symptômes. -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) -Nuisances associées au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures car des prélèvements terminaux sont nécessaires à l'étude des effets des traitements.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Des méthodes existent pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénérescence et régénérescence du nerf périphérique ne sont pas reproduits in vitro. L'expérimentation animale reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
Un calcul de taille d’échantillon a été réalisé, basé sur la variabilité attendue, la différence biologiquement significative à mettre en évidence avec une puissance suffisante et un risque alpha déterminé. Ces calculs ont été réalisés sur les données d’électrophysiologie et de comportement moteur afin de connaitre le nombre minimum d’animaux à avoir par lot pour chaque test. Dans tous les modèles sauf ceux des souris développant une démyélinisation d’origine auto-immune, les deux sexes seront utilisés car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Pour les modèles de souris de neuropathies d’origine auto-immune uniquement les femelles seront utilisées car 100% présenteront la pathologie, contre 16 à 30% des mâles. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation aux expérimentateurs sera effectuée ; - Pour éviter les douleurs neuropathiques, nous utiliserons de la litière de cellulose. Cette litière présente également l’avantage d’avoir une bonne capacité d’absorption et sera donc particulièrement adaptée à la polyurie des souris diabétiques. De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons en fonction de l’évolution du diabète. - Des fiches individuelles de suivi pré- et post-opératoire seront utilisées ; - Deux fois par semaine, l’évaluation de l’état clinique des animaux sera faite, avec des scores corrélés à l’intensité de la souffrance, à l’aide de plusieurs fiches dont chacune est adaptée aux besoins spécifiques des lignées et au suivi post-opératoire. Selon la souffrance évaluée, il y aura une discussion avec le vétérinaire pour décider des soins à apporter ou de la nécessité d’une euthanasie. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple, en cas de déshydratation, apport d’eau gélifiée ou injections sous-cutanées d’une solution isotonique d’électrolytes. En cas de perte de poids ou d’état affaibli, mise à disposition de nourriture humide et d’eau gélifiée sur le sol de la cage. -Nous sédaterons les rats avant leur euthanasie par dislocation cervicale ; -Une fois par semaine (modèles de souris de neuropathie auto-immune) ou une fois par jour (rat SGB) nous évaluerons l’évolution de la paralysie par une fiche de scoring. -Pour éviter la perte d’identification des animaux et le stress de contention : les animaux seront marqués de manière permanente soit par des poinçons d’oreille, soit par des micro-puces sous-cutanées, soit à la queue par un stylo marqueur non toxique.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez des souris C57Bl6 sauvages ou db/db et sur des rats, ceci nécessitant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Rat/souris : juvéniles et adultes Les animaux seront reçus entre 3 et 6 semaines d’âge. Une partie d’entre eux commenceront à être traités entre 4 et 8 semaines d’âge (procédure 1, 2, 3, 4 et 5). L’autre partie des animaux sera traitée à partir de 20 à 30 semaines d’âge (une partie de la procédure 4). Il s’agit de souris modèles de neuropathie périphérique d’origine auto-immune chez qui les symptômes moteurs s’expriment tardivement. Ces femelles seront générées par FIV, aucun mâle ne sera commandé pour ces modèles.
Formation gestes techniques (injections, prélèvements) sur poules et cailles
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Autres oiseaux : 500
1 500 oiseaux, 1 000 poules et 500 cailles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans mise à mort, pour entraîner le personnel aux prises de sang et aux injections. Chaque animal subit un seul geste, prélèvement ou injection au sinus occipital, à la veine de l'aile ou à la jugulaire, sur animal vigile. Le porteur indique que les gestes ratés peuvent provoquer un hématome ou une douleur et que la contention est source de stress. Il présente la formation comme un moyen de maintenir les compétences de l'unité et d'optimiser la "prestation" offerte aux chercheurs, en réutilisant des animaux déjà engagés dans d'autres protocoles.
Objectifs
Répondre à un besoin de se former et de s’exercer pour maintenir un bon niveau de compétences et effectuer des prises de sang ou des injections chez les oiseaux conformément au principe des 3R. Les nouvelles recrues ne sont pas forcément familiarisées à la manipulation des oiseaux ni formées aux contentions, injections ou prélèvements. Cette formation leur permettra de débuter leur exercice avec plus de sérénité, sans la pression d’un projet à réaliser. Les animaliers en place peuvent également être demandeurs s’ils n’ont pas eu l’occasion de réaliser les gestes pressentis depuis plusieurs mois voire années. Notre objectif est donc de maintenir les compétences sur notre unité et d’y améliorer les manipulations des animaux.
Bénéfices attendus
Geste technique de prélèvement ou d’injection maîtrisé et effectué sans stress. Optimisation de la prestation offerte aux chercheurs.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles, une seule fois sur chaque animal. Plusieurs points de prélèvements possibles mais un seul prélèvement ou injection par animal : sinus occipital, veine alaire ou jugulaire. Selon le nombre d’animaux à disposition pour la formation, chaque agent pourra se former aux différents points de prélèvements et d’injection décrits mais sur des animaux différents : - un animal pour le point de prélèvement au sinus occipital - un animal pour le point de prélèvement à la veine alaire - un animal pour le point d’injection à la veine alaire Chaque geste technique (injection ou prélèvement) dure 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections ou prélèvements en intraveineuse lors de la formation de personnel peuvent engendrer un hématome et/ou une possible douleur si ces gestes s’avèrent ratés. La contention de l’animal peut également engendrer du stress.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux sont maintenus en vie.
Remplacement
Réutilisation d’animaux issus de protocole avant replacement. Nous avons prévu une démonstration avec des explications au fur et à mesure du geste technique. De plus, nous avons fait des photos du geste que nous montrerons à chaque formation.
Réduction
On utilise des animaux déjà présents en expérimentation. Dès que le geste sera maitrisé, nous arrêterons les entrainements.Le nombre de 10 animaux nous paraît suffisant pour acquérir les gestes techniques.
Raffinement
Présence d’un formateur. Manipulation dans le calme des animaux. Un point de pression sera exercé au site de prélèvement pour prévenir la formation d’hématome. Un massage du site sera exercé après injection, quelle que soit la modalité (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse,…).Le prélèvement ou l'injection ne sera pratique qu'une seule fois par animal. Les techniques mises en oeuvre seront adaptées aux espèces , aux types génétiques et aux âges des animaux. En cas de problème, l’apprentissage sera stoppé et les animaux seront mis sous surveillance en infirmerie.
Choix des espèces
Espèce cible de l’unité, aux âges disponibles.
Perfusion in situ de foie de rat adulte à la collagénase
- Enseignement supérieur
30 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques menés sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil par dislocation cervicale. Chacun subit une intervention de moins de deux heures, incision de l'abdomen et pose d'une canule dans la veine porte, non pour produire des connaissances mais pour que des étudiants s'entraînent à prélever un foie et en cultiver les cellules. Le porteur décrit un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire pendant les gestes, et prévoit quatre rats par an plus deux de secours en cas d'échec de la canulation. Sur le remplacement, il affirme que la réalisation de cultures primaires impose de tuer un rat pour prélever son foie, sans mentionner d'alternative par don de tissus.
Objectifs
Le Bachelor Universitaire de Technologie Génie Biologique parcours Biologie médicale et Biotechnologie prépare en 6 semestres des techniciens supérieurs ou des assistants ingénieurs polyvalents dans le domaine de la santé humaine et du bien-être, de la santé animale, ainsi que dans celui des biotechnologies. Qu'il exerce dans un laboratoire ou dans une entreprise, le titulaire de ce diplôme possède les compétences techniques requises pour réaliser des examens ou des analyses biologiques, physico-chimiques ou biochimiques, effectuer des tests de contrôle des produits et intervenir en expérimentation animale in vivo et in vitro. Dans le cadre de la formation, une des « compétences ciblées » porte sur les études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé. Parmi les apprentissages critiques, des techniques alternatives et complémentaires à l'expérimentation animale sont mises en œuvre. Les effets de molécules toxiques sont mesurés. Dans le cadre de travaux pratiques du Bachelor Universitaire de Technologie Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, l'objectif est d'établir des cultures primaires d'hépatocytes obtenues en perfusant le foie du rat adulte à la collagénase (enzyme de dissociation tissulaire) in vivo. Ces cultures primaires sont largement utilisées pour les études toxicologiques et métaboliques et sont normalisées. Ce projet va permettre aux futurs actifs de mettre en place des cultures primaires d'hépatocytes afin de tester la cytotoxicité de molécules à différentes concentrations in vitro. Les hépatocytes sont isolés directement du foie de rat et sont ainsi utilisés comme modèles de l'état physiologique in vivo. Des lignées cellulaires immortelles de foie existe mais sont moins représentatives de cellule hépatique normale in vivo.
Bénéfices attendus
La formation professionnelle dispensée aux étudiants leur permet d'appréhender la réglementation relative à l'expérimentation animale et les techniques de dissociation tissulaire et de pouvoir établir ainsi une culture primaire de cellules in vitro.
Procédures
Dans la procédure, les rats sont soumis à une intervention de moins de 2 heures sous anesthésie générale avec antalgie préalable au moins 30 minutes avant de réaliser l'anesthésique. Une incision de la peau de la patte arrière droite puis une injection d'héparine dans la veine fémorale sont effectuées (1 minute). Une incision de la peau et des plans musculaires de l'abdomen est réalisée (quelques minutes). La veine porte est canulée (quelques minutes). A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort réglementairement (dislocation des cervicales).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1- Le stress généré lors de la contention de l'animal au moment des injections de l'antalgie puis de l'anesthésie, durée une minute, de gravité légère. 2-Une hémorragie massive si la veine porte est sectionnée durant les gestes réalisés, durée de moins d’une minute et de gravité modérée. 3-Le stress lié à la détresse respiratoire malgré la trachéotomie, durée une minute et de gravité modérée.
Devenir
Après la perfusion le rat ne peut pas survivre. Par conséquent, à l'issue de la procédure, l'animal est mis à mort par dislocation des cervicales.
Remplacement
L'objectif de la séance de travaux pratiques est de réaliser des cultures primaire à partir de foie ; cela nécessite de mettre à mort un rat pour prélever son foie. L'utilisation d'animaux ne peut être substituée pour générer ces cultures.
Réduction
L'équipe enseignante est consciente de la nécessité de limiter le nombre d'animaux utilisés et s'efforce d'adapter le protocole dans cet optique. Nous avons mis en place les mesures suivantes permettant la réduction du nombre d'animaux : - Quatre rats sont utilisés par an (1rat par groupe de travaux pratiques de 14 étudiants) et deux rats supplémentaires par an sont prévus au cas où la canulation de la veine porte échoue. Dans environ 50 % des groupes de travaux pratiques, le rat supplémentaire est utilisé. Ce projet n'a pas pour objet d'études statistiques.
Raffinement
La raffinement est mis en place dans la pratique de l'antalgie et de l'anesthésie, nos procédures expérimentales étant sans réveil. 30 minutes avant la séance de travaux pratiques, chaque rat est analgésié puis anesthésié par le personnel habilté dans la pièce réservée aux anesthésies. Au cours de la procédure, les étudiants suivent la grille d'évaluation du suivi d'anesthésie et appellent l'enseignant dès qu'un signe de réveil apparait. L'enseignant évaluera la situation et mettra en place les gestes adéquats (réinjections ou mise à mort).
Choix des espèces
Le projet se propose d'utiliser le rat, modèle d'utilisation standardisée, dans les domaines de la recherche et du diagnostic. Les rats sont couramment utilisés pour des études en physiologie et pharmacologie. Le protocole (débit de perfusion et concentration enzymatique) a été élaboré pour des rats adultes d'environ 250g.
Enseignement des techniques avancées de chirurgie digestive sous cœlioscopie
- Formation professionnelle
40 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal, âgé de trois à quatre mois, est anesthésié jusqu'à sept heures pendant lesquelles des internes ou des praticiens réalisent plusieurs gestes de chirurgie digestive sous cœlioscopie sur l'estomac, le foie, le pancréas et l'œsophage. Le porteur décrit une "simulation haute fidélité" destinée à des chirurgiens en fin de formation, la mise à mort évitant toute souffrance liée aux interventions. Il affirme que les procédés inertes ne reproduisent pas le saignement et présente le modèle porcin comme "indispensable", l'objet étant la formation et non la recherche.
Objectifs
La place de la simulation dans les programmes d'enseignement des chirurgiens en formation est désormais fondamentale depuis la réforme du 3ème cycle des études de médecine. Plusieurs procédés de simulation chirurgicale ont déjà été proposés (sur cadavre ou simulateurs chirurgicaux) mais les procédés de conservation et surtout l’absence de saignement ne permettent pas une simulation réaliste. La simulation sur des modèles animaux est considérée comme de la simulation haute fidélité et ne concerne que des internes de chirurgie en fin de formation ou des praticiens confirmés qui souhaitent acquérir une nouvelle technique chirurgicale notamment par cœlioscopie. Elle ne concerne pas l’acquisition de gestes de base réalisables sur d’autres procédés de simulation. Le modèle porcin permettra de réaliser l’ensemble des interventions chirurgicales réalisables chez l’Homme grâce à son anatomie proche. La stratégie opératoire est la même et présente la nécessité d’une gestion rigoureuse des saignements.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette formation est avant tout l’amélioration de la formation chirurgicale des internes de chirurgie ou de praticiens confirmés et l’accélération de la courbe d’apprentissage : apprentissage de gestes techniques de chirurgie digestive avancée, amélioration de la fluidité des gestes et dimunition des temps opératoires, amélioration de la sécurité des soins (première procédure simulée chez l’animal et non réalisée chez le patient), permettre dans des conditions de centre de simulation la construction de scénario de situations opératoires réalistes, pour définir avec l’aide du formateur la bonne prise en charge, une adaptation aux situations réelles ainsi qu’un débriefing des problèmes rencontrés en fin de procédure. Ainsi, à long terme, l’utilisation de modèles porcins pour l’apprentissage de ces procédures contribuera à l’amélioration de la sécurité du patient au bloc opératoire en diminuant le temps d’intervention et le taux de complications.
Procédures
Chaque animal sera anesthésié pendant un maximum d’une journée (7 heures) pour la réalisation de plusieurs gestes en chirurgie digestive (estomac, foie, pancréas, oesophage) sous coelioscopie. La durée de réalisation des gestes dépendra des compétences des apprenants. Chaque session de la formation prévoit deux jours de pratique avec 2 animaux à chaque fois soit un total de 4 animaux.
Impact sur les animaux
En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour éviter toute souffrance liée aux chirurgies réalisées.
Remplacement
Cette formation par simulation "in vivo" est indispensable avant de pratiquer soi même un geste sur un patient. Plusieurs procédés de simulation chirurgicale ont déjà été proposés (modèles inertes, simulateurs) mais l’absence de saignement ne permet pas une simulation réaliste.
Réduction
Le nombre d’animaux est évalué en tenant compte du nombre de sessions de formation prévisibles, répondant à la demande et fonction du nombre d'inscrits. En comptant 2 sessions complètes de formation par an, il faudra 8 animaux (2 x 2 jours de pratique x 2 animaux par jour). Il faudra donc 40 animaux pour la durée du projet sur 5 ans.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront prises pour éviter les nuisances sur les animaux. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’intervention jusqu’à sa mise à mort, avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal.
Choix des espèces
Le modèle porcin permet de réaliser l’ensemble des interventions chirurgicales réalisables chez l’Homme. L’anatomie de ce modèle en est proche et la stratégie opératoire est la même. La nécessité d’une gestion rigoureuse des saignements est une contrainte immédiate qui sera bénéfique à plus long terme chez le patient. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3-4 mois, pour des raisons techniques (poids autour de 30-35 kg). En effet, à ce stade de développement l’anatomie correspond à celle de l’humain et permettent donc de réaliser les gestes dans de bonnes conditions.
Ateliers de formations en cryobiopsie
- Formation professionnelle
30 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal, âgé de quelques mois, subit une anesthésie d'au moins trois heures pendant laquelle jusqu'à quatre pneumologues réalisent chacun une vingtaine de gestes de cryobiopsie pulmonaire, avec des risques d'hémoptysie et de pneumothorax. Le porteur justifie la mise à mort par la douleur et les complications qu'entraînerait un réveil après ces prélèvements pulmonaires répétés. Il décrit une formation de praticiens et affirme qu'aucune alternative satisfaisante n'existe pour le prélèvement à la cryosonde, l'objet étant la formation et non la production de connaissances.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la formation et le perfectionnement de pneumologues sur des techniques de cryobiopsie (prélèvement de tissu par congélation), dans le cas de désobstruction tumorale, de bilans étiologiques de pneumopathies interstitielles, de diagnostic de nodules périphériques ou ganglionnaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la formation et la consolidation des acquis des candidats sur les indications des différentes techniques de prélèvements. Cela permettra un apprentissage des gestes ainsi que leur sécurisation mais également la prévention et la gestion des complications pour leur permettre ensuite la mise en place de ces techniques dans leur établissement d’origine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure sous anesthésie d’une durée de 3 heures minimum.
Impact sur les animaux
La seule nuisance éventuelle pour chaque animal est qu'il ait peur lorsqu'il est manipulé pour être préanesthésié Effets indésirables attendus: Risque d’hémoptysie (toux ramenant du sang en provenance des voies respiratoires), Risque de pneumothorax (présence anormale d'air dans la cavité pleurale)
Devenir
Les animaux ayant subi de multiples prélèvements de tissu de poumon au cours de la formation, le réveil des animaux pourrait être source de douleur, et présenterait des risques de complications importants. Ils seront ainsi mis à mort toujours sous anesthésie générale en fin de procédure.
Remplacement
Pour certains gestes, notamment prélèvement au niveau des ganglions à l’aiguille, un modèle est en cours de développement pour ce type de formation. Cependant, pour le prélèvement à l’aide de cryosonde, aucune alternative satisfaisante n’existe en dehors du modèle animal.
Réduction
Plusieurs praticiens (jusqu’à 4) pourront utiliser le même animal, permettant à chaque médecin d’effectuer une vingtaine de gestes, tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour cette formation.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans une structure agréée pour l’expérimentation animale, dans des conditions maîtrisées (température, ventilation, éclairage). Ils sont suivis quotidiennement. Leur environnement est enrichi par la présence de ballons et d’autres objets permettant de maintenir des comportements normaux (mâchonnement, fouissage). Au cours des procédures, les animaux sont anesthésiés et l’anesthésie est suivie et ajustée par un personnel qualifié. En cas de signes de souffrance, une analgésie supplémentaire pourra être mise en place. Si une souffrance venait à survenir sans qu’il soit possible de la soulager ou si une procédure venait à présenter des complications trop importantes pour être gérées, l’animal sera mis à mort pour éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
Pour se rapprocher au plus des contraintes inhérentes à la manipulation qui sera effectuée ensuite chez l’humain, il est indispensable de pouvoir former les médecins sur un modèle animal permettant d’utiliser le même matériel (bronchoscope, sondes de cryothérapie) que celui pour l’humain. Le porc présente une taille suffisante et une morphologie compatible avec ces différents paramètres et est donc tout indiqué pour la réalisation de ces manipulations. Les animaux utilisés seront des jeunes de 20 à 35 kg, afin que leur taille soit suffisante pour utiliser le même matériel que celui utilisé chez l’humain.
Mesures par électromyographie de l’activité neuro-musculaire chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des électromyographies sous anesthésie tous les trois mois pendant vingt et un mois, sous régime obésogène pour une partie, avant le prélèvement de leurs muscles, pour valider un protocole de mesure de l'onde H et prendre en main un nouvel appareil. Le porteur présente ces mesures comme non invasives et vise à en faire une "prestation" ouverte à la communauté scientifique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal.
Objectifs
Examen de référence en neurologie, l’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle plantaire est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse : une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde réflexe (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. La latence et l'amplitude de ces ondes permettent de détecter une atteinte neuromusculaire. L'onde H est difficile à détecter et à mesurer car son amplitude est faible (inférieure à 1 mV) et l'onde peut être difficile à distinguer du bruit de fond. Nous avons fait l'acquisition d'un système EMG qui permet d'éliminer le bruit de fond et de visualiser l'onde H. Une équipe partenaire a mis au point et validé un protocole permettant d'observer correctement l'onde H. Nous souhaitons d'une part prendre en main ce nouvel appareil et valider notre capacité à observer une onde H en utilisant quelques animaux envoyés par cette équipe, d'autre part valider ce protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire avec les souris C57Bl6J adultes jeunes et âgées afin de déterminer si l'évolution de l'amplitude de l'onde H chez ces souris est une variable d'intérêt pour les études sur le vieillissement, et enfin, tester si un régime obésogène, entraine une diminution plus rapide de l'amplitude de l'onde H chez les souris, signant un développement précoce d'atteintes neuromusculaires liées à l'âge. Ces mesures non invasives, si nous validons nos protocoles lors de ce projet, seront proposées à la prestation dans notre plateforme d'exploration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Validation du protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire, plateforme d'exploration fonctionnelle ouverte à la communauté scientifique - Ouverture d'une nouvelle prestation répondant à des besoins exprimés par la communauté scientifique locale - Utilisation d'une variable obtenue de manière non invasive dans les études du vieillissement.
Procédures
Mesures de l'electromyogramme (EMG) sous anesthésie générale chaque 3 mois durant 21 mois maximum. Mise en régime obésognène durant 21 mois. Pour l'enregistrement de l'EMG, les souris sont anesthésiées par voie intra-péritonéale (durée de l'injection
Impact sur les animaux
La mesure de l'EMG ne présente pas de nuisance pour l'animal qui est anesthésié. Si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Les souris FXN-Pvalb ont une délétion homozygote du gène codant pour la frataxine. Ces animaux présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent dès l'âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement de différents organes d'intérêt, notamment des muscles afin de comparer les mesures EMG et des observations histologiques.
Remplacement
Les modèles murins de neuropathies présentent des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique ou du vieillissement sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.
Réduction
Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les mesures électromyographiques. Ainsi, pour une puissance d'analyse de 80% avec un risque de 5%, nous avons défini des tailles de groupes de n=12 pour pouvoir conclure sur les paramètres mesurés. Nous avons constaté que cette taille d'effectif convenait dans les études électromyographiques antérieures réalisées chez nos partenaires d'autres plateformes nationales. Dans le protocole de challenge nutritionnel qui s'étale sur 21 mois, la cohorte de départ est doublée pour garantir un nombre correct d'animaux exploitables jusqu'au dernier point de mesure. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés. En fonction de la normalité des données, la comparaison des résultats entre deux groupes sera réalisée à l'aide d'un test paramétrique ou non paramétrique. Nous utiliserons 168 souris au total pour cette étude.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement qui devrait nous permettre de préserver au maximum le bien-être des animaux tout au long des procédures. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage, ils sont hébergées par cage de 4. De l'enrichissement sera ajouté pour pour amoindrir le stress et permettre aux animaux de faire un nid, des igloos seront placés dans les cages. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours par les personnels de la zootechnie et 2 fois par semaine par une personne impliquée sur le projet, ceci permettant de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements.
Choix des espèces
Notre plateforme propose des expérimentations sur les souris de laboratoire, c'est également l'espère hébergée dans la zootechnie dans laquelle sera installé le matériel. C'est par conséquent l'espèce sur laquelle nous souhaitons travailler et nous entrainer afin de répondre aux besoin de nos utilisateurs. Les souris FXN-Pvalb sont utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich et montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 7 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer chez ces souris, puis un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez les souris FXN-Pvalb. Ces animaux seront donc utilisés au stade jeune et adulte. Les souris C57Bl6J seront utilisées du stade jeune adulte (3 mois) jusqu'au stade âgé (24 mois) pour répondre à la question de l'évolution de l'onde H au cours du vieillissement sous challenge nutritionnel ou non.
Modèles expérimentaux d’uvéites
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 5100
Lapins : 2550
12 750 animaux non-humains, soit 5 100 souris, 5 100 rats et 2 550 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'œil leur est provoquée par injection oculaire ou systémique, suivie d'examens ophtalmologiques parfois sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur attend des modèles servant à évaluer de futurs traitements et décrit une inflammation, un gonflement au point d'injection et de possibles diarrhées. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".
Objectifs
Les uvéites sont des inflammations, réactions de défense de l'organisme à une agression, de la partie de l'oeil appelée uvée qui est composée de plusieurs structures internes de l’oeil. Elles entrainent une rougeur de l'oeil, altèrent la vision, occasionnant des troubles ou l'apparition de taches, et peuvent conduire à la cécité en l'absence de soins. Dans les pays occidentaux, elles seraient à l’origine de 5 à 20% des cas de cécité. Les causes des uvéites sont variées: d’origine infectieuse, associées à une autre pathologie ou auto-immunes. L’objectif du projet est la mise en place de modèles expérimentaux d'uvéite chez le rongeur et le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux pour diminuer les symptômes. Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif, nous devrons avoir recours à des animaux pour établir notre modèle. Les informations bibliographiques recueillies, les analyses statistiques ainsi que notre expérience, nous permettrons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les signes et les origines des uvéites est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Selon la procédure, l'induction de la pathologie peut se faire soit par une injection directement au niveau de l'oeil soit par une injection systémique, intraveineuse pour le lapin, sous cutanée pour le rat, sous-cutanée ou intrapéritoneale pour la souris. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations par une lampe à fente d'phtalmologie). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur des recommandations et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus sont une inflammation de tissus de l'oeil, conjonctive, iris, humeur aqueuse, rétine, vitré et photophobie. De même un gonflement au niveau du site d'injection de l'inducteur est attendu (patte, dos, et base de la queue). Des diarrhées peuvent se produire, les animaux seront pesés juste avant l’induction le lendemain et chaque semaine qu’à la fin de la procédure.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de produits...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Des évaluations non invasives des structures internes de l'oeil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum pour les rongeurs, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie légère pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8-12 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.
Thérapie génique du syndrome de la déficience intellectuelle par sonoporation
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à modéré. Elles subissent l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés et microbulles jusqu'à trois fois, des séances d'imagerie et, pour 380 d'entre elles, une perfusion intracardiaque mortelle, afin de tester une thérapie génique du syndrome du X fragile. Le porteur indique que la sonoporation pourrait endommager le cerveau si les paramètres ne sont pas adaptés, risque qu'il estime inférieur à 10 % d'après le projet précédent. Il décrit la souris FMR1KO comme le modèle le plus proche de la maladie et juge le recours à l'animal "fondamental" pour étudier l'effet à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Le syndrome du X fragile est une maladie génétique héréditaire où l'expression de la protéine FMRP, codée par le gène FMR1, est fortement inhibée. Cette protéine a un rôle très important de transport et de transcription des ARN messager dans les cellules neuronales et les astrocytes. Son absence dans cette maladie provoque un déficit intellectuel et des troubles du comportement. Il n'existe pas de thérapie à l'heure actuelle, les seuls traitements étant symptomatiques. Ce projet vise à proposer une nouvelle stratégie thérapeutique par thérapie génique, c'est-à-dire en réexprimant la protéine manquante dans la maladie, ici FMRP, via l'expression d'un transgène. Si la thérapie génique a déjà fait ses preuves dans de nombreuses pathologies, aucune n'a pour l'instant été approuvé pour des maladies génétiques cérébrales. Cela est dû à la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui bloque le passage du sang vers le cerveau de la quasi-totalité des vecteurs ou molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous proposons de passer la BHE grâce à l'utilisation d'ultrasons focalisés associés à des microbulles de gaz, ces ultrasons faisant osciller les microbulles, provoquant l'ouverture de la BHE. Nous avons plusieurs objectifs dans ce projet. Nous souhaitons tout d’abord évaluer la sécurité, la reproductibilité et l'efficacité du passage dans le cerveau de vecteurs via des ultrasons focalisés combinés à des microbulles de gaz. Cette technique est connue sous le nom de sonoporation. Un second objectif dans ce projet consiste à analyser la biodistribution des molécules de vecteurs ainsi que des microbulles après la procédure de sonoporation. Nous souhaitons également suivre le niveau d’expression du vecteur dans le cerveau en fonction du temps. Enfin, nous souhaitons comprendre comment la restauration de l’expression du gène FMR1 peut modifier la communication neuronale et le comportement de la souris FMR1KO. Cela afin d'évaluer le potentiel de cette technique de thérapie génique pour traiter le syndrome du X fragile, dont les souris FMR1KO sont le modèle le plus proche et le plus utilisé. Ces souris sont génétiquement modifiées pour interrompre l'expression du gène FMR1 (dit Knock-out, ou KO pour le gène FMR1), reproduisant par conséquent plusieurs des phénotypes du syndrome du X fragile, dont les troubles de la sphère sociale et cognitive. Ce phénotype n'est pas dommageable car il ne génère aucune douleur et ces souris n'ont aucun problème pour se nourrir ou se reproduire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal apporté par ce projet sera la mise en place d’une preuve de concept d’un protocole de thérapie génique du syndrome du X fragile. Nous seront alors capable de faire exprimer un transgène dans le cerveau de manière sûre, reproductible et efficace pour restaurer les fonctions cognitives dans un modèle murin du syndrome du X fragile. Le syndrome du X fragile étant une maladie génétique qui provoque principalement une déficience intellectuelle. Cette avancée pourrait permettre dans le futur une avancée clinique pour le traitement de maladies cérébrales d’origine génétique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures de transfert de gène assisté par sonoporation, exclusivement sous anesthésie, durant 15 à 30 minutes, cette procédure pourra être subite jusqu’à 3 fois par animal. Ils seront également soumis à des procédures d'imagerie échographique, photoacoustique, et optique, non-invasive et réalisées sous anesthésie, durant 15 à 30 minutes, cette procédure pourra être répété jusqu’à 3 fois par semaine pendant 3 semaine suivant la procédure de sonoporation. Jusqu’à 380 souris pourront également être soumises à une procédure de chirurgie pour la perfusion intracardiaque nécessaire à la procédure d’immunohistochimie, intervention qui ne pourra être subite qu’une fois car il s’agit d’une mise à mort, le décès de l'animal par arrêt cardiaque est constaté au bout de 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les seules nuisances attendues sont celles apportées par les injections et l'insertion du cathéter, ainsi que celles liées à l'anesthésie. Une simple gêne est ainsi induite au réveil au niveau de l'injection. Aucune nuisance liée à la sonoporation n’est attendue dans les conditions normales, cependant des dommages dans le cerveau pourraient être possibles dans le cas où les paramètres de la procédure ne seraient pas adaptés (de pression acoustique ou de dose d'Evans Blue principalement). Ces paramètres ont déjà étés déterminés sur le précédent projet sur des souris Balb/c et seront affinés de manière expérimentale, dans ce précédent projet cette nuisance n'est parvenue que dans moins de 10% des cas et nous estimons ce risque encore plus faible dans ce projet maintenant que nous avons gagné en expertise sur cette procédure.
Devenir
À la suite de la procédure de sonoporation, seuls les animaux devant être analysé ex vivo en immunohistochimie ou avec d'autres analyses moléculaires seront mis à mort afin de prélever leur cerveau. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour suivre l'efficacité de transfection ou suivre le comportement. Les animaux pourront également être réutilisés une fois maximum pour suivre la procédure de sonoporation, à condition de l'absence de signes de souffrance et de l'absence d'expression du transgène. À la suite de la procédure de comportement, les animaux pourront également être réutilisés une fois maximum pour suivre la procédure de sonoporation, à condition de l'absence de signes de souffrance et de l'absence d'expression du transgène. À la fin du projet, ils seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé afin d'être analysé en immunohistochimie ou avec d'autres analyses moléculaires.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental afin d'étudier l'impact de nos protocoles de thérapie génique au niveau de l'organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. De plus des études comportementales valideront l'efficacité du protocole thérapeutique, celles-ci ne peuvent être réalisées que chez l'animal vivant.
Réduction
Afin de réduire au maximum la quantité d'animaux utilisés des études in vitro ont été menées en amont du projet pour valider la technologie. En effet nous avons pu valider in vitro les propriétés de nos microbulles. Les caractéristiques de taille, de concentration et de formulation sont contrôlées au laboratoire, aucune toxicité n'a été observée sur ces agents lors des tests in vitro sur culture de cellules ou in vivo sur la souris WT (Wild-Type, c'est à dire des souris non modifiées génétiquement). Dans notre projet, un contrôle interne est présent dans chacune de nos expériences de sonoporation, nous permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux. En effet seule la partie du cerveau visée par les ultrasons focalisés exprimera le transgène, par conséquent les autres parties du cerveau serviront de contrôle négatif. Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Uniquement les expériences pertinentes seront répétées avec des animaux de groupes équivalents.
Raffinement
Les procédures seront réalisées sous anesthésie. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées par groupe de 5 maximum, avec de la nourriture, de l'eau, de la litière ainsi qu'un enrichissement de leur milieu afin de leurs assurer de bonnes conditions de vie. Afin de s'assurer de leur bien-être, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent. Une grille de score clinique sera renseignée pour les animaux en cours d'expérimentation prenant en compte l'aspect, le poids, et le comportement / la mobilité de l'animal. Des points limites seront mis en place si des animaux atteignent un point limite, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant une bonne représentation des phénotypes et a une similitude génétique importante avec l’Homme. De plus grâce à la faible épaisseur de son crâne, la souris est un bon modèle pour les études d’ultrasons thérapeutique dans le cerveau. Les outils génétiques développés chez la souris ont permis de générer la souris C57BL/6 Fmr1 KO, qui est le modèle le plus proche de la pathologie humaine. Il en reproduit plusieurs des phénotypes et c'est le modèle le plus utilisé pour étudier les phénotypes du syndrome du X fragile. Il s’agit du premier modèle à étudier avant de pouvoir passer à une étude sur de plus gros animaux. Ces souris ont un trouble de la sphère sociale et cognitive avec notamment de l'hyperactivité. Ce phénotype n'est pas dommageable car il ne génère aucune douleur et ces souris n'ont aucun problème pour se nourrir ou se reproduire. Nous utiliserons les souris au stade de jeunes adultes (8-10 semaines) où le comportement est supposé être stabilisé, et à un stade plus jeune (3-4 semaines). Cela nous permettra de déterminer l'efficacité de notre protocole à rétablir le phénotype sauvage à un stade avancé du développement et étudier le bénéfice d'un traitement au début du développement. En effet le syndrome du X fragile étant une maladie neurodéveloppementale nous voulons voir si la restauration du phénotype sera plus importante sur des souris jeunes.
Réalisation des travaux pratiques de la « Formation spécifique destinée aux personnes appliquant des procédures expérimentales sur rongeurs.
- Formation professionnelle
18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des stagiaires apprennent sur elles le gavage, des injections et une prise de sang à la veine mandibulaire, avec jusqu'à deux tentatives par geste, lors d'une formation réglementaire de deux heures. Le porteur emploie des mannequins et des planches, mais affirme que les réactions de l'animal vigile restent "indispensables" et que la réglementation impose des animaux vivants. Les souris sont prises sur des surplus d'élevage déjà destinés à l'euthanasie.
Objectifs
L’objectif du projet est la formation initiale des applicateurs de procédures expérimentales, plus précisément la partie travaux pratiques (2h) de cette formation d’une durée totale de 45h. Les formations spécifiques en experimentation animale constituent en effet une obligation réglementaire à laquelle doivent se soumettre tous les acteurs de la recherche in vivo afin d’acquérir les outils nécessaires à la mise en place d’une démarche éthique prenant en consideration la sensibilité animale. Ces formations ont ainsi pour objectif de sensibiliser les personnels impliqués afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux lors des procédures expérimentales. Ce projet s’inscrit ainsi dans le cadre de la formation réglementaire et qualification du personnel utilisant des animaux à des fins scientifiques : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Ceci implique notamment un enseignement pratique comprenant une première approche des techniques de contention et de manipulation de l’animal à laquelle s’ajoute l’apprentissage de gestes peu invasifs courants (prise de sang, injection sous-cutanée…). Les travaux pratiques proposés dans cette formation permettent aux personnels d’apprendre à mettre en oeuvre différents gestes de base, encadrés par des formateurs expérimentés. Les séances (2h) se déroulent en petits groupes, avec 1 encadrant pour 6 stagiaires maximum. Ces travaux pratiques seront réalisés sur souris, les espèces les plus utilisées en recherche scientifique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.
Procédures
Au cours de la séance de 2h de travaux pratiques, quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin peuvent être réalisées, selon le niveau de maîtrise des participants : ces gestes ne seront réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires et validée par l’encadrant. Les gestes qui peuvent alors être appris sont : - le gavage par voie orale (VO), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) - l’injection intra-péritonéale (IP), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) - l’injection sous-cutanée (SC), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) - le prélèvement sanguin (PS) à la veine mandibulaire, dans la limite de 10% du volume sanguin total Chaque geste ne durera que quelques secondes. Chaque animal pourra faire l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. Ainsi, au maximum, pour les 3 animaux dédiés à un participants, il peut y avoir : - Animal 1 : gavage VO + PS - Animal 2 : injection IP + PS - Animal 3 : injection SC + PS En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - le stress lié à une préhension et contention d’un manipulateur non expérimenté - la souffrance pouvant être liée à une administration de produit ou prise de sang incorrectement réalisées La durée de ces effets est au maximum de 2h, durée de la seance de travaux pratiques. Si un animal présente des signes de stress ou souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal
Devenir
Les animaux euthanasiés sont utilisés pour réaliser les gestes techniques n’ayant pas pu être pratiqués sur animal vigile, lorsque la contention n’est pas suffisamment maîtrisée.
Remplacement
Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. La réglementation et la Commission Nationale de l’Expérimentation Animale imposent d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations initiales en expérimentation animales. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour ces travaux pratiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus majoritairement soit de l’élevage de l’établissement d’accueil, soit éventuellement d’un éleveur agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal (au maximum : contention, 1 administration et 1 prélèvement sanguin), 3 animaux par participant sont nécessaires. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.
Raffinement
En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques par une approche douce. Une grande importance est donnée à l’observation des animaux, la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal afin de préserver son bien-être. Pour la contention, les différentes méthodes montrées sont parmi les moins stressantes pour l’animal. Les notions d’entrainement des animaux, de bientraitance, de raffinement des techniques sont enseignées. Pour des raisons éthiques, les gestes techniques ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques.
Choix des espèces
La formation réglementaire dispensée comprend un module général (13h) et un module spécifique des rongeurs et lagomorphes (32h). Les animaux utilisés pour cette formation sont donc spécifiquement des rongeurs ou lagomorphes. Les participants travaillant au quotidien sur rongeurs, ce qui correspond à la grande majorité de nos participants puisque les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en recherche, sont orientés vers des travaux pratiques réalisés exclusivement sur rongeurs (en grande majorité des souris), tels que ceux que nous souhaitons organiser chez le client. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.
Travaux pratiques sur rongeur dans le cadre de la formation réglementaire opérateur de projet.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 150
450 rongeurs, 300 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des stagiaires s'exercent sur eux à la contention, aux injections et aux prélèvements de sang, non pour produire des connaissances mais pour valider une formation réglementaire. Le porteur mobilise des mannequins et des vidéos, mais affirme que le contact avec l'animal vivant reste "incontournable" pour des gestes comme les prélèvements rétro-orbitaires. Les animaux sont tués juste après les manipulations, pris en partie sur des surplus d'élevage déjà destinés à l'euthanasie.
Objectifs
Le projet a pour but d’appliquer les recommandations de la commission nationale de la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (dite CNEA) proposant précocement aux étudiants qui seraient amenés à utiliser des animaux à des fins scientifiques de suivre des formations réglementaires a minima de niveau applicateur. De plus, les mauvais gestes de prélèvement ou d’injection chez les petits animaux peuvent engendrer des dommages ou du stress pour l’animal. Ces perturbations peuvent avoir un impact significatif sur le bien-être animal et sur la valeur scientifique des résultats. Les travaux pratiques de cette formation enseignent les bonnes pratiques de préhension, de contention, de prélèvement et d’administration chez la souris et le rat dans le respect des principes d’éthique et de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
Ce projet fait appel à différentes procédures expérimentales à visée éducative. Il a pour but de familiariser les stagiaires avec les rats et les souris, raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera pratiqué sur des animaux vigiles (les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant chaque procédure de prélèvement) Des injections (intrapéritonéale, sous cutanée, intradermique) seront faites sous anesthésie locale sur animaux vigiles (rat et souris). Nous fixons le seuil d’une voie d’administration (durée d’environ une minute) et de deux voies de prélèvements par animal qui durent environ deux minutes (une minute par voie de prélèvement).
Impact sur les animaux
Douleur suite à l’introduction des aiguilles dans les sites d’injection et de prélèvement. Les pratiques de contention et de manipulation peuvent engendrer de stress pour les animaux.
Devenir
A la fin de chaque séance de formation, les animaux ayant subi des interventions d’injection et/ou de prélèvement ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles.
Remplacement
Nous allons remplacer l’utilisation de l’animal vivant par des modèles d’imitation rat et souris pour initier : à la contention, l’injection dans la veine caudale et le gavage. En outre la familiarisation des stagiaires avec les animaux nécessite un contact direct avec les animaux, en plus il n’est pas possible de pratiquer certains gestes techniques sur des mannequins ou des tissus artificiels comme les prélèvements rétro-orbitaires ou sub-mandibulaires. L’usage de l’animal est incontournable.
Réduction
Les études statistiques requises habituellement dans les études scientifiques ne peuvent pas être appliquées car le projet sera réalisé dans un but éducatif. Le nombre total des animaux dépend du nombre de participants qui est limité à 50. Les stagiaires seront répartis en 5 groupes de 10 et chaque groupe réalisera 1 TP sur les souris et 1 autre TP sur les rats. Le TP1 sur les bonnes pratiques de préhension, de contention, de prélèvement et d’administration chez la souris pour lesquelles 12 souris seront nécessaires (2 souris pour l’enseignant et une souris par stagiaire). Le Tp2 sur les bonnes pratiques de préhension, de contention, de prélèvement et d’administration chez le rat pour lesquelles 6 rats seront nécessaires (1 rat pour l’enseignant et un rat pour 2 stagiaires). Soit au total 60 souris et 30 Rats par an pour la formation de 50 stagiaires. Le nombre total d’animaux pour les 5 années est donc de 150 rats et de 300 souris. Néanmoins le projet a été pensé de manière à mettre en place plusieurs dispositions pour réduire l'effectif d’animaux nécessaire : -L’utilisation des modèles d’imitation souris et rats. -Des vidéos éducatives sur l’ensemble des gestes techniques. - l’utilisation des animaux de réforme destinés à l’euthanasie.
Raffinement
Avant les procédures, les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des micro-environnements enrichis par la présence de tunnels en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique et dômes pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes spécifiques et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribuées à volonté. Tous les animaux recevront une analgésie adéquate avant les manipulations. Les injections seront faites sous anesthésie locale avec du sérum physiologique qui sera réchauffé à l’aide d’un bain-marie ou tapis chauffant afin d’éviter la diminution de la température corporelle lors de l’administration. Les prélèvements sanguins seront faits sous anesthésie générale. Les animaux seront contrôlés systématiquement avant le début des TP et si nous constatons qu'un animal présente une blessure ou des signes d'inconfort (baisse d'activité, diminution des interactions, réduction de la prise alimentaire), il sera mis à mort sans rentrer dans la procédure. Pendant la procédure les encadrants mettent en place un environnement pour le contrôle des procédures d’injection et prélèvement par les stagiaires et de la souffrance animale. Les animaux n’auront pas le temps d’exprimer des signes de douleur ou d’inconfort car ils seront mis à mort directement après les procédures.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les principales espèces utilisées au sein de notre université Dans le but de faciliter la contention la manipulation pour les participants, nous utiliserons des souris et rats adultes (de 25 à 35 g pour les souris et de 300 à 350 g pour les rats).
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 460
3 880 rongeurs, 3 420 souris et 460 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 348 en gravité sévère. Ils subissent des chirurgies du nerf sciatique, une induction de neuropathie et, pour certains, un diabète db/db provoquant obésité morbide et hyperglycémie, avec un risque d'automutilation après section nerveuse. Le projet sert aussi à la formation de personnels, au-delà de la seule recherche, et tous les animaux sont tués pour prélever leurs nerfs. Le porteur annonce des essais chez l'humain entre 2024 et 2026 et une mise sur le marché entre 2026 et 2029, retombées lointaines face à des atteintes immédiates.
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé dans les pattes arrière permettant à la fois de les faire bouger et de ressentir des sensations perçues au niveau de ses pattes (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une membrane autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire), comme les maladies de Charcot-Marie-Tooth (CMT) ou l’hypersensibilité héréditaire à la pression ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie traumatique (causée par une blessure). Il n’existe actuellement aucun traitement. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif du projet est de valider notre approche thérapeutique, basée sur une thérapie génique qui utilise des vecteurs viraux, pour introduire dans les cellules des nerfs des patients, des candidats médicaments au potentiel anti-démyélinisant pendant plusieurs années lors desquelles les troubles moteurs existants et la progression de la maladie seront diminués. Ces vecteurs sont inoffensifs et ne partagent pas leur matériel génétique avec celui des patients. Afin de savoir si nos traitements seront efficaces aux stades précoces et tardifs de la maladie, nous administrerons les traitements soit en amont, soit après l’apparition des premiers symptômes dans des modèles de rongeurs de ces maladies. D’autre part, nous analyserons les nerfs prélevés sur les animaux à la fin de chaque procédure afin d’évaluer l’effet des candidats médicaments sur l’état de myélinisation des nerfs malades.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme Ce projet doit nous permettre de valider notre stratégie thérapeutique pour réaliser par la suite des essais cliniques et créer une banque de tissus pour des analyses ultérieures. Les résultats seront publiés. Avantages à long terme Cette approche thérapeutique permettrait d’administrer une fois tous les 10 ans, un traitement non toxique et stable aux patients. Il n’existe pas encore de traitement pour ces maladies et nous cherchons à en développer un qui diminuerait les symptômes existants et empêcherait la maladie d’évoluer. Nous prévoyons les premiers essais chez l’Homme entre 2024 et 2026 et l’approbation pour la mise sur le marché entre 2026 et 2029.
Procédures
Nuisances - Stress : hébergement individuel des femelles gestantes jusqu’à la mise bas (une semaine) car les cages jetables sont plus petites que les cages standards lavables. - Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours) - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines) - Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) - Nuisance associée au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive). -Deux types de chirurgies oLa première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez la majorité des animaux car elle consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques. Elle durera 30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisée. oLa deuxième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. -L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. -Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances : - Stress : hébergement individuel des femelles gestantes jusqu’à la mise bas (une semaine) car les cages jetables sont plus petites que les cages standards lavables. - Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours), biopsie (oreilles) - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines). -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour). Effets indésirables : -Effets indésirables du diabète, souris db/db : obésité morbide, une hyperglycémie, une myocardie et un retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive). -Automutilation (nerf coupé lors d’une chirurgie) d’une durée maximale de quelques heures car nous euthanasierons l’animal si nous en faisons le constat. Les données historiques montrent que 1,5% des animaux pourraient être concernés. Les différents modèles animaux présenteront une faiblesse musculaire d’intensité légère à modérée au niveau des pattes arrière qui ne se voit pas par simple observation de l’animal et ne sera mise en évidence que dans nos tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons leurs nerfs pour étudier l’effet du traitement sur leur pathologie.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Il existe des méthodes pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
En nous basant sur la littérature et nos données internes, nous avons réalisé des tests statistiques afin de déterminer le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental et limiter ainsi le nombre d’animaux aux stricts besoins des procédures en place. Le test statistique utilisé pour l’analyse des résultats sera une one-way ANOVA suivie d’un test-post-hoc de comparaison multiple Dunnett. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée tous les jours durant une minute par les expérimentateurs avant de débuter les tests comportementaux en vue de diminuer le stress.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de souris, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements au début de l’apparition des symptômes, pour stopper la démyélinisation pathologique (stade précoce), ou une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin d’essayer de stimuler la régénération. Rat/souris : juvéniles et adultes Nouveau-nés : J1 à J4 pour les souris, J6 à J7 pour les rats Femelles gestantes pour fournir les nouveau-nés : elles arrivent pendant le dernier tiers de gestation et sont gardées jusqu’au sevrage de leur portée
Travaux pratiques en licence sur les échanges gazeux respiratoires et leurs significations métaboliques
- Enseignement supérieur
60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées. Sans intervention invasive, elles sont soumises à un jeûne de quinze heures et à une exposition au froid de quinze minutes, puis placées cinq minutes dans une enceinte de mesure des échanges gazeux, pour des travaux pratiques d'étudiants en licence. Le porteur indique que le jeûne et le froid provoquent une angoisse légère et que les manipulations s'arrêtent en cas d'agitation, d'agressivité ou de prostration. Il précise que les mêmes souris sont réutilisées pour une seconde séance puis remises à la disposition de la plateforme, et retient cette espèce parce qu'elle est "couramment utilisée" pour former les futurs chercheurs.
Objectifs
Cette manipulation à deux objectifs principaux : 1. Elle s’inscrit dans démarche progressive d'apprentissage de la manipulation des animaux de laboratoire avec une mise en pratique du respect de la règle des 3R tout au long d’une procédure expérimentale scientifiquement rigoureuse. 2. Elle vise à approfondir la formation sur le métabolisme et permettra aux étudiants de mettre en relation les enseignements suivants : • La respiration à l’échelle de l’organisme, • Le métabolisme cellulaire vu en biochimie, • La Bioénergétique. Plusieurs conditions permettront d’appréhender différents aspects métaboliques : • Effet d’un jeun alimentaire, • Effet d’une exposition à un environnement froid dont le choix a été motivé par sa reproductibilité car non corrélé à des variations de comportements comme par exemple la mise lors d’une activité motrice contrainte. Ces deux stimuli reproductibles modifient le métabolisme qui sera évalué par les mesures des variations des échanges gazeux. Ces variations pourront alors être interprétées en augmentation ou diminution du métabolisme, et préciser le métabolite énergétique préférentiellement utilisé par l’organisme en fonctions du paramètre expérimental.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectifs : 1. La mise en pratique de la règle des 3R vue en théorie en amont de ce projet, de la première manipulation et de la préhension des souris de souche swiss choisie pour sa docilité ainsi que les bases de l’observation comportementale permettant d’appréhender les différences entre mal-être et bien être animal en cours de manipulation ; 2. De montrer l’influence des facteurs environnementaux comme le froid et de l’alimentation sur le métabolisme général de l’organisme en prenant les échanges gazeux respiratoire comme paramètre mesuré. Ainsi il permettra aux étudiants de mettre en relation les enseignements suivants : • Mise en pratique de la règle des 3R à tous les niveaux d’un protocole : en amont, pendant et une fois celui-ci terminé, • Les bonnes pratiques de préhension des souris, • La respiration à l’échelle de l’organisme, • Le métabolisme cellulaire vu en biochimie, • La Bioénergétique. Une attention particulière sera portée : • Sur l’importance de l’éthique en expérimentation animale dont les textes de référence sont présentés et la règle des 3R bien développée. • Sur la rigueur et l’attention portée au bien-être animal en amont, pendant et après les séances de TP, indispensable à toute expérimentation animale avec des organismes sensibles. • Sur la présentation des gestes de préhension de l’animal.
Procédures
Aucune intervention invasive ne sera pratiquée sur les animaux. Cependant les souris seront exposées aux contraintes suivantes : • Jeun alimentaire de 15h avec accès à l’eau ad libitum, • Exposition à un environnement froid durant 15 min sans hypothermie, • Stabulation dans une une enceinte métabolique durant 5 minutes pour l’enregistrement des échanges gazeux respiratoires sur les animaux vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à des stimuli désagréables (jeun et froid) qui seront associés à une angoisse légère. Ces deux stimuli sont reproductibles de par la maîtrise des variables expérimentales, base d’une bonne démarche scientifique. Durant l’exposition au froid et les périodes d’enregistrement des échanges gazeux, une vigilance particulière sera portée sur le comportement des animaux notamment la présence d’un comportement d’exploration bien exprimé par l’animal pouvant être accompagné par un comportement de toilettage. Les limites de ces manipulations seront définies par des signes tels qu’une agitation importante, une agressivité ou encore une prostration. Dans ces cas l’animal ne sera plus manipulé, remis en cage et placé sous surveillance. Le calme dans la salle de manipulation (bruit de fond sonore, mouvements des personnes) fera l’objet d’une attention particulière.
Devenir
Les mesures se font sur les animaux contrôles ou à jeun à température ambiante, puis après exposition à un environnement froid. Les animaux sont gardés vivants pour une autre séance de manipulation à 48h d'intervalle minimum dans le même projet avec inversion des statuts des souris : les contrôles deviennent les animaux à jeun réciproquement A la fin du projet, après un repos d’un mois : • Les autres seront mises à la disposition de la plateforme animalerie et potentiellement réutilisés pour un autre projet, • Le cas échéant, les souris seront euthanasiées. • Selon les besoins de la plateforme animalerie, une partie des animaux pourra devenir des reproducteurs pour l’obtention de souris calibrées pour un autre projet. Dans ce cas un cycle de reproduction par femelle sera envisagé.
Remplacement
L’acquisition des connaissances pratiques sur la ventilation et de sa régulation ont été effectuées préalablement à partir d’une manipulation assistée par ordinateur sur les étudiants eux-mêmes. Cette approche ne permet pas de mettre en évidence la signification métabolique des échanges gazeux dans les situations comme le jeun alimentaire léger et l’exposition au froid et en l’absence de logiciel dédiés justifient le recours à l’expérimentation animale. Par ailleurs les manipulations pratiques par les apprenants est prégnante dans la démarche d’investigation comme dans tout processus d’apprentissage. Elles ne peuvent être remplacées par la visualisation d’une vidéo (une de plus…) où la passivité de l’étudiant l’éloigne du concret.
Réduction
Une seule souris sera manipulée par poste d’expérimentation comprenant 4 personnes. Pour une séance il y a 2 souris contrôles et 2 souris à jeun. Les résultats seront mis en commun à la fin des séances afin que chaque étudiant puisse comparer les échanges gazeux entre souris contrôle et à jeun dans les deux conditions de température. Les manipulations seront renouvelées au cours d’une autre séance dans un délai minimum de 48h avec inversion des statuts : les sujets contrôles de la 1ère séance deviendront les sujets à jeun et réciproquement. Les résultats obtenus avec l’ensemble des souris sont mis en commun pour la prise en compte des variations individuelles et la signification statistique des différences observées dans les différents lots et sexes.
Raffinement
Cette étude nécessite une préhension, une stabulation dans une enceinte métabolique. Les animaux seront habitués à ces manipulations par le zootechnicien et le concepteur durant une semaine. Un seul sexe par séance sera manipulé supprimant toute perturbation générée par la présence des 2 genres en salle. L’exposition au froid est réduite au minimum pour avoir des modifications significatives sur le métabolisme, les animaux sont placés dans une enceinte métabolique identique à l’enceinte d’enregistrement, excepté la présence des sondes au dioxygène et au dioxyde de carbone. Afin de réduire le froid au niveau des coussinets des pattes, sera placée dans le fond de l’enceinte une plaque isolante. Après exposition au froid, l’individu est placé dans l’enceinte métabolique présentant les sondes, celle-ci à température ambiante ce qui lève totalement l’exposition au froid. Durant l’exposition au froid et les périodes d’enregistrement des échanges gazeux le comportement des animaux sera surveillé notamment la présence d’un comportement d’exploration bien exprimé par l’animal pouvant être accompagné par un comportement de toilettage. Si une agitation importante (stéréotypie), une agressivité, une prostration est constatée, il y aura arrêt de la procédure, l’animal sera remis en cage et placé sous surveillance. Par séance, 2 souris en plus des 4 manipulées resteront en cage dans le cas où des souris manipulées montreraient des signes d’angoisse aigüe justifiant de l’arrêt de leur manipulation. En fin d’enregistrement, le jeun sera interrompu, et tous les animaux recevront une récompense (céréales). Le retour en cage sera surveillé par le responsable du projet afin que les individus ne retournent pas une mauvaise cage, évitant la mise en place d’une nouvelle hiérarchie et le passage d’animaux à jeun dans la cage des animaux contrôles. Les enceintes métaboliques et d’exposition au froid sont nettoyées à l’eau savonneuse rincées et séchées afin de supprimer toute odeur de stress et ainsi annihiler la transmission du stress de l’animal manipulé lors du passage de l’animal suivant. Le calme dans les salles de manipulation tant au bruit de fond sonore qu’aux mouvements des personnes fera l’objet d’une attention particulière.
Choix des espèces
La souris faisant partie des animaux de laboratoire couramment utilisés, le choix de cette espèce s’impose pour la formation des futurs chercheurs. La souche swiss a été choisie pour sa faible anxiété par rapport à d’autres souches comme la souche C57Bl6 et sa faible agressivité pour un premier contact avec les étudiants. Animaux réformés. Les résultats correspondant aux échanges gazeux seront rapportés en pourcentage d’O2 et de CO2 pour 30g afin de pouvoir comparer les résultats sans pour autant utiliser des animaux calibrés produits par l’établissement éleveur.