Maintien des lignées génétiquement modifiées

Triés selon leur génotype, les rongeurs qui ne correspondent pas au projet visé sont tués dès le sevrage quand aucune autre utilisation n'est trouvée. 40 000 souris et 2 800 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Entre le cinquième et le douzième jour de vie, chaque animal est immobilisé pour un tatouage par perforation des phalanges ou des coussinets et pour l'amputation de l'extrémité de la queue, geste de cinq secondes qui peut entraîner un saignement, une infection, ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Le porteur annonce que 500 rats non transgéniques seront proposés à l'adoption, sur les 42 800 rongeurs concernés.

Objectifs

La recherche fondamentale, dans de nombreux domaines, nécessite encore l’utilisation d’animaux pour des sujets d’étude requérant l’observation d’interactions entres les organes et systèmes vivants. L'objectif de cette demande est d’identifier et de déterminer l'ensemble des caractères génétiques d’animaux génétiquement modifiés ou altérés. Ces animaux sont élevés à des fins scientifiques, suite à des demandes d’établissements externes pour réaliser leurs études. Ce projet décrit l’identification et le génotypage de souris et rats transgénique dans le but de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation et les reconnaitre individuellement - sélectionner les animaux reproducteurs et les identifier individuellement - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements ou de tissus pour des études hors du vivant.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux, - d’identifier les animaux de manière permanente, - d’éviter le recours à une méthode d'identification plus invasive. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables,- de minimiser les risques de contaminations entre échantillons, - d’éviter le recours à l’anesthésie.

Procédures

La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - Le tatouage par perforation des phalanges et/ou des coussinets : réalisé une fois, durée d'une minute maximum - La biopsie de queue qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue : réalisée une fois, durée de 5 secondes. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure.

Impact sur les animaux

La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention sécuritaire pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Dans certains cas, très rares, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : - Saignement - Rejet du nouveau-né par la mère - Infection au niveau de la queue

Devenir

Le devenir des animaux diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet, pour la formation ou pour le maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP), b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies, c/ ils sont mis à mort pour prélèvements de tissus post mortem, d/ ils sont mis à mort dès sevrage si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoin du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.

Remplacement

La recherche fondamentale, dans de nombreux domaines, nécessite encore l’utilisation d’animaux pour des sujets d’étude requérant l’observation d’interactions complexes et fines entres les organes et systèmes vivants. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables sur les équipements robotisés. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de recommencer à nouveau les gestes (prélèvement et tatouage). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement contraire à la réduction, ; - des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement).

Réduction

Le responsable de l’établissement établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de ne produire que les animaux nécessaires et éviter des surnuméraires non utilisés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’établissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.

Raffinement

Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté et formé. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté permettant de limiter les infections, d’effectuer un geste rapide et précis tout en respectant les conditions d'aspesie. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les animaux sont remis en présence de leur mère dans des cages collectives enrichies : maison rouge, nid... et observés quotidiennement. De plus, des mesures précoces sont mises en place au sein de l'animalerie pour tous les rongeurs pour s'assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie. Dans le cas de rats non transgéniques, ils seront proposés à l’adoption (particulier ou association spécialisée).

Choix des espèces

Le choix de la souris et du rat comme modèle d’expérimentation se justifie par son utilisation très fréquente dans le milieu scientifique, notamment dans la recherche fondamentale. Il se justifie également par la connaissance approfondie de son génome,ses similitudes avec le génome humain et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Pour toutes les lignées, les rongeurs sont identifiés et génotypés entre 5 et 12 jours. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables.

84 000 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un projet dont l'objet unique est le génotypage des lignées transgéniques élevées par le laboratoire. À trois à six jours de vie, chaque souriceau est immobilisé moins de trois minutes et l'extrémité de sa queue est coupée, un second prélèvement pouvant être fait à l'oreille avec une pince emporte-pièce. Le porteur reconnaît un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme, et indique qu'une méthode de génotypage sur le poil est à l'essai. Les souris ne portant pas le génotype recherché servent pour partie à l'apprentissage de la contention avant d'être tuées, les autres partent vers les projets de recherche du laboratoire ou vers le renouvellement des accouplements.

Objectifs

Les projets de recherche du laboratoire impliquent l'utilisation de plusieurs lignées de souris transgéniques qui nécessitent un élevage pour augmenter les effectifs de souris dont le génotype est adapté aux protocoles mis en place. Nous hébergeons et produisons environ 30 lignées différentes de souris génétiquement modifiées avec la nécessité parfois de créer de nouveaux modèles comme par exemple, des croisements de deux lignées génétiquement modifiées existantes. Le génotypage est une étape indispensable au bon déroulé des projets du laboratoire et doivent être réalisés précocément pour la mise en place ultérieure des protocoles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Les recherches menées à l'unité grâce à l’utilisation d’animaux transgéniques ont des objectifs multiples : - accroitre les connaissances sur les mécanismes conduisant aux maladies rénales - développer des traitements, des outils et des approches plus efficaces contre l'insuffisance rénale - étudier la génétique des maladies rénales rares héréditaires et acquises - comprendre les mécanismes de formation des calculs rénaux. Ces thématiques sont d'une importance cruciale en matière de santé publique. Par ailleurs, la méthode utilisée pour la caractérisation du génome permet de sélectionner les animaux d’intérêts et ainsi constituer des groupes expérimentaux stables de manière précoce.

Procédures

Une contention de moins de 3 minutes pour la biopsie. Prélèvement d'une petite partie distale de la queue . Et si besoin d'un deuxième prélèvement il sera éffectué au niveau de l'oreille avec une pince emporte pièce adapté à la souris .

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible . Eventuel infection possible au niveau du prélèvement mais reste très rare .

Devenir

Les animaux ne portant pas le génotype d'intérêt seront pour une première partie utilisés pour de l'apprentissage à la contention et l'autre partie sera euthanasiée par une méthode réglementaire . Les autres animaux portant le bon génotype seront utilisés dans les projets de recherche ou pour des renouvellement d'accouplements, l'élevage étant en continue .

Remplacement

En raison notemment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l'état encore embryonnaire de la recherche sur les organoides, l'étude des maladies rénales requiert l'obtention de tissu rénal prélevé sur l'animal. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l'évolution de la défaillance chronique progressive d'organes. Les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles pour étudier des mutations, des invalidations ou des surexpressions de gènes d'intérêt. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain , en particulier pour les étapes du développement embryonnaire.

Réduction

Le génotypage précoce des souriceaux permet de conserver uniquement les animaux avec le génotypage d’intérêt et de constituer des lots expérimentaux avant le sevrage des animaux, pour l’utilisation future dans des projets autorisés de l’unité . Dans le cadre de l'apprentissage à la contention nous utilisons une partie des animaux qui ne sont pas utilisés dans les projets de recherche. Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé sur la base des productions des années antérieures. Le projet requiert l’utilisation de 84000 animaux sur une période de 5 ans en utlisant trente lignées différentes pour l'élevage.

Raffinement

Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés ,dans les zones d’hébergement un contrôle de la température et de l’hygrométrie est effectué tous les jours , un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau . Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un transfert d’odeurs est réalisé sur les gants de l’opérateur pour minimiser le risque de rejets des nouveaux- nés par la mère ou de cannibalisme . Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.Une mise au point d'une autre méthode moins invasive est en cours d'essais pour du génotypage sur le poil .

Choix des espèces

Les équipes de recherche de l'unité travaillent sur des modèles souris génétiquement modifiées. Par conséquent, la plateforme animalerie est chargée de la production de ces souris et de la collecte des échantillons d’ADN (biopsie de queue) de manière précoce dans le but de caractériser le génome. Pour les besoins des activités de recherche, une identification et un génotypage précoces sont requis. Les deux interventions sont réalisées à l’âge de 3 à 6 jours post natal.

1 800 souris vont être utilisées pour une biopsie d'oreille de cinq secondes chacune, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le geste est pratiqué sur animal vigile maintenu en contention, avec un second prélèvement sur la même oreille si l'analyse génétique échoue. La procédure elle-même ne tue aucune souris, et leur sort dépend ensuite du résultat du génotypage : entrée dans un projet de recherche, maintien dans les colonies d'élevage, ou mise à mort pour prélever des tissus ou faute de correspondre aux caractéristiques attendues. Le porteur affirme qu'aucune méthode n'est aussi performante que la biopsie d'oreille et présente le génotypage comme une "nécessité" pour valider et entretenir ces lignées.

Objectifs

La thématique générale de mon projet de recherche est la compréhension des mécanismes de régénération des cellules souches pulmonaires. Pour cela, j’étudie les mécanismes de dérégulation que sont la fibrose et le cancer. Ce projet nécessite le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Chaque animal, identifié par application d'une boucle d'oreille, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour mon projet de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; -sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.

Procédures

Une biopsie de l’oreille (durée : 5 secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement sur la même oreille pourra être envisagé.

Impact sur les animaux

Les biopsies d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère et dans de très rares cas un léger saignement. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress. S

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche ; b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.

Remplacement

Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. les plans d’élevage en amont, sont définis afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.

Raffinement

Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.

Choix des espèces

Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et miment les pathologies humaines. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 21 jours.

Un bout de queue de moins de deux millimètres est prélevé sur chaque souriceau, de préférence pendant sa première semaine de vie, sur animal éveillé ou sous anesthésie gazeuse selon son âge. 500 souris vont être utilisées sur cinq ans dans cette seule procédure, déclarée d'un niveau de souffrance léger, pour identifier celles qui portent le génotype recherché et les orienter vers d'autres protocoles. Le porteur résume les atteintes attendues en une ligne, une douleur passagère au moment du prélèvement. Sur le devenir des souris, il écrit seulement que la procédure vise à définir les animaux d'intérêt, sans dire ce qu'il advient de celles qui n'ont pas le bon génotype.

Objectifs

Afin de déterminer les animaux d'intérêt à inclure dans d'autres procédures, il est nécessaire de réaliser une identification génétique des souris présentes en élevage à l'animalerie. Pour ce faire, les souris subiront une biopsie de l'extrémité de la queue.

Bénéfices attendus

L'identification génétique nous permet de sélectionner les animaux à inclure dans les procédures expérimentales de recherche.

Procédures

Les souris subiront une biopsie au niveau de l'extrémité de la queue (

Impact sur les animaux

Une douleur passagère est attendue au moment du prélèvement.

Devenir

Cette procédure vise à définir les animaux d'intérêt pour d'autres protocoles de recherche.

Remplacement

Ce protocole étant préliminaire à des études autorisées utilisant des animaux transgéniques à des fins scientifiques, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des souris par une méthode alternatives.

Réduction

La procédure ne sera réalisée que sur des animaux dont le croisement d'origine permet d'obtenir le génotype d'intérêt. La vérification du génotype au cours de l'élevage nous permet de limiter les dérives génétiques. Le nombre d'animaux est défni en fonction de notre protocole actuel pour le maintien de l'élevage. Ce nombre sera réduit en fonction des portées obtenues.

Raffinement

Après leur naissance, les animaux resteront hébergés en groupe avec leur mère dans une cage bénéficiant d'un milieu enrichi (coton foisonnant, aspen brick, tube carton et dôme) jusqu'à leur sevrage. Le geste sera réalisé au cours des 2 premières semaines de vie des souriceaux pour limiter la douleur associée à ce geste. Après sevrage, les animaux seront hébergés en groupe et avec un milieu enrichi. Les souris seront vérifiées quotidiennement et différentes mesures seront mises en place pour assurer leur bien-être. Dans le cas où un point limite serai atteint, l'animal concerné sera mis à mort.

Choix des espèces

Nos protocoles d'étude impliquent une vérification du génotype concernant les modèles expérimentaux murins transgéniques. Le génotypage se fera jusqu'à la 3e semaines de vie. L'opérateur effectuera le génotypage préférentiellement lors de la première semaine de vie.

Expédiées à deux ou trois mois vers un autre établissement pour y servir dans un projet distinct, les souris kF-DH sont élevées pour reproduire une maladie rénale liée au dépôt d'anticorps produits par une cellule cancéreuse. 640 souris porteuses de ce phénotype dommageable vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le génotypage se fait par poinçonnage du pavillon de l'oreille après dix-sept jours, une bague d'identification étant posée sur l'autre oreille. Celles qui restent pour la reproduction sont tuées avant six mois, soit avant que l'insuffisance rénale ne se déclare, et le porteur indique qu'à la fin du projet l'élevage sera arrêté et la lignée conservée sous forme cryoarchivée.

Objectifs

Dans certaines maladies rénales, un anticorps fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré- cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie rénale observée chez l’homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les mécanismes de développement des lésions rénales en aval des dépôts d’immunoglobulines, afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique plus large, déposé, pour lequel nous espérons plusieurs bénéfices : - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec cette maladie). Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 17 jours. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement les animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.

Impact sur les animaux

Les souris doubles mutées présentent à partir de 8 mois une perte progressive de fonction rénale. Les symptômes de l'insuffisance rénale terminale sont, chez l'homme et la souris, très peu spécifiques. Les principaux symptômes, ou nuisances, seront donc une asthénie, un amaigrissement et une altération de l'état général et du comportement traduite par un poil hérissé, une baisse de la réactivité, ou une prostration. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).

Devenir

Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt kF-DH sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable avec leurs contrôles DH (sans phénotype dommageable) et utilisée dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des animaux kF-DH sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie des dépôts d’immunoglobulines monoclonales. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 640 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux kF-DH mutés de manière homozygote pour les deux modifications génétiques et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 8 mois seront suivis tous les jours à partir de deux mois et ce jusqu'à leur envoi à 2-3 mois vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour les croisements et mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime. Les animaux seront suivis avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les seules espèces permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les souris doubles homozygotes kF-DH seront utilisées pour les croisement dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à 6 mois, soit avant le développement du phénotype dommageable. Dans l'article initial, les souris commencent à développer des lésions rénales à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans retentissement rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Les animaux doubles homozygotes kF-DH envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 2-3 mois.

Porteuses de mutations qui provoquent la maladie de Charcot, deux lignées de souris sont élevées pour fournir des lots à deux autres projets déjà autorisés. 375 souris à phénotype dommageable vont être utilisées sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réduites pour l'essentiel à une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur décrit la maladie comme paralysante, incurable et fatale, et indique que les animaux partent vers le site utilisateur à 70 ou 90 jours, avant les premiers signes moteurs, le stade terminal survenant à 170 jours pour la première lignée. Les souris qui n'ont pas le génotype attendu seront tuées, tout en pouvant servir d'animaux de compagnie aux autres pour éviter les cages solitaires.

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière, responsables de la contraction des muscles striés. Environ 7000 patients en France sont touchés par la maladie de Charcot. La maladie commence généralement entre 50 et 70 ans avec une faiblesse musculaire qui évolue rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire entrainant le décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Les modèles de souris de la maladie de Charcot permettent d’explorer des pistes thérapeutiques. Notre objectif est d’élever deux lignées de souris génétiquement modifiées présentant une diminution de leur capacités motrices. Les animaux sont produits dans le but de répondre à des objectifs scientifiques centrés sur deux modèles d’étude complémentaires de la maladie de Charcot. La production des animaux a pour objectif de constituer des lots expérimentaux pour deux projets déjà validés par le ministère de l’enseignement, de la recherche et de l’innovation. Cette présente demande d’autorisation de projet élevage permet de faire suite à la précédente et nous permettra d’assurer une continuité d’élevage. Les lots expérimentaux sont produits pour répondre à deux études thérapeutiques des deux projets connexes. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Nous avons fixé une durée du projet de 3 années pour correspondre aux projets connexes. Ces souris porteuses de mutation causant la maladie de Charcot, issues de cet élevage, sont transférées à l’établissement utilisateur avant l’apparition des symptômes, puis sont incluses dans le cadre des projets expérimentaux.

Bénéfices attendus

L’élevage de deux modèles génétiques différents de la maladie permettra à terme d'évaluer deux approches thérapeutiques ciblant deux mécanismes distincts lorsque les souris seront utilisées en étude dans le cadre d'un autre projet. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet. L’élevage sur un site de deux lignées de souris porteuses d'une mutation causant la maladie de Charcot pour générer des lots expérimentaux qui sont étudiés sur un autre site utilisateur permet d’optimiser les espaces des sites utilisateurs. Le maintien de ces deux lignées sur deux sites permet également de réduire tout risque de perte d’une lignée et donc éviter de devoir générer des animaux en plus pour reconstituer une colonie. Les souris porteuses de la mutation (environ 50% de chaque descendance) sont transférées à un âge où aucun symptôme ne se déclare. La gestion du phénotype dommageable sur le second site se fait donc avec un personnel et un cadre spécifique au suivi de ce phénotype.

Procédures

Les animaux des deux lignées décrites seront transférés sur le deuxième site d’expérimentation avant l’apparition du phénotype dommageable. Cependant un suivi quotidien par équipe de zootechnie permet de rendre compte de tout signe lié à la pathologie qui pourrait se manifester de manière inhabituelle : tels que la boiterie d’un membre postérieur chez un premier modèle de la maladie de Charcot ou les tremblements d’un membre postérieur chez le deuxième modèle de la maladie. En examinant rétrospectivement les autorisations précédentes aucun problème lié à la pathologie n’a été signalé dans le délai de transfert que nous proposons. La biopsie pour le génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable et fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien phénotypés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation des 3Rs. Le transfert des animaux du site d’élevage se fait à un stade qui exclut toute déclaration de premiers signes moteurs chez les deux lignées. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées est la diminution sélective des capacités motrices. Ces modèles présentent donc une atteinte motrice variable. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les individus sont produits uniquement à des fins d’élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans d’une utilisation continue sur un autre site. Les animaux qui ne sont pas du bon génotype ou encore des animaux qui ont atteint un point limite seront euthanasiés.

Remplacement

L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre les neurones moteurs touchés dans la maladie et d’autres types cellulaires qui peuvent être très distants. Une telle interaction se met en place durant des mois et implique de nombreux autres types cellulaires autres que ceux ciblés ici. Notre premier objectif est de développer une approche thérapeutique utilisant des anticorps (immunothérapie) ciblant cette population de globules blancs. L’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle intégratif physiologique complet que seul l’animal offre. La barrière hémato-encéphalique et les méninges, qui sont les lieux où s’effectuent des échanges entre les cellules du système immunitaire et le système nerveux, illustrent la complexité de cette physiologie que l’on ne peut récapituler pleinement in vitro. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique vers la clinique. Notre second objectif est d’explorer une approche thérapeutique ciblant certaines populations de cellules du cervelet. Ces réseaux neuronaux très distants entre la moelle épinière et le cervelet ne peuvent pas être mimés in vitro. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent la diversité des interactions dynamiques et plastiques entre ces différentes populations de cellules. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer le potentiel thérapeutique des interactions aussi distantes qui peuvent exister dans cette pathologie. La validation d’une approche thérapeutique ciblant des interactions aussi distantes nécessite des modèles animaux. Cependant, afin d’explorer la pertinence des cibles thérapeutiques, nous développons des systèmes de co-cultures in vitro entre les cellules immunitaires et les neurones moteurs purifiés ainsi que des cultures organotypiques du cervelet.

Réduction

Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 3 années, un nombre total de 375 souris avec phénotype dommageable. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement. Afin de minimiser le nombre d’animaux, les animaux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. La stratégie d’élevage que nous avons permet de produire le juste nombre d’animaux qui répond aux besoins de réduction précédemment validées dans les saisines connexes à cette demande. Nous avons suffisamment de recul sur la gestion des animaux pour assurer une production de lots expérimentaux définis sur le site d’élevage. Nous utilisons également pour nos lots expérimentaux des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.

Raffinement

Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’élevage est éviter que le phénotype dommageable survienne lors de l’élevage. Les animaux sont transférés bien avant la possible apparition de premiers signes moteurs. De façon rétrospectives avec nos précédents élevages aucun phénotype dommageable n’a pu être signalé en suivant l’âge limite pour lequel les animaux sont systématiquement transférés sur le second site utilisateur. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur, d’infection et de déambulation anormale compte tenu de l’âge est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. L’utilisation de mâles pour la reproduction permet d’avoir des portées plus robustes, plus nombreuses et de réduire de potentielles faiblesses car les femelles transgéniques sont connues commle étant de mauvaises reproductrices. Les animaux qui n'ont pas le génotype attendu pourront toujours servir d'animaux compagnons pour éviter tout animal isolé.

Choix des espèces

Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats : début précoce ou tardif, progression lente ou rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. Nous évaluons deux protocoles thérapeutiques ciblant deux cibles cellulaires distinctes. Le protocole d’immunothérapie et de thérapie génique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie thérapeutique. La complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et des réseaux neuronaux distants et requiert un modèle mammifère à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Les modèles de souris de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits dans la littérature. Les souris sont élevées sur le premier site puis transférées avant l’apparition des symptômes sur un deuxième site où elles seront prises en charge pour l’expérimentation. Pour le premier modèle le début de la maladie se situe à 110 j et le stade terminal à 170 j. Les souris sont transférées à l’âge de 70 j. Pour le deuxième modèle, un défaut de réponse à une sollicitation motrice est détectable à 60 j, mais à cet âge les souris ne présentent pas de défauts moteurs spontanés et prennent plus de poids que les souris contrôles (+15%). A partir de 290 j, stade où des tremblements des pattes postérieures sont présents, c’est le stade symptomatique. La survie des souris n’est pas altérée. Ces souris sont transférées du site d’élevage à l’âge de 90 j vers le site d’expérimentation dans le cadre de l’utilisation continue.

13 000 souris vont être utilisées pour un unique geste de quelques secondes chacune, une biopsie de la queue pratiquée sur animal vigile dès l'âge de dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert à trier les descendants de croisements destinés à invalider seize gènes de la reproduction. Le porteur reconnaît que la contention et le geste provoquent une douleur légère et un stress. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées et leurs tissus récupérés, les autres restent en vie pour intégrer d'autres projets de recherche que le RNT ne décrit pas.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales dans le domaine de la biologie de la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à comprendre les mécanismes qui gouvernent la gamétogenèse, le processus biologique qui permet la formation des gamètes, les cellules sexuelles impliquées dans la reproduction. Pour cela seize gènes clefs vont être étudiés. Afin de mieux comprendre leur fonction nous étudierons l’effet de leur invalidation au cours de la gamétogenèse. Le second objectif de ce projet est d’identifier de potentielles causes génétiques d’infertilité. L’infertilité est une pathologie qui touche environ un couple sur six et dans de nombreux cas les causes en demeurent inconnues. Mieux comprendre les acteurs impliqués dans le processus de gamétogenèse et les mécanismes associés permettra de mieux diagnostiquer l’infertilité.

Bénéfices attendus

La fonction de reproduction est très particulière. C’est en effet une des premières à se mettre en place au cours du développement et une des dernières à devenir fonctionnelle à l’âge adulte (c.a.d. lorsqu’un individu souhaitera procréer). Il existe de ce fait une ‘boite noire’ entre le moment où cette fonction peut être altérée et le moment de la découverte de l’infertilité. Il est donc capital de prévenir autant que de ‘guérir’ toute atteinte à la fonction de reproduction et ceci implique une connaissance poussée des mécanismes biologiques impliqués. La compréhension du rôle des gènes est essentielle pour comprendre globalement la gamétogenèse, et donc ce qui assure la fertilité. Connaitre les gènes et comprendre les processus permettra d’identifier les causes génétiques et améliorera la prise en charge et le conseil apporté aux patients. Plus spécifiquement, notre projet améliorera cet aspect en apportant des connaissances fondamentales sur les étapes dérégulées lorsque des gènes impliqués en méiose sont invalidés. La méiose est le processus qui permet la formation des gamètes haploïdes (ovules et spermatozoïdes).

Procédures

Un biopsie de queue sera réalisé sur animal vigile afin de déterminer son statut génétique. La durée de cette procédure est de quelques secondes. Un prélèvement unique sera réalisé par animal. Celui-ci servira à déterminer le statut génétique de l’animal. En effet, afin d’étudier le rôle d’un gène dans la fonction de reproduction, nous produirons des animaux déficients pour ce gène à partir de croisements d’individus hétérozygotes (ne possédant qu’une copie sur deux du gène invalidés). Les descendants de ces animaux seront alors soit sauvages génétiquement (avec les deux copies du gène non mutées) soit hétérozygotes, soit homozygotes mutants (avec les deux copies du gène mutées). Nous allons comparer les tissus reproducteurs des animaux homozygotes à ceux des animaux sauvages pour comprendre l’effet de l’invalidation du gène candidat. Les animaux hétérozygotes serviront à maintenir la lignée. Exceptionnellement si le résultat de l’analyse génétique, n’est pas concluant, un second prélèvement peut être envisagé.

Impact sur les animaux

La biopsie de queue est un geste qui provoque une douleur légère. L’animal est maintenu en contention (pour éviter qu’il bouge) lors du prélèvement ce qui représente une source de stress.

Devenir

A l’issue de la procédure (prélèvement d’un morceau de queue) tous les animaux sont maintenus en vie. au-delà, les animaux dont le génotype ne convient pas seront euthanasiés et leurs tissus pourront être récupérés post-mortem. Les autres animaux seront maintenus en vie pour intégrer des projets de recherche nécessitant ce type d’animaux.

Remplacement

La fonction de reproduction ne peut être efficacement modélisée in vitro car elle implique plusieurs tissus et types cellulaires en interaction. De plus, l’étape centrale de la gamétogenèse, la méiose, est absolument impossible à mimer avec une lignée cellulaire. En effet, la méiose est une division cellulaire différente de la mitose qui ne permet pas la multiplication cellulaire et donc exclut l’usage d’une lignée cellulaire par définition. La souris est un modèle de choix pour l’étude de la fonction de reproduction du fait de son cycle rapide de reproduction et de l’existence de nombreux modèles mutants avec des phénotypes finement décrits dans la littérature facilitant la comparaison des données. A ce jour cette méthode, la biopsie de queue, est la seule parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire pour le génotypage des souris portant des constructions génétiques spécifiques. Ce processus est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et permettre l’entretien de ces lignées.

Réduction

Sur la base de notre expérience, nous avons estimé le nombre d’animaux requis pour l’étude de ces différents gènes en fonction des étapes supposées être atteintes. Le croisement d’animaux hétérozygotes permettra de générer à la fois des animaux homozygotes et sauvages dont les phénotypes seront comparés. L’étude du processus de reproduction dans les deux sexes simultanément devrait limiter la génération d’animaux non exploités. Les animaux hétérozygotes issus des mêmes croisements serviront à maintenir les lignées.

Raffinement

Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les souriceaux âgés de 10 à 21 jours sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place. Dans les cas exceptionnels ou une seconde biopsie serait requise au-delà de 21 jours, un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux au développement et à la reproduction rapides. Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines, notamment l’infertilité, car les souris possèdent de grandes similarités génétiques avec l'être humain. La production des cellules sexuelles est bien décrite dans cette espèce et il est donc aisé, par comparaison, de positionner le rôle d’un nouveau gène. Chez les vertébrés, il n’existe pas d’autre modèle dans lequel autant de mutations affectant la fertilité aient été décrites. Chez les organismes modèles invertébrés (levure, ver, mouche) de nombreuses mutations affectant la fertilité sont rapportées mais la conservation des gènes est relativement faible vis-à-vis de l’espèce humaine. Les biopsies de queues sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 10 jours. Le génotypage (pour visualiser le(s) gène(s) d’intérêt) des lignées est essentiellement réalisé à cet âge pour permettre d'avoir le résultat au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.

Une biopsie de l'oreille ou du bout de la queue, moins d'une minute de contention, moins de 5 mm de tissu prélevé : l'acte est bref et il concerne 100 000 souris. Toutes sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, 10 000 sont annoncées comme réutilisées, les autres sont tuées, à l'issue d'un projet autorisé ou dès le génotypage quand elles ne portent pas le génotype recherché. Le porteur indique qu'au moins la moitié des souris nées dans son animalerie ne portent pas ce génotype, qu'un quart est utilisé pour des prélèvements de tissus et un quart pour des projets validés par le ministère. Le chiffre de 100 000 n'est adossé à aucun calcul dans le résumé, ni à un nombre de lignées, ni à une durée.

Objectifs

L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés

Bénéfices attendus

Il est nécessaire d'identifier tous les individus génétiquement modifiés dans le cadre de la gestion d’élevage afin de répérer les animaux d'intérêt pour les différents projets scientifiques.

Procédures

Prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)

Impact sur les animaux

L’effet indésirable qui peut survenir est une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement.

Devenir

Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.

Remplacement

Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive à la queue ou à l’oreille, n’ont pas été retenues.

Réduction

L'animalerie élève de nombreuses lignées pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par reproduction nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter la consanguinité, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans d’autres projets.

Raffinement

Les méthodes de prélèvement (biopsie à l’oreille ou à la queue) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie à l’oreille prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 10 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées modifiées génétiquement permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. 5 à 10% des animaux sont utilisés après sevrage (entre 21 et 30 jours après la naissance) lorsqu'un génotypage précoce n'est pas nécessaire. Pour minimiser le stress, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps.

Tuées à un mois si elles n'ont pas le génotype recherché et qu'aucune autre équipe ne les récupère, transférées vers les projets expérimentaux si elles l'ont, les souris de cet élevage ne dépassent pas douze mois quand elles sont mises à la reproduction. 24 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour produire les lots destinés à l'étude du développement du cerveau. Chaque juvénile subit, vigile et maintenu à la main, le prélèvement d'un fragment de queue, avec un risque de saignement, et certaines lignées ne sont pas maintenues à l'état homozygote parce que les embryons meurent dans le dernier tiers de la gestation. Le porteur mène en parallèle des travaux sur des mouches et des cellules humaines, et affirme qu'il reste "indispensable" de passer par un mammifère vivant.

Objectifs

Le développement du cerveau se produit par une succession d’étapes de prolifération et de différenciation cellulaire très contrôlées dans le temps par différents facteurs. Nous nous intéressons aux mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la façon dont les cellules sont générées au cours du temps. Notre objectif est de comprendre le rôle de certaines protéines, et donc les gènes dont elles sont issues, dans ces processus et de les étudier dans un contexte in vivo au cours du développement d’un cerveau de Mammifère. L’objectif de ce projet est l’élevage des animaux nécessaires pour produire les lots expérimentaux qui seront utilisés pour répondre aux différentes questions scientifiques citées ci-dessus.

Bénéfices attendus

Les études réalisées à partir des animaux produits dans ce projet permettront d’acquérir des connaissances précieuses sur les mécanismes mis en jeu dans la régulation de la génération des différentes cellules du cerveau lors du développement. Elles seront mises en perspective avec d’autres études menées en parallèle chez la mouche et dans des cultures de cellules humaines, afin de comprendre comment ces mécanismes se sont ajustés au cours de l'évolution, dans différentes espèces. De plus, ces études constitueront un socle pour de futures découvertes permettant de comprendre certaines maladies développementales du cerveau. Elles seront la base pour commencer des essais cliniques pour promouvoir la réparation cérébrale chez des patients atteints de maladies, comme la Sclérose en Plaques ou comme dans la pathologie du cerveau des grands prématurés.

Procédures

Un prélèvement d’un fragment de queue sera réalisé sur l‘ensemble des animaux juvéniles produits au cours de l’élevage. Cette procédure à lieu sur animaux vigiles, avec contention manuelle, une seule fois et dure quelques secondes. Rarement un reprélevement à l’oreille (1 seule fois, moins d’une minute) aura lieu sur un animal adulte si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur peut être attendue lors du prélèvement de tissus au niveau de la queue ou de l’oreille, l’animal étant maintenu en contention, il y a un léger stress lié à cette manipulation. Il y a un risque de saignement. Certaines lignées utilisées ne seront pas être maintenues à l’état homozygote car les embryons homozygotes ne survivent pas, ce qui présenterait un phénotype dommageable. D’après notre expérience avec la lignée nous estimons que la létalité embryonnaire se situe dans le 3ème tiers de gestation.

Devenir

Les reproducteurs seront euthanasiés à 12 mois maximum afin de ne pas observer de baisse de la fertilité. Les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt pour nos projets seront euthanasiés à 1 mois, ou si cela est possible, ces animaux pourront être donnés à d’autres équipes, dans un souci de réduction. Les animaux produits pour nos projets de recherche seront transférés dans ces projets pour une utilisation continue à partir de l’âge de 1 mois.

Remplacement

Notre projet vise à comprendre les mécanismes de développement du cerveau en prenant en compte toute sa complexité (diversité des types cellulaires, interactions cellulaires, contraintes physiques, signalisations…). Suivant le principe de remplacement, des études sur mouches, ainsi que sur cellules humaines sont réalisées et permettent de comprendre certains aspects et mécanismes impliqués dans les processus étudiés avant le passage au modèle de souris. En revanche, il est indispensable dans le cadre de nos questions scientifiques, de passer par une approche chez le Mammifère vivant afin de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision le moment d’inactivation de gènes d’intérêts.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés en élevage (24480) sera limité au strict nécessaire pour le nombre d’animaux nécessaires pour nos études (calculé pour chaque type d’analyse pour obtenir des données statistiquement exploitables). Nous pilotons notre élevage de manière raisonnée afin d'obtenir uniquement le nombre de petits nécessaires au renouvellement des reproducteurs et aux lots expérimentaux. Nous privilégierons les croisements optimums pour éviter de générer des animaux non porteurs des génotypes d'intérêt. Nous proposerons aux autres équipes de recherche en don nos animaux non porteurs des génotypes d'intérêt.

Raffinement

L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement en portoirs ventilés (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison, papier kraft), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront contrôlées. La nourriture sera adaptée au stade physiologique des animaux. Tout au long de la vie des animaux, un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué certifiant un contrôle régulier du bien-être des animaux. La biopsie de queue sera réalisée en même temps que le tatouage afin de limiter la manipulation des animaux. Le geste est pratiqué dans une pièce dédiée, au calme. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal afin d’éviter tout risque d’infection ou de contamination croisée. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. Certaines lignées utilisées ne seront pas être maintenues à l’état homozygote car les embryons homozygotes ne survivent pas, ce qui présenterait un phénotype dommageable. Des points limites sont définis et seront respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux

Choix des espèces

Dans notre projet de recherche, nous utilisons des modèles de mouches, ainsi que des modèles de cellules humaines. Cependant, il est indispensable de comparer ces données avec un modèle de cerveau de Mammifère vivant. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche ont été réalisés pour des travaux chez la souris. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à cette étude sont uniquement disponibles chez la souris. Les animaux sont tatoués aux doigts à l’âge maximal de 10 jours et un bout de queue est prélevé au même moment pour le connaitre leur patrimoine génétique. Les animaux étant très jeunes, l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite. Les animaux reproducteurs seront mis en accouplement à partir de l’âge de 6 à 8 semaines (âge où les capacités de reproduction sont optimales) et euthanasiés à l’âge de 12 mois maximum.

50 000 souris pour un geste de moins d'une minute chacune, la section d'un bout de queue de deux millimètres sur des nouveau-nés de trois à dix jours, afin de lire leur génotype. Ces souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'établissement pulvérisant un anesthésique local sur la queue avant de couper et signalant qu'une infection reste possible. L'élevage lui-même est l'objet du projet, qui alimente en animaux les autres protocoles de la plateforme. Celles dont le génotype intéresse un projet y seront versées, les autres serviront à la formation interne ou seront tuées, sans que le résumé indique combien relèvent de chaque cas.

Objectifs

Dans le cadre des projets de recherche développés sur notre plateforme, différents modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisés pour les études en neurosciences. Le projet vise à prendre en charge l'utilisation en continu de la gestion des lignées murines génétiquement modifiées de l’établissement utilisateur nécessitant une biopsie pour génotypage (réalisée indépendamment de l'acte d'identification).

Bénéfices attendus

L'élevage de souris de laboratoire permet de produire des modèles animaux et de chercher les relations entre l'expression génétique et le comportement animal, le fonctionnement d'un organe, et le fonctionnement d'une pathologie afin de developper des traitements. Il concerne l'élevage des animaux qui seront utilisés dans ces projets et leur génotypage par une méthode invasive et dissociée de leur identification. Le présent projet concerne uniquement l'activité d'élevage de lignées murines à des fins d'expérimentation sur notre site.

Procédures

Une intervention sera effectuée sur ces animaux : Le prélèvement d'un petit bout de la queue avec une paire de ciseaux. Ce geste dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Lors de l'acte de biopsie d'un bout de la queue (2mm maximum) pour génotypage les animaux peuvent ressentir une légère douleur. Une infection est rare mais toujours envisageable.

Devenir

Les animaux présentant un génotype d'intérêt seront utilisés dans des procédures expérimentales de notre établissement en utilisation continue. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux seront, soient utilisés pour des formations internes, soient euthanasiés.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent à l’utilisation d’animaux déjà justifiés dans les différentes DAP (demande d’autorisation de projet) déposée par l’Institut.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle ; utilisation du gêne d'interêt etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux. Concernant les animaux produits ne pouvant pas être intégrés aux lots expérimentaux, nous essaierons au maximum de les utiliser dans le cadre de la formation/tutorat en interne, afin de limiter au maximum la production d’animaux non utilisés.

Raffinement

2-3 minute avant l'acte de biopsie du bout de la queue, une pulvérisation de spray de chlorhydrate de lidocaïne 5% sera effectuée sur la queue de l'animal comme anesthésique local afin de réduire au maximum toute douleur pouvant être ressentie. Puis une compresse imbibée de povidone iodée sera appliquée sur la queue en prévention d'une infection.

Choix des espèces

Le plateau d'experimentation est un établissement d'élevage et d'utilisation de souris génétiquement modifiées. La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques afin d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. L'acte de biopsie d'un bout de la queue est réalisé sur les nouveau-nés entre 3 et 10 jours conformément à la règlementation et afin de pouvoir les génotyper avant le sevrage dans une optique de réduction.