Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Elevage d’un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (projet site 1)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées à un partenaire, soit tuées. Ce projet consiste à élever une lignée porteuse d'une duplication du gène PMP22 reproduisant la maladie de Charcot-Marie-Tooth, les souriceaux développant dès trois semaines une atteinte neuromusculaire et des troubles de la coordination. Le génotypage passe par une biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur indique produire ces animaux pour un partenaire cherchant un traitement pharmacologique et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer le modèle in vivo.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculosquelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.
Impact sur les animaux
Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies de génotypage.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies génétiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 480
5 000 souris et rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère, la plupart tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, une partie gardée pour la reproduction. Elles reçoivent des injections répétées par voie intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, orale, oculaire ou intracérébrale avec pose de canule, sur une durée pouvant atteindre 24 semaines, avant une mesure terminale de la contractilité musculaire sous anesthésie. L'objectif est de sélectionner des candidats de thérapie génique ou antisens contre la myopathie de Duchenne, les retombées pour les patients étant renvoyées au long terme. Sur le remplacement, le porteur teste d'abord les molécules in vitro mais affirme que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" pour le développement préclinique.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent essentiellement sur des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le système nerveux central (aspect cognitif) représente notamment aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie neuromusculaire notamment la myopathie de Duchenne. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une biodistribution sur le corps entier et une amélioration significative chez les modèles animaux étudiés, et à plus long terme chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée seront plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Afin de permettre l’accumulation progressive, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 2, nous testerons la voie d’administration orale (intra-stomachal) moins invasives; afin de permettre l’accumulation progressive les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Afin de cibler plus spécifiquement certaines zones, nous testerons les voies d’injection oculaire et intracérébrale. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil. Les injections oculaires pourront être plus brèves de l’ordre de 5 à 10minutes, et les animaux ne seront injectés qu’une seule fois. Pour les animaux en procédure intracérébrale, les injections ne seront pas répétées sauf s’il y a implantation de canules où l’animal pourra recevoir des administrations 1 fois par semaine pendant 6 semaines via la canule après anesthésie gazeuse. Ces ré-administrations seront brèves de l’ordre de 5 minutes. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. après anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxillaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de façon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine. Les animaux ayant recus des injections pourront également suivre la procédure terminale sans réveil de mesure de la contractilité musculaire pour mesurer l’efficacité de notre traitement sur l’amélioration de la force après anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses, les nuisances et effets indésirables sont donc faibles. Les animaux subissant la procédure d’administration intracérébrale pourraient présenter des difficultés d’alimentation et une potentielle douleur dans la première journée suivant la procédure. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoin. Ils seront particulièrement suivis après la chirurgie avec un tableau de suivi quotidien pendant les 3 jours suivants la chirurgie, et observés bi-quotidiennement le jour de la chirurgie avec ré-administration d’analgésie 8h post opératoire si l’évaluation d’après la grille le justifie (score >6). Dans ce cas, une vigilance accrue et une observation biquotidienne sera maintenue. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classés « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs : mobilité réduite et problème cardiaque. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si ces symptômes devaient apparaitre prématurément.
Devenir
Ormis pour la procédure d’élevage où les animaux seront gardés en reproduction, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’intérêt et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant une biodistribution au corps entier avec un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.
Réduction
Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations à savoir l’administration par voie orale, par voie occulaire ou intracérébrale.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Les procédures se feront majoritairement sous anesthesie, avec analgésie post procédure si besoin. L’évaluation des points limites (poids, mobilité…) se feront selon la grllle de Morton et griffith. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, bien connus et documentés. Les points limites sont similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une procédure d’élevage (procédure 1). Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.
Choix des espèces
Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique préclinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces pouvant être exigée dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique. La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveau-nés à 4 semaines).
Développement de nouvelles stratégies de thérapie génique d’édition du génome pour le traitement de la drépanocytose sur modèle murin
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour accepter des cellules humaines, elles reçoivent une chimiothérapie puis une greffe de cellules souches sanguines humaines corrigées, avec des prélèvements sanguins mensuels, avant d'être tuées pour analyser leur moelle osseuse et leur rate. Le porteur indique que la modification génétique affaiblit leur système immunitaire et que la greffe et les prélèvements sont sources de stress. Il affirme que la capacité de greffe et la reconstitution du système sanguin ne peuvent être reproduites en laboratoire, rendant selon lui l'usage d'un modèle murin "requis".
Objectifs
La drépanocytose, maladie génétique du sang la plus répandue, altère la structure des globules rouges, posant un problème de santé mondial avec près de 300 000 nouveaux cas diagnostiqués annuellement. Une mutation génétique affectant la production d'hémoglobine, composant essentiel des globules rouges, provoque leur déformation, entraînant coagulation, obstruction vasculaire et dommages multi-organiques, réduisant sévèrement l'espérance de vie. Les traitements actuels, tels que les transfusions sanguines ou les greffes de cellules souches hématopoïétiques, ne sont accessibles que pour une fraction des patients et présentent des résultats insatisfaisants, se concentrant sur la gestion des symptômes. Ce projet permettrait d'apporter aux patients un traitement curatif afin de supprimer leurs symptômes tout en réduisant le coût de la prise en charge de leur maladie. En effet, grâce à une greffe unique de cellules souches hématopoïétiques modifiées, prélevées directement chez la personne atteinte de la maladie pour éviter les risques de rejet associés aux greffes issues de donneurs, les globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet. Notre laboratoire travaille sur une nouvelle approche thérapeutique axée sur la récupération et la correction des cellules affectées chez les patients souffrant de drépanocytose. Cette méthode vise à corriger de manière permanente le défaut génétique dans les cellules souches sanguines afin d'obtenir une hémoglobine fonctionnelle. Ces dernières se trouvent dans la moelle osseuse et sont capables de générer toutes les cellules nécessaires aux fonctions sanguines. En utilisant une technique basée sur des outils et des ciseaux moléculaires, nous avons réussi à corriger l’erreur génétique responsable de la drépanocytose. Notre stratégie a été développée, en laboratoire, sur des cellules souches hématopoïétiques humaines. Ce projet a donc pour but d’évaluer les caractéristiques fonctionnelles des cellules modifiées après transplantation. Ainsi, une fois les cellules souches hématopoïétiques corrigées par notre traitement, il sera nécessaire de vérifier leur capacité à se greffer dans la moelle osseuse dans un organisme entier et à re-fabriquer ensuite différents types de cellules. Pour ces raisons, le recours à un modèle murin permettant la greffe de cellules souches humaines est désormais nécessaire pour valider ces protocoles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre aux cellules humaines de retrouver une hémoglobine fonctionnelle, tout en s’assurant que notre traitement permet une greffe stable et efficace au cours du temps. Le projet s’effectuant directement sur des cellules humaines (et non murines), l’efficacité de notre traitement reflètera directement l’applicabilité aux patients. Seules la dose de chimiothérapie et le nombre total de cellules à transplanter seront à adapter. Ce projet permettrait d'apporter aux patients drépanocytaires un traitement curatif permettant de supprimer définitivement leurs symptômes tout en réduisant significativement le coût total de la prise en charge de leur maladie tout au long de leur vie. En effet, grâce à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées (permettant d’éviter les rejets observés lors des greffes issues de donneurs), leurs globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet.
Procédures
Les souris recevront une injection de traitement chimiothérapeutique pour les préparer à recevoir des cellules souches sanguines humaines. Après la transplantation de ces cellules, un prélèvement sanguin sera réalisé chaque mois pour surveiller la réussite de la greffe. Enfin, une injection d'un médicament favorisant la production de globules rouges sera administrée.
Impact sur les animaux
Les animaux possèdent une modification génétique, afin de faciliter la transplantation de cellules souches humaines, ce qui affaiblit leur système immunitaire. Pour prévenir les infections, les souris seront logées dans des cages dotées d'une ventilation, contribuant ainsi à réduire la présence de pathogènes dans leur environnement. Pendant ces procédures, deux actes peuvent causer du stress: l'injection de cellules modifiées et le prélèvement de sang.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. En effet, il sera nécessaire de récolter notamment les informations suivantes dans les organes suivants : - Le sang des souris sera récupéré, afin d’analyser la quantité et la qualité de ces globules rouges humains. - La moelle osseuse et la rate seront récupérées. Ces organes, cruciaux pour le fonctionnement du système sanguin, seront analysés afin d'évaluer la prise de greffe et leur capacité à produire toutes les cellules présentes dans le système sanguin.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer notre stratégie thérapeutique sur un organisme entier car il n’est pas réalisable de reproduire en laboratoire, la complexité d’un organe comme la moelle osseuse, ainsi que la complexité du système sanguin, notamment en termes de prolifération et de différenciation en différents types de cellules sanguines.
Réduction
Dans le but de limiter l'utilisation d'animaux dans ce projet, nous avons évalué diverses stratégies visant à corriger ce défaut génétique sur des cellules souches sanguines humaines en laboratoire. Les quatre meilleures stratégies ont été retenues pour leur efficacité et seront testées sur modèle animal. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, nous avons estimé le nombre minimal d'animaux permettant de tester et de conclure sur l'efficacité de nos stratégies. Cette démarche s'appuie sur les taux de réussite de la prise de greffe issus d'une référence établie. Notre objectif est d'atteindre une prise de greffe similaire à ce modèle mentionné. Afin de viser ces résultats, les calculs statistiques conduisent à estimer que 8 souris par groupe sont nécessaires. Ainsi, notre plan prévoit l'utilisation de 8 souris par groupe, totalisant 400 souris sur 5 ans, tout en visant des résultats scientifiquement robustes.
Raffinement
Les souris, présentant un système immunitaire affaibli, seront placées dans un environnement exempt de pathogènes. Après le traitement chimiothérapeutique et la greffe des cellules, l'état général des souris (apparence, posture, comportement...) ainsi que leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours. Les procédures expérimentales potentiellement inconfortables (greffe des cellules corrigées et prélèvement sanguin pour suivre la prise de greffe) seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress et l'inconfort des animaux. En cas d’inconfort trop important, les procédures seront interrompues.
Choix des espèces
Pour évaluer l’efficacité de nos stratégies, nous sommes obligés de réaliser des études sur l’animal, car la capacité de greffe ainsi que la reconstitution et la différenciation complète du système sanguin en différentes cellules sanguines ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires en laboratoire. De plus, seule l’utilisation d’animaux peut nous permettre d’observer les éventuels effets secondaires sur le long terme de notre traitement au niveau de l’ensemble des organes. Pour ce faire, l’utilisation d’un modèle murin permettant la greffe de cellules humaines est requis. Les animaux seront greffés à l’âge adulte, de plus de 8 semaines. L'âge des animaux receveurs pour obtenir et conclure sur une efficacité optimale de la greffe des cellules souches sanguines dans la moelle osseuse se situe à 16 semaines.
Elevage et maintien de la lignée de rat Royal College of Surgeons nude à des fins de recherche scientifique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevés pour maintenir une lignée à la fois immunodéficiente et atteinte d'une dégénérescence de la rétine, ils servent de modèle de rétinite pigmentaire pour évaluer des thérapies cellulaires. Ils sont identifiés par tatouage des phalanges et biopsie de l'oreille, et leur absence de poils entraîne une accumulation sous la paupière, source d'irritation oculaire. Le porteur justifie le rat par la taille de l'œil, qui facilite les greffes sous-rétiniennes.
Objectifs
Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent des populations jeunes. En France, environ 200.000 personnes sont atteintes de RP. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. La lignée RCS NUDE est à la fois une lignée immunodéficiente et porteuse d'une mutation qui entraine la perte progressive de la vue par dégénérescence des photorécepteurs (animal modèle de RP). Le programme d’élevage a pour but de maintenir la lignée RCS NUDE et de produire des cohortes d’animaux pour évaluer des pistes thérapeutiques. En particulier, les animaux sont utilisés pour évaluer l’effet thérapeutique de produit de thérapie cellulaire et acellulaire (issus de la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines). Le modèle immunodéficient permet de se passer d’une immunosuppression induite par des composés pharmaceutiques dont la prise et le dosage ne sont pas aisés chez les rongeurs. Les animaux sont identifiés par marquage (marqueur indélébile sur les pattes). Des biopsies d’oreilles serviront pour le génotypage des animaux.
Bénéfices attendus
Il n'existe que peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdu. L'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire et acellulaire pour préserver ou restaurer la vision dans ce contexte.
Procédures
Marquage à l'encre indélébile au bout des doigts pour l'identification individuelle des animaux et biopsie du pavillon de l'oreille pour l'identification génétique des animaux. Le double geste de microtatouage au bout des phalanges et de prélèvement d'un petit morceau du pavillon de l'oreille est réalisé dans la foulée l'un de l'autre et prend moins d'une minute. Le double geste est pratiqué à environ une semaine postnatale.
Impact sur les animaux
Dans le modèle RCS NUDE, le phénotype nude entraine une perte de poils à partir de la 3e/4e semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières ce qui nécessite une attention et un soin particuliers pour éliminer cette accumulation par instillation de l'oeil avec un produit de rinçage. Les autres effets indésirables sont ceux dûs au marquage hypodermique des phalanges et ceux dûs au prélèvement d'un petit bout de pavillon d'oreille pour le typage. L'ensemble de ces nuisances font l'objet d'une classe de gravité légère.
Devenir
Nous sommes ici en utilisation continue d'animaux produits par un fournisseur agréé afin de satisfaire les besoins expérimentaux d'un autre établissement utilisateur.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’un produit de thérapie cellulaire pour permettre une préservation de la vue lorsqu'elle ne s'est pas encore dégradée ou une récupération de la fonction visuelle lorsque les photorécepteurs ont dégénéré. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro compte tenu de la complexité de l'oeil et ne peut être réalisé que chez un modèle animal de dégénérescence rétinienne.
Réduction
La calculatrice d'élevage du JAX a été utilisée pour calculer l'effectif au plus juste. De plus, concernant les animaux utilisés dans les procédures expérimentales, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Les 2 sexes seront utilisés sur la base d'un élevage maitrisé et raisonné en conditions indemnes de germes infectieux et assorti d'une surveillance quotidienne des animaux.
Raffinement
L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un rinçage des yeux à fréquence régulière avec un produit vétérinaire prévu à cet effet. Les biopsies pour le génotypage sont de petits morceaux d'oreille (1 à 2 mm) qui sont prélevés la première semaine postnatale (4/5 jours).
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques et permettent une comparaison des résultats avec ceux de la littérature scientifique. La taille de l’animal rend le geste technique de transplantation sous-rétinienne moins difficile que chez la souris car la taille des tissus est proportionnelle à celle de l'espèce, ce qui réduit significativement le risque d’échec lors des actes de transplantation rétinienne et par là même, le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. La lignée RCS NUDE est dérivée de la lignée RCS : le rat Royal College of Surgeons est le premier modèle animal et variant spontané connu de dégénérescence rétinienne. Combiné au caractère nude, le modèle double homozygote permet d'évaluer des produits de thérapie cellulaire et acellulaire d'origine humaine xénogreffé sans risque de rejet des transplants. La stratégie alternative qui consite à appliquer un traitement immunosuppresseur agressif et difficile à doser a des conséquences néfastes à long terme pour l'animal et un effet immunosuppresseur moins efficace. Les animaux sont utilisés à différents stades: : à 4/5 semaines avant la dégénérescence des photorécepteurs pour des stratégies de préservation de ceux-ci et après 2 mois quand les photorécepteurs ont complétement dégénéré pour des stratégies de restauration de la vision.
Psoriasis et dysbiose vaginale, sont ils des déclencheurs des spondyloarthrites ?
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la majorité tuée à l'issue et 560 mâles susceptibles d'être réutilisés dans d'autres projets. Porteuses d'un déficit immunitaire, elles reçoivent des injections destinées à déclencher une arthrite qui se traduit par un gonflement des articulations, une baisse d'activité et une perte de poids pouvant être importante. Le porteur décrit aussi l'induction d'une inflammation cutanée de type psoriasis et d'une infection vaginale, croisées pour tester l'apparition de spondyloarthrites. Les femelles sont mises à mort pour examen des tissus articulaires, tandis que les mâles en excès sont tués au sevrage ou orientés vers d'autres protocoles.
Objectifs
Les spondyloarthrites sont des rhumatismes inflammatoires fréquents (0,3% de la population française) touchant les articulations, les tendons mais aussi d’autres organes (inflammation des yeux, de la peau et du tube digestif). Les spondyloarthrites entrainent une altération de la qualité de vie. Les raisons du déclenchement de cette maladie sont à ce jour mal comprises. Il y a parfois l’association d’une susceptibilité génétique et d’un environnement déclencheur comme une infection, parfois l'influence de la flore intestinale est suspectée, parfois la présence de lésions de psoriasis sur la peau, mais la relation de cause à effet reste non prouvée. 2% de la population française est touchée par le psoriasis, maladie inflammatoire chronique de la peau. 30% de ces patients développeront au cours de leur vie un rhumatisme psoriasique, en moyenne 10 ans après le début du psoriasis. Comparativement au psoriasis isolé, le rhumatisme psoriasique, comme toutes les autres spondyloarthrites, entraîne un surcoût important pour le système de santé, notamment du fait des traitements biologiques utilisés au long cours pour contrôler cette maladie. Notre premier objectif est d’étudier sur modèle animal la transition entre psoriasis local et le rhumatisme psoriasique. La dysbiose vaginale, est une perturbation de l'équilibre de la flore vaginale. C’est la maladie génitale la plus fréquente au monde chez les femmes en âge d'être sexuellement actives, avec une fréquence de 23 à 29 %. Elle est associée à une susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles et à un risque accru de maladie inflammatoire. Nous suspectons une plus grande susceptibilité aux spondyloarthrites chez les femmes atteintes de dysbiose vaginale. Notre second objectif est d’établir une relation causale entre une dysbiose vaginale et la survenue d’une spondyloarthrites, dans notre modèle de souris. Le troisième objectif est d’élever les souris avec un déficit immunitaire les rendant susceptibles aux spondyloarthrites afin de pouvoir mener ces études.
Bénéfices attendus
Entre les premières lésions de psoriasis et le déclenchement du rhumatisme psoriasique, il y a l’opportunité de traiter par des médicaments afin d’éviter la survenue de ce dernier. Notre recherche, une fois le modèle de cette transition établie permettra d’identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition, voire de tester des médicaments. De même, si nous arrivons à démontrer le lien entre dysbiose vaginale et spondyloarthrites, nous pourrons identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition puis tester des médicaments.
Procédures
Les diamètres des chevilles et poignets des souris seront mesurées toutes les semaines, parfois deux fois par semaine. Suivant le protocole pour induire la maladie, elles auront une injection intrapéritonéale d’hormone pour synchroniser leurs chaleurs, et quelques jours plus tard un dépôt intravaginal, pour induire la maladie. Ce sera fait sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes) et couplé à une prise de sang. Elles pourront avoir jusqu’à 5 autres prises de sang. Il y aura aussi jusqu'à sept écouvillonnages vaginaux. Dans l’autre protocole, elles subiront jusqu’à 5 injections sous cutanées (éventuellement répété une fois après plus d’un mois) pour induire la maladie. Elles auront des prises de sang (maximum 6) sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes). Selon l’avancée de nos connaissances, elles pourront avoir des injections de traitements en intrapéritonéal, dont les fréquences pourront varier de 1 par jour pendant 4 semaines à 1 par semaine pendant 20 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des contentions pour les peser et mesurer le diamètre de leurs poignets et de leurs chevilles, une à deux fois par semaine. Le stress de ces mesures disparait après 2 à quatre mesures. Ils subiront des courtes anesthésies (3-15 min) pour l’injection qui déclenche la maladie et les prises de sang. Ils pourront aussi subir des injections (ip) jusqu’à une par jour, pour favoriser le déclenchement (synchronisation du cycle oestrale), induire un traitement, une atténuation des symptômes, ou de façon inattendue une exacerbation de ceux-ci. Il y aura une irritation et une inflammation locale après induction du psoriasis. Cette irritation sera inférieure à celle qui déclenche une réaction de grattage nuisible. L’infection vaginale déclenchera une inflammation de l’utérus (décrite en post mortem dans la littérature sans qu’il soit fait mention d’altération de l’état général). L’arthrite que nous cherchons à induire se traduit par un gonflement des articulations (chevilles et poignets), une baisse de l’activité (détectable par actimétrie continue sur une journée, il ne s’agit pas d’une prostration), une rougeur transitoire des oreilles, une possible conjonctivite. La perte de poids peut être importante quand la maladie est installée.
Devenir
Les femelles de la procédure d’élevage sont gardés en vie soit comme reproducteurs soit pour servir dans les expériences. A la fin des expériences, nous avons besoin de faire des examens sur les tissus articulaires des animaux donc ils sont mis à mort, tant pour les malades que pour les contrôles. Il y aura un excès d’animaux mâles (610-50, nos expériences se feront quasi-exclusivement sur des femelles). La majorité sera mise à mort au sevrage, mais la totalité de ces 560 animaux mâles pourront être potentiellement réutilisés dans d'autres projets. Il faudra que les conditions sanitaires de cette réutilisation permettent de les utiliser sans que leur déficit immunitaire les handicape.
Remplacement
Actuellement, il n’existe aucun modèle in vitro capable de mimer les spondylarthrites ou de comprendre son mécanisme, son déclenchement cellulaire ou moléculaire. Le développement de cette maladie complexe et donc son étude nécessitent l’intervention d’un système immunitaire complet en plus d'un tissus cartilagineux, voire d'une articulation, et des autres organes dont nous voulons démontrer l’implication (peau ou utérus). Nous faisons des expériences en complément de celles décrites ici ; in vivo : mesures d’activités enzymatiques, calibrage des inoculum bactériens ; ex vivo : mise en culture des cellules immunitaires, cytométrie sur les cellules immunitaires, analyses sanguines, histologie, PCR…
Réduction
Les effectifs des expériences ont été calculés afin de réduire le nombre d’animaux. Dans les expériences longues durée, nous tenons compte du taux de réussite habituel d’induction de la maladie, et de la variabilité de la grosseur des articulations. Nous synchronisons les chaleurs des femelles par une injection d’hormone afin d’augmenter les chances d’induction de la maladie. D’autres expériences seront faites sur des temps plus court pour explorer les mécanismes mis en jeu, elles se feront sur des effectifs très réduits car nous voulons alors détecter des effets tout ou rien et non des variations sur le diamètre des articulations Enfin, nous mettrons en commun les animaux contrôles sur la première expérience entre les procédures 1 et 2 et nous répéterons cela chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires très strictes (air filtré, nourriture et eau stériles) qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. L'enrichissement sera conforme aux préconisations de la structure de bien-être animal de l’établissement. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation qui est contraignante pour elles en termes de durée de contention et afin de réduire cette durée de contention. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré après. Les anesthésies générales seront de courte durée (3 à 15 minutes) afin que la perturbation du rythme de vie soit de moins de 24h (l’équivalent d’un examen sous anesthésie générale en ambulatoire chez l’homme). Nous avons une grille d’évaluation des souffrances subies par les animaux. Les critères intermédiaires entrainent des mesures d’aide : ainsi en cas de perte de poids de 10%, pour un individu ou pour tout le groupe si plus de 4 en sont à ce stade, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles. Les critères terminaux de cette grille correspondent à une mise à mort pour éviter des souffrances inutiles et ces critères sont atteints avant que la détérioration de l’état général ou la perte de poids n’atteignent un stade sévère.
Choix des espèces
Nous élevons une lignée de souris avec un déficit immunitaire qui les rend susceptibles à des maladies auto-immunes. Ces souris sont un bon modèle de spondylarthrite car elles vérifient assez bien ou très bien les trois critères d’un modèle animal de maladie humaine : - Elles développent des symptômes qui sont très proches de la maladie humaine. - La mutation génétique à l’origine de leur auto-immunité n’est pas décrite chez l’homme (donc ce modèle n’est pas parfait), mais la perturbation des cellules immunitaires qui en découle est retrouvée dans la maladie humaine. - Une des biothérapies efficaces en clinique est aussi efficace sur les spondyloarthrites classiques induites chez ces souris. Nous avons donc un grand espoir que pour les variantes de spondyloarthrites que nous voulons induire chez ces souris, leurs réponses aux médicaments seront prédictives de ce qui sera efficace dans l’espèce humaine. L’âge des souris au début des expériences est compris entre 5 et 10 semaines pour 1) avoir des animaux adultes ; et 2) ne pas avoir des animaux vieillissant en fin d’expérience. Pour l’élevage nous aurons des animaux de leur naissance à la réforme (à 6-8 mois).
Élevage et maintien de modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington à phénotype dommageable (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées pour reproduire la maladie de Huntington, elles portent une mutation qui provoque en vieillissant des symptômes neurologiques et moteurs que le porteur décrit comme visibles uniquement lors de tests comportementaux dédiés, sans les détailler. Maintenues sous forme hétérozygote, elles sont mises à mort à la fin de leur vie reproductive, vers huit mois, et leur cerveau est prélevé. Le porteur indique qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité d'un organisme vivant et revendique la nécessité de générer ces animaux pour plusieurs projets.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien dans 2 établissements utilisateur de differents modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de la maladie de Huntington comme dommage. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisé par de symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive.
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous forme hétérozygote, qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer des altérations significatives de la qualité de vie des animaux, ni de morts prématurées dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères potentielles: 1) un stress léger pendant leur transport d'un établissement à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements; 3) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré que les modèles murins actuelles reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de la maladie de Huntington in vitro et in vivo, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de la maladie et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de la maladie de Huntington en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2880 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 3 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été determiné de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement prévu par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Pour reduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress (comme l'alopécie) et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs hétérozygotes seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Gestion d’élevage expérimental de souris transgéniques dans le cadre de recherche sur le système immunitaire dans la lutte contre le cancer
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
10 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une biopsie du pavillon de l'oreille et parfois un prélèvement de sang pour identifier leur génotype. Le porteur indique que les souris au génotype recherché sont expédiées vers un institut de recherche et que celles qui ne portent pas les caractères souhaités sont tuées à l'élevage, sans chiffrer la part de chaque devenir. Il signale que les lignées immunodéficientes développent des infections faciales à staphylocoque et sont tuées dès l'apparition d'abcès. Il affirme que l'étude du système immunitaire "à l'échelle du corps entier" rend l'animal "indispensable", ce projet servant à fournir des lignées à d'autres travaux sur le cancer.
Objectifs
Dans le cadre des projets de recherche menés par notre Institut sur le système immunitaire dans la lutte contre le cancer, des lignées de souris transgéniques ont été générées afin de vérifier l'implication et le rôle de certaines molécules dans la réponse immunitaire. Pour ce faire, nous avons modifié le génome de souris en délétant ou en modifiant des gènes à l'origine de ces molécules d'intérêt. C'est ainsi qu'un ensemble de 16 lignées ou sous-lignées génétiquement modifiées a été établi et maintenu en zone d'élevage dans cet objectif.
Bénéfices attendus
La génération de ces lignées d’animaux transgéniques permet en premier lieu d'approfondir les connaissances scientifiques fondamentales afin de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire. L'acquisition de ces connaissances permet en second lieu aux équipes de recherche d’avancer sur des projets plus appliqués. De manière plus globale, ces animaux sont utilisés comme modèles pour répondre à différentes questions scientifiques dans les domaines de la cancérologie, de la thérapie cellulaire, de l’immunothérapie, de l'allergie, de la réparation tissulaire, etc.…. Les connaissances provenant des résultats de ces projets doivent permettre d’améliorer l’efficacité des outils thérapeutiques appliqués à l'oncologie et de proposer de nouveaux outils.
Procédures
Au stade de l'élevage, l'identification génétique des animaux soumet ces animaux à un prélèvement d'un petit fragment d'oreille obtenu avec une pince emporte-pièce (1 à 1,5 mm) et suivant les lignées, un prélèvement de sang peut être pratiqué. Que l'identification génétique des animaux se fasse à partir d'une biopsie du pavillon de l'oreille (génotypage) ou d'un prélèvement sanguin, (phénotypage), la contention nécessaire pour réaliser ces actes ne dépasse pas 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les biopsies d'un petit bout du pavillon de l'oreille peuvent s'accompagner d'une légère douleur passagère n'excédant pas quelques heures post-intervention. Dans le cas du prélèvement sanguin nécessaire à l'analyse sanguine, un hématome peut survenir au niveau de site de prélèvement. S'agissant des animaux immunodéficients qui sont sujets à développer des infections faciales à staphylocoque doré, ils sont euthansiés dès l'apparition d'abcès.
Devenir
Les animaux présentant les génotypes d'intérêt seront expédiés à un institut de recherche tandis que ceux ne présentant pas les caractères souhaités seront mis à mort dans l'établissement d'élevage.
Remplacement
Les projets de recherche impliquant ces animaux étudient des mécanismes immunologiques à l’échelle du corps entier. Il n'est pas encore possible de reproduire in vitro toutes les interactions complexes entre les différents acteurs du système immunitaire. C'est pourquoi une étape passant par un système physiologique vivant et intégré tel que les modèles animaux que nous utilisons est nécessaire. C'est une étape indispensable pour tester les interactions des populations cellulaires du système immunitaire entre elles. Chaque projet fait l'objet d'études préalables in vitro et in sillico dans le cadre d'évaluation de molécules candidates d'intéret bio- ou immunothérapeutiques appliqués à la lutte contre le cancer. Les tests doivent ensuite être corroborés et validés dans un environnement in vivo.
Réduction
Une stratégie d’accouplement est mise en place pour chaque lignée en amont de la production afin de générer les animaux transgéniques d’intérêts pour satisfaire les besoins expérimentaux et limiter le nombre d’animaux surnuméraires. Le calcul des objectifs de production est basé sur un long historique des données d'élevage collectées et une utilisation raisonnée des animaux d'étude. Par la suite, la taille des groupes expérimentaux sera défini par l'EU d'accueil des animaux.
Raffinement
Lors de la biopsie d’oreille, le site de prélèvement est préalablement désinfecté à l'alcool et la pince emporte-pièce utilisée stérilisée. Une biopsie d'une taille maximale de 1 à 1,5 mm est opérée. Les prélèvements sanguins pour phénotypage sont pratiqués une seule fois et sous anesthésie gazeuse. Pour les lignées immunodeficientes, un suivi particulier a été mis en place pour détecter au plus tôt l’apparition d’une infection. Le suivi de ces animaux a été rapporté en plénière de la structure du bien-être animal (SBEA) du fournisseur. Les animaux sont élévés dans des cages eurostandardisées et des conditions sanitaires très protégées et jouissent d'un statut sanitaire indemne de pathogène spécifique. Des points limites on été mis en place de manière à anticiper des situations d'inconfort, de signes cliniques indicateurs d'une dégradation de l'état physiologique ou comportemental, de blessures (plaies) ou l'apparition d'éventuels abcès chez les animaux immunodéficients. L'anticipation de la suvenue de points limites s'exerce dans la cadre de la surveillance quotidienne qui est appliquée aux animaux 7 jours sur 7.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour les expériences menées en immunologie pour différentes raisons : a) une très bonne connaissance du génome de l'espèce qui nous permet de créer des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques dont les gènes correspondant ont été identifiés ; b) Il existe une grande collection de variants congéniques et transgéniques chez cette espèce dans le commerce et au sein des réseaux professionnels qui mettent ces modèles à disposition ;. c) Notre Laboratoire de recherche a consacré plusieurs dizaines d’années à l’étude du système immunitaire chez la souris et ses variants et possède une grande maitrise de la création et du maintien de lignées de soruis multitransgéniques. Les stades de développement des animaux utilisés porteront du sevrage (3-4 semaine) jusqu’à l'âge de 25 semaines en moyenne . Pour certains projets de recherche, un stade juvénile peut être nécessaire alors que d’autres projets requièrent l’utilisation d’animaux adultes. Le stade utilisé sera projet dépendant.
Élevage et maintien de modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington à phénotype dommageable (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Il s'agit d'un élevage de lignées modélisant la maladie de Huntington, les animaux étant maintenus en reproduction puis tués en fin de vie reproductive pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme que les symptômes neurologiques et moteurs "ne deviennent jamais handicapants" et n'apparaissent que lors de tests comportementaux dédiés, sans les nommer. Il indique qu'il n'existe "pas de méthode alternative" au modèle animal et signale un stress lié au transport, aux manipulations et à l'isolement des mâles reproducteurs.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien dans 2 établissements utilisateur de differents modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de la maladie de Huntington comme dommage. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisé par de symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive.
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous forme hétérozygote, qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer des altérations significatives de la qualité de vie des animaux, ni de morts prématurées dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères potentielles: 1) un stress léger pendant leur transport d'un établissement à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements; 3) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré que les modèles murins actuelles reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de la maladie de Huntington in vitro et in vivo, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de la maladie et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de la maladie de Huntington en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2880 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 3 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été determiné de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement prévu par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Pour reduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress (comme l'alopécie) et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Double geste tatouage des phalanges/récolte d’un bout d’oreille dans le but de faire un génotypage sur des souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, limitées ici à leur identification. Chaque animal subit au sevrage un tatouage des phalanges à l'aiguille et l'ablation d'un bout d'oreille de deux millimètres pour le génotypage, un double geste que le porteur décrit comme provoquant une douleur passagère. Les animaux ne sont pas tués dans le cadre de ce projet, une partie étant incluse dans une autre autorisation et le reste maintenu pour l'élevage. Le porteur affirme que le tatouage est "obligatoire" pour les animaux génétiquement modifiés et indique qu'un essai de génotypage sur poils s'est révélé peu fiable.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude du rôle d’une protéine, une souche de souris mutées a été générée. Un élevage de ces souris est hébergé et maintenu au sein de notre animalerie, dans le cadre d’un projet de thèse portant sur le rôle de cette protéine dans la relation vascularisation/formation osseuse. Des croisements hétérozygotes sont effectués pour obtenir des individus de génotypes différents. Il est donc nécessaire de génotyper systématiquement les individus provenant de ces portées et des croisements homozygotes sont effectués pour regénérer des individus hétérozygotes. Ce génotypage est effectué dans le même temps que le tatouage des animaux afin de les identifier au moment du sevrage, à 1mois. Le but du tatouage est d’identifier les animaux grâce à un code de points au niveau des doigts des pattes avant et arrière. Ce tatouage est obligatoire pour les animaux génétiquement altérés dans l’éventualité d’une fuite des animaux. Un bout d’oreille est récolté afin d’avoir assez de matériel génétique pour génotyper les animaux provenant de portées dont les souriceaux peuvent être d’un génotype différent.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’identifier les animaux de façon rapide et simple et de récupérer une quantité de matériel génétique suffisant pour pouvoir génotyper les animaux. Les deux gestes se font dans le même temps et la manipulation durent environ 5min afin de limiter le stress des animaux.
Procédures
Le tatouage des phalanges et récolte d'un bout d'oreille se font systématiquement chez tous les animaux dans le même temps. L'entièreté de la procédure ne dure pas plus de 5min.
Impact sur les animaux
Le tatouage des phalanges se fait à l’aide d’une aiguille trempée dans de l’encre verte et un bout d’oreille de 2mm est coupé à l’aide d’une paire de ciseaux. Ce double geste induit une douleur passagère dûe à la piqûre de l’aiguille et à la découpe de l’oreille. L’oreille ne saigne pas et cicatrise très vite, il n’y a donc pas de douleur sur le long terme. Le tatouage n’entraîne pas de problème pour se déplacer.
Devenir
Une partie de ces souris est incluse dans une Demande d'Autorisation de Projet actuellement en cours, le reste sera utilisé pour du maintien d'élevage et potentiellement pour d'autres Demandes d'Autorisation de Projet.
Remplacement
Ces animaux sont utilisés dans le cadre d’une autre Demande d’Autorisation de Projet. Le tatouage est obligatoire pour les animaux génétiquement altérés dans l’éventualité d’une fuite des animaux. La récolte d’un bout d’oreille est la meilleure façon d’avoir suffisament de matériel génétique pour faire un génotypage.
Réduction
Les croisements sont effectués entre des animaux de génotype différent, les souriceaux peuvent donc aussi avoir des génotypes différents qui ne sont pas visibles au niveau du phénotype, il est donc nécessaire de récupérer du matériel génétique afin de les génotyper. Le tatouage est obligatoire pour les animaux génétiquement altérés dans l’éventualité d’une fuite des animaux.
Raffinement
Afin de réduire la douleur des animaux, un essai de génotypage sur des poils récupérés au niveau du dos ou du ventre a été effectué mais la qualité des résultats est assez aléatoire, ce qui rend difficile de conclure sur le génotype surtout pour les souris hétérozygotes. De nouveaux essais seront effectués et en cas de validité et fiabilité, cette technique de génotypage sur prélèvement d’oreille sera arrêtée et remplacée par une technique de prélèvement de poil.
Choix des espèces
Ces animaux sont utilisés dans le cadre d’une autre Demande d’Autorisation de Projet. Les souris sont sevrées à 1mois. Le double geste tatouage/récolte d’un bout d’oreille se fait à ce moment là.
Rôle des neurones thalamo-corticaux dans la cognition sensorielle physiologique et pathologique chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de quarante minutes, une légère décharge électrique et une série de tests comportementaux (activité motrice, exploration, anxiété, attention, mémoire associative), avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur décrit des atteintes limitées, un stress lié à l'anesthésie et aux tests, mais ne précise pas les effets de la décharge électrique. Il affirme que ces explorations sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro et espère identifier des cibles thérapeutiques contre les troubles neuropsychiatriques.
Objectifs
Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d ́exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. D'autre part, nous allons nous demander quel est le rôle de ces régions spécifiques dans la cognition sensorielle. Dans les deux cas, nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Nous espérons que cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de disséquer de manière fonctionnelle l’implication du système thalamo-corticale dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre le système thalamo-corticale sensorielle permettra d’appréhender les processus d'apprentissage, de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles elle est altérée. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Procédures
Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale, 1 fois de 40 minutes. Légère décharge électrique, 1 fois de 1 seconde. Injection intra-péritonéale: 1 injection, durée 5 secondes. Etudes du comportement, 1 fois chacun: moteur (5 minutes), d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes), d’attention (15 minutes) et de mémoire associatif (15 minutes/jour, 3 jours), répartis sur 4 à 7 jours.
Impact sur les animaux
L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée à la biopsie de queue et aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical. Le test de memoire peut entraîner de l'inconfort et du stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroule dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués aux mains de l'expérimentateur afin de réduire leur stress par leur manipulation.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les experiences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 6 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.
Utilisation d’une lignée de souris transgénique AARE-LUC pour identifier les inducteurs et les tissus cibles de la voie eIF2α-ATF4
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 035 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré sévère. Cette lignée transgénique brevetée exprime un gène rapporteur luminescent servant à visualiser l'activation d'une voie de signalisation selon le régime alimentaire, au moyen de prises de sang sur animal vigile, d'injections de luciférine, d'imagerie sous anesthésie, d'un jeûne jusqu'à seize heures et d'un hébergement individuel. Le porteur affirme pourtant que les souris "ne présentent pas de phénotype dommageable" et décrit des atteintes qu'il qualifie de limitées, en contraste avec la gravité sévère annoncée pour la totalité des animaux. Parmi elles, 105 souris sans transgène fonctionnel sont tuées d'emblée et 930 après deux procédures, le porteur jugeant "indispensable" d'expérimenter sur l'animal pour tenir compte du métabolisme entier.
Objectifs
Afin de pouvoir étudier le rôle joué par la voie de signalisation eIF2α/ATF4 au niveau de l’animal entier, nous avons généré une lignée de souris transgénique qui exprime le gène rapporteur luciférase sous le contrôle de séquences de fixation du facteur de transcription ATF4. Cette lignée de souris a été breveté et constitue un outil de choix pour visualiser le stress nutritionnel ou pharmacologique au niveau de l'animal entier. Notre objectif avec cet outil murin transgénique est de mieux caractériser les conditions d’activation de cette voie de signalisation dans l’espace et dans le temps en fonction du régime nutritionnel ou du traitement pharmacologique.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre chez les mammifères les effets de la consommation d’un régime déséquilibré en acides aminés ou d’un traitement avec un inducteur pharmacologique. Dans ce but, les souris transgéniques bioluminescentes sont un outil de choix pour situer dans l’espace (identification des tissus et cellules cibles) et dans le temps (chronologie d’activation en fonction des sites) l’activation de la voie eIF2α-ATF4 dans des conditions de carences nutritionnelles en acides aminés ou lors d’un traitement pharmacologique par la mesure de la bioluminescence au niveau du corps entier de l’animal vigile, de l’expression (immuno-histochimie) et/ou de l’activité de l’enzyme codée par le gène rapporteur luciférase dans les tissus cibles.
Procédures
Des prises de sang pourront aussi être réalisées sur animal vigile au niveau de la veine submandibulaire (1 min par souris) à l'aide de microlancettes spécifiques. Elles seront réalisées avant et après le protocole nutritionnel en alternant le côté du prélèvement. Pour visualiser l’activité luciférase en utilisant un appareil d’imagerie bioluminescente (10 min par souris), les animaux seront injectés avec de la luciférine (10 sec par souris), anesthésiés sans effets indésirables (15 min par souris). Pendant toute la durée d'adaptation au régime contrôle (7 jours) et d'expérimentation (96h maximum), les souris seront hébergées individuellement avec un accès libre à l’eau et à la nourriture.
Impact sur les animaux
Les 2 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Les expériences réalisées ne vont pas engendrer d’effets indésirables sévères : piqûre d’aiguille, transport des souris, anesthésie gazeuse, jeûne de 16h maximum et isolement de courte durée. Pour la majorité des experiences réalisées, les souris doivent être hébergées en cages individuelles pour éviter les interactions afin de pouvoir mesurer précisément la prise alimentaire.
Devenir
Les animaux dont le transgène n’est pas fonctionnel seront mis à mort dans la procédure 1 (105 souris). Les autres animaux dont le transgène est fonctionnel sont gardés en vie pour rentrer dans les procédures 2 et 3 (930 souris) puis mis à mort à la fin de ces 2 procédures.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur des lignées de cellules en culture permettent d'abord de tester l'efficacité de carence en un acide aminé ou d’inducteurs pharmacologiques sur l’activation de la voie eIF2α-ATF4. Ces expériences permettent dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris. Il est ensuite indispensable d'expérimenter sur des souris pour tenir compte du métabolisme et des échanges inter-organes pour pouvoir évaluer l'effet de ces inducteurs in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal de l’induction de la bioluminescence, il s'avère indispensable de répéter les expériences. Etant donné que les procédures sont légères, une même souris pourra être réutilisée pour tester l’effet de plusieurs régimes après une période de récupération d’une semaine.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Par ailleurs, l'utilisation d’un transgène exprimant la luciférase nous permettra de suivre l’activation de la voie eIF2α-ATF4 à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).
Choix des espèces
Les deux lignées homozygotes de souris transgéniques bioluminescentes (fond génétique C57 Bl/6), ont été générées par notre équipe. Les croisements pour amplifier ces deux lignées seront réalisés avec des souris âgées de 4 à 6 mois, âge où le taux de fécondité est optimum. Pour toutes les procédures, les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 2 à 24 mois. L'âge pourra dépendre de l'objectif de l'expérience réalisée.
Décontamination de lignées murines par transfert d’embryons
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
7800 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles donneuses sont soumises à une stimulation hormonale puis tuées pour la récolte d'ovocytes, les femelles receveuses subissent une microchirurgie de transfert d'embryons sous anesthésie, et les mâles reproducteurs et vasectomisés sont tués en fin de projet. L'opération vise à réintroduire des lignées de souris génétiquement modifiées avec un statut sanitaire contrôlé, les jeunes issus des transferts étant conservés pour la recherche. Le porteur affirme que le transfert d'embryons est "la seule méthode possible" de redérivation des lignées.
Objectifs
Les équipes de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations d'assainissement et de décontamination des lignées génétiques impliquées vise à préserver le statut sanitaire des animaux. Le statut sanitaire des colonies de rongeurs correspondantes conditionne à la fois leur état de santé, leur bien-être, et leur pertinence en tant que modèle. Ce projet a pour but l'introduction de nouvelles lignées murines originales après décontamination au sein des zones d'animalerie de différents centres de recherche afin dêtre utilisées dans diférents domaines dont notamment la recherche fondamentale en oncologie, sur le système immunitaire et endocrinien.
Bénéfices attendus
Le statut sanitaire des colonies de souris de laboratoire utilisées comme modèles animaux pour les recherches scientifiques et biomédicales conditionne à la fois leur état de santé, leur bien-être, et leur pertinence en tant que modèle. L’évolution des connaissances concernant les pathogènes spécifiques des rongeurs, et des contaminations accidentelles, imposent des procédures d'entrée de nouvelles lignées murines par transfert d’embryons afin de garantir pour ces nouveaux modèles murins un statut sanitaire approprié.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intrapéritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en intrapéritonéale et une en sous-cutanée
Impact sur les animaux
Les mâles stérilisés et les mâles reproducteurs utilisés pour la production des embryons sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. Les femelles receeveuses d'embryons peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie des femelles receveuses d'embryons.
Devenir
Les mâles reproducteurs sont mis à mort en fin de projet et ceux ayant servis à produire les femelles pseudo-gestantes (mâles vasectomisés) également. Les femelles ayant été sujettes à la chirurgie de transfert d'embryons ne peuvent subir un deuxième transfert d'embryons. Les femelles donneuses sont mises à mort pour permettre la récolte d'ovocytes post-mortem. Les animaux issus des transfert d'embryons seront conservés.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, le transfert d'embryon est la seule méthode possible pour la redérivation de lignées murines. La redérivation des lignées sera limitée aux lignées originales pour lesquels ces lignées ne sont pas disponibles sous une forme respirante auprès d'un centre de ressouces.
Réduction
Les nombres d'animaux utilisés sont réduits au maximum et l'estimation a été faite en se basant sur la littérature scientifique et sur la base des années d'expérience dans ces approches.
Raffinement
La procédure chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post et per-opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
La redérivation de lignées murines s'appuie sur l'intérêt et la justification pré-existante des modèles animaux disponibles pour répondre aux multiples objectifs scientifiques des programmes de recherche concernés. Il s'agit ici d'un prolongement de leur utilisation dans le sens d'une utilisation plus pertinente dans un contexte sanitaire protégé. Les animaux utilisés sont d'âge adulte pour les mâles reproducteurs, les femelles receveuses et les males vasectomisés, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubères (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation. Les animaux issus des transferts d'embryons seront âgés de 7 à 10j.