Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
3 613 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère, la plupart tuées à l'issue. Le modèle exprime une protéine humaine qui s'accumule dans le système nerveux et provoque une paralysie progressive, dont le porteur bloque l'apparition par antibiotique pendant l'élevage puis la laisse se développer pour tester des candidats médicaments. Les souris malades présentent perte de poids, atrophie musculaire et déficits moteurs, suivies par un score clinique jusqu'à leur mise à mort, les reproducteurs étant conservés pour la lignée. Le porteur qualifie le "besoin médical" d'"immense" et juge le modèle animal "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire à évolution rapide qui conduit au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par une disparition progressive et irréversible des neurones moteurs (les cellules qui commandent les muscles), provoquant une perte progressive des capacités vitales par paralysie des muscles: locomotion, alimentation, respiration,… Bien que les recherches, réalisées ces dernières années, aient permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes mis en jeu au cours de l’évolution de la maladie, les origines de la maladie restent inconnues dans la plupart des cas. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Seuls deux composés (qui ralentissent modestement la progression de la maladie dans certains cas) ont été approuvés. Le besoin médical est donc immense et totalement insatisfait. Le modèle murin choisi dans ce projet exprime très fortement une protéine humaine qui va s’accumuler dans le système nerveux central et la moelle épinière. Cette accumulation va entraîner la mort des cellules nerveuses. Ce modèle reproduit la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA à travers ses caractéristiques moléculaires - L’accumulation toxique de protéines dans les cellules nerveuses du cerveau et de la moelle épinière, est très représentatif des formes cliniques de SLA (plus de 90% des cas de SLA). - Les signes cliniques sont engendrés par la mort progressive des cellules nerveuses, induite par l’accumulation de protéine, et qui conduit un déficit moteur puis une paralysie musculaire.
Bénéfices attendus
A ce jour il n’existe aucun traitement curatif de la SLA. En parallèle de la prise en charge multidisciplinaire des patients pour diminuer et soulager les symptômes, il existe que deux molécules approuvées qui permettent, au mieux, de ralentir modestement la progression de la maladie. La SLA est une maladie multifactorielle et complexe, dont la plupart des mécanismes sont encore très mal connues. Ce projet permettra : - de mieux comprendre la physiopathologie de la SLA - de développer de nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la SLA. - La mise en perspective des signes cliniques et des analyses moléculaires effectuées sur les prélèvements de sang permettra de comprendre les mécanismes complexes conduisant à la maladie.
Procédures
Durant l’élevage, tous les souriceaux seront identifiés avec un microtatouage au niveau des doigts puis analysés par génotypage via un prélèvement d’un petit bout de queue. Durant cette phase, aucun animal n’aura de signe clinique, ils seront tous en parfaite santé. Aucun autre prélèvement ne sera réalisé sur ces animaux. Pour l’évaluation des médicaments, les animaux présenteront les signes de la SLA (déficit moteur progressif) et par conséquent seront suivis de manière étroite et rigoureuse afin d’évaluer de manière objective mais non invasive l’évolution de la maladie : - Observation quotidienne des signes cliniques - Evaluation des capacités motrices hebdomadaires (force et endurance musculaire) Les candidats médicaments seront administrés soit par voie oral soit par voie intraveineuse en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques qui seront déterminées. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Durant l’élevage, aucun animal ne développe de signes cliniques dommageables. En effet, le développement des signes cliniques est bloqué par un traitement antibiotique. Tous les animaux seront donc en parfaite santé. Durant la phase de test, les animaux présentent la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA après l’arrêt de l’antibiotique : - Perte de poids progressive des animaux - Mort progressive des cellules nerveuses et perte des liaisons nerveuses avec les muscles qui se traduit par des déficiences motrices (tremblements, perte de la coordination des mouvements, pattes postérieurs qui se recroquevillent), une perte de poids et une atrophie musculaire. La toxicité et la tolérance des candidats médicaments seront préalablement déterminées dans des études de tolérance et de pharmacologie. Dans ce projet, aucun effet indésirable n’est donc attendu. Lorsque le produit est administré par voie oral, aucune nuisance n’est attendue. Lorsque le produit est administré par voie intraveineuse, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine à l’aide de capillaire, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. La nuisance est uniquement liée à la piqûre lors d’injection de l’anesthésie par voie intrapéritonéale.
Devenir
A l'issue de la phase d’élevage : - Certains animaux seront utilisés comme reproducteurs pour maintenir la lignée. Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Certains animaux ne pouvant pas développer la maladie à cause de leur patrimoine génétique seront utilisé dans le groupe contrôle pour les tests d’efficacité (195 animaux). Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Les animaux développant les signes cliniques de la SLA seront utilisés pour les tests d’efficacité. A l'issue des tests d’efficacité, tous les animaux seront euthanasiés. Ils ne peuvent pas être réutilisés à cause de leur phénotype et l’issue fatale de la maladie.
Remplacement
Les candidats médicaments testés feront l’objet d’une sélection minutieuse avant leur utilisation. Les substances sont préalablement testées, caractérisées et auront fait la preuve de leur efficacité in vitro, avant d’être utilisé sur des animaux. Cependant, aucune étude vitro ou ex-vivo ne peut permettre de faire un lien entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. La SLA est une maladie multifactorielle complexe. Elle ne peut donc en aucun cas être réduite à une simple mutation ou à un simple mécanisme, le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Etudier, analyser les paramètres physiologiques tels que la réponse immunitaire, le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’évolution des biomarqueurs au cours de la maladie ou la correspondance avec les signes cliniques observés. •Valider l’effet thérapeutique sur le phénotype et en confirmer le mécanisme d’action chez l’animal vivant. •Mettre en perspective les effets moléculaires avec les signes cliniques observés et ainsi, comprendre les mécanismes conduisant à la maladie.
Réduction
La phase d’élevage va permettre la génération de souris qui développeront la SLA nécessaire à l’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux utilisé sera déterminé mathématiquement pour n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaire mais néanmoins suffisant pour des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les ou dans les laboratoires de recherche privés. Pour l’élevage, nous utiliserons la méthode proposée par les éleveurs agréés dans le but de déterminer de manière précise le nombre minimal nécessaire et suffisant de souris reproductrices à la conduite du projet et à la préservation de la lignée.
Raffinement
Pour l’élevage, les animaux seront hébergés en trio de reproducteurs. Dans cette procédure, aucun animal ne développe aucun signe dommageable car l’expression des signes cliniques est bloquée par un traitement antibiotique administré dans l’eau de boisson. Durant la phase de test d’efficacité, les animaux seront observés quotidiennement. Les observations cliniques seront évaluées selon un scoring strict et validé par un grand nombre de laboratoire. Afin de renforcer le suivi des signes cliniques, nous allons donc utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes : - Score basé sur l’observation clinique - Poids qui reflète l’évolution de la maladie - Evaluation de la force musculaire qui permettra de détecter les signes de faiblesse musculaire et de paralysie - Evaluation de la coordination des membres et des performances motrices Ces mesures permettent de garantir une évaluation précise de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et d’étayer les conclusions par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition du phénotype dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté la SLA présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des croquettes mouillées disposées sur le fond de la cage ainsi qu’une supplémentation en nourriture enrichie humide (complément alimentaire gélifié) sera apportée aux animaux pour faciliter la nutrition et l’hydratation.
Choix des espèces
Pour les maladies neurodégénératives, les signes cliniques dépendent essentiellement de la localisation des lésions (cerveau, moelle, …) et l’efficacité d’un médicament dépend de sa capacité à atteindre les lésions. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour évaluer l’efficacité d’un médicament notamment : -la capacité à accéder à la zone d’intérêt (comme franchir la barrière hémato-encéphalique pour accéder au cerveau) - son action au niveau moléculaire et son impact sur les signes cliniques observés. Le modèle animal de souris a été choisi à cause de ses similitudes avec la pathologie humaine : - Au niveau moléculaire : l’accumulation « toxique » d’une protéine humaine dans les neurones du cerveau et de la moelle qui représente, en clinique, 90% des cas de SLA - Signes cliniques: mort des cellules nerveuses de la moelle épinière et perte de la connexion musculaire qui a pour conséquence un déficit moteur progressif menant à la paralysie totale des muscles. Pour l’élevage, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’être en capacité de se reproduire. Pour les tests d’efficacité, nous cherchons à nous rapprocher au plus près du contexte physiopathologique de la maladie qui touche des adultes afin de pouvoir transposer nos résultats à l’Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés. En effet, d’après les études ayant permis le développement du modèle, les mâles et les femelles développent des signes cliniques comparables, ils peuvent donc tout deux être inclus dans des analyses groupées.
Prélèvement de nageoire pour génotypages de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
6000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit un poinçon d'un millimètre dans la nageoire caudale pour génotyper des lignées génétiquement modifiées, puis un isolement pouvant durer cinq jours chez cette espèce grégaire. Le porteur indique que le prélèvement peut provoquer douleur, infection ou déchirure et que certains poissons ne se réveillent pas de l'anesthésie, une partie des individus étant gardée vivante pour des projets ultérieurs et le reste tué. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces modèles pour l'étude du rôle des gènes.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir maintenir et reproduire nos lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés en réalisant des génotypages à partir de prélèvements de nageoires.
Bénéfices attendus
Les études qui pourront être menées à l'aide de ces différents modèles biologiques génétiquement modifiés permettront d'étudier l'implication des gènes délétés dans des processus physiologiques clefs, ainsi que les mécanismes de perturbations de ces processus par des substances chimiques. De plus, les modèles transgéniques permettent d'étudier certains processus physiologiques de manière non invasive au cours du temps (cinétiques), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations. Chaque étude fera l'objet de demandes spécifiques auprès du comité d'éthique dès que nécessaire.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de nageoire par poinçonnage de la nageoire caudale (poinçon d'un mm de diamètre). Le temps de réalisation du poiçon est de moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées pour pêcher le poisson peuvent représenter un stress pour l'animal (pêche du poisson à l'aide d'une épuisette et transfert dans un nouveau bac). Dans de rares cas, il peut arriver que les poissons ne se reveillent pas de leur anesthésie. Le trou laissé par le prélèvement de nageoire (1mm de diamètre) peut entrainer une douleur pour l'animal et dans de rares cas une perte d'ions des poissons, une infection localisée de la nageoire ou encore une déchirure de la nageoire caudale. La procédure de génotypage nécessite également l'isolement des poissons pendant maximum 5 jours, le temps de déterminer leur génotype, ce qui représente un stress pour cette espèce grégaire.
Devenir
Une partie des animaux génotypés sera gardée en vie pour être utilisés dans des procédures ultérieures faisant l'objet d'autres demandes d'autorisation de projet à venir.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode in vitro/in silico intégrant l'ensemble des interactions entre les organes et les processus de biotransformation des substances chimiques, nous permettant de remplacer ces modèles animaux. L'utilisation de ces modèles transgéniques/mutants est indispensable à l'étude du mode d'action des gènes. En effet, les mutations génétiques engendrent des modifications biologiques et physiologiques complexes qui ne peuvent être étudiées que sur des êtres vivants.
Réduction
Pour chaque souche (4 souches différentes), nous envisageons de réaliser les prélèvements de nageoires sur 1500 poissons en 5 ans, soit 300 par an, ce qui représente un échantillon aléatoire des animaux qui seront produits. Ce chiffre a été estimé au minimum afin de reproduire les lignées tout en gardant un effectif suffisamment conséquent pour maintenir une diversité génétique correcte.
Raffinement
Il est actuellement impossible de conserver ces lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés sans réaliser de génotypage. La méthodologie pour le prélèvement de nageoire a été nettement améliorée au laboratoire en réduisant considérablement la taille du prélèvement de nageoire. En effet, la plupart des publications présentent un prélèvement d'au moins un tiers de la nageoire caudale. Le raffinement de notre protocole nous permet actuellement de réaliser le génotypage sur des prélèvements de nageoire par poinçon d'un mm de diamètre. Les conditions d'anesthésie ont également été raffinées en entourant les aquariums d'anesthésie et de réveil par des décors reproduisant une végétation naturelle afin de permettre au maximum un isolement vis-à-vis des expérimentateurs. De plus, les conditions d'isolement ont été raffinées afin que les individus puissent conserver des échanges visuels et olfactifs avec leurs congénères. Enfin l'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale. En dehors des procédures, tout au long de leur vie, les poissons zèbres du laboratoire sont gardés dans des environnements connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Le poisson zèbre étant une espèce grégaire, ils sont hébergés en groupes afin d’éviter les comportements d’anxiété engendrés par l’isolement, tout en conservant des densités de population faibles évitant ainsi les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris pour partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux par le comportement de chasse.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées par l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE) dans différents tests réglementaires. Sa petite taille permet des manipulations aisées comparé à d’autres espèces de poissons. De plus, ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents et efficaces à la fois pour la détection des substances chimiques (incluant les perturbateurs endocriniens) tout en réduisant le nombre d'animaux et le coût des analyses, mais également pour la compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans des processus clefs tels que la reproduction ou le développement.
Rôle de protéines régulatrices du cytosquelette dans les plaquettes murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
3 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Les procédures expérimentales, courtes, se déroulent sous anesthésie générale et les souris sont tuées avant tout réveil pour prélever leurs organes, 1 228 relevant d'une souffrance sans réveil et 1 852 d'une souffrance déclarée légère liée à l'élevage et au génotypage. Le projet vise à comprendre le rôle de deux protéines du cytosquelette des plaquettes sanguines comme cibles thérapeutiques éventuelles. Le porteur indique que les plaquettes ne peuvent être mises en culture et affirme qu'il est "nécessaire" de disposer de plaquettes issues de sang frais, ce qui l'a conduit à générer deux lignées de souris.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont des cellules vitales par la formation d'un bouchon qui vient colmater les vaisseaux pour arrêter le sang de couler après une blessure. Dans des conditions pathologiques, de part leur implication prépondérante en hémostase, des déficites plaquettaires peuvent aboutir aussi bien dans des troubles hémorragiques (saignement) que thrombotiques (gros caillots). Le fonctionnement correcte dans la circulation des plaquettes nécessite une série de changements en interne de la cellule, le squelette de la plaquette (appelé cytosquelette). Des anomalies dans ces processus peuvent conduire à des défauts de fonctionnalité. Récemment, il a été montré que des défauts chez l'homme de ce squelette touchant certaines molécules des plaquettes avaient une répercussion sur la capacité du sang à coaguler. Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de deux protéines de ce squelette, présentes dans les plaquettes, et de finir si elles peuvent représenter de futures cibles thérapeutiques chez l'homme.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la formation et les fonctions plaquettaires, et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies hémorragiques et thrombotiques liés aux plaquettes sanguines.
Procédures
Toutes les procédures expérimentales se feront après une anesthésie générale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience. Quatre procédures expérimentales seront mises en place d'une durée courte: de 10 à 60 minutes maximun.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. Le projet ne comporte que des procédures expérimentales sans réveil sous anesthésie générale. Il n'y a donc pas de contraintes pour les animaux lors des procédures expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure (sans réveil). Des prélèvements d'organes post-mortem seront alors effectués.
Remplacement
Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur de la culture cellulaire. Ces modèles cellulaires sont essentiels pour orienter nos recherches mais ces lignées ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mise en culture car elle ne possèdent pas de noyau et peuvent donc pas se multiplier. Par ailleurs, hors d'un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang fraichement collecté. Nous avons alors généré deux modèles de souris pour comprendre le rôle de protéines multifonctionelles dans les plaquettes. Ces souris permettront d'étudier les plaquettes sanguines dans un organismes vivant, d'évaluer les interactions entre toutes les composants du sang et d'évaluer les risques de saignement ou d'occlusion thrombotique des vaisseaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire dans les procédures expérimentales est de 1228 pour deux lignées de souris différentes. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques (GPower3.1).
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d'hébergement de l'animalerie juste avant la procédure exprérimentale. Les souris sont anesthésiées et analgésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris aussi bien mâles que femelles, seront agées entre 3 semaines et 1 an.
Décrypter le rôle de la voie de la kynurénine dans la progression des mastocytoses systémiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.
Objectifs
Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.
Procédures
Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.
Impact sur les animaux
La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.
Devenir
La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.
Réduction
Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.
Caractérisation métabolique de la diète très appauvrie en sucres chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées privées de gènes clés du métabolisme sont créées, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés, à des tests de tolérance au glucose après jeûne et à une diète cétogène presque totalement dépourvue de sucres, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de mesurer les contributions respectives du foie et du rein dans la production des corps cétoniques, avec une visée translationnelle vers l'usage humain de la diète cétogène. Le porteur affirme que l'étude des délétions géniques tissu-spécifiques n'est faisable que sur des souris.
Objectifs
Le projet a pour objectif de déterminer les contributions relatives foie et des reins dans la production des corps cétoniques lors d’une administration d’une diète cétogène. Pour pouvoir déterminer les contributions des deux organes à la foi dans l’anabolisme (synthèse) des corps cétoniques (par les deux organes) et dans le catabolisme (utilisation) par le foie, les enzymes clé pour la synthèse (HMGCS2) et l’utilisation (OXCT1) des corps cétoniques seront deletée dans le foie ou les reins (OXCT1) et dans le rein (SCOT1) pour générer de lignées knock out tissues spécifiques. La génération des lignées de souris constitue le premier objectif du projet. Le deuxième objectif est d’étudies le métabolisme de ces lignées de souries pendant une diète contrôle, enrichie en gras et sucres et cétogène.
Bénéfices attendus
Le projet présenté vise à améliorer les connaissances scientifiques sur le métabolisme des corps cétoniques. Dans les humaines, la diète cétogène est utilisé dans des conditions cliniques particulières come approche nutritionnel reconnu (épilepsie) ou dans des études exploratoires (certains types de cancer, ou comme diète avant une chirurgie bariatrique). Notre projet pourra apporter des nouveaux acquis scientifiques utiles dans ce contexte translationnelle vers l’utilisation de la diète cétogène dans l’homme.
Procédures
L'intervention principale sur les animaux consistera dans des prélèvements sanguins et prélèvement de queue pour génotypage. La prise de la glycémie chaque deux semaines (7 fois pendant le protocole nutritionnel) sera faite à l'état vigil après 6 heures de jeûne. Une ponction de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) permettra de mesurer la glycémie au glucomètre. La tolérance au glucose sera évalué à 8 et 16 semaines (2 fois pendant le protocole nutritionnel) à l'état vigil après 6 heures de jeûne, suite à une injection intra-péritonéale de glucose 2mg/g du poids de la souris. Pour cela, des ponctions de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) seront effectués à l'extrémité de la queue aux temps 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes, afin de suivre la courbe de la glycémie et de l'insulinémie. L'incision de la queue sera réalisée au temps t0, puis les prélèvements suivants seront effectués par simple grattage du caillot sanguin. Lors des prélèvements d'un fragment minime de queue pour le génotypage l’utilisation d’une crème anesthésiante à la lidocaïne sera envisagée afin de minimiser toute douleur et/ou souffrance associée au prélèvement.
Impact sur les animaux
Par rapport aux données de la littérature sur les souris sauvages (wild-type), les protocoles d’alimentation cétogène présentés dans ce projet ne devraient pas être susceptibles de générer des effets indésirables. Néanmoins, si l’administration de la diète cétogène (presque totalement dépourvue en sucres) devrait générer de la souffrance (inappétence, perte de poids, troubles comportementales), notamment dans les lignées transgéniques, le protocole sera terminé et les souris retournées à la diète standard avant mise à mort. La génération de souris transgéniques pourrait aussi engendrer un phénotype dommageable. Celui-ci pourrait consister dans des effets sur les paramètres métaboliques qui pourraient être manifestes à la naissance tels que hypo or hyperglycémie ou cétoacidose. Pour déceler ces événements, si les nouveaux nés montreront des signes de souffrance, la glycémie et cétonemie seront mesurées avec le kit Nova pro glu/ket qui mesure la glycémie et cétonemie de façon simultanée. Si avérées, ces évènements mèneront à l’arrêt de la génération de la ligne transgénique.
Devenir
Les protocoles se termineront avec une prise de sang retroorbitale (après anesthesie), et mise a mort par dislocation cervicale pour pouvor recuperer differents organes et tissues. La necessité de faire les analyses biochimiques justifie la mise à mort et recuperation de ces tissus et organes.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l’analyse des effets des diètes au niveau de l’organisme et, d’un point de vue mécanistique, l’étude des Knock-outs tissue-spécifiques pour les gènes Oxct-1 et HMGCS2 ne peut être faisable que sur des souris.
Réduction
Notre stratégie de réduction, tout en restant dans de limites imposée par la nécessité d’obtenir une puissance statistique satisfaisant, nous permet d’avancer une demande d’utilisation de 256 souris au maximal.
Raffinement
Dans ce projet nous essayerons de raffiner et optimiser les procédures expérimentation pour réduire au maximum l’inconfort et les stress subie par les animaux. En plus, les protocoles ont été prévus de façon d’obtenir le plus d’informations possible de chaque animal en imposant, en même temps, le "moindre coût" en terme de mal être des animaux. Le raffinement dans le protocole expérimentale s’applique tout au long de la vie des animaux, et en particulier pendant la durée des protocoles nutritionnels. Pour satisfaire les conditions de raffinement, nous planifierons les protocoles de façon à éviter des perturbations susceptibles de procurer le stress de l’animal. De plus, les recours à l’anesthésie/analgésie est prévu pour les prises de sang et nous utiliserons des procédures d’euthanasie appropriées (dislocation cervicale) et sous anesthésie. Ces procédures de raffinements nous permettront aussi de générer des résultats de meilleure qualité et d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de l’expérimentation.
Choix des espèces
Comme notre projet est à l’interface entre le métabolisme et la signalisation cellulaire, le recours au model murin nous permettra i) dans les études nutritionnelles sur les souris wild-type d’obtenir des données nouvelles et originales dans le contexte de la grande quantité de littérature décrivant les effets d’une diète obésogène sur les souris et ii) en ce que concerne les études mécanistiques en utilisant les modèles KO, tissue-spécifiques, d'éclaircir les métabolisme des corps cétoniques et des effets bénéfiques potentielles de la diète cétogène. L’intervention nutritionnelle (diète contrôle, hypercalorique, cétogène) débutera chez des souris âgées de 5 semaines et se poursuivra pendant 16 semaines consécutives. Il est important que le protocole nutritionnel débute peu de temps après le sevrage pour maximiser les effets métaboliques. La présence de troubles métaboliques (hyperglycémie, intolérance au glucose …) chez la souris sous diète hypercalorique/hyperglycémique après 8 semaines de régime est connue, permettant de valider les potentiels effets bénéfiques d'une diète cétogène administée après les 8 semaines de diète hypercalorique/hyperglycémique. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 21 semaines.
Prélèvements et injections sur des modèles AGA dans un contexte de génotypage, caractérisation moléculaire et phénotypage in-vivo dans un élevage.
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rats : 696
80 905 animaux non-humains, 80 209 souris et 696 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant surtout un niveau de souffrance léger, avec 10 102 cas modérés et 12 sévères. Ils subissent des biopsies de la queue, des injections et des prélèvements de sang pour génotyper et caractériser des lignées génétiquement modifiées, une partie étant tuée pour prélever des tissus ou faute de porter la modification recherchée. Le porteur indique que les animaux d'intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs, et que d'autres sont utilisés pour former le personnel. Il présente le recours à un organisme entier comme difficilement substituable et signale que la suppression de certains gènes provoque des phénotypes sévères, jusqu'à une mort précoce.
Objectifs
Réalisation de prélèvements et injections sur les animaux génétiquement modifiés dans le but de les caractériser, les valider et de réaliser leur production afin de livrer de slots expérimentaux aux aires thérapeutiques (Immuno-Oncologie, Immuno-Inflammation, Maladies Neurologiques Rares, Unité de médecine génétique). La validation du modèle consiste à vérifier la présence de la modification génétique et la caractérisation permet d'une part de vérifier qu’elle soit fonctionnelle puis d’autre part d’en mesurer l’impact sur la santé de l’animal. Ces techniques sont réalisées par du personnel formé et qualifié et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : valider, caractériser et vérifier la présence/absence de la modification génétique avant et pendant la production et l’utilisation des animaux présentant un intérêt pour les indications cliniques des aires thérapeutiques. Les unités de recherche ont au préalable déterminé en relation avec le département de biostatistiques le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre leurs objectifs scientifiques. Avantages à long terme : les animaux génétiquement modifiés utilisés dans ce projet permettront l’avancée dans la compréhension de la physiopathologie de certaines maladies, améliorer le diagnostic et tester des molécules pour traiter les patients. Les connaissances scientifiques obtenues feront l’objet de publications dans un délai de 2 à 5 ans et le bénéfice sur les patients est attendu par le biais des études cliniques dans un délai de 5 à 10 ans.
Procédures
- Biopsie de queue : de 2mm maximum réalisée entre 10 et 21 jours d’âge - Injection unique ou répétée (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse - Administration de Doxycycline dans l’eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum (contrainte liée à l’inappétence du produit) - prélévement de sang sur 14 jours (suivi glycémique) via la veine submandibulaire (contrainte de courte durée). Pour avoir des naissances ou des embryons à une date/stade précis, des injections d’hormones sont réalisées (contention, injection).
Impact sur les animaux
Stress ou douleur légère de courte durée liée à la biopsie de queue .Stress ou douleur légère de courte durée liée aux injections unique ou répétées (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse . Inconfort lié à l'inappétence du produit dans l'eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum -Stress ou douleur légère de courte durée liée au prélèvement sanguin. La suppression de la protéine A peut entrainer un phénotype dommageable dont la gravité pourra potentiellement aboutir à un phénotype sévère, tel qu’une encephalomyopathie incluant retard de croissance, léthargie, perte des fonctions motrices, ataxie à évolution progressive entrainant la mort à ~7 semaines d’âge. La suppression de la protéine B entraine un phénotype dommageable de gravité modérée se traduisant par un stress accru, une diminution de la fertilité, une mortalité avant sevrage de 10% .
Devenir
Les animaux d’intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs pour être intégrés dans des projets de recherche en utilisation continue. Par ailleurs, certains animaux seront euthanasiés soit pour permettre le prélèvement de tissus nécessaire à la caractérisation du modèle, soit parce qu’ils ne présentent pas la modification génétique d’intérêt, ou ayant atteint un point limite. Enfin, certains animaux seront réutilisés pour la formation du personnel manipulant des animaux.
Remplacement
La validation, la caractérisation et la production de rongeurs répondent aux besoins de certains projets scientifiques de disposer d'animaux homogènes en poids et en âge selon des critères génétiques définis et en nombre suffisant. Les modèles génétiquement modifiés permettent de reproduire le contexte physiologique d’un organisme entier, cette étape est difficilement substituable puisque seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Chaque fois que des méthodes in silico ou méthodes in vitro (cultures de cellules, organoïdes…) suffisent à couvrir les besoins des chercheurs celles-ci sont privilégiées sans recours ultérieur à l'animal.
Réduction
La caractérisation moléculaire et l’immunophénotypage visent à déterminer la viabilité du modèle selon la cible analysée. Ce phénotypage est réalisé en amont de l’élevage afin de réduire la production inutile d’animaux en cas d’obsolescence du modèle. Le nombre d’animaux produit est optimisé par les pratiques d’élevage et le relevé d’indicateurs de production propres à chaque souche. Les objectifs de production sont réévalués régulièrement (maximum tous les 6 mois) avec les utilisateurs, et ajustés chaque fois que nécessaire. Les demandes sont calculées sur la base des évaluations statistiques propres à chaque projet utilisateur, afin de limiter le nombre d’animaux produits aux stricts besoins des procédures en place dans chaque projet de recherche, selon les justifications statistiques de chaque test.
Raffinement
Les conditions d’utilisation des animaux sont conformes à toutes les législations en vigueur, encadrées par des procédures et mises en place sur la base des meilleurs standards internationaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, un enrichissement est placé dans les cages (cellulose de nidification, dômes en carton) et un enrichissement sonore est présent dans chaque pièce d’hébergement afin de couvrir les sons liés au travail zootechnique. L’observation des animaux est faite quotidiennement par du personnel formé et compétent. Le responsable de l’étude est informé de toute anomalie, de même que le vétérinaire désigné si des signes cliniques sont relevés. Chaque observation est consignée, permettant ainsi de suivre le bien-être de l’animal et d’ajuster au besoin les conditions environnementales. Dans le cas où la modification génétique altère le bien-être de l'animal nous mettons en place les mesures nécessaires pour y remédier (environnement, nourriture à disposition dans les cages, critères d’arrêt spécifiques) et une surveillance quotidienne des animaux par du personnel formé et compétent. Les biopsies sont réalisées à la queue et font au maximum 2mm sur des animauxde 10 à 21 jours( absence d'innervation et de ossification à cet âge) afin de limiter l'impact de ce geste. Cette intervention ne concerne que les animaux dont le schéma d’accouplement ne permet pas 100% d'animaux porteurs de la modification génétique d'interêt. Dans le cas contraire, seuls les géniteurs sont biopsiés afin de garantir le génotype de la descendance sans avoir recours à la biopsie. Une seconde biopsie est réalisée si et seulement si les résultats de génotypage ne sont pas concluants.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des modèles pharmacologiques de choix pour les études scientifiques. En effet, leur génome facilement modifiable et à 90% similaire à celui de l’homme permet d’utiliser ce modèle pour mimer les pathologies humaines afin d’en comprendre l’origine et de tester des molécules dans les phases préliminaires de recherche. De plus, sa rapidité de production et d’hébergement permettent de réaliser des modèles en un temps et un espace restreint. Les animaux commandés sont le plus souvent des adultes (jeunes ou matures), permettant de garantir la pleine expression physiologique des cibles thérapeutiques visées. Le génotypage est effectué sur des animaux âgés de 10 à 21 jours afin de sélectionner les animaux d’intérêts aux études et aux renouvellements de géniteurs. Le phénotypage est effectué généralement sur des animaux âgés de 3 à 10 semaines. Des animaux plus âgés peuvent être également phénotypés dans le cadre d’études de vieillissement. Les animaux sont expédiés généralement entre 5 et 8 semaines d’âge selon les besoins des chercheurs.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.
Elevage avec Identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3000
72 000 souris et 3 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les animaux dont le génotype ne présente pas d'intérêt étant tués et les autres gardés en vie pour d'autres protocoles. Nouveau-nés ou adultes maintenus en contention, ils reçoivent un tatouage puis une biopsie de la queue ou de l'oreille pour identification et génotypage. Le porteur décrit une douleur légère et brève, avec dans de rares cas une hémorragie à la queue ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Il affirme que les prélèvements non invasifs par écouvillon salivaire ou follicule pileux ne permettent pas un génotypage fiable avant sevrage, ce qui justifierait ces biopsies.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans l'Etablissement Utilisateur(EU) pour répondre aux besoins des chercheurs des deux instituts de Neurosciences. Les 23 équipes emploient une centaine de lignées qui sont couvertes en expérimentation par actuellement 88 autorisations de projets. Pour ce faire, sur les nouveau-nés, deux gestes techniques invasifs sont réalisés succéssivement: un tatouage digital selon un code de numérotion enregistré dans les procédures de l'EU suivi d'une biopsie de queue et sur les animaux adultes seul le prélèvement de la biopsie d'oreille est réalisé. Ces procédures sont réalisées sur animal vigile agé de 6 à 12 jours pour les nouveau-nés et sur animal adulte. Cette identification et génotypage se justifient par la nécessité de: -sélectionner les animaux d'intérêt pour l'expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projets si des procédures le justifient -sélectionner et vérifier le génotype des géniteurs permettant l'amplification et l'entretien des colonies -sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d'organes ou des tissus pour des études ex-vivo hors champ d'application. Les animaux dont le génotype n'est pas d'intérêt pour les expérimentations déclarées, les activités d'élevage, la formation ou les prélèvements seront mis à mort selon une méthode réglementaire.
Bénéfices attendus
La procédure d'identification et de génotypage est nécessaire pour la sélection des animaux d'intéret dans les projets de recherche. L'identification par tatouage permet: -d'identifier individuelement ou par lot les animaux -de manière permanente sur le long terme -de ne pas mutilier les animaux sur leurs pattes pour garder une motricité fine -d'éviter un recours à l'anesthésie. Le génotypage par biopsie de l'extrémité de la queue ou d'oreille permet: -l'obtention de resultats fiables grâce à une quantité et une qualité du matériel génétique obtenu pour réaction d'amplication d'ADN -de minimiser les risques de contaminations entre échantillons grâce aux procédures de prélèvement compatible avec les contraintes sanitaires nécessaire au maintien du statut EOOPS (Exempt d'opportunistes et d'organismes pathogènes spécifiques) ciblé -d'éviter le recours à l'anesthésie
Procédures
Tatouage et prélèvement de biopsie de queues sur animal nouveau-né vigile ou d'oreille sur animal adulte vigile: un seul prelevement /animal et la procédure dure de 2 à 3min/animal
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés provoquent une douleur légère et de court durée. L'animal est maintenu en contention pendant les actes ce qui est une source de stress qui sera minimisé par l'expérience des expérimentateurs. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir: -une légère hémorragie à la queue -le rejet du nouveau-né par la mère
Devenir
Une mise à mort des animaux est réalisée si leur génotype n'est pas d'intérêt ou gardé en vie pour une utilisation continue couverte par les autorisations de projets.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base d'écouvillons salivaires ou de follicules pileux ne permettent pas de procéder au génotypage de façon fiable en prenant en compte les techniques de génotypage robotisées, des procédures de prélèvements en condition stérile et la nécessité d'obtenir des résultats avant sevrage pour la gestion des élevages et la production des animaux expérimentaux. Un doute sur les résultats de génotypage conduirait à la nécessité de procéder à un nouveau prélèvement sur des animaux plus âgés et donc plus sensibles à la douleur. Chaque erreur qui conduirait à l'accouplement d'animaux n'ayant pas les caractéristiques attendues engendrerait: -une augmentation du nombre d'animaux produits inutilement -la naissance d'animaux avec des phénotypes potentiellement délétères -l'utilisation d'animaux génétiquement sans interet dans des projets expérimentaux induisant des résultats érronés et non exploitables
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Les plans d'élevage mis en place en concertation avec le porteur de projet visent à réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux à identifier et génotyper. Dans la mesure du possible, nous favorisons l'utilisation des animaux au génotype non d'intéret dans d'autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d'animaux produits par l'EU. Nous pouvons également utiliser ces animaux comme congénère de compagnie pour éviter les animaux isolés.
Raffinement
Les actes d'identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maitrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et prélèvements de biopsies sont réalisés avec du matériel et des instruments stériles et appropriés permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d'aseptie établies dans l'EU. La procédure est réalisée sous PSM et est limitée dans le temps (2-3min/animal) pour limiter le temps de séparation des nouveaux-nés de leur mère et la contention des animaux. Une mise à mort est décidée si la queue de l'animal présente un saignement non maitrisé dans l'heure suivant la réalisation de la biopsie sinon il est réalisé à reception des résultats de génotypage ou à P14 si les animaux nés ne seront pas utilisés.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme ce qui permet une extrapolation des résultats à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire ou comportementale. Le rat est lui couramment utilisée dans des études de comportement et de neurogénèse adulte ce qui a permis de constituer des bases de données importantes pour guider la conception des protocoles expérimentaux et d'obtenir une bonne réplicabilité des expériences. Que soit la souris ou le rat, ces espèces de rongeurs sont des espèces qui permettent une obtention aisée de modèles génétiquement altérés par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies neurologiques bien caractérisés. Pour la grande majorité, les animaux sont identifiés entre 6 et 12 jours post natal. A cet age les animaux sont aisément manipulable, le cartilage est souple et les groupes sociaux sont stables. Toutes fois, certaines procedures exigent un génotypage précoce entre la naissance et 5 jours : ces stades de développement sont ceux où les cellules expriment le mieux leur potentiel de différenciation et de survie en culture; cultures primaires de neurones hippocampiques et cultures organotypiques de tranches de cerveaux sur nouveaux nés. Pour les animaux adultes qui sont les géniteurs lors de l'introduction d'une lignée ou bien des vérifications sur animal adulte demandées par le chercheur, c'est un autre prélèvement qui est utilisé pour le génotypage: biopsie d'oreille.
Impact du diabète maternel sur la fonction cardiaque
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
6 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Un diabète est induit chez les mères par injection sous-cutanée, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la queue pendant la gestation, échographie des descendants sous anesthésie sans réveil puis mise à mort pour prélever les cœurs. Le porteur indique qu'aucun analgésique ni anesthésiant ne peut être administré pendant la gestation car ces molécules perturbent le développement cardiaque, et classe en souffrance sévère les douleurs liées au diabète maternel et à la cardiopathie des descendants. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier une surcharge en glucose sur le cœur en développement et conclut à la nécessité d'un modèle animal.
Objectifs
Le diabète maternel augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. Cependant, les mécanismes par lesquels le glucose maternel perturbe le développement cardiaque reste encore largement méconnu. Le but de notre travail est d'acquérir une meilleure compréhension des cardiopathies induites par le diabète en utilisant des souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.
Bénéfices attendus
La connaissance des mécanismes impliqués dans les cardiopathies induites par le diabète permettra de mieux prédire les risques afin de personnaliser la prévention et d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées. De plus, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant aux cardiopathies.
Procédures
L’élevage de souris génétiquement modifiées nécessite de vérifier la présence ou absence de la modification génétique qui est effectuée grâce à une biopsie au niveau de la queue. L’induction du diabète est conditionnelle et inductible. Elle est obtenue via une seule injection sous cutanée d’un composé chimique particulier, qui n’induit pas de toxicité au stade où il est administré. Dans cette étude, nous ne pouvons pas administrer d’analgésiants ni d’anesthésiants, car ces molécules ont un impact sur le développement cardiaque. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie chez les mères diabétiques, sont limités à un volume de 10 microlitres par animal et réalisés au niveau de la queue, une fois par semaine pendant la durée de la gestation. Les descendants issus de mères diabétiques ou non diabétiques seront échographiés sous anesthésie. Après l’échographie, les souris seront mises à mort afin de prélever les cœurs.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables causées durant les actes expérimentaux sont : 1) des nuisances légères. Tous les animaux issus des croisements sont marqués à l’aide d’une bague d’oreille à 3 semaines de vie. Dès le 7ème jour après l’induction de diabète chez les femelles, le taux de glucose sanguon sera mesurée 1 fois par semaine pendant la durée de la gestation jusqu’au sevrage de la deuxième portée. 2) des nuisances sévères : douleurs liées à 2 types de maladies : diabète maternel et cardiopathie des descendants.
Devenir
Les croisements seront arrêtés lorsque les objectifs du projet seront atteints. Les mères diabétiques et non-diabétiques et les pères prédisposés aux maladies cardiaques seront mis à morts selon la réglementation : les femelles après le sevrage des descendants, et les mâles à l’âge de 7 à 8 mois. Les descendants seront mis à mort selon la réglementation afin de prélever le cœur et de réaliser toutes les analyses moléculaires. L’échographie sera menée intégralement sous anesthésie générale au terme duquel les souris ne reprendront pas conscience. Après échographie, les souris seront mises à mort selon la règlementation afin de prélever les cœurs pour des analyses d’histologie. Les souris n’ayant pas le génotype désirable seront mises à mort selon la réglementation. Les souris ayant le génotype désirable seront gardées et transférées en zone d’expérimentation à l’âge de 8 semaines.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur. Nous ne pouvons pas expérimenter chez l'être humain les maladies cardiaques liées à une dérégulation du métabolisme du glucose. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle d'étude de la pathologie. Nous mettrons en croisement deux lignées de souris génétiquement modifiées pour générer un modèle unique permettant une surcharge en glucose chez des femelles susceptibles de donner naissance à des individus prédisposés génétiquement à développer une malformation cardiaque congénitale.
Réduction
Pour la première procédure, le nombre d’animaux utilisé par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour le maintien des différentes lignées et pour générer un nombre suffisant de souris afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. L’effectif n requis est basé sur notre expérience, nos statistiques effectuées précédemment ainsi qu’une vérification réalisée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Pour la deuxième procédure, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à un logiciel d’analyse statistique afin d’obtenir des résultats significatifs. Pour la troisième procédure qui concerne l’élevage d’animaux génétiquement modifié, le nombre d’animaux a été fixé selon les recommandations européennes en lien avec la création de lignée.
Raffinement
Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Nous suivrons les descendants issus de mères diabétiques afin d'identifier le plus précocement possible l'apparition de phénotypes délétères (anomalies cardiaques congénitales). Ces cardiopathies sont détectables par échographie, une procédure classée sans réveil. Il est possible d’observer directement certains indices physiologiques de détresses liés à ces cardiopathies. L’accélération du rythme respiratoire, cyanose et perte de poids sont des signes communs de ces états qui peuvent facilement être observés. Si ces signes d’inconfort anormalement élevés étaient observés, l’étude serait limitée à l’analyse cardiaque des nouveau-nés faisant l’objet d’une DAP précédemment autorisée. Nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection (rougeurs, saignements, suintements).
Choix des espèces
Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par un diabète maternel. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes cardiaques chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Nous utiliserons des mères reproductrices âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques. Les souris issues de mères diabétiques et de pères susceptibles de transmettre une malformation cardiaque seront analysés à l’âge de 3 mois par échocardiographie. L’identification des souriceaux se fera après le sevrage (vers l’âge de 21 à 28 jours) et les souriceaux ayant le génotype désirable seront utilisés jusqu’à l’âge de 6 à 8 mois.
Génotypage invasif des lignées transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
100 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées et environ 5 000 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un fragment d'oreille ou de queue pour établir son génotype dans le cadre de la gestion d'un élevage de lignées génétiquement modifiées. Le porteur décrit une douleur "légère et très passagère" et affirme qu'une anesthésie serait plus stressante que le geste lui-même. Il indique qu'au moins la moitié des souris n'ont pas le génotype recherché et sont mises à mort, l'objet de l'élevage étant de produire les animaux destinés à l'expérimentation.
Objectifs
L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Bénéfices attendus
Nécessité d'une caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Procédures
prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui-même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)
Impact sur les animaux
Aucune nuisance supplémentaire n'est attendue par rapport à des techniques de marquage et génotypage non-invasives, c'est à dire une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement de la biopsie
Devenir
Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.
Remplacement
Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive caudale ou auriculaire, n’ont pas été retenues.
Réduction
L'animalerie élève de nombreuses lignées transgéniques au phénotype non dommageable pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype (estimé à 5000 animaux sur 5 ans).
Raffinement
Les méthodes de prélèvement (biopsie auriculaire ou caudale) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage digital avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie auriculaire prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 15 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. La mise en place d’un anesthésique et/ou analgésique serait plus stressante que le geste lui-même. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec l'utilisateur et sur la base de point-limites pré-établis. Si l'utilisateur n'est pas joignable, la décision est prise par le soigneur, avec le vétérinaire si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. La majorité des animaux est utilisée au sevrage (entre 20 et 30 jours après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sevrage, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps. 5 à 10% des animaux sont utilisés avant sevrage lorsqu'un génotypage précoce est nécessaire.
Génotypage des souris transgéniques réalisées à partir d’une biopsie de tissu lors de l’identification de l’animal.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
10 000 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 8 000 tuées à l'issue faute du bon génotype, 2 000 conservées pour l'élevage. Une biopsie de la queue à quinze jours ou du pavillon de l'oreille à l'âge adulte, inférieure à un millimètre, est réalisée en même temps que l'identification par tatouage ou bague, pour analyser leur ADN. Le porteur reconnaît que la queue remplit de nombreuses fonctions et que son atteinte "entretient un handicap", et que la bague peut être arrachée ou l'oreille mutilée lors de bagarres. Ce prélèvement remplace la section de phalanges pratiquée jusque-là dans l'établissement.
Objectifs
L’établissement est une animalerie d’élevage de souris génétiquement modifiées nécessitant la détermination de la constitution génétique de chaque individu par une amplification précise de séquences d’ADN (génotypage par PCR), qui est généralement réalisée en même temps que leur identification. L’objectif de ce projet est d’utiliser un prélèvement (biopsie) de queue ou du pavillon d’oreille pour obtenir un morceau de tissu de souris transgéniques afin d’effectuer une analyse d’ADN et sélectionner les animaux avec les bonnes séquences d’ADN. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Ce projet ne concerne que les animaux n’ayant pas de caractère qui altère gravement l’état général de l’animal (phénotype dommageable). Le prélèvement de tissu au niveau de la queue/oreille est considéré comme moins invasive que la coupe des phalanges distales, méthode utilisée jusqu’à présent dans l’établissement. La biopsie sera effectuée en même temps que l’identification des animaux, par tatouage à l’aide d’encre appliquée en intradermique ou par la pose d’une bague numérotée à l’oreille (à lâge adulte uniquement). Ce projet sera mis en place dans l’établissement, suite à l’arrêt de l’identification des animaux par phalangectomie. Il ne concerne pas les lignées à phénotype dommageable, la création de nouvelle lignée et les animaux qui ont été inclus dans une procédure d’élevage dans un projet. Pour les nouveaux projets, tous les animaux transgéniques qui devront être identifiés par une biopsie invasive couplée à une identification seront inclus dans une demande de projet impliquant ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la réalisation du génotypage, couplé à l’identification des souris transgéniques à phénotype non dommageable en élevage dans l’EU, dès l’arrêt de la phalangectomie. Le projet est limité à une durée de 1 an ce qui permettra la mise en place d’une technique de prélèvement de tissu de préférence non invasive.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 15 jours, réalisé en même temps que leur identification par tatouage. Si le prélèvement de tissu doit être réalisé à l’âge adulte, il sera réalisé sur le bord du pavillon de l’oreille dans une partie souple, non cartilagineuse de l’oreille ; dans ce cas, il sera réalisé en même temps que l’identification de l’animal par tatouage ou par la pose d’une bague à l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes et l’identification des animaux par tatouage ou pose d’une bague à l’oreille nécessite moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de la souris, et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. La queue de la souris a de nombreuses fonctions (régulateur de température, balancier, organe sensitif du toucher…) et son absence entretient un handicap pour les souris. C’est un élément de l’anatomie de la souris sensible, qui contient des os, du cartilage, des vaisseaux sanguins et des nerfs. La coupe de la queue après 28 jours d’âge occasionne un inconfort prolongé en raison de la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation qui est présent à cet âge. Ainsi, à l’âge de 15 jours, une biopsie de moins de 1 mm peut être envisagée sans induire d’effets indésirables importants pour l’animal. Cet âge est choisi car il est compatible avec une identification précoce des souris par tatouage. A l’âge adulte, le prélèvement au niveau du pavillon de l’oreille sera privilégié et toujours limitée à 1mm pour limiter les nuisances. Cette zone est fibro-cartilagineuse et tapissée d’une fine couche de peau. L’incision sera réalisée dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort d’au poids de la bague. En cas de bagarre entre congénères, la bague peut être arrachée ou l’oreille mutilée.
Devenir
Les animaux dont les séquences d’ADN ne sont pas celles attendues seront mis à mort ; les autres animaux d’intérêt seront conservés pour maintenir l’élevage des lignées de souris transgéniques.
Remplacement
L’utilisation de souris transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.
Réduction
Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 souris maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées pour la recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme ou d’embryons. Il est important de noter que le croisement de lignées transgéniques entraine la production d’animaux de mauvais génotype, c’est-à-dire dont les séquences d’ADN ne correspondent pas à celles ciblées. Certains de ces animaux (mais ne représentant qu’un faible pourcentage) pourront être utilisés pour de la formation aux gestes techniques ou comme animaux « contrôles » d’expérience.
Raffinement
Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille sera privilégié, et réalisé si possible sous anesthésie gazeuse. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Le tatouage à l’encre par injection intradermique n’entraine pas de nuisance. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque la validation des séquences d’ADN par PCR sera obtenue et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.
Choix des espèces
La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et l’établissement est un plateau de conservation et d’élevage de différents modèles de souris transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. Le prélèvement caudal sera réalisé à l’âge de 15 jours afin de limiter les nuisances. Le prélèvement effectué sur le pavillon l’oreille sera réalisé à 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifiée à cet âge.
Approches génétiques pour la régénération de la moelle épinière chez le poisson zèbre
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
22 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 6 300 d'entre eux et sévère pour 15 950. On leur sectionne la moelle épinière, ce qui les paralyse, on pratique des microinjections, des ablations de populations cellulaires et des tests de nage, avec une mortalité d'environ 10 % après la chirurgie. Le porteur exploite la capacité de régénération spontanée du poisson zèbre pour comprendre, à terme, comment stimuler la réparation médullaire chez les mammifères, bénéfice renvoyé à l'avenir. Il affirme que la lésion médullaire implique "l'animal entier" et ne peut être reproduite en culture.
Objectifs
Chez l’homme, la section de la moelle épinière est actuellement irréversible, perturbant les mouvements et de nombreuses fonctions physiologiques. Chaque année, dans le monde, entre 250 000 et 500 000 personnes subissent une lésion médullaire, nécessitant des interventions thérapeutiques, chirurgicales et de réadaptation. Les lésions de la moelle épinière peuvent être causées par des traumatismes (accidents de voiture, chutes, violences), des maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique) ou par des cancers. Après une coupure de la moelle épinière, les axones endommagés ne repoussent pas vers les motoneurones périphériques. Si cette lésion est partielle (certaines connexions restent intactes), des interventions chirurgicales, des mesures de soutien et de réadaptation permettent de diminuer la mortalité et d’améliorer les capacités motrices de certains patients. Pourtant, de nombreux déficits sont durables et la moitié des personnes touchées restent paralysées et handicapées à vie. Il est désormais admis que la voie vers une guérison efficace des lésions médullaires nécessite une combinaison d'approches biologiques et d'ingénierie. Ces approches doivent être guidées par une compréhension plus approfondie de la capacité de régénération innée de la moelle épinière de certaines espèces. Contrairement aux humains et aux mammifères adultes, le poisson zèbre possède une capacité étonnante à se régénérer et à nager de nouveau après avoir été paralysé. Ce processus de régénération implique l'activation des cellules mères qui prolifèrent et génèrent de nouveaux neurones rétablissant les connections neurales endommagés. Ce projet vise à explorer le processus de régénération observé chez le poisson zèbre pour répondre aux questions suivantes : Quels sont les facteurs et mécanismes permettant la régénération innée de la moelle épinière ? Comment ces mécanismes sont-ils régulés ? Est-il possible d'améliorer la régénération chez les mammifères adultes par le rétablissement de programmes pro-régénératifs innés ? Comprendre ces signaux de régénération nous aidera à étudier les possibilités de stimuler la régénération tissulaire des structures du système nerveux central chez les mammifères adultes.
Bénéfices attendus
Les informations et les réactifs développés ici seront précieux à plusieurs égards : i) nous contribuerons à la compréhension des mécanismes innée de régénération de la moelle épinière, en exploitant la valeur du poisson zèbre comme système modèle; ii) nos travaux permettront de comprendre comment et pourquoi la régénération a évolué en tant que mécanisme naturel chez certains vertébrés et s'est perdue chez les mammifères; iii) ce projet révélera de nouveaux gènes capables de stimuler une réponse régénérative, à utiliser comme cibles thérapeutiques pour la régénération de la moelle épinière lésés chez les mammifères; iv) en raison de leur pertinence dans le contexte d'une maladie dévastatrice, actuellement incurable, les résultats obtenus avec ces expériences résonnent auprès d'un large public. Ils ouvriront la voie à des collaborations avec des groupes étudiant la régénération de la moelle épinière chez les mammifères, en France et à l'étranger.
Procédures
1. Microinjections; 3-5 sec. 2. Lésion de la moelle épinière : 3-5 min anesthésie, 30-40 sec chirurgie. 3. Essai comportemental de nage : Le temps est défini par la capacité du poisson à nager contre l'augmentation des courants d'eau. 4. Application de protéines recombinantes: 3-5 min anesthésie, 2 min chirurgie. 5. Traçage d’axones : 3-5 min anesthésie, 2 min chirurgie pour l'application du traceur. 6. Analyse de la prolifération : 3-5 min anesthésie, 30 sec pour injection. 7. Traçage de cellules : 3-5 min anesthésie, 30 sec injection ou incubation pendant 18h. 8. Ablation de sous-populations cellulaires : 3-5 min anesthésie, traitement de l'agent d'ablation pour incubation pendant 18h. 9. Imagerie in vivo de la moelle épinière chez les larve : les larves sont soumises à une anesthésie constante et elles sont imagées pendant 18h maximum.
Impact sur les animaux
La lésion de la moelle épinière chez le poisson zèbre est une technique bien établie et robuste. Son effet majeur est la paralysie, soit la perte de la fonction motrice, ainsi que la perte de sensation. Dans nos expériences, les lésions de la moelle épinière sont pratiquées dans la région thoracique et n'affectent donc que la partie inférieure du corps du poisson (partie caudale). Après chirurgie, les poissons présentent une mobilité réduite, bien qu'ils puissent se déplacer avec la partie rostrale de leur corps et puissent se nourrir par eux-mêmes. Parfois ils maigrissent après la procédure. La mortalité observée est de ~ 10% des poissons subissant une intervention chirurgicale coupant complètement la moelle épinière. Pour la majorité des adultes, dès une semaine après la lésion, les poissons sont capables de recommencer à bouger. À 6 semaines après la lésion, les adultes nagent comme s’ils n'avaient jamais été blessés auparavant. Ce processus de régénération est encore plus rapide chez les larves, qui peuvent à nouveau nager dès quatre à six jours après la lésion. L'implantation de mousse de gel en soi ne pose aucun dommage majeur. Cependant, additionnée à de la biocytine, celle-ci nécessite une seconde section médullaire et s'accompagne de toutes les conséquences décrites ci-dessus pour la section médullaire. L'ablation des populations cellulaires pourrait entraîner des anomalies dans la capacité de régénération et/ou dans le comportement et la santé générale des poissons soumis à la procédure. Pourtant, les populations de cellules que nous allons ablater sont spécifiques à la moelle épinière et n'apparaissent que de manière transitoire après une blessure, nous ne nous attendons donc pas à des dommages majeurs en dehors du tissu que nous étudions. Chez le poissons-zèbre les nuisances engendrées lors de l’établissement des transgénique se limite au stress lié à la manipulation des animaux et leur isolement lors des périodes de fécondation/réintroduction avec les congénères. La transgenèse I-Sce1 avec l'insertion d'ADN dans le génome se produit de manière aléatoire et, dans de nombreux cas, sur plusieurs sites. Les effets de position associés et les différences de nombre de copies rendent le phénotype des poissons moins prévisible. D'une manière similaire, la perturbation génique constitutive avec Crispr/Cas9 peut entraîner des effets secondaires tels la létalité embryonnaire, ce qui peut représenter une limite importante à l'analyse des phénotypes.
Devenir
1. Microinjections: Les animaux non porteur de transgène/mutation et les animaux F0 pour lesquels une population de porteurs F1 de transgène/mutation a été établi seront mis a mort. 2. Animaux soumis à une lésion de la moelle épinière: Finalement, tous les animaux utilisés pour les procédures énumérées dans ce protocole seront mis à mort pour évaluer la régénération de la moelle épinière sur des coupes de tissus.
Remplacement
La régénération de la moelle épinière est actuellement incurable chez les mammifères, mais se produit spontanément chez les vertébrés non mammifères comme les poissons téléostéens. La lésion de la moelle épinière est une condition impliquant l'animal entier, qui ne peut pas être reproduite de manière adéquate en culture tissulaire. Les interactions cellulaires complexes au cours de la régénération limitent l'utilisation de systèmes in vitro pour la découverte de facteurs de régénération du poisson zèbre. Par conséquent, il s'agit d'un problème qui ne peut pas encore être modélisé avec précision par un ordinateur ou des cellules en culture. À ce jour, il n'existe pas de moyen alternatif, sans l'utilisation d'animaux vivants, pour comprendre les signaux génétiques et les conséquences physiologiques impliqués après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés en effectuant une recherche documentaire approfondie définissant les connaissances existantes sur les approches expérimentales spécifiques. Nous avons réalisé des expériences pilotes pour optimiser les méthodes et les protocoles avant d'étendre les méthodes à un nombre statistiquement significatif d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront gardés dans une plateforme d’expérimentation animale équipées pour assurer un maximum de confort et de soins avec des aquariums enrichis. Ils seront gardés en groupes et logés dans des bacs offrant un espace de vie suffisant (espèce grégaire, environ 5 poissons//litre). Des conditions d'élevage et des nourrissages appropriées seront assurés. Pour minimiser autant que possible la mortalité, nous garderons les réservoirs propres autant que possible, éviterons les dépôts et l'accumulation de nourriture, maintiendrons un débit d'eau faible et constant pour éviter de déranger les poissons et maintiendrons une densité de poissons faible (mais adéquate). Tout le personnel impliqué dans la recherche sera formé de manière appropriée pour savoir identifier la souffrance physique et émotionnelle, la quantifier via une échelle et agir lorsque les critères d’interruption (points limites) prédéfinis sont atteints. Spécifiquement, les animaux seront mis à mort en cas de i) Changement soudain du niveau d’activité (bien que les animaux soient paralysés après une lésion de la moelle épinière, ils devraient pouvoir bouger activement avec la partie rostrale de leur corps); ii) Signes de douleur ou de détresse modérée à sévère qui n'a pas été prévue par le plan d'étude; iii) Amaigrissement. Nous surveillerons les animaux pour un amaigrissement nul/faible/sévère en observant et en comparant le groupe expérimental et le groupe contrôle, et par rapport à une référence appariée selon l'âge. Les animaux présentant un amaigrissement sévère seront mis à mort. Les animaux seront surveillés quotidiennement pendant trois jours après la chirurgie, et après trois fois par semaine. Ceux montrant des signes de souffrance dépassant les limites définies seront mis à mort. Les conditions seront soigneusement consignées dans les journaux chirurgicaux pendant la chirurgie, où nous noterons également la viabilité et les animaux qui atteindront les point limites.
Choix des espèces
La régénération de la moelle épinière se produit sur plusieurs jours et implique plusieurs types cellulaires et signaux différents. Sa complexité explique le manque de modèles de régénération in vitro or informatique. Le poisson-zèbre a été sélectionnée pour les raisons suivants : i) Il possède une capacité étonnante à se régénérer spontanément après une lésion de la moelle épinière et à inverser complètement la paralysie ; ii) L'anatomie et la physiologie est particulièrement adaptée à cette étude. Les poissons zèbres sont petits, se reproduisent bien et régénèrent plusieurs organes de manière robuste ; iii) Il s'agit d’une espèce réputée moins sensible pour ces études ; iv) C'est le seul système où nous pouvons étudier la régénération avec de méthodes génétiques ; v) Une base de données existe permettant des comparaisons avec des données existantes. Ce site répertorie les réactifs et les publications de plus de 500 laboratoires utilisant ce modèle. Pour nos expériences de régénération, nous utiliserons des larves et des poissons zèbres adultes. - Pour les expériences larvaires (imagerie in vivo), nous utiliserons des animaux à 3 jours après la fécondation. Les larves permettent l'imagerie in vivo de plusieurs types de cellules de la moelle épinière, pour étudier leur comportement in situ lors de la régénération. Ceci n'est toujours pas possible dans la moelle épinière adulte. - Les larves offrent l'avantage de visualiser les processus in vivo, cependant le taux basal de neurogenèse dans la moelle épinière larvaire est plus élevé que chez les adultes. En outre, les tissus associés à la moelle épinière (c. méningées, squelettiques, vasculaires) et les cellules immunitaires adaptatives non présentes aux stades larvaires pourraient influencer régénération en fournissant des signaux supplémentaires. Par conséquent, la plupart de nos études emploieront des adultes, que seront âgés de 2 à 12 mois. La régénération de la moelle épinière dépend de la taille du poisson zèbre, et des études précèdent ont montré que les animaux de plus de 2,5 cm perdent leur capacité de régénération. Par conséquent, nous utiliserons des animaux mesurant environ 2,5 cm.