Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Caractérisation du foie et de ses fonctions dans deux modèles de souris déficientes en myotubularine
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Trop faibles pour atteindre la nourriture placée en hauteur dans leur cage, les souris mâles privées de myotubularine développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements. 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 798 d'entre elles et modéré pour 52. Elles subissent l'ablation d'un bout de queue pour génotypage, deux à six prélèvements de sang sous anesthésie, puis une perfusion intracardiaque qui les tue en moins d'une minute, pour chercher des anomalies du foie que les patients atteints de myopathie myotubulaire présentent dans 91 % des cas. Deux lignées sont utilisées, l'une privée de la protéine dans tout le corps et dont l'espérance de vie ne dépasse pas six à huit semaines, l'autre seulement dans le foie, retenue parce qu'elle vit assez longtemps pour laisser à l'atteinte hépatique le temps de se développer.
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie congénitale liée au chromosome X, affectant les garçons et caractérisée par une faiblesse musculaire généralisée et une insuffisance respiratoire. Les patients meurent prématurément dans les premières années de vie, généralement suite à un arrêt respiratoire. Cette myopathie est due à des mutations dans un gène exprimant une protéine, la myotubularine qui est présente dans l’ensemble du corps humain. Des maladies du foie et des voies biliaires ont notamment été reportées pour 91% des patients. Un modèle murin de la myopathie myotubulaire a été créé avec une absence d’expression de la protéine dans l’ensemble des tissus. De prime abord, il ne montre pas de signe apparent d’une dysfonction au niveau de la structure du foie. Cependant, des analyses plus approfondies doivent être réalisées pour détecter certaines anomalies du foie. De plus, l’espérance de vie de ces souris ne dépassant pas 6 à 8 semaines, à cause de leur insuffisance respiratoire, il est possible que la pathologie hépatique ne se soit pas suffisamment développée pour être détectable au niveau structurel. Nous disposons d’un autre modèle murin n’exprimant pas la myotubularine spécifiquement dans le foie qui nous permettra de caractériser la fonction hépatique sur une période plus longue, à différents âges, puisque l’espérance de vie de ces animaux ne sera pas affectée. Dans ce projet, nous souhaitons donc étudier les problèmes qui peuvent survenir dans le foie sur les deux modèles de souris et ce, par des analyses d’enzymes hépatiques, des analyses de la structure du foie et des analyses biologiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier et de caractériser des atteintes hépatiques dans un modèle existant de la myopathie myotubulaire ou dans un nouveau modèle spécifique pour mieux comprendre la pathologie hépatique observée chez les patients. Cela permettrait également d’identifier de nouveaux candidats thérapeutiques pour lesquels nous pourrions à l’avenir vérifier leur efficacité chez la souris, pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients.
Procédures
Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : environ 5 min par souris, 2 à 6 fois en fonction de l’âge à l’euthanasie. Injection intrapéritonéale d’anesthésiques et injection sous-cutanée d’analgésique pour certains groupes avant perfusion intracardiaque : moins de 1min, 1 fois pour ces deux types d’injection. Perfusion intracardiaque pour fixation des tissus : moins d’une minute avant la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un prélèvement d’un bout de queue associé au tatouage, pour identification et génotypage. Les nuisances que le modèle n’exprimant pas la myotubularine dans l’ensemble des tissus peut rencontrer sont liées à l’absence de la protéine dans les muscles squelettiques. Les mâles développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les injections intra-péritonéales, sous-cutanées ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever le foie qui nous permettra de caractériser son état, sa fonction, sa structure, et des altérations biomoléculaires. Tous les animaux reproducteurs servant au maintien des lignées seront euthanasiés lorsque la reproduction ne sera plus efficace.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour caractériser l’atteinte hépatique observée chez les patients tels que les défauts de localisation de certaines molécules dans les différents compartiments du foie (canal biliaire par exemple), les défauts de structure de ces compartiments, ou encore les défauts de composition de la bile. Les organoïdes de foie que l’on pourrait développer ne possèdent pas à ce jour toutes les caractéristiques du foie : ils ne possèdent pas les structures anatomiques spécifiques comme les canaux biliaires, et par conséquent également il n’y a pas de flux biliaire. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à l’aide de calculs statistiques pour pouvoir observer des différences entre les animaux sains et mutés ou pour maintenir les lignées le long du projet. Pour la caractérisation des souris porteuses de la mutation uniquement dans le foie, trois âges d’euthanasie sont définis : 3 mois, 6 mois et 12 mois. Si dès 3 mois, l’atteinte hépatique s’est développée, nous étudierons l’évolution jusqu’à 6 mois.Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.
Raffinement
Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale ou mandibulaire, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse. Concernant les souris porteuses de la mutation dans l’ensemble des tissus, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis.
Choix des espèces
Les souris porteuses de mutation dans le gène exprimant la myotubularine ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène responsable de la myopathie myotubulaire, de façon ubiquitaire ou spécifiquement dans le foie, ce qui en font les plus petits modèles animaux à caractériser pour la fonction hépatique. Les mâles n’exprimant pas la protéine dans l’ensemble des tissus ainsi que les animaux contrôles seront utilisés après sevrage, à l’âge de 3 semaines et seront euthanasiés à l’âge de 6 semaines. A ce stade, la pathologie s’est suffisamment développée pour permettre la caractérisation d’une éventuelle atteinte hépatique. Les animaux qui n’expriment pas la protéine dans le foie et les animaux contrôles, seront utilisés à partir de 2 mois et jusqu’à 3, 6 ou 12 mois pour observer une évolution des enzymes hépatiques dans le sang et laisser le temps aux souris de développer une atteinte hépatique que l’on caractérisera à partir de prélèvements post-mortem. Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés dans l’étude si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.
Maintien et production pour l’expérimentation de la lignée de souris col4a3 KO
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
220 souris porteuses d'une invalidation du gène col4a3 vont être utilisées dans un élevage classé en souffrance légère, expédiées à quatre ou cinq semaines vers un autre établissement où l'expérimentation aura lieu. Celles qui ne portent pas la mutation sont gardées pour maintenir la lignée, et les homozygotes non transférées sont mises à mort avant six semaines, avant que la maladie rénale ne se déclare. Le porteur indique que ces souris développent une perte auditive vers six à huit semaines puis une fibrose rénale vers dix semaines, tout en écrivant qu'elles ne devraient pas en souffrir pendant la période d'élevage. Sur le remplacement, il affirme que la fibrose ne peut s'étudier que sur "organisme entier" et conclut qu'il faut recourir à l'expérimentation animale.
Objectifs
La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus (durcissement et perte d’élasticité) constatée après agression desdits tissus. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. L’objectif de cet élevage est de produire des souris déficientes de manière homozygote pour le gène col4a3. En effet, le gène col4a3 code pour la chaîne α3 du collagène IV, un composant majeur de la membrane basale des glomérules (unités fonctionnelles du rein). L’invalidation de ce gène chez les souris conduit au développement d’une glomérulonéphrite progressive sur un temps court (environ 10 semaines). Cette déficience permettra d’obtenir des animaux mimant phénotypiquement le syndrôme d'Alport, une néphropathie héréditaire conduisant au développement d'une fibrose rénale qui seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les causes et les mécanismes de cette fibrose afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cet élevage est l’obtention de souris déficientes pour le gène col4a3 qui seront des modèles de fibrose spontannée utilisés dans le cadre d’un projet plus large visant à étudier les causes et les mécanismes de cette fibrose afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).
Devenir
Les animaux portant le génotype d’intérêt (col4a3 KO et contrôles col4a3 WT) seront expédiés et utilisés dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Les animaux ne portant pas la mutation de manière homozygote et les animaux col4a3 WT non expédiés ne présentent pas de phénotype dommageable, ils seront utilisés pour maintenir l’élevage
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein du laboratoire demandeur pour la lignée générée ont permis d’obtenir de nombreux résultats. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 220 animaux au phénotype dommageable est nécessaire pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (4 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux mutés de manière homozygote pour le gène col4a3 et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 6-8 semaines seront suivis quotidiennement à partir du sevrage réalisé à 3-4 semaines et ce jusqu'à leur envoi à 4-5 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation : une observation individuelle sera réalisée chaque jour de la semaine selon les critères d’une grille de score. En fonction du score total, des mesures seront mises en place et, notamment, chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront mis à mort avant 6 semaines soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Les souris déficientes pour col4a3 vont notamment être particulièrement adaptées pour l’étude la fibrose rénale car il s'agit d’un modèle mimant le syndrôme d’Alport, une néphropathie héréditaire conduisant au développement d'une fibrose rénale. Des souris adultes, en âge de procréer pour maintenir l’élevage, seront utilisées. Les animaux envoyés pour expérimentation auront un âge de 4-5 semaines (avant les premiers signes d’expression du phénotype dommageable et du commencement de la fibrose rénale).
Développement de nouvelles immunothérapies cellulaires pour le traitement des tumeurs solides
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées porte des modifications qui les font développer spontanément des tumeurs : mélanomes chez 25 à 60 % d'entre elles à partir de deux mois, tumeurs de l'ensemble des glandes mammaires après une latence moyenne de 92 jours. 4 372 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la quasi-totalité, 54 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent quatre à six injections sous anesthésie, trois à six injections intrapéritonéales vigiles, des prélèvements de sang à la queue ou en rétro-mandibulaire, et une irradiation de 2 grays ou une injection de busulfan, avec nécrose, ulcération et saignements des tumeurs annoncés. L'élevage croise des femelles sauvages avec des mâles qui ne développent leurs tumeurs mammaires qu'après leur période de reproduction, ce que le porteur compte au titre du raffinement.
Objectifs
L’immunothérapie connaît un grand essor depuis ces dernières années et est de plus en plus utilisée pour traiter différents cancers. Cette thérapie consiste à réactiver le système immunitaire du patient afin qu’il puisse lui-même reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Malgré de nombreux succès cliniques, l’efficacité des immunothérapies est encore limitée à un sous-ensemble de patients répondeurs. Une des principales limites réside dans l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. En effet, un faible effet thérapeutique corrèle avec une tumeur dite « froide », c’est-à-dire peu infiltrée et pauvre en cellules immunitaires. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes permettant l’infiltration des cellules immunitaires au sein de ces tumeurs et de développer des stratégies pour manipuler ce processus afin de contourner la résistance thérapeutique aux points de contrôle immunitaire (ICB). Ce projet a pour but de développer de nouvelles thérapies capables de remodeler le microenvironnement tumoral afin de rendre répondante une tumeur qui ne l’est pas initialement. Utiliser ces nouvelles thérapies en combinaison avec les immunothérapies déjà existantes pourrait ainsi permettre de surmonter la résistance primaire observée chez de nombreux patients. Ce projet nécessite la modélisation du contexte immunitaire dans des modèles vivants. Au fur et à mesure de l’avancement du projet, des modèles pré-cliniques (tumeurs endogènes et souris humanisées) seront utilisés afin d’imiter au mieux les effets présents chez l’Homme. Ainsi les modèles précliniques permettent de sélectionner les stratégies immuno-thérapeutiques les plus efficaces à tester dans le cadre d'essais cliniques et par conséquent réduire les risques associés aux essais cliniques infructueux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif fondamental d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs solides. En parallèle, il cherche à développer des thérapies innovantes capables de réguler et de maîtriser ce processus complexe. En réalisant cette double démarche, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la lutte contre les tumeurs solides, en exploitant ces connaissances pour élaborer des approches thérapeutiques plus efficaces et ciblées. Ces traitements seront conçus pour surmonter la résistance initiale souvent observée vis-à-vis des immunothérapies. Ils agiront en transformant une tumeur qui, au départ, ne répondait pas favorablement envers ces traitements en une tumeur réceptive, permettant ainsi une meilleure efficacité des immunothérapies. Cette approche novatrice vise à contourner les obstacles initiaux et à ouvrir la voie à des réponses positives là où elles étaient auparavant limitées, potentiellement révolutionnant ainsi le traitement des tumeurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à ces types d’interventions : - 4 à 6 injections en intraveineuse/sous-cutanée/intra-tumoral, sur animaux anesthésiés. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 3 à 6 injections en intra-péritonéal, sur animaux vigiles. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 1 à 3 prélèvements sanguins au niveau de leur queue, sur animaux vigiles. Cet acte dure quelques minutes. - 1 à 3 prélèvements sanguins en rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes. - 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital ou rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes et est sans réveil. - 1 injection intra-péritonéale de buprénorphine. Cet acte dure quelques secondes. - 1 à 3 injections intra-péritonéales d’un anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 anesthésie locale par injection sous cutanée d'une solution d’anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 irradiation (générateur X, dose 2 Gy) ou 1 injection de busulfan dilué en solution saline. Cet acte dure quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés sur les animaux ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux saints, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie. Certaines souris sont viables et fertiles, mais 25 % à 60 % ou plus développeront spontanément des mélanomes avec un début à l'âge de 2 à 12 mois. L'application topique d’une molécule entraîne le développement de lésions cutanées pigmentées en 21 à 28 jours, qui évoluent en mélanomes. D’autres souris développant des tumeurs mammaires spontanément, les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et poursuivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris femelles d’un certain génotype développent des tumeurs au niveau de toutes les glandes mammaires (m1 à m10) avec un temps de latence moyen de 92 jours. Les tumeurs apparaissent progressivement à partir de 15 semaines jusqu’à un point limite vers 25 semaines. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales en sous-cutanées (cancer du sein, mélanome) sont : nécrose, uclération et saignements de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, perte de poids. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales du cancer du poumon sont : perte de poids, difficultés respiratoires, baisse de la tonicité dans les derniers stades de la maladie. Les nuisances liées aux injections des thérapies et aux prélèvements sont égales à la douleur causée par l’insertion d’une aiguille. Cet inconfort est léger et passager. Les traitements utilisés n’induisent pas de réaction adverse chez la souris. Une autre lignée (phénotype dommageable) sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentent dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.
Remplacement
Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les diverses thérapies cellulaires seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti-tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.
Réduction
Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistiques. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance . En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux respirant non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées.
Raffinement
Une lignée de souris étudiée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. La stratégie d’élevage participe au raffinement du projet, elle repose sur le croisement de femelles sauvages avec des mâles hétérozygotes qui développent tardivement des tumeurs mammaires (donc sans phénotype dommageable pendant la période d’utilisation comme reproducteurs. Les expérimentations avec une lignée de souris seront réalisées avant que les tumeurs se développent spontanément (à partir de 2 à 12 mois). Dans ce cadre nous utiliserons les souris mâles et femelles pour l'expérimentation. Les animaux seront régulièrement surveillés, et en cas d'apparition inattendue de tumeurs, ils serviront à standardiser
Choix des espèces
La souris se révèle être le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine de l'onco-immunologie et de la thérapeutique du cancer. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt, ainsi qu'une variété étendue de modèles de tumeurs transplantées. La souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre le cancer. Les animaux seront mis en expérimentation entre 8 et 14 semaines après leur naissance, car c’est l’âge à partir duquel ils auront atteint le stade « adulte » et que leur système immunitaire sera pleinement développé.
Évaluation dans le modèle souris de l’efficacité de la thérapie génique AAV pour traiter la forme infantile de la maladie de Pompe
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Injectés une seule fois dans le cerveau à la naissance, sous hypothermie provoquée sur une plaque métallique refroidie, les souriceaux d'une lignée modèle de la maladie de Pompe sont ensuite saignés une fois par mois pendant un, trois ou dix-huit mois. Leur force musculaire est évaluée jusqu'à quatre fois sur dix-huit mois, pendant que la myopathie s'installe : dos arqué, écartement des membres postérieurs, dandinement à la marche. 660 souris vont être utilisées, 525 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 135 d'un niveau léger. Toutes sont tuées à la fin, leurs tissus prélevés pour mesurer le sucre accumulé et l'expression de l'enzyme manquante, chez les traitées comme chez les non traitées.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer un médicament pour traiter la forme infantile de la maladie de Pompe. Cette maladie rare d’origine génétique touche les muscles qui permettent le mouvement (en premier lieu les muscles des hanches et des cuisses), les muscles respiratoires et cardiaques ainsi que le système nerveux. Elle toucherait entre 5 000 et 10 000 personnes dans le monde. D’après le registre français de la maladie de Pompe, il y aurait autour de 200 personnes atteintes en France. À l'origine de cette maladie, une enzyme déficiente, appelée alpha-glucosidase acide (GAA), qui ne joue pas son rôle et provoque l'accumulation pathologique de sucre dans les cellules et leur déterioration progressive. Il existe plusieurs formes de maladie de Pompe selon l’âge d’apparition des symptômes: la forme infantile de la maladie de Pompe est la plus sévère. S'ils ne sont pas traités, les bébés, atteints d’une forte faiblesse musculaire dès la naissance, meurent généralement aucours de leur première année. Un traitement, qui consiste en une injection toutes les deux semaines d'une enzyme de synthèse, est actuellement disponible mais il ne soigne pas la maladie, il ralentit son développement. De plus, son efficacité est réduite au cours du temps et une partie des patients développent une forte réaction immunitaire. Avec ce traitement, la durée de vie des malades est d'environ 7 ans. C’est pourquoi il est plus que nécessaire de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Pour cela, la thérapie génique est un outil prometteur. Pour traiter efficacement ces nouveau-nés, nous devons corriger les organes affectés par l'accumulation du sucre (les différents muscles, le cerveau, la moelle épinière). Notre projet vise à développer des outils de thérapie génique efficaces pour cibler et corriger ces tissus et valider leur potentiel thérapeutique sur un modèle animal de le maladie de Pompe, ici il s'agit de la souris Pompe.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une alternative thérapeutique efficace à long-terme pour corriger les muscles et le système nerveux dans la maladie de Pompe. La thérapie génique consiste à corriger le défaut génétique et de traiter la maladie en une seule et unique injection. Un traitement efficace permettra de limiter l’accumulation du sucre dans les muscles et dans le sytème nerveux, et ainsi empêcher le développement de la myoptahie et prévenir l’apparition des symptômes neurologiques et cognitifs. Nos travaux sont des preuves de concept qui visent à être traduites en clinique dans un futur proche.
Procédures
Des nuisances seront liées (i) à l'injection des traitements experimentaux : stress lié à la manipulation, douleur de la piqure (une seule injection, environ 100 µL de produit); (ii) aux prélèvements de sang : stress lié à la manipulation, douleur de la piqure (prélèvement 1x par mois pendant 1, 3 ou 18 mois, de 50-100 µL); (iii) aux évaluations de la force musculaire : stress lié à la manipulation (maximum 4x sur 18 mois, environ 1 minute par test); (iv) liées à l'euthanasie : stress lié à la manipulation (x1). Chaque geste (injections, prélèvements, etc.) durera moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Des stress liés à la manipulation et à l’injection/prélèvements sont attendu sur les souris. Sur les souris malades, des effets indésirables liés à la progression de la maladie chez les souris agées de plus de 8 mois (légère cambrure de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche (début à l’âge de 8-9 mois), dos arqué, fréquent écartement des membres postérieurs (apparition à l’âge de 9-11 mois). À noter que l’injection du traitement devrait empêcher l’apparition de ces symptômes et maintenir la force musculaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, à la fin des études. Des prélèvements de différents tissus seront réalisés afin de mesurer le niveau d'expression de notre protéine GAA ainsi que le niveau d’évolution de la maladie (baisse de sucre dans les tissus (muscles, cerveau, etc.) des souris traitées comparé aux souris non traitées).
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être substitué car nous avons besoin d'un organisme vivant entier pour étudier certains paramètres physiopathologiques: la correction des symptomes principaux (normalisation de la taille du coeur, réduction de taux de sucre dans l'ensemble des organes, restauration de la force musculaire), les réactions immunitaires, le passage du produit thérapeutique vers le cerveau, etc.
Réduction
Les candidats médicaments que nous testerons ont été préalablement validés sur modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons utilisés une approche statistique. Le résultats de ces calculs ont montré que 5 ou 6 souris/groupe, selon les procédures et le paramètre biologique mesuré pour répondre à la problématique posée, doivent être utilisés dans le projet.
Raffinement
Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant inclusion en PE, sera réalisé afin que les souris s'adaptent à leur nouvel environnement. Pour les PE sur souris non sevrées, les mères gestantes seront transférées en zone d'expérimentation, afin qu'elles s'adaptent aux nouvelles conditions avant la naissance des petits. Le nombre de males par cage sera limité à 5 souris afin de limiter les bagarres, et potentielles blessures. Si toutefois des bagarres sont constatées, les males agressifs seront séparés. Les prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur des souris préalablement anesthésiées à l'isoflurane. La douleur générée par l’injection intracérébroventriculaire à la naissance sera prévenue par l’induction d’hypothermie (forme d’anesthésie appropriée pour des petits animaux jusqu’à l’âge de 5 jours et lors d'une procédure chirurgicale inférieure à 5 minutes). Ces expérimentations ne dépasseront pas le degré de douleur modéré. Une plaque d'aluminium sera refroidie en la plaçant sur de la glace. Un chiffon sec sera disposé sur la plaque, les souris seront placées dessus environ 5 minutes. Les souris seront gardées sur un coussin chauffant avant et après l’injection. L’euthanasie sera réalisée, par dislocation cervicale, sur souris préalablement anesthésiées à l'isoflurane. Le sacrifice sera précédé d’une injection par voie intrapéritonéale de deux anesthésiques (5 ml/kg de poids) la kétamine et la xylazine. Points limites du modèle : les souris Gaa développent une myopathie progressive. Ces signes d'atteinte musculaire sont observés généralement à partir de 6 mois. Nous attribuons un score de signes cliniques basé sur la littérature : Degré 1 : légère cambrure convexe de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche (vers 8 mois). Degré 2 : Dos arqué, légère atrophie des muscles du dos, fréquent écartement des membres postérieurs (vers 9 mois). Dès l'apparition des symptômes de degré 1, des actions seront mise en place afin de limiter des efforts musculaires (alimentation au sol). Une pesée sera réalisée 1x par semaine et si une perte de poids de plus de 10 % est constatée, du DietGel sera ajouté dans la cage. Si la perte de poids persiste et devient trop importante (>20 %), la souris sera euthanasiée. Si une souris développe des symptômes de degrés 2, elle sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le model souris de la maladie de Pompe est un excellent moyen de déterminer l’efficacité thérapeutique d'un produit puisqu'il présente des symptomes proches de ceux observés chez l’homme : même défaut enzymatique, accumulation de sucre dans les muscles, coeur et système nerveux, diminution de la force musculaire et peut développer une réaction immunitaire. La litterature démontre qu’il est possible de corriger ses symptômes par thérapie génique, mais de nombreuses optimisations sont nécessaires pour traiter les plus jeunes individus. C'est pourquoi dans ce projet nous testerons nos candidats thérapeutiques chez des souris adultes et chez des souriceaux (entre 0 jours et 20 jours).
Elevage d’une lignée de souris à phénotype dommageable d’une pathologie neuromusculaire héréditaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Les souris homozygotes de cette lignée développent à partir de quatre mois une cardiomyopathie qui évolue en insuffisance cardiaque vers sept mois, accompagnée d'une cyphose, d'une atteinte des muscles squelettiques et d'une perte d'environ 20 % de leur poids. 980 souris vont être utilisées pour entretenir cet élevage, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, 106 d'entre elles subissant une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort systématiquement à l'âge de sept mois, pour limiter la contrainte de ce phénotype qu'il qualifie lui-même de dommageable. Les reproducteurs sont tués en fin de période de reproduction pour prélèvement d'organes, les souriceaux alimentant les projets de l'équipe déjà en cours ou à venir.
Objectifs
Le but de ce projet est d’entretenir une lignée transgénique de souris, modèle murin d’une pathologie neuromusculaire héréditaire. Cette pathologie est une maladie rare et à l’heure actuelle il n’existe pas de thérapie curative pour les patients. Cette lignée générée par notre équipe est un outil essentiel pour approfondir nos connaissances sur la physiopathologie et le développement de thérapies innovantes pour cette pathologie. Cette lignée, n’est pas commercialisée et n’est donc pas disponible en dehors de notre établissement utilisateur. Ce projet permettra le maintient de cette lignée, pour fournir les animaux, pour ce projet et pour les autres projets de l’équipe déjà en cours et approuvés par le ministère ou à venir qui feront l’objet d’un dépôt de dossier afin d’obtenir les autorisations nécessaires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice premier de projet est de maintenir notre lignée de souris transgénique en évitant la dérive génotypique afin de fournir des animaux pour les projets en cours ou à venir de l’équipe. Cette production d’animaux permettra de fournir des lots expérimentaux qui seront utilisés pour mettre en évidence des nouveaux mécanismes de signalisation moléculaire impliqués dans le développement d’une pathologie neuromusculaire héréditaire ou de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. On estime la prévalence de cette pathologie est environ 1 à 2 cas pour 100 000 personnes dans la population générale, les futurs traitements pourraient donc bénéficier à plusieurs milliers de personnes.
Procédures
Une biopsie de queue d’environ un millimètre sera réalisée sur une partie des animaux (106) pour lesquels une identification génétique est nécessaire. Le phénotype dommageable des souris homozygotes débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animal à 4 mois (environ 20 g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable des souris homozygotes débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animal à 4 mois (environ 20 g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. La biopsie pour le génotypage d’une partie des animaux qui constitue une nuisance (douleur et stress) de courte durée.
Devenir
Les animaux reproducteurs seront euthanasiés en fin de période reproductive pour prélèvement d'organe. Les souriceaux issus des accouplements serviront d’une part comme animaux reproducteurs, et d’autre part ils serviront en utilisation continue au sein des projets de recherche en cours ou à venir préalablement autorisés
Remplacement
Nous sommes toujours dépendant de l’utilisation de modèles animaux car les questions que nous abordons, ne peuvent pas être abordées uniquement avec des modelées cellulaires. Effectivement, les cardiomyocytes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas et ne peuvent pas être maintenues en cultures. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. D'autre part, les quelques modèles cellulaires existant ne reproduisent pas les conditions physiologiques spécifiques des cellules cardiaques. Ils seront toutefois utilisés pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.
Réduction
Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet (980), nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est évalué à partir de la connaissance et l’expérience approfondie de l’investigateur principale en matière d’entretien de lignée de souris. Le nombre d’accouplement par an et par génotype est évalué en fonction de la durée d’un accouplement, le temps moyen entre deux portés, du nombre de portées moyen par femelle, la taille moyenne d’une portée (sevrée), du taux de sevrage, du taux de mortalité, du sexe ratio, de génotype ratio, de l’indice de reproductivité.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. L’isolement des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable, une fiche de scoring est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype et les animaux sont mise à mort systématiquement à l’âge de 7 mois.
Choix des espèces
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire et musculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant responsable à l’état homozygote d'une pathologieneuromusculaire. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire iPS que nous pouvons dériver en cardiomyocyte ou en myoblaste, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront utilisés à maturité sexuelle entre 3 et 6 mois avant l'apparition des stymptomes dommageables et entre 5 et 7 jours de vie pour les biopsies caudales pour génotypage.
Elevage de lignées de souris immunodéficientes et prélèvements pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
79 950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pour une biopsie d'oreille au poinçon de deux millimètres ou une prise de sang, contention comprise, en une trentaine de secondes. Aucun anesthésique ni analgésique n'est prévu, le porteur estimant la douleur aiguë mais limitée à deux secondes environ. Ces prélèvements servent au génotypage de lignées de souris immunodéficientes élevées en vue d'être utilisées dans d'autres projets, et le porteur indique qu'une méthode non invasive sur poils ou salive sera privilégiée quand elle sera au point. Une partie des souris est gardée vivante selon les génotypes recherchés et les besoins de reproduction, les autres sont tuées faute de génotype utile, en fin de reproduction, ou parce qu'aucune procédure ne les attend.
Objectifs
Il concerne donc toutes les méthodes de prélèvements invasives d’échantillons en vue des génotypages (biopsies oreilles ou prélèvements sanguins) ainsi que l’hébergement de souris immunodéficientes. Le génotypage des animaux est indispensable afin de définir le génotype de chaque individu, ce qui permettra par la suite d’identifier les animaux qui seront utilisés en reproduction ou à des fins scientifiques dans le cadre de projets/procédures de recherche autorisés. A terme, lorsque la technique de génotypage sur échantillon de poils ou salivaire sera mise au point et que cela sera possible techniquement, une méthode non-invasive sera privilégiée.
Bénéfices attendus
Pouvoir fournir des animaux d’intérêts de lignées de souris génétiquement altérées qui seront utilisés dans les différentes procédures expérimentales des projets autorisés. De manière à atteindre les objectifs scientifiques dans les domaines de l’inflammation, du cancer et de l’infectiologie.
Procédures
Biopsies oreilles : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague) Prélèvements de sang : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague)
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées aux animaux sont : - le stress lié à la contention (environ 30 secondes) - la douleur, aigue mais de très courte durée, ressentie lors du poinçonnage de l’oreille (environ 2 secondes) ou au point de ponction pour le prélèvement sanguin (environ 2 secondes)
Devenir
Les animaux sont gardés en vie, en fonction des procédures expérimentales en cours, des génotypes d’intérêts ainsi que des besoins en reproduction. Les animaux mis à mort concernent les animaux ayant un génotype ne présentant pas d’intérêt, arrivant en fin de reproduction, n’étant pas inclus dans une procédure expérimentale.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est incontournable dans certains projets des équipes de l'institut. En effet, la nature des travaux qui sont menés imposent le choix du modèle murin, dans la mesure où les processus développementaux étudiés ne peuvent être abordés dans leur complexité physiopathologique dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro.
Réduction
Une gestion raisonnée des accouplements est mise en place au sein du service de zootechnie. Nous adaptons au mieux le schéma de reproduction en fonction de la spécificité de chaque lignée et/ou des besoins expérimentaux. Cela ayant pour objectif de limiter au maximum la production d’animaux.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Le personnel étant formé et sensible au bien-être animal et les animaux habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. De plus, toutes les mesures sont prises lors des gestes techniques afin de minimiser au maximum les dommages causés aux animaux. Le matériel est adapté à l’espèce et la taille ou le volume de prélèvement est minimisé (poinçon de 2 mm pour la biopsie d’oreilles et volume de 50µl pour le sang). Tous ces éléments font qu’il n’est pas prévu d’utiliser d’anesthésiques volatils, d’analgésique et/ou anesthésique local.
Choix des espèces
Le modèle murin offre plusieurs avantages : 1) sa génétique est bien connue ce qui permet une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques et développementales fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu et est à maints égards semblable au système immunitaire humain. Les animaux seront prélevés au sevrage soit entre 21 et 27 jours pour les biopsies d’oreilles et à partir de 28 jours pour les prélèvements sanguins.
Gestion d’élevage expérimental par génotypage dans le cadre de la création et le maintien de lignées transgéniques pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques dans le lait.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
3 000 lapereaux subissent une biopsie de tissu, répétée une fois à une semaine d'intervalle, pour trier ceux qui portent la modification génétique permettant de produire un médicament dans le lait de lapines. Ils relèvent d'un niveau de souffrance léger, la biopsie provoquant une douleur légère et un stress transitoire à la préhension, sur des animaux âgés de cinq à douze jours. Le remplacement de la biopsie d'oreille par un prélèvement de follicules pileux est à l'étude dans l'établissement, sans être assez avancé pour arrêter les biopsies. Les lapereaux reconnus non transgéniques sont tués au plus tard au sevrage, le porteur invoquant un risque de modification génétique partielle ou non détectable, tandis que les transgéniques sont gardés pour la reproduction et la traite.
Objectifs
Notre objectif est de produire des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et nous produisons ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet a pour objectif de génotyper des lapereaux que nous créons par transgénèse ou par croisements, afin de déterminer ceux qui portent la modification génétique souhaitée.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de connaitre le statut génétique des animaux que nous générons pour notre objectif final : produire des protéines recombinantes pour soigner l’Homme, dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet participe donc à la production de protéines médicaments dans le lait de lapines pour soigner des maladies rares humaines.
Procédures
Les lapereaux subiront un prélèvement minime de tissu (1 à 2 fois selon les résultats, à 1 semaine d’intervalle).
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les animaux est la douleur, légère, due à la biopsie, ainsi qu’un stress léger et transitoire lors de la préhension pour biopsie.
Devenir
Les lapereaux déterminés comme non transgéniques seront euthanasiés, au plus tard au moment du sevrage, car il subsiste toujours un risque de modification génétique partielle ou non détectable dans ces animaux. Les lapereaux transgéniques seront gardés pour être mis en reproduction, pour obtenir du lait des femelles. Leur matériel génétique sera cryoconservé sous forme de sperme ou d'embryons.
Remplacement
La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques permet de produire des protéines de structure complexe, compatible avec leur utilisation chez l’humain comme médicament. Le médicament que nous avons produit à partir de nos lapines transgéniques est plus efficace et plus sûrs que « concurrents » car il n’est pas dérivé du plasma humain, n’entraine pas une surexposition du corps à de trop fortes concentrations car son élimination est rapide, ne contient pas d’autres protéines que celle souhaitée ni de virus ou protéines potentiellement dangereux. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines similaires à celles de l’Homme, (en quantité et qualité) ce qui est permet une meilleure efficacité du traitement auprès des patients, ce qui n’est pas le cas des protéines produites par des bactéries ou des levures. Nous travaillons actuellement sur le remplacement de la biopsie d’oreille par le prélèvement de follicules pileux mais nos travaux ne sont pas encore finis. Nous n’avons pas testé à ce stade assez d’échantillons pour pouvoir arrêter les biopsies d’oreilles.
Réduction
Pour l'optimisation de la production des protéines, nous avons mis au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous testons tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir présélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule. Cela nous permet de diminuer le nombre total d’animaux utilisés et de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Lorsqu’une portée nait, il ne nous est pas possible de réduire le nombre d’animaux à génotyper, car nous sommes dans l’attente d’obtenir un ou des animaux transgéniques. En revanche, nous sommes très attentifs à ne pas créer inutilement des portées à génotyper, préférant garder des animaux transgéniques dont nous n’avons pas besoin sur le moment, plutôt que de générer une nouvelle portée si le besoin apparaissait plus tard. Il s’agit ici d’une gestion raisonnée, mais aucune approche statistique n’est utilisée.
Raffinement
Les lapins sont surveillés quotidiennement et des points limites précoces sont strictement appliqués. Ils reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher, un de leur comportement naturel. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Depuis quelques mois, nous avons abandonné l’identification par tatouage. Tous les lapereaux sont contrôlés au minimum une fois par jour, le matin après le passage de la mère dans le nid pour l’allaitement de sa portée. Nous vérifions si les lapereaux ont bu le lait de leur mère par la présence d’ une poche de lait dans leur abdomen. S’ils n’ont pas bu ou pas assez, nous préparons de l’allaitement artificiel ou leur donnons du lait d’une autre lapine afin de les complémenter. Nous pouvons également faire adopter les lapereaux issus de trop grandes portées par une femelle ayant eu une portée plus petite.
Choix des espèces
Pour la production de protéines recombinantes dans le lait, le lapin a été choisi par notre société car : - courte période de gestation (30 jours), - maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), - important volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), - synthèse de protéines complexes et en quantité importantes par la glande mammaire (glycosylation et gamma carboxylation similaires à celles de l’Homme). Les animaux seront utilisés très jeunes : le prélèvement invasif aura lieu entre 5 et 12 jours de vie. Il est impératif de savoir rapidement si un animal est transgénique dans le but de planifier ou non de nouvelles procédures ou des accouplements.
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Elevage de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Fournir des souris génétiquement altérées à 20 à 25 projets du laboratoire, répartis sur 40 à 45 lignées : telle est la finalité de ce projet, qui prévoit le génotypage de 4 000 souris par an, soit 20 000 sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit à vif un prélèvement de tissu à l'oreille de moins d'une minute, qui sert en même temps d'identification définitive. Celles dont le génotype ne convient pas sont tuées, les autres restant en vie pour une utilisation continue. Sur le remplacement, le porteur se limite à une phrase, qui redit que le projet existe pour alimenter les études in vivo du laboratoire.
Objectifs
L'objectif est de générer des souris génétiquement altérées pour les équipes de recherche du laboratoire. Il y a en moyenne entre 20 et 25 projets autorisés dans la structure. Cela implique l'élevage de 40 à 45 lignées différentes.
Bénéfices attendus
Le projet permet d'optimiser la production d'animaux modèles pour les différents projets du laboratoire avec des retombées positives dans les domaines de la biologie du développement, du cancer et des maladies neuropsychiatriques et neurodégénératives.
Procédures
Un prélèvement d'un échantillon de tissu sur animal vigile. Durée totale de moins d'1 minute.
Impact sur les animaux
La contention induit un stress léger de moins d'1 minute qui peut s'accompagner d'une douleur brève et légère lors du prélèvement de tissu à l'oreille.
Devenir
Soit mise à mort des animaux si le génotype n’est pas approprié, soit animaux gardés en vie pour une utilisation continue.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de générer des animaux pour les études in vivo développées au laboratoire.
Réduction
Les stratégies d'élevage sont discutées avec les utilisateurs pour optimiser le nombre d'individus utiles pour les projets. Sur la base des 2 dernières années, nous estimons que la génération d'animaux issus des 40 à 45 lignées hébergées dans la structure nécessite le génotypage d'environ 4000 souris par an, soit 20 000 sur 5 ans.
Raffinement
Le prélèvement de tissu et le marquage aux doigts sont réalisés au même moment pour minimiser le stress de l'animal. Les animaux sont ainsi soumis à une seule contention d'environ 1 à 2 minutes qui permet ensuite de les identifier tout au long de leur vie sans avoir à les manipuler de nouveau.
Choix des espèces
Les projets scientifiques développés par les utilisateurs utilisent le modèle souris. Le prélèvement est réalisé au moment de l'identification soit entre 14 et 21 jours.
Elevage et maintien de lignées murines modèles pour l’étude de maladies liées au défaut de transport axonal
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Tuées à la fin de leur vie reproductive, 2 875 souris vont être élevées pendant cinq ans pour fournir des animaux à d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent des mutations qui provoquent en vieillissant une maladie neurodégénérative, que le porteur décrit comme se limitant à des symptômes légers, détectables seulement par des tests comportementaux qu'il ne nomme pas. Chaque souris subit un rasage à la tondeuse pour le génotypage, et les mâles reproducteurs sont isolés jusqu'à la fin de leur vie reproductive, vers huit mois. Le cerveau de tous les animaux générés sera prélevé, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction, sans détailler le calcul qui aboutit à 2 875 souris pour maintenir deux lignées.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien de deux modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de maladies neurodégénératives. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de ce type de maladies et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien-être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de ce type de maladies et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant une maladie neurodégénérative caractérisée par des symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Le génotype des animaux générés sera contrôlé au fur et à mesure par prélèvement pileux (rasage à la tondeuse – geste inférieur à 5 sec.).
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous une forme qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Nous pouvons identifier 2 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant le rasage destiné à prélever quelques poils pour analyses génétiques et 2) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Il a été précédemment démontré que les modèles murins actuels reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de maladies neurodégénératives, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de ces maladies et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de ces maladies en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2875 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 2 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et de matériaux prévus par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Pour réduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Si lors du monitoring quotidien des animaux une douleur est observée, une injection de Carprofen (5mg/kg) sera réalisée. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de maladies neurodégénératives. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la protéine responsable de ces maladies et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Élevage d’une lignée de souris transgéniques pour l’étude du syndrome de Rett
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Ce projet sert à faire naître des souris porteuses de la mutation du syndrome de Rett, destinées ensuite à d'autres expériences. 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées à l'issue de l'élevage. Les mâles porteurs se développent normalement jusqu'à cinq semaines, puis leur état se dégrade avec des atteintes musculaires, cardiaques et respiratoires qui en tuent environ la moitié entre huit et douze semaines. Le porteur les tue au sexage et au génotypage pour devancer ce phénotype, et revendique la mise à disposition de la communauté scientifique de "modèles précliniques" de la maladie.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une pathologie neurodéveloppementale rare et sévère qui touche principalement les filles, avec une prévalence de 1 pour 10 000 naissances féminines. Dans 95 % des cas, cette maladie résulte d'une mutation du gène porté par le chromosome X. Les garçons atteints de cette mutation décèdent in utero ou au cours des premières semaines de vie (encéphalopathie létale). Cliniquement, le syndrome de Rett chez les filles se caractérise par une régression comportementale apparaissant vers l'âge de 2 ans, accompagnée de déficits moteurs sévères, notamment au niveau respiratoire, de troubles cognitifs, et d'un syndrome autistique (altération des comportements sociaux, comportements stéréotypés), souvent associé à de l'épilepsie. À ce jour, aucun traitement médicamenteux n'est disponible pour soulager les troubles moteurs et les symptômes autistiques chez les patientes atteintes du syndrome de Rett. Sur le plan neurobiologique, les mécanismes sous-tendant les atteintes motrices et les symptômes autistiques chez les patientes demeurent incompris. L'objectif du projet est la génération de souris possédant la mutation sans l'expression d'un phénotype dommageable. Ces animaux seront utilisés dans des expériences visant à trouver des solutions thérapeutiques pour soulager les patientes atteintes de la maladie.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet est de générer des souris modèles du syndrome de Rett. Ces animaux seront utilisés dans des expériences visant à développer des solutions thérapeutiques pour soulager les patientes atteintes de cette maladie.
Procédures
Le processus décrit concerne l'élevage d'une lignée de souris présentant des problèmes de santé. Seuls les mâles porteurs de la mutation développent ces problèmes. Ces souris grandissent normalement jusqu'à environ 5 semaines. Ensuite, leur santé se détériore rapidement, avec des problèmes graves de muscles, de cœur et de respiration, ce qui entraîne leur décès vers l'âge de 12 semaines. Nous retirons les souris présentant ces problèmes avant qu'ils ne surviennent. Les souris ne subissent aucune intervention hormis les procédures nécessaires pour les élever correctement.
Impact sur les animaux
Les souris mâles présentant la mutation se développent normalement jusqu'à leur cinquième semaine. Ensuite, leur état se dégrade, conduisant à un taux de mortalité d'environ 50% entre la 8ème et la 12ème semaine de vie.
Devenir
Les mâles mutant présentent le problème de santé, et ils seront euthanasiés lors du sexage et du génotypage avant le développement de ce phénotype.
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l'autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d'aspect pour la pathologie autistique, et aussi d'évaluer le cas échéant l'efficacité d'une approche thérapeutique. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental. En effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Nous nous mettons en place une stratégie d’accouplement spécifique afin de réduire le nombre d’animaux qui présentent un problème de santé.
Raffinement
Nous affinerons nos expériences en soulageant l'inconfort ou le stress potentiel subi par les animaux tout au long de leur période d'élevage. Nous logerons les souris par groupes sociaux de 2 à 4 individus, en mettant à leur disposition le matériel nécessaire pour construire un nid (ouate et cabane en carton). Nous mettons en place une stratégie de croisement afin de limiter le nombre d'animaux présentant un phénotype dommageable.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d'aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Le phénotype des souris mâles présentant la mutation génétique apparaît à l'âge de 6 semaines. L'observation hebdomadaire des animaux nous permet de surveiller l'état général des individus et d'appliquer les points limites pour décider de la mise à mort des animaux quand cela est nécessaire.
Elevage d’une lignée murine immunodéficiente à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour maintenir une lignée de souris privées de défenses immunitaires, 8 550 animaux sont élevés dans des procédures déclarées en souffrance légère. Aucune expérience ne leur est appliquée dans ce projet, la seule atteinte déclarée étant le déclenchement de leur phénotype dommageable, une vulnérabilité à tout germe opportuniste que le porteur affirme neutraliser par un hébergement stérile. Les souris arrivées en fin de fertilité, vers six mois, sont tuées, les autres étant transférées vers d'autres projets d'expérimentation. Le porteur indique que les croisements sont conçus pour que "toute la descendance serve", et déclare cet élevage parce que la réglementation européenne l'y oblige désormais.
Objectifs
La lignée de souris qui est l'objet de cette Demande d'Autorisation de Projet (DAP) est fortement immunodéprimées : les animaux issus de cet élévage sont donc fortement immunodéficients (sans défenses immunitaires). Leur phénotype (l'ensemble des caractères visibles) est par conséquent considéré comme dommageable : ils deviennent sensibles et vulnérables à tout pathogène, dont l'infection peut leur être délétère. Cependant, ce phénotype peut ne pas s'exprimer si leur élevage est réalisé dans des conditions sanitaires optimales : statut sanitaire contrôlé sans pathogène, hébergement en cages ventilées, manipulation sous hotte, utilisation d'équipements, d'aliment, d'eau de boisson et d'enrichissements stériles, ce qui est le cas dans notre Etablissement Utilisateur. Désormais la règlementation européenne nous demande de déclarer l'élevage de ces animaux à phénotype dommageable, même si ce phénotype ne s'exprime pas grâce aux conditions adéquates de maintien de cette lignée. C'est l'objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Cette lignée est utilisée par de nombreuses équipes de notre Animalerie car son immunodéficience sévère rend possible la recherche sur les fonctions immunitaires humaines, les maladies infectieuses, le diabète, l’oncologie et la biologie des cellules souches.
Procédures
La seule intervention qui pourrait intervenir sur les animaux est le déclenchement de leur phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable qui pourrait arriver sur ces animaux extrêmement immunodéficients est une contamination par des pathogènes opportunistes. Mais étant donné les conditions d'hébergement et d'expérimentation au sein de notre structure (classe 2, SPF, hébergement en portoirs ventilés, travail sous PSM de classe 2, équipements de travail et outil stériles), ce phénotype délétère ne s'exprime pas.
Devenir
Les animaux arrivant en fin de fertilité (environ 6 mois d'âge) sont mis à mort. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d'Expérimentation et inclus dans d'autres DAP en utilisation continue.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. De plus, les lignées murines immunodéficientes restent très intéressantes pour appliquer des paramètres humains sans risque de rejet.
Réduction
Nous essayons de prévoir nos plans de production au plus précis afin de ne pas surproduire. Les croisements sont double homozygote pour que toute la descendance serve. La production est adaptable en fonction des besoins expérimentaux des DAP. Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Nos conditions d'élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s'exprimer: cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment et eau stérilisés. Les enrichissements sont variés et adaptés au type d'animaux dans la cage. Les points limites définis dans le cadre du suivi des animaux sont des points limites d'élevage précoces de manière à éviter la transmission potentielle du phénotype d'élevage.
Choix des espèces
Au sein de notre Etablissement Utilisateur, l'ensemble des équipes de recherche utilise le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de mimer. Les animaux de cette DAP sont utilisés depuis leur naissance jusqu'à: - leur transfert en expérimentation, où ils sont inclus dans d'autres DAP en utilisation continue (environ 8 semaines), - la fin de leur vie de reproducteurs, pour les animaux de maintien de la colonie (environ 6 mois),