Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Évaluation de la Sécurité préclinique des candidats médicaments chez les rongeurs génétiquement modifiés ou non (rats et souris) et les non rongeurs (chiens, mini-porcs et primates non humains)
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 4800
Chiens : 540
Cochons : 540
Macaques à longue queue : 1250
13 530 animaux non-humains vont être utilisés, en très grande majorité tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 6 400 souris, 4 800 rats, 1 250 macaques à longue queue, 540 chiens et 540 cochons. Ils reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments, des prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal et, pour les non-rongeurs, la pose chirurgicale d'implants de télémétrie, dans des études de toxicité réglementaire. Le porteur indique qu'une analyse terminale des organes est le plus souvent nécessaire, seuls 10 à 15 % des non-rongeurs pouvant être réutilisés et certains proposés à l'adoption. Il justifie l'emploi de deux espèces, dont un non-rongeur, par les lignes directrices internationales et l'extrapolation à l'humain, aucune méthode ne remplaçant selon lui l'"organisme entier".
Objectifs
Un médicament n’est mis sur le marché pour les patients qu’après plusieurs années de Recherche et Développement. Les études précliniques, en amont des essais chez l’Homme, sont indispensables à l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un candidat médicament. Celles visant à qualifier la sécurité du candidat médicament sont réalisées en accord avec la réglementation qui impose cette évaluation sur deux espèces mammifères, un rongeur (rats ou souris) et un non rongeur (chiens, mini-porcs ou primates non humains) (sauf cas particulier, par exemple pour les anticorps si une seule espèce est pertinente). L’objectif de ce projet est de réaliser des études de sécurité préclinique afin d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments. Pour cela, les procédures mises en œuvre concernent le suivi clinique et biologique des animaux suite à l’administration unique ou répétée du candidat testé, par des voies, la plupart du temps, identiques à celles prévues chez l’Homme, avec des prélèvements de fluides biologiques (par exemple : sang, urines) permettant de mieux caractériser les effets observés. Cela permettra d’avoir des informations essentielles (choix de dose et index thérapeutique) avant la première administration chez l’Homme ou bien de stopper le développement d’un candidat ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité. Ce projet fait partie des prérequis indispensables à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’Homme, efficaces, plus sûrs et mieux tolérés et participe aux progrès scientifiques et biomédicaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter les éléments d’information nécessaires aux prérequis toxicologiques en évaluant la sécurité et les effets indésirables des candidats médicaments chez l’animal vivant. Les avantages attendus sont la protection de l’Homme, d’une part en stoppant le développement de composés pour lesquels la toxicité est rédhibitoire et/ou innocuité insuffisante et d’autre part en fournissant les informations essentielles avant les administrations en clinique (par exemple calcul des index thérapeutiques, caractérisations des effets secondaires attendus, biomarqueurs).
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle par exemple. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. La mise en place d’implants vasculaires par chirurgie provoquera une contrainte de courte durée (douleur légère, baisse d’appétit par exemple).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Le projet est réalisé sur animal vivant car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. Il n’existe pas de méthode substitutive pour remplacer l’ensemble des études menées pour l’évaluation des risques en sécurité préclinique. Cependant, l’utilisation de méthodes in silico (modélisation informatique) et in vitro (par exemple organ-on-chip) mimant la structure et la fonction d’un organe (par exemple : foie, cœur, rein) permet un premier criblage des futurs candidats ou de mieux caractériser l’atteinte de telle ou telle fonction.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance, un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l’utilisation d’animaux contrôles n’est pas systématique et est soumis à réflexion en fonction des objectifs de l’étude. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Pour certains gestes techniques, une phase de désensibilisation/habituation est faite en amont de l’étude pour diminuer le stress de l’animal. L’administration est associée à une récompense physique (caresses, félicitations avec la voix) et/ou alimentaire. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie et avec l’utilisation d’une analgésie multimodale. Le suivi clinique, au moins quotidien des animaux, permet la détection précoce de toute douleur, inconfort ou détresse et la mise en application de critères d’arrêt anticipés supervisée par le Directeur d’étude, le Vétérinaire clinicien et la Structure en charge du Bien-Etre Animal, afin que les animaux ne subissent pas plus qu’une contrainte modérée.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par : -les lignes directrices internationales (ICH) définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique (par exemple, les primates non humains pour les biologiques). Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.
Elevage de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
6000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour gérer un élevage de souris génétiquement altérées. Chaque animal subit sous anesthésie un prélèvement au bout de la queue ou de l'oreille pour son génotypage. Le porteur indique que les souris au génotype voulu sont versées en continu dans d'autres projets et que celles au génotype non requis sont mises à mort ou réutilisées. Il présente cet élevage comme une "réduction" du nombre d'animaux, tout en programmant le génotypage de 6000 individus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la caractérisation génétique des rongeurs (souris) dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés. L'élevage est réalisé par une plateforme au service des activités de recherche utilisant des animaux à des fins scientifiques comme modèle expérimental dans le domaine des neurosciences, de la physiologie, la compréhension de la réponse immunitaire dans certaines pathologies humaines ou encore dans les mécanismes liés au développement de cancers. Certains de ces projets sont amenés à utiliser des animaux génétiquement altérés (génétiquement modifiées ou avec des mutations spontanées) en l'absence de solutions alternatives disponibles n'utilisant pas d'animaux. L'élevage des animaux génétiquement modifiés nécessite la détermination de la constitution génétique (appelé génotype) de chaque individu par une amplification précise et localisée des séquences d’ADN modifiées à partir des cellules de tissu facilement accessible et avec une approche la moins invasive possible. Cette caractérisation précoce au moment du servage ou plus tardive des animaux nés sur site, est indispensable et contribue au respect de la règle des 3R, notamment en termes de réduction.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet repose sur la réduction du nombre d'animaux utilisées. La mise en place d'une procédure de caractérisation génétique fiable et reproductible permet: d'utiliser des individus avec un génotype défini et requis dans les projets scientifiques, de maitriser la production du nombre d'individus au strict minimum et la qualité génétique des animaux élevés sur site.
Procédures
un prélèvement tissulaire (extrémité de la queue ou pavillon de l'oreille de 2mm) sous anesthésie générale pour 6000 souris; durée inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront en utlisation continue dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées. Les individus ne possédant pas le génotype requis seront mis à mort ou seront réutilisés dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.
Remplacement
Les animaux élevés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Il n'existe pas non plus de technique in vitro ou in silico pour déterminer le génotype d'un animal sans prélèvement de son ADN contenu dans ses propres cellules. L'ADN est spécifique à chaque individu.
Réduction
La stratégie d'accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter la production d'animaux au strict minimum. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Selon les lignées et les projets, un certain nombre d’animaux n'ont pas le patrimoine génétique requis. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype. La réutilisation participe à la réduction du nombre d'animaux utilisés globalement pour les projets scientifiques. De plus, le génotypage en amont des projets et non pas à la fin des projets scientifiques participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une alternative non-invasive pour la récupération de cellules (prélèvement buccal) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables et reproductibles. Des techniques alternatives de biopsie non invasives n'ont pas permis à ce jour d'obtenir des résultats satisfaisants. Le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Pour les jeunes individus, ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue précocement, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisées dans l'animalerie. Ils font appel à des souris génétiquement modifiées. Pour les individus nécessitant une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage, ils sont âgés de 21 à 30 jours maximum. Pour les individus nécessitant un prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille, ils sont agés de plus de 6 semaines.
Maintien d’une ligné de rats DMDmdx
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
1150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, pour maintenir une lignée de rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne. Chaque raton subit vers huit à dix jours une biopsie de la queue sous anesthésie locale pour le génotypage, sans analgésie prévue d'emblée. Le porteur indique que les rats au génotype voulu rejoignent de futures études de thérapie génique ou le pool de reproduction, les autres étant mis à mort. Il décrit le rat DMDmdx comme plus proche de la maladie humaine que la souris mdx ou le chien, et affirme qu'aucune méthode alternative ne teste un traitement sur un "organisme entier".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (1 garçon sur 5000 naissances). Elle est due à un défaut dans le gène codant pour une protéine nommée Dystrophine, situé sur le chromosome X et est à l'orgine d'une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Aucun traitement n’est disponible à ce jour sur le marché. La thérapie génique, la thérapie cellulaire ou l'utilisation de certaines molécules pharmocologiques font partie des approches envisageables pour le traitement de cette pathologie ou pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. En 2014, un consortium de laboratoires a généré un nouveau modèle animal de la DMD : le rat DMDmdx. Cette lignée de rat, totalement caractérisée, se révèle être un très bon reflet de la pathologie humaine (atteintes supérieures à d'autres modèles animaux, notamment au niveau de l'atteinte cardiaque) . Notre projet vise à maintenir une colonie de rats DMDmdx à partir de femelles porteuses et de mâles sains. Les rats mâles DMDmdx générés et les rats sains issus de portées communes aux rats DMDmdx (rats mâles littermates) seront destinés à être inclus dans des études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques. Certaines femelles porteuses générées seront destinées à devenir à leur tour reproductrices. Afin d'assurer le maintien d'une colonie et de répondre aux besoins des études, nous devons générer au maximum 150 rats mâles DMDmdx par an. Nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 40 femelles porteuses et 40 mâles sains par an, soit un total de 400 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 750 rats mâles DMDmdx. La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat DMDmdx.
Bénéfices attendus
(i) Le maintien d'une lignée de rat DMDmdx présentant une atteinte musculaire proche de la pathologie humaine de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) permettra d'obtenir un modèle animal supplémentaire et complémentaire à ceux existants, afin d'évaluer et définir les doses thérapeutiques des traitements expérimentaux développés (thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique) dans des projets pré cliniques. La souris mdx et le chien GRMD (pour Golden Retriever Muscular Dystrophy), tous deux porteurs d’une mutation dans leur gène de la dystrophine, sont 2 modèles largement utilisés, mais présentent cependant un certain nombre d’inconvénients : La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches et une évolution semblable à la maladie des patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. (ii) Un élevage aggrée a arrêté récemment sa production de rats DMDmdx et à ce jour aucun autre fournisseur n'en propose à la communauté scientifique. (iii) Le maintien d'une colonie de rat DMDmdx sur notre Centre permettra de mettre à disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la DMD et de réaliser sur site les études associées.
Procédures
Une biopsie de queue (prélèvement d'environ 1 millimètre de la queue) sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions de la lignée DMDmdx. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, de 8 à 10 jours après la naissance, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
(i) Gestion de la douleur lors des caudectomie : une anesthésie locale est prévue lors de la réalisation des biopsie de queue pour le génotypage chez le raton de 8/10 jours. Pas d'analgésie complémentaire prévue d'emblée , mais une observation bi-quotidienne des animaux sera effectuée par les techniciens animaliers, et si besoin, un traitement adéquat sera mis en place par le vétérinaire du centre. Si nécessaire, en cas de douleur chez le raton, comme le défaut de reptation, l’émission de cris, le fait de rester à l'écart du reste de la portée et la non reprise de la tétée dès la remise au nid, une injection en sous-cutanée de Buprénorphine® pourra être réalisée. (ii) Le phénotype lié à la maladie des rats DMDmdx est évolutif et dégénératif (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation, difficultés à s'alimenter liées à une mauvaise usure des dents / déficits des muscles masticateurs). Cette dégradation devient sévère pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois. Aussi, le plus souvent les animaux générés seront inclus dans les études à un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Cependant, jusquà inclusion dans une étude, l’aspect et le comportement général des animaux seront observés de façon quotidienne par le personnel animalier. L’appétit, la consommation hydrique, la prise de poids et la capacité de locomotion de l’animal constitueront les principaux éléments surveillés de façon hebdomadaire pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l’expression clinique de la maladie. Ces observations seront automatiquement fournies au vétérinaire responsable.. Dans le cas, où l’animal n’arriverait plus à se déplacer correctement, perdrait du poids et présenterait des symptômes laissant penser à l’existence de douleurs chroniques, la mise à mort de l’animal sera anticipée.
Devenir
Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats mâles DMDmdx, voire les rats sains issus de portées communes aux rats DMDmdx (rats sains littermates) seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des femelles porteuses (environ une par portée) obtenue sera conservée en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement sur un organisme complet et ses effets sur les différents organes/tissus. Pour exemple, en thérapie génique , nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Cette lignée permet en outres de tester l'effet d'un traitement à la fois dans un contexte malade (rat DMD) et un contexte sain (rat sain littermate).
Réduction
La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat DMDmdx. Dans ce projet, afin de générer au maximum 150 rats mâles DMDmdx par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 40 femelles porteuses et 40 mâles sains par an, soit un total de 400 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 750 rats mâles DMDmdx. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement de l'environnement mis en place systématiquement, favorisant entre autres la nidation (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisure de papier, cellulose, bûchettes de bois), accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Une alimentation convenant à l'élevage sera mise en place dès que la femelle sera gestante. Les prélèvements seront réalisés dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, un tableau de points limites sera miseen place dès que celui-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en annexe 1 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Le rat DMDmdx possède une mutation dans l’exon 23 du gène dmd codant pour la protéine Dystrophine. Ce modèle a été généré par l’utilisation de TALENs. Dans ce modèle animal de la DMD, l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype l'expression de la maladie sévère. En 2014, un consortium de laboratoires a généré un nouveau modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) : le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression d'une protéine, la dystrophine, essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité des fibres musculaires est nulle, d'où une expression sévère de la maladie DMD. Cette lignée de rat, totalement caractérisée, se révèle être un très bon reflet de la pathologie humaine (atteintes ssupérieures à d'autres modèles animaux, notamment au niveau de l'atteinte cardiaque). Les modèles animaux atteints de DMD les plus classiquement utilisés, la souris mdx et chien GRMD (pour Golden Retriever Muscualr Dystrophy), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec une expression de la maladie peu marquée. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients DMD et une expression de la maladie sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Pour le programme de reproduction, de jeunes adultes en âge de procréer et adultes pour les animaux reproducteurs sont utilisés : - rats sains provenant d'un fournisseur agréé : entre 12 et 14 semaines - rats femelles porteuses de la maladie : 14 semaines. La fin de la fertilité pour la lignée rat DMDmdx étant entre 10 et 11 mois. Les animaux générés, les rats mâles DMDmdx générés et les rats mâles sains issus des mêmes portées, sont ensuite en général inclus dans les protocoles expérimentaux au moment du sevrage. Selon les projets, les animaux seront utilisés à différents âges, ce qui sera justifié au niveau des saisines de chacun des projets.
Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées et biopsies pour leur génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
12 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et environ 200 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un millimètre de queue sous anesthésie locale pour son génotypage, avant le sevrage. Le porteur indique que les souris au génotype recherché rejoignent d'autres procédures, tandis que celles sans intérêt sont réutilisées ou tuées. Il reconnaît qu'aucune méthode de génotypage moins invasive, comme la PCR sur poils, ne donne à ce jour de résultats exploitables dans son établissement.
Objectifs
Le projet consiste à produire des souris génétiquement modifiées qui nécessitent un prélèvement d'un petit bout de la queue (1mm maximum) afin de connaitre leur génétique et savoir si elles seront utilisables pour les projet de recherche ou non.
Bénéfices attendus
Raffiner la production de souris génétiquement modifiées en prenant en charge la douleur ressentie lors de l'acte de biopsie pour génotypage.
Procédures
Identification et prélèvement d'un petit bout de la queue pour caractérisation des souris (moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Lors de l'acte de prélèvement d'un bout de queue les animaux peuvent ressentir de la douleur. C'est pourquoi nous réalisons cet acte sous anesthésie locale.
Devenir
Les animaux présantant un génotype d'intérêt seront utilisés dans des procédures expérimentales de notre établissement en utilisation continue. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux seront soit réutilisés pour d’autres projets expérimentaux quand c’est possible, soit euthanasiés.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur-même des projets des utilisateurs. Pour le moment, aucune autre méthode de biopsie pour génotypage moins invasive fonctionne. En effet, les protocoles de génotypage par PCR sur des poils ne nous ont toujours pas permis d'obtenir des résultats exploitables pour déterminer le génotype de nos animaux. Mais nous sommes toujours dans le recherche d'un nouveau protocole et nous ne manquerons pas de changer pour une méthode de biopsie moins invasive dès que possible.
Réduction
La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (batonnets de coton, maison en carton, mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / cage). Immédiatement avant l'acte de prélèvement du bout de la queue (1mm maximum), la pulvérisation d'un anesthésique sera effectuée sur la queue de l'animal afin de réduire au maximum toute douleur pouvant être ressentie. Une infection au niveau du site de biopsie serait le point seul point limite pouvant être atteint. Il s'agit ici d'une anticipation d'une potentielle infection car le cas ne nous est jamais arrivé, bien que nous réalisons ce geste sur un grand nombre d'animaux. Si cela devait nous arriver, nous désinfecterions la plaie avec de la povidone iodée (Vétédine) dans un premier temps et si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors nous euthanasierons l'animal afin de stopper ses souffrances.
Choix des espèces
La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. L'acte de biopsie d'un bout de queue est réalisé sur les nouveau nés, ceci afin de pouvoir les génotyper avant le sevrage dans une optique de réduction.
Optimisation de la prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans un modèle de souris déficient en acide lipase lysosomale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une déficience génétique en lipase acide lysosomale, elles subissent un génotypage par biopsie de la queue, une destruction de leur moelle osseuse par deux injections de Busulfan ou une irradiation létale, puis une greffe de cellules souches et jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur indique que la destruction de la moelle peut provoquer une perte de poids et des plaies cutanées, et que les souris seront tuées pour prélever leur moelle osseuse et leur rate. Sur le remplacement, il affirme que les cellules de patients disponibles in vitro ne suffisent pas à reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique, et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Le déficit en enzyme (=protéine) : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras (=lipides) au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La transplantation de cellules souches de la moelle osseuse d’un donneur sain peut être bénéfique après déplétion au préalable des cellules du patient. Les cellules saines du sang produisent la protéine manquante et corrige l'accumulation de gras. Le manque de donneur compatible et le risque de rejet de greffe limitent le recours à cette procédure. Nous souhaitons développer un traitement curatif à long terme de la déficience en LAL (LAL-D) en utilisant une traitement génétique pour corriger les cellules souches de la moelle osseuse du patient. Les cellules corrigées du patient pourront à nouveau produire la protéine manquante et corriger l'accumulation de gras sans risque de rejet de greffe. Pour mettre au point cette stratégie, nous souhaitons tester différents méthodes de déplétion de cellules souches de la moelle osseuse afin de garantir une greffe de cellules souches optimales chez notre modèle de souris LAL-D.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de raffiner la méthode de déplétion des cellules souches de la moelle osseuse dans notre modèle de souris LAL-D afin de développer à terme un traitement génétique de la maladie. Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre de développer un traitement curatif pour les patients souffrant de LAL-D.
Procédures
Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance. Les animaux subiront soit 2 injections de Busulfan par voie intra péritonéales réalisé 48h avant la transplantation et espacée de 24H ou une irradiation létale réalisée 3h avant la transplantation de cellules. Pour l’irradiation, les souris seront disposées dans un irradiateur Faxitron (Rayon X, débit : 0,8Gy/min) pendant environ 12 min. Les animaux subiront une injection de cellules souches et des prélèvements de sang (au maximum 4 prélèvements) sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de queue, les injections des cellules ou Busulfan et les prélèvements de sang sont des procédures rapides, et ne devrais pas prendre plus de 10 min par souris.
Impact sur les animaux
Le maintien de la colonie LAL-D correspond à une nuisance légère car bien que les animaux LAL-D souffrent d’hépatosplénomégalie, il n’y a pas de modification de leur comportement (mobilité et alimentation). Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance ce qui est une nuisance légère de courte durée et seront sacrifiés à 8 mois pour éviter toutes souffrances. La nuisance lors des procédures de transplantation sera modérée et dura 16 semaines, en effet, les souris subiront une déplétion de cellules souches hématopoïétiques et seront transplantées par des cellules souches pour reconstituer la moelle osseuse. La déplétion peut entrainer une perte de poids des animaux et d’éventuelle plaies cutanées mais la transplantation de cellules souches permettra aux souris de se développer normalement.
Devenir
A la fin des procédures expérimentales, les souris seront euthanasiées afin de récupérer la moelle osseuse et la rate pour faire les analyses de prise de greffe.
Remplacement
Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches hématopoïétiques de patient pour la LAL-D, nous devons d’avoir étudier la transplantation des cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à comparer nos valeurs de prise de greffe à nos valeur observée de référence à savoir 80% de prise de greffe en utilisant l’irradiation létale. Nous souhaiterions atteindre un pourcentage de prise de greffe similaire, à savoir 80% en moyenne, avec un minimum de prise de greffe de 50% plus ou moins 25% (variance). Nous avons utilisé test statique calculé par le logiciel G Power et conclut que 10 animaux par groupe sont nécessaires.
Raffinement
Les souris LAL-D sont plus petites que les souris saines, mais sans souci de motricité ou de douleur donc pas de condition particulière d’hébergement. Lors de la réalisation des procédures expérimentales, l’état général des souris (apparence, posture, comportement...) et leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours, puis toutes les semaines. En cas de plaies cutanées, une pommade sera appliquée tout au long de la cicatrisation. Toutes les procédures potentiellement douloureuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse. En cas de plaies oculaires, les prélèvements de sang seront suspendus et une application locale de gel cicatrisant sera effectuée. Si les plaies oculaires ne cicatrisent pas (infection, œil blessé) dans la semaine après traitement, les souris seront euthanasiées. De plus, afin de raffiner nos études, nous allons évaluer une méthode de myéoablation ayant moins d’effets d’indésirables pouvant ainsi améliorer la survie des animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris LAL déficiente car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. Afin d’étudier la prise de greffe, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte.
Impératifs d’Élevage (génotypage et isolement) dans le cadre de projets de recherche chez le rongeur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 2560
45 260 souris et rats vont être utilisé·es, la grande majorité tuée à l'issue et 500 souris réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces animaux forment des lignées élevées pour fournir leurs tissus après mise à mort à des équipes de neurosciences travaillant sur Parkinson, Alzheimer ou la schizophrénie. Chaque petit subit un prélèvement de l'extrémité de la queue à 10 jours pour le génotypage, et certains mâles peuvent être isolés jusqu'à six mois pour caler les dates d'accouplement. Le porteur affirme que l'expérimentation animale est "nécessaire" en neurosciences et que ces techniques d'élevage couvrent les "besoins" des chercheurs.
Objectifs
Cette demande couvrira les lignées élevées pour l’utilisation de leurs tissus en post-mortem dans le cadre de projets en neurosciences pour réaliser des cultures, du développement de lignées cellulaires, d’organoïdes…. Les recherches associées à l’établissement utilisateur portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur pour développer nos connaissances sur le sujet et trouver des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Nous produirons des modèles pour nos équipes de recherche avec des caractéristiques génotypiques précises.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont d’apporter des modèles animaux (souris et rats) à nos équipes de recherche possédant le bon génotype et au bon stade de développement de manière, à ce que les connaissances progressent en neurosciences, et qu’in fine de nouveaux axes thérapeutiques puissent émerger, pour améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies neurodégénératives, troubles autistiques, dépressions qui sont au cœur des recherches menées dans notre établissement utilisateur.
Procédures
Il y aura la réalisation d’un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours, période où l’animal est moins sensible à la douleur et cicatrise rapidement. Cet acte n'est réalisé qu’une seule fois et dure environ 1 minute par animal. Rarement un reprélevement à l’oreille ou sanguin (1 seule fois, moins d’une minute) aura lieu sur un animal adulte si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal. Chez le Rat, ce prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie pour faciliter la manipulation de l’animal. Dans le cadre de mise en accouplement pour obtenir des souriceaux à des dates précises, certaines souris mâles pourraient être isolées de manière intermittente et pour une durée de 6 mois maximum avec une mise en accouplement au minimum une fois toutes les deux semaines.
Impact sur les animaux
Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage (ou du pavillon de l’oreille chez les souris adulte). L’identification et le prélèvement pour génotypage ont lieu au même moment. Dans les rares cas où le prélèvement sanguin sera préféré pour vérifier le génotypage, il y aura une légère douleur à la piqure, un risque d’hématome ou de saignement sur le site de prélèvement (veine sous mandibulaire (souris) ou saphène externe (Rat)). Chez le Rat, le prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie avec les risques inhérents à celle-ci (hypothermie, dépression cardio-respiatoire, recouvrement de la vigilance). Lors de l’isolement, les souris mâles qui sont des animaux grégaires, peuvent ressentir du stress.
Devenir
Exception faite des animaux n’ayant pas un génotype d’intérêt qui pourraient être inclus pour de la formation aux gestes techniques dans un projet autorisé dans notre animalerie, tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure : les reproducteurs sont maintenus pour un temps donné, et les animaux produits sont euthanasiés pour des raisons expérimentales pour permettre l’analyse de leurs tissus ou la culture cellulaire en utilisant les prélèvements réalisés en post-mortem. Il n’y aura pas d’utilisation continue de ces animaux en les incluant par la suite dans d’autres projets de recherche.
Remplacement
Malgré l’élaboration de projets in vitro en amont, l’utilisation d’animaux utilisés à des fins scientifique est nécessaire dans de nombreux projets de recherche en Neurosciences. De plus, les techniques d’isolement et de prélèvement sont nécessaires à la production d’animaux pour couvrir les besoins des chercheurs. L’utilisation des animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet car ils sont à la base de travaux sur tissus ou la production de lignées cellulaires sur lesquels pourront être réalisés un bon nombre d’expériences.
Réduction
Le maintien de 32 lignées différentes (souris et rats confondus) sera nécessaire pour répondre à l’ensemble des projets de recherche. D’après le cumul du nombre d’animaux maximum utilisés dans tous les projets de recherche à l’année, nous estimons que nous prélèverons un maximum de 43200 souriceaux et 2560 petits rats. Les projets de recherche associés à l’élevage seront conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en s’assurant de résultats scientifiques robustes. Etant donné la nature du projet, aucun test statistique n’a été réalisé en dehors de ceux utilisés dans les projets de recherche associés. Un maximum de 900 souris mâles pourra être isolées au cours du projet afin de définir précisément la date d’accouplement, ces animaux étant issus de notre élevage et donc inclus dans le nombre de petits générés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont agréées et les animaux reçoivent des enrichissements correspondants à leur besoin : matériel de nidification, maisonnette, bâtonnet à ronger. La quantité de ces enrichissements pourra être adaptée pour les animaux isolés. A la moindre anomalie qui est observée un suivi et des conseils sont données par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) de manière à assurer une prise en charge rapide et optimale de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux notamment en ce qui concerne la durée d’isolement des mâles, le nombre de portée par femelle et le temps de reproduction des géniteurs. Les animaux isolés sont identifiés par des cartes spécifiques pour qu’ils puissent bénéficier d’une surveillance adaptée (présence de comportements anormaux, durée de l’isolement). Le prélèvement tissulaire est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulation des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprèlèvement est nécessaire à l’oreille ou sanguin sur un animal, il n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien être animal.
Choix des espèces
Il existe de nombreuses lignées génétiquement modifiées chez la souris pour apporter des modèles aux équipes de recherche. Nous avons également des équipes qui travaillent chez le Rat, pour des raisons génétiques et de la taille des rats qui permet d’accéder à un cerveau plus grand, à des embryons de taille supérieure et en nombre important, et de réaliser ainsi certaines expériences plus aisément. Les animaux produits seront tatoués et prélevés à l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours (pour limiter la douleur et permettre une cicatrisation rapide) pour connaitre leur patrimoine génétique et pouvoir les reconnaitre. Exceptionnellement, Il pourra être nécessaire parfois de prélever une nouvelle fois sur les adultes mais cela sera fait à l’oreille ou par prélèvement de sang avec une demande justifiée par l’équipe et évaluée par la structure chargée du bien-être animal. Les reproducteurs sont utilisés à l’âge de 6 semaines pour les femelles et 8 semaines pour les mâles jusqu’à l’âge d’environ 8 mois pour les souris et 12 mois pour les rats. Les mâles souris susceptibles d’être isolés seront donc des adultes.
Archivage de lignées murines par cryoconservation de sperme ou d’embryons
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
35 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des stimulations hormonales par injection, des microchirurgies de transfert d'embryons sous anesthésie et des biopsies pour génotypage, pour archiver des lignées génétiquement modifiées par congélation de sperme et d'embryons. Le porteur indique que les mâles reproducteurs et donneurs de sperme, les femelles donneuses d'ovocytes et les femelles ayant subi le transfert d'embryons sont toutes mises à mort, comme les animaux nés des transferts et utilisés pour le contrôle qualité. Il affirme que la congélation des semences est "la seule méthode possible" pour sauvegarder ces lignées murines.
Objectifs
Les équipes de recherches utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations de stockage et de congélation en azote liquide des lignées génétiques impliquées vise à garantir la disponibilité de ces lignées à l'état cryoconservé permettant au besoin de revivifier la lignée en cas de problème survenu sur la lignée à l'état respirant (perte, dérive génétique, contamination) et de faciliter les échanges de ces lignées entres les différents sites hébergeurs par l'envoi des semences cryoconservées.
Bénéfices attendus
L'archivage et la sauvegarde des lignées par cryoconservation de sperme et/ou d'embryons permet de garantir la disponibilité des lignées murines traitées et de favoriser/simplifier les échanges entre différents sites.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intrapéritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en IP et une en sous-cutanée - Biopsies de tissu pour génotypage (moins d'1 minute)
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs (utilisés pour la production du sperme ou des embryons) sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie des femelles pseudo-gestantes. Le prélèvement de tissu pour génotypage peut entrainer une douleur et un stress en lien avec la contention de l'animal.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort. En effet, les mâles reproducteurs sont mis à mort en fin de projet et ceux donneurs de sperme doivent être mis à mort afin de prélever le sperme. Les femelles pseudo-gestantes ayant été sujettes à la chirurgie de transfert d'embryons ne peuvent subir un deuxième transfert d'embryons. Les femelles donneuses sont mises à mort pour permettre la récolte d'ovocytes post-mortem. Les animaux issus des transfert d'embryons (contrôles qualités) ne sont pas conservés.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, la congélation des semences est la seule méthode possible pour la sauvegarde de lignées murines.
Réduction
Les nombres d'animaux utilisés sont réduits au maximum et l'estimation a été faite en se basant sur la littérature scientifique et sur la base des années d'expérience dans ces approches. Pour les cryoconservations de sperme, 2 animaux sont nécessaires par lignée. Pour les cryoconservations d'embryons, en moyenne, 45 animaux seront nécessaires par lignée
Raffinement
La procédure chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post et per-opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
L'archivage des lignées murines déja existantes impose l'utilisation du modèle murin. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses et les males reproducteurs ou donneur de sperme, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubères (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation. Les animaux issus des transferts d'embryons dans le cadre des contrôles qualités effectués seront âgés de 7 à 10j.
Elevage de lignées de souris (animaux génétiquement altérés : AGA) immunodéprimées ou exprimant une cécité précoce, en condition exempt de pathogènes spécifiques et opportunistes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
15 600 souris génétiquement modifiées vont être élevées, immunodéprimées ou frappées d'une cécité précoce, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur décrit lui-même des lignées au phénotype "dommageable", avec dégénérescence rétinienne sévère et susceptibilité accrue aux infections, destinées à des protocoles sur la cryptosporidiose et la tuberculose. Une partie des souris part vers d'autres protocoles ou renouvelle les reproducteurs, le reste étant tué en surnombre ou en fin de "carrière" de reproduction. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Ce projet consiste à élever différentes lignées de souris, génétiquement modifiées/altérées (= AGA : animaux génétiquement altérés), dont le phénotype est dommageable pour l’animal élevé au sein de la a plateforme expérimentale et qui serviront pour des protocoles réalisés également au sein de la plateforme expérimentale. Les souris sont élevées pour répondre aux besoins scientifiques des chercheurs de l'unité de recherche qui étudient (i) à mieux comprendre les mécanismes protecteurs ou pathologiques mis en jeu lors de la cryptosporidiose et la tuberculose et à (ii) plus particulièrement dans le cadre de la cryptosporidiose, à évaluer l’effet d’immunostimulants et de molécules anti-parasitaires dans des modèles murins expérimentaux sensibles à ces agents pathogènes telles que les souris immunodéprimées par délétions génétiques de gènes de l’immunité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l'obtention de souris génétiquement altérée pour l'expérimentation correspondant aux besoins des projets correspondants. Comme précisé plus haut cryptosporidiose est une maladie zoonotique qui a une forte incidence dans les élevages de ruminants et qui est encore mal contrôlée par la chimiothérapie ou un vaccin. La compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la protection est donc déterminante pour pouvoir indentifier des stratégies d’immunostimulation du système immunitaire notamment des jeunes individus afin de les rendre plus résistants ou plus résilients à l’infection. La compréhension des mécansimes immunitaires est donc essentielle pour la mise en place de stratégies efficaces. La recherche de nouveaux antiparasitaires plus efficaces que le produit possédant une autorisation de mise sur le marché (antiparasitaires) est une priorité de recherche et il convient d’évaluer les antiparasitaires sur les modèles sensibles à l’infection (souriceaux, veaux, agneaux, chevreaux, souris immunodéficiente : individus immunodéprimés). Les bénéfices attendus sont donc à la fois forts pour l’élevage de ruminants et l’humain qui sont tous deux infectés par le même parasite sur lequel nous travaillons. La contamination se fait par contact direct (animal-animal ; animal-humain ; humain-humain) ou indirect via l’environnement (eau de boisson insuffisamment traitée ou de piscine, aliment souillés…). Le contrôle de la maladie chez les animaux d’élevage bénéficie donc directement à l’environnement et à l’humain. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections mycobactériennes est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Dans le cadre de la tuberculose, nous pourront ainsi définir les signes précoces de la maladie en analyse leur comportement grâce à la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur. Cette lignée permettra aussi de caractériser le rôle des gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés.
Procédures
Les souris seront élevées de façon conventionnelle (identification, surveillance quotidienne, mise en reproduction, change des cages) dans l’attente d’être intégrées dans nos protocoles de recherche
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent certains degrés d’immunosupression par altération d’une cytokine, de son récepteur ou de cellules immunitaires. On peut donc s’attendre à une susceptibilité accrue aux infections (agents pathogènes intracellulaires par exemple). Pour les souris C3H, Elles sont homozygotes pour l'allèle donné et présentent une dégénérescence rétinienne sévère précoce.
Devenir
Tous les animaux produits sont en majorité utilisés pour des protocoles expérimentaux ou pour renouveller les animaux reproducteurs. Les animaux non utilisés dans des protocoles expérimentaux (sous autorisation éthique validée) seront mis à mort à l’issue d'une "carrière" de reproducteur ou s'ils sont surnumérraires (nombre très réduits d'animaux).
Remplacement
Pour étudier les réponses immunitaires de l’hôte ou des stratégies d’immunostimulation qui ciblent le système immunitaire, il n’est pas possible d’utiliser de système in vitro ou des méthodes alternatives suffisament élaborées pour reproduire un environnement tissulaire complexe tel que l’intestin (pour étudier la cryptosporidiose) ou le poumon (pour étudier la tuberculose). Cas de la cryptosporidiose : Pour étudier, l’effet de molécules anti-parasitaires (anti Cryptosporidium), il est possible dans un premier temps de faire un criblage de molécules in vitro sur des lignées de cellules épithéliales intestinales. La phase in vivo intervient pour avoir un environnement cellulaire plus complexe impossible à reproduire in vitro ou lorque l’on doit évaluer l’efficacité de métabolisation d’une molécule ou sa biodisponibilité dans l’organisme. La culture partielle des parasites est possible sur des lignées de cellules épithéliales intestinales et toutes les interactions que nous pouvons étudier dans cet environnement sont toujours réalisées en amont des expérimentations in vivo. Par exemple, si on veut étudier l’effet d’une cytokine sur les cellules épithéliales, on peut commencer à l’évaluer in vitro comme tous les essais d’antiparasitaires qui sont sélectionnés in vitro. La phase in vivo intervient pour avoir un environnement cellulaire plus complexe impossible à reproduire in vitro ou lorque l’on doit évaluer l’efficacité de métabolisation d’une molécule ou sa biodisponibilité dans l’organisme. Cas de la tuberculose : A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum, mais en nombre suffisant afin d’éviter toute risque de perte d’une lignée. Le nombre est défini en fonction de la prolificité de la lignée et de l’expérience acquise dans l'élevage de ses lignées. Le maintien de ces derniers en statut SOPF (Specific and Opportunistic Pathogen Free) permet également de diminuer le nombre de reproducteurs nécessaires. Comme indiqué précédemment, la reproduction en plus grand nombre des animaux est fonction de la demande des chercheurs et des projets pour lesquels les protocoles et le nombre d’animaux ont été validés par le comité d’éthique local et le ministère. Pour le maintien des lignées (conservation d'un "noyau") : A raison de 10 animaux par lignée (mâles et femelles confondus) et par génération, avec un renouvellement trimestriel, nous estimons le nombre à (10x4) x 5ans, soit 200 animaux par lignée gardé en vie. Donc 1600 animaux pour les 8 lignées sur les 5 ans. En se basant sur la formule de calcul de probabilité : F= (P/PP)/R, nous comptons 5,55 femelles qui’il faut mettre en reproduction pour obtenir 10 petits par génération (5 mâles et 5 femelles), 10 = (10/6)/30%. F = nb de femelles à mettre en accouplement P = nb d'animaux demandé PP = nb de petits par portée R = nb de femelles gestantes sur 1 accouplement (lié au cycle oestrien) = 30% Toutefois, la portée moyenne est de 6 petits par femelle, ce qui ferait si toutes les femelles mettaient bas, 30 petits par génération et par lignée. Mais afin d’éviter les surprises, nous allons compter la totalité des animaux si toutes les femelles mettaient bas. Ce qui nous ferait au final, un nombre théorique de 30 petits par générations x 4 renouvellements annuel x 8 lignées = 960 animaux par an, soit 960 X 5 ans= 4800 animaux juste pour le maintien du "noyau". Ce qui nous fait : 45 (reproducteurs) x 3 (reproductions par an) x 5 ans x 8 lignées = 5400 animaux servant la multiplication des lignées. Puis en suivant le même raisonnement que le maintien de lignée si toutes les femelles mettaient bas, 30 (femelles mis en repro) x 6 (petits par portée) x 3 (fois par) x 5 ans x 8 lignées = 21600 animaux. Autre paramètre, toutes les lignées ne sont pas utilisées en même temps, ainsi pour se projeter par rapport à notre expérience des années précédentes, nous estimons une multiplication de la moitié des lignées annuellement, ce qui ferait 21600/2 = 10800 animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en conditions particulière de type exempt de pathogènes spécifiques et opportunistes. Le change est effectué dans des conditions d'hygiènes strictes. Un suivi sanitaire trimestriel est mis en place afin de surveiller leur statut sanitaire et des modes opératoires sont rédigés, validés, respectés et révisés régulièrement pour permettre de maintenir ce statut. Leur milieu de vie est enrichi et diversifié afin que les animaux puissent exprimer un comportement normal, propre à l’espèce. Parmi les différents types d’enrichissement utilisés, citons : la maison igloo. Ces enrichissements sont adaptés en fonction des lignées, de l'âge des animaux… en fonction de l'évaluation faite par les zootechniciens. Les cages sont pourvues au minimum de 2 enrichissements différents. D’autres enrichissements pourront être testés / utilisés au fil du temps, pour améliorer / diversifier l’environnement des animaux et leurs possibilités d'activité..., en fonction des propositions des fournisseurs en particulier. Les lignées sont identifiées par poinçon à l’oreille ; l’échantillon prélevé à cette occasion sert pour le génotypage des animaux d’intérêt, à garder pour le maintien et le suivi de la lignée. Concernant plus particulièrement les souris, modèle de la tuberculose, nous gardons un environnement enrichi unique sans diversification pour ne pas perturber les animaux à l’apparition du phénotype dommageable = leur cécité.
Choix des espèces
Le modèle murin est très largement utilisé par toute la communauté internationale travaillant sur la cryptosporidiose. L’infection mime bien celle que nous observons chez l’humain et les ruminants (même site d’infection : ileum), même suceptibilité liée au statut immunitaire, même souche parasitaire capable d’infecter l’humain, la souris et les ruminants). Le modèle murin permet l’utilisation de nombreux animaux trangéniques, leur génétique bien définie permet d’avoir des réponses homogènes. Leur reproduction rapide permet l’obtention régulière d’animaux, leur cycle court de reproduction permet des mises-bas synchronisées très utiles pour les expériences sur les nouveau-nés. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. Le modèle murin permet une manipulation en animalerie de confinement de niveau 3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce : kits, anticorps. Les animaux seront utilisés pour la reproduction : il y aura donc les deux sexes à l’âge adulte, des femelles gestantes et allaitantes, ainsi que leurs nouveau-nés qui suivront leur croissance jusqu’au sevrage puis jusqu’à leur maturité pour ensuite être mis en accouplement. à leur tour. Pour les projets en lien avec la cryptosporidiose, les animaux âgés entre 3 et 7 jours en début d’expérimentation seront fournis (encore accompagnés de leur mère) ainsi que des souris adultes de sexe indéterminé généralement âgés de 8 à 20 semaines. Pour les projets en lien avec la tuberculose, les souris adultes seront âgées de 6 semaines. Il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus, nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.les souris adultes seront âgées de 6 semaines. Il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus, nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.
Création de lignées murines transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
18 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, au service de la création de lignées génétiquement modifiées. Les femelles reçoivent des injections hormonales et une microchirurgie de transfert d'embryons sous anesthésie, avec des douleurs post-opératoires possibles, et les souriceaux subissent une biopsie de génotypage. Les mâles isolés sont tués à un an, les femelles donneuses tuées pour prélever les embryons et les receveuses tuées en fin de procédure, seuls les souriceaux jugés d'intérêt étant gardés pour fonder les lignées. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer ces animaux et que la production de nouveaux modèles "impose" le recours à des souris donneuses et receveuses.
Objectifs
Les équipes des instituts de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées sous une forme similiaire chez des patients humains, à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. Ce projet a pour objectif la génération de tels modèles murins transgéniques sur site obtenus par 2 approches différentes de modification du génome.
Bénéfices attendus
Les lignées génétiquement modifiées créées sont des modèles de choix pour la communauté scientifique. En effet, ce sont des modèles pour la recherche fondamentale, mais aussi des modèles de pathologies humaines servant à mieux comprendre les processus de développement de ces maladies et voire même à tester des molécules/médicaments afin de valider (ou invalider) des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en IP et une en sous-cutanée - Biposei de tissu pour génotypage (moins d'1 minute)
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie/analgésie des femelles pseudo-gestantes. A propos des animaux dits "fondateurs" obtenus après réimplantation des embryons modifiés, ceux-ci peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. .
Devenir
Les mâles isolés sont mis à mort à l'âge d'un an pour éviter que leur vieillissement n'impacte leur qualité de reproduction, les femelles donneuses d'embryons sont mises à mort pour permettre la récolte des embryons post-mortem et les femelles pseudo-gestantes réimplantées sont mises à mort en fin de procédure ne pouvant pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons. Sont conservés uniquement les souriceaux issus des réimplantations confirmés comme d'intérêts pour assurer la création des nouvelles lignées, les autres souriceaux obtenus sont mis à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveur d'embryons.
Réduction
La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. Une seule série de production - réimplantation sera effectuée dans un premier temps par projet. La deuxième et éventuellement troisième série ne sera programmée qu'en cas d'absence d'un fondateur d'intérêt. L'estimation des nombres maximums d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique. En moyenne, 50 animaux seront nécessaires pour l'établissement d'une nouvelle lignée.
Raffinement
La chirurgie de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les mâles reproducteurs utilisés pour la production des embryons ainsi que les femelles receveuses et les males vasectomisés, sont d'âge adulte (2 à 12 mois) Les femelles donneuses d'embryons utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.
Méthode de génotypage invasif pour l’élevage de modèles de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souriceau de trois à six jours subit une biopsie de la queue sur animal vigile pour déterminer son génotype, geste pouvant provoquer douleur et saignement. Les souris ne portant pas le génotype recherché sont réparties entre la formation, le don comme animaux de compagnie et la mise à mort, tandis que les autres alimentent les projets de recherche et les accouplements. Ce projet d'élevage produit et trie ces lignées génétiquement modifiées à très grande échelle pour la recherche en neurosciences.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire des souris génétiquement modifiées et de caractériser leurs génomes de manière précoce avec la collecte d’échantillons d’ADN (biopsie de queue). Dans le cadre des projets de recherche de l’Institut, différents modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisés pour les études en neurosciences. Plus particulièrement, les animaux jeunes sont utilisés pour des études sur le développement du cerveau. C’est pourquoi une identification et un génotypage précoce est requis.
Bénéfices attendus
Les recherches menées à l’institut grâce à l’utilisation d’animaux utilisés à des fins scientifiques ont des applications médicales multiples dans le cadre des maladies neurologiques et psychiatriques telles que les troubles neurodéveloppementaux, l’épilepsie, les mouvements anormaux, les maladies neurodégénératives, la dépression et l’addiction. Par ailleurs, la méthode utilisée pour l’identification et la caractérisation du génome permet de sélectionner les animaux d’intérêts et ainsi constituer des groupes expérimentaux stables de manière précoce.
Procédures
Une intervention d’une biopsie de queue est réalisée sur souris vigiles à l’âge de 3 à 6 post-natal. Cet acte technique dure moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible.
Devenir
L’ensemble des animaux qui ne sont pas euthanasiés à l’issus de ce projet rentreront en utilisation continue pour d’autres projets autorisés. Les souris ne portant pas le génotype d’intérêt seront pour une première partie utilisées dans le cadre de formation tutorat, pour une seconde partie utilisées en animaux de compagnie et pour une troisième partie euthanasiés. Les animaux portant le génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche de l’Institut ou pour le renouvellement des accouplements.
Remplacement
Une partie des projets du centre de recherche sont réalisés in vitro (biochimie et biologie cellulaire), nous utilisons des lignées cellulaires et des cellules souches embryonnaires afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le Système Nerveux Central (SNC) et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement du cerveau qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Le génotypage précoce des souriceaux permet de conserver uniquement les animaux avec le génotypage d’intérêt et de constituer des lots expérimentaux avant le sevrage des animaux, pour l’utilisation future dans des projets autorisés de l’Institut. Dans le cadre de formation/tutorat, nous utilisons une partie des animaux qui ne sont pas utilisés dans les projets de recherche. Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé sur la base des productions des années antérieures. Le projet requiert l’utilisation de 180 000 animaux sur une période de 5 ans.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau . Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un transfert d’odeurs est réalisé sur les gants de l’opérateur pour minimiser le risque de rejets des nouveaux- nés par la mère ou de cannibalisme . Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.
Choix des espèces
Les équipes de recherche du centre travaillent sur le modèle souris. Par conséquent, la plateforme animalerie produit les souris génétiquement modifiées et collecte des échantillons d’ADN (biopsie de queue) de manière précoce dans le but de caractériser le génome. Pour les besoins des activités de recherche, une identification et un génotypage précoce sont requis. Les deux interventions sont réalisées à l’âge de 3 à 6 jours post natal.
Génotypage de souris transgéniques dans le cadre des élevages internes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
8 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, dans le cadre d'un élevage de lignées génétiquement modifiées. Après sevrage, chacune est identifiée par une boucle à l'oreille et subit une biopsie d'oreille ou de queue pour génotypage. Le porteur indique que les souris au génotype recherché sont orientées vers d'autres projets ou vers la reproduction, tandis que les reproducteurs en fin de rendement et les surnuméraires de plus de quinze semaines sont systématiquement tués. Ce projet ne vise aucune connaissance en propre, il entretient l'élevage et sélectionne les souris destinées à d'autres expériences.
Objectifs
Les différents laboratoires participent à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par une boucle métallique à l’oreille, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout d’oreille (préférentiellement) ou de queue. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet). Ce projet doit donc nous permettre de produire les animaux d’intérêt et les animaux nécessaires au renouvellement des couples/trios de reproduction. Cet élevage sera mis en œuvre et maintenu en fonction des autorisations des projets utilisant ce modèle transgénique.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de : • Produire les animaux nécessaires aux projets scientifiques utilisant le modèle de tumeur du colon inductible • Maintenir notre élevage interne de souris.
Procédures
- Prélèvement par punch auriculaire (ou bout de queue) pour génotypage, après sevrage (tous les animaux) et identification individuelle par bague métallique.
Impact sur les animaux
La contention, le poinçon auriculaire et la mise en place d’une boucle d’identification à l’oreille (auxquels sont soumises l’ensemble des souris de l’élevage) sont susceptibles de générer un inconfort transitoire. Les souris ne seront pas traitées au tamoxifène dans le cadre de ce projet. Ainsi aucune mutation ne sera induite et donc les animaux ne devraient donc pas avoir d’autre effet indésirable supplémentaire.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux présentant les génotypes d’intérêt seront gardés et utilisés pour les projets utilisant cette lignée ou pour le maintien de l’élevage selon leur génotype. Les animaux en reproduction seront régulièrement euthanasiés selon les performances de reproduction. Les animaux surnuméraires âgés de plus de 15 semaines seront systématiquement euthanasiés (certains pourront être utilisés, en fonction des besoins pour des trainings internes).
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie d’oreille (ou de queue) pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Notre expérience acquise dans la gestion des élevages complexes (plusieurs gènes à sélectionner) nous permet de dimensionner au mieux les élevages en fonction des besoins des manips. Des échanges réguliers avec l’équipe de recherche permettent de s’assurer de produire les animaux nécessaires sans excès.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé par suite de cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place. Les animaux en élevage sont surveillés régulièrement toutes les semaines. Toutes les cages sont pourvues d’enrichissement (coton). Les cages de reproducteurs sont également pourvues de maisons pour diminuer tout éventuelle agressivité.
Choix des espèces
Il n’est pas encore possible de modeler in vitro la complexité d’un organisme dans son entier. De plus, dans certains projets, seule l’utilisation de modèles transgéniques permet de modeler au mieux les pathologies étudiées. Pour générer des animaux, des animaux plutôt jeunes (à partir de 8 semaines jusqu’à 15 semaines pour la mise en reproduction) seront utilisés afin d’assurer de bonnes performances de reproduction. Les animaux reproducteurs seront surveillés et renouvelés aussi fréquemment que nécessaire.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.