Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Maintien d’une lignée de rat modèle de mucoviscidose
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Porteurs par construction génétique d'une mucoviscidose, 600 rats reçoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de dix jours jusqu'à leur mise à mort, ce qui provoque des selles molles en continu. Le niveau de souffrance déclaré est léger et le projet se limite à entretenir la lignée. Les rats sont tués pour prélèvement d'organes ou versés dans d'autres projets soumis à autorisation, sans que le RNT indique la part de chacun. Le porteur écarte les modèles drosophile et poisson zèbre, qui existent, au motif qu'ils ne renseignent ni sur le microbiote pulmonaire ni sur la fonction testiculaire, et affirme la supériorité du rat sur la souris.
Objectifs
Le projet a pour but le maintien d'une lignée de rat mucoviscidose. Ce modèle permettra de mieux comprendre la genèse de la pathologie, d'évaluer son impact sur les différents organes et sur le microbiote intestinal et pulmonaire et de proposer ou de tester des solutions thérapeutiques pour limiter l'expression de la maladie.
Bénéfices attendus
Mettre à disposition d'équipes de recherche un modèle pertient de la mucoviscidose pour répondre à leurs questions scientifiques sur le sujet.
Procédures
Les animaux recoivent une alimentation adaptée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de 10 jours jusqu'à leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux recoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson qui peuvent provoquer la production de selles molles depuis le sevrage jusqu'à l'âge de sortie du projet.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure en cas de prélèvement d'organes ou de matériel biologique post mortem ou ils seront inclus dans d'autres projets soumis à demande d'autorisation.
Remplacement
Pour la mucoviscidose qui touche de nombreux organes, il n'existe pas de modèle intégré in vitro reproduisant la compléxité de la pathologie et les interactions entre les différents organes touchés. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire et digestif, fonction testiculaire, ...). Des expériences ont montrées une supériorité du modèle rat sur le modèle souris avec un phénotype qui se rapproche plus de celui de l'humain.
Réduction
En fonction des demandes des équipes intéressées par le modèle, des tests statistiques seront réalisés à priori pour déterminer la taille des groupes expérimentaux en vue des différentes attendues (test de puissance) et/ou des tests à posteriori pour s’assurer de la validité statistique des résultats obtenus. En cas de projets en prévision ou en préparation, la lignée sera maintenue sous forme d'animaux porteurs d’une seule mutation ce qui permet d'avoir des animaux qui n’expriment pas la maladie et avec une alimentation conventionnelle (en effet, seuls les rats porteurs de 2 mutations expriment la maladie). Cela permettra la production des animaux d'intérêt au moment de la réalisation du projet. Si aucun projet n'est en prévision, la lignée sera conservée au maximum 12 mois à l'état respirant puis sera maintenue sous forme non respirante par conservation d’embryons congelés. Le maintien de la lignée à l’état respirant sur 12 mois correspond à peu près à une génération de rat (car les rats mâles peuvent être mis en reproduction jusqu'à cet âge) et permet d'éviter la décongélation de la souche cryoconservée qui est aussi consommatrice d'animaux. En effet les animaux obtenus nécessitent des accouplements sur une génération avec des animaux non consanguins pour éviter tout accouplement frère-sœur issus des embryons ce qui pourrait introduire un biais lié à la consanguinité
Raffinement
Des grilles de score seront mises en place pour détecter une altération du bien-être des animaux et prendre des mesures correctrices grâce à des points limites qui déclencheront une action curatrice ou une mise à mort des animaux si la souffrance ne peut pas être réduite. Un antalgique sera administré en cas de signe d'expression de douleur.
Choix des espèces
Le modèle rat a montré qu'à plusieurs égards qu'il est plus pertinent que le modèle souris. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire, fonction testiculaire, ...).
Maintien de lignées génétiquement modifiées chez la souris qui développent spontanément des tumeurs et utilisation d’une méthode de génotypage invasif pour l’étude des cancers du sein luminaux.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Importée des États-Unis puis élevée sur place pour réduire les coûts d'achat, la lignée MMTV-PyMT fournit les 2 040 souris de ce projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit à 21 jours l'amputation d'un millimètre de queue sous anesthésie, pour le génotypage. Les femelles porteuses du transgène développent des tumeurs mammaires à croissance rapide, avec métastases pulmonaires chez 80 à 90 % d'entre elles, ulcération possible de la tumeur, gêne mécanique et détresse respiratoire, avant d'être tuées pour prélever tumeurs et métastases. Les mâles sans transgène sont tués faute d'usage, les mâles porteurs et les femelles sans transgène restant en vie pour la reproduction.
Objectifs
Maintien de lignées génétiquement altérées pour développer des tumeurs mammaires spontanées pour l’étude de la formation des métastases des cancers du sein luminaux et caractérisation génétique de ces dernières par une méthode invasive. La biopsie sera utilisée afin d’extraire l’ADN de la souris et de réaliser un génotypage nous informant de l’altération génétique ou non des souris.
Bénéfices attendus
La lignée MMTV-PyMT est disponible commercialement mais l’obtention des animaux est couteuse car elle nécessite une importation des États-Unis. L’élevage permet donc de réduire les coûts et d’avoir des animaux vivants disponibles pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein luminaux. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour le prélèvement de tumeurs.
Procédures
Prélèvement de la queue (1mm) pour biopsie 1 fois sous anesthésie générale à l’isoflurane, durée inférieure à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. Le modèle MMTV-PyMT est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et souvent métastatique (80 à 90% des animaux développent des métastases pulmonaires spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose (mort cellulaire) et être associée à la formation d’ulcère entraînant une douleur pour l’animal. Les métastases pulmonaires peuvent entraîner de la dyspnée, de la polypnée, une respiration abdominale marquée et de la détresse respiratoire. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.
Devenir
Les animaux de sexe masculin n'exprimant pas le transgène seront euthanasiés. Les mâles exprimant le transgène et les femelles sauvages seront gardés en vie pour le maintien des lignées (reproduction). Les femelles exprimant le transgène seront mise à mort pour prélever le tissus tumoral et métastatique.
Remplacement
Génotypage : pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissu. Les souris générées dans ce projet permettront l’étude des mécanismes de la colonisation métastatique des cancers du sein luminaux. Il est très compliqué de mimer in vitro la formation de métastases. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau de l’organe métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité des cellules cancéreuses observée in vivo. L’élevage des lignées MMTV-PyMT permet de générer des tumeurs de cancer du sein luminal en conservant l’hétérogénéité des cellules cancéreuses et du stroma. Les cellules cancéreuses seront isolées et étudiées ex vivo avec des essais se rapprochant le plus des conditions in vivo comme la culture en 3 dimensions de tumoroïdes. Notamment, afin d’étudier le rôle de gènes d’intérêt, l’effet de l’amplification ou la délétion de ces gènes sera évalué ex vivo afin d’éliminer les gènes n’ayant pas d’effet sur les cellules cancéreuses. Les poumons prélevés serviront à étudier les métastases pulmonaires afin d’étudier l’environnement immunitaire mais également la présence de protéines d’intérêt impliquées dans la formation de celles-ci par immunofluorescence.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, un nombre minimum de deux cages de reproduction seront utilisés pour le maintien des lignées murines. Comme le croisement des souris MMTV-PyMT se fait avec un male hémizygote pour le transgène et une femelle sans transgène, seule la moitié des souris issue du croisement exprimeront le transgène. Parmi ces souris, seule la moitié sera de sexe féminin et développera une tumeur mammaire utilisée pour notre étude. D’après notre expérience, ces souris génèrent 8 souriceaux toutes les 3-4 semaines ce qui correspond à 2 souris avec le bon phénotype (femelle MMTV-PyMT). Avec deux cages, on estime obtenir 4 souris toutes les 3 semaines. Ces souris sont utilisées au laboratoire pour toutes nos expériences ex vivo. Ce nombre de cages nous permettra de réaliser 3 à 4 expériences par mois. Le nombre de cage sera réduit si nos besoins diminuent.
Raffinement
Génotypage : La biopsie de queue des animaux est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale à l’isoflurane (induction 5%, 1.5L d’air) en fonction de l’aisance du personnel. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. Le prélèvement est ensuite stocké au congélateur jusqu’à utilisation pour le génotypage. Lignée à phénotype dommageable : les souris femelles développent des tumeurs mammaires à partir de 53 jours. Le suivi tumoral se fera 2 fois par semaines avec un pied à coulisse puis quotidiennement lorsque les tumeurs atteignent environ 10 mm de diamètre. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront surveillés tous les jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle MMTV-PyMT de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie et concorde avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein luminal (S. Attalla et al. 2020). - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine Les animaux seront génotypé à 21 jours. Les souris MMTV-PyMT développent des tumeurs spontanées à partir de 53 jours avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 10-12 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant.
Gestion de la production d’animaux génétiquement modifiés pour l’étude des myopathies associées aux mutations STAC3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Nées avec une hypotonie, atteintes d'une faiblesse musculaire qui s'aggrave, exposées à un risque de mort peu après la naissance, les souris porteuses de deux copies altérées du gène STAC3 font partie des 840 souris de ce projet d'élevage, classé au niveau de souffrance sévère. Les interventions se limitent à la reproduction, huit couples par an et par lignée, six portées au maximum par femelle avant qu'elle ne soit tuée par dislocation cervicale ou réaffectée à un projet de phénotypage. Les souris entièrement privées de la protéine peuvent devenir paralysées et présenter des difficultés respiratoires, et un stress suffit à déclencher chez les mutantes une réaction dangereuse à la chaleur. Le tri des excédents intervient à trois semaines, dès le génotype connu, les animaux jugés inutiles étant tués et les autres transférés vers une autre autorisation où le phénotypage invasif est prévu.
Objectifs
Ce projet a pour objet le maintien, la reproduction contrôlée et la surveillance des lignées murines génétiquement modifiées, dont certains génotypes peuvent développer un phénotype musculaire sévère incluant une faiblesse marquée, une altération du couplage excitation-contraction et une atteinte histologique du muscle squelettique. La surveillance et la gestion de ces animaux à phénotype dommageable relèvent du cadre réglementaire de l’expérimentation animale. Ce projet garanti la disponibilité d’animaux reproducteurs porteurs des allèles d’intérêt pour les projets de recherche et de phénotypage rattachés à d’autres DAP.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet de maintien de lignée sont multiples. Il permet tout d’abord de préserver des modèles murins uniques dont la génération a été longue et complexe, évitant ainsi de devoir les régénérer et de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Ce maintien garantit également une disponibilité continue de reproducteurs et de descendants pour les projets de phénotypage et de recherche thérapeutique, ce qui assure la continuité et la planification des études sur les myopathies associées à ce gène. En optimisant les schémas de croisement et en limitant la production d’animaux excédentaires, le projet contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en améliorant la qualité et la reproductibilité des données obtenues. Enfin, ces modèles sont essentiels pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies rares et développer des stratégies thérapeutiques innovantes, tout en permettant le partage avec la communauté scientifique et en évitant la duplication de la génération de modèles.
Procédures
Les souris de cette lignée ne subissent que des interventions liées à la reproduction : mise en cohabitation contrôlée (à partir de 7 semaines d’âge, environ 8 couples maximum par an et par lignée, maximum 6 mois par femelle) et surveillance quotidienne rapide des portées (moins de 5 minutes par cage). Absence d’interventions invasives. Aucune opération chirurgicale, aucun prélèvement ni manipulation invasive n’est pratiqué. Les animaux utilisés pour la reproduction sont ensuite réaffectés à une autre autorisation d’expérimentation distincte. Les signes de la maladie (faiblesse musculaire sévère, difficultés respiratoires, posture anormale) apparaissent spontanément chez les souriceaux porteurs de deux copies altérées du gène de la souche de souris génétiquement modifiée modélisant la myopathie humaine dès la phase néonatale, juste après la naissance. Cela survient aussi chez les souris complètement absentes de la protéine ciblée.
Impact sur les animaux
1. Souris porteuses de la mutation responsable de la maladie humaine: Ces souris reproduisent les symptômes observés chez les patients atteints de la myopathie : elles naissent avec une hypotonie, développent une faiblesse musculaire qui s'aggrave progressivement, et peuvent présenter un retard de croissance avec perte de poids. On observe également des signes de mal-être général comme une prostration, des tremblements et une diminution des mouvements. Sous l'effet d'un stress, ces souris peuvent développer une réaction dangereuse à la chaleur. Un risque de décès peu après la naissance est possible. 2. Souris totalement privées de la protéine étudiée: Chez ces souris, l'absence complète de la protéine empêche le muscle de recevoir correctement l'ordre de se contracter envoyé par les nerfs. Cela peut provoquer une paralysie et, dans le cas où cette absence est déclenchée de façon ciblée et contrôlée après la naissance, des difficultés respiratoires peuvent apparaître.
Devenir
1) Reproducteurs hétérozygotes (asymptomatiques) : Maintenus jusqu'à infertilité/âge max (6 mois, 6 portées) puis mis à mort (dislocation cervicale) ou réaffectés à des DAP de phénotypage si aptes. 2) Excédents des contrôles et des mutants (souris porteuses de deux copies altérées du gène): Réaffectés à des DAP de phénotypage (DAP distincte: 60188) ou mis à mort immédiatement si non utilisés.
Remplacement
Aucune alternative non animale disponible ne permet de reproduire fidèlement le phénotype de cette myopathie. Les modèles cellulaires ou in silico ne recréent ni l’architecture musculaire complexe ni la réponse systémique observée chez l’animal vivant. Le recours au modèle murin est donc indispensable pour étudier la physiopathologie et développer des thérapies géniques. Ce projet s’inscrit dans un domaine où le remplacement n’est pas encore réalisable.
Réduction
Le nombre d’animaux est minimisé par l’optimisation des schémas de croisement, qui repose sur des calculs génétiques permettant de limiter la production d’animaux excédentaires, ainsi que par le maintien d’un nombre de reproducteurs suffisant mais restreint (12 reproducteurs par lignée). Les animaux non reproducteurs sont, lorsque cela est possible, utilisés comme contrôles dans d’autres projets, et ceux qui ne sont pas nécessaires (sexes ou génotypes sans intérêt) sont mis à mort rapidement selon les méthodes préconisées.
Raffinement
Une surveillance quotidienne est assurée dès la naissance pour les portées et tout au long de la vie des reproducteurs. Le nombre de portées est limité à 6 portées maximum par femelle pour éviter l’épuisement, avec un tri précoce des excédents à 3 semaines regroupant les animaux par cohorte de même portée. Les manipulations sont minimales et non invasives, avec des points limites précoces. Le personnel formé reconnaît les signes de douleur ou de stress, et le phénotypage invasif est exclu de cette DAP (procédures couvertes par DAP distincte).
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour l’étude des myopathies congénitales et du couplage excitation-contraction en raison de la conservation fonctionnelle des gènes et protéines impliquées entre l’homme et la souris. Les modèles murins reproduisent fidèlement les défauts musculaires, la faiblesse, l’hypotonie et la susceptibilité à l’hyperthermie maligne observées chez les patients, contrairement aux modèles non mammifères ou systèmes cellulaires. La souris offre une génétique bien caractérisée et un phénotypage fonctionnel (force in vivo/in situ, locomotion) compatible avec les objectifs. Les animaux sont utilisés jusqu’au stade adulte reproducteur (6 mois maximum). Au sevrage (4 semaines), les animaux contrôles et mutants (souris porteuses de deux copies altérées du gène) sont réaffectés à des projets de phénotypage ou mis à mort si excédentaires (dès connaissance du génotype) ; les souris porteuses d'une seule copie altérée du gène sont mis en accouplement dès 7 semaines pour optimiser la production d’allèles d’intérêt, ou mis à mort si excédentaires.
Création d’une lignée quadruple transgénique avec phénotype tumoral cérébral
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Créer une lignée de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau, puis mesurer l'effet de très faibles doses de rayonnements ionisants sur leur apparition : 240 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un seul des génotypes obtenus par croisement développe des tumeurs cérébrales agressives, avec perte de poids, baisse d'activité, troubles de la coordination et retard de croissance. Les autres serviront surtout à fournir des cellules pour des analyses en laboratoire, et les animaux gardés pour la reproduction sont tués lorsqu'ils franchissent un point limite. Le RNT affirme qu'"en dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique", alors que la tumeur cérébrale est précisément ce que la lignée est construite pour produire.
Objectifs
Nous créons une lignée de souris spécialement modifiée pour étudier les tumeurs du cerveau. Ces modifications n’agissent que dans les cellules nerveuses et permettent de mieux comprendre comment les cancers du cerveau se développent, afin d’aider à trouver de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
L’objectif est de disposer de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau afin de mieux comprendre pourquoi ces cancers, notamment chez les enfants, sont en augmentation. Le projet étudiera en particulier l’impact de très faibles doses de rayonnements ionisants. Pour cela, différentes conditions d’irradiation seront testées, sur le cerveau ou d’autres parties du corps, afin de mesurer leur influence sur l’apparition des tumeurs cérébrales.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques qui les rendent susceptibles de développer spontanément des tumeurs du cerveau. Ces tumeurs peuvent apparaître au cours de leur croissance et entraîner progressivement différents signes de maladie, comme une perte de poids, une baisse d’activité, des difficultés de coordination ou un retard de croissance. Ces animaux ne présentent pas de déficience immunitaire particulière, mais le risque principal pour leur bien-être est lié au développement de la tumeur cérébrale, qui peut provoquer des troubles neurologiques. Pour cette raison, ils font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou d’atteinte de leur état général. Des critères d’arrêt stricts sont définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. En dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique. Elles sont élevées dans des conditions standards de bien-être animal, avec des soins adaptés et une manipulation précautionneuse, afin de garantir les meilleures conditions de vie possibles tout au long de l’étude.
Impact sur les animaux
Parmi les différentes catégories de souris obtenues après les croisements, une seule développe des tumeurs cérébrales agressives. Ces animaux peuvent présenter des signes de maladie susceptibles d’affecter leur bien-être, comme un retard de croissance. Les autres groupes ne développent pas de symptômes importants. Ils restent en bonne santé et seront surtout utilisés pour obtenir des cellules destinées aux analyses en laboratoire.
Devenir
Tous les animaux seront gardés soit pour le maintien de la lignée ( hors groupe 3) soit à destination de l'expérimentation. Les animaux mis à mort dans le cadre de cette gestion de lignée sont les animaux qui préseront l'un des points limites cités précédement.
Remplacement
Les effets de certaines mutations sur le développement du cerveau, et en particulier les changements qui apparaissent lorsqu’une tumeur se forme, ne peuvent être compris qu’en observant comment le cerveau évolue dans un organisme vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de méthodes uniquement réalisées en laboratoire (in vitro) capables de reproduire toutes les interactions complexes qui se déroulent dans le cerveau. Les neurones, les cellules gliales, les vaisseaux sanguins et même la réaction inflammatoire travaillent ensemble d’une manière très précise, et ces processus sont encore impossibles à recréer complètement dans un modèle artificiel. C’est pour cette raison que l’étude sur l’animal reste nécessaire pour comprendre correctement la formation et la progression des tumeurs cérébrales.
Réduction
Le nombre de souris élevées est calculé avec soin pour répondre exactement aux besoins des projets scientifiques et pour maintenir la lignée, sans produire d’animaux inutiles. La reproduction est planifiée et ajustée en continu selon les demandes réelles. Des outils de suivi permettent d’éviter toute production excessive, et lorsque c’est possible, les animaux sont partagés entre plusieurs projets ayant des besoins similaires. Si des animaux ne sont pas utilisés, les prochaines portées sont réévaluées pour éviter de reproduire inutilement.
Raffinement
Le suivi sanitaire des animaux est réalisé quotidiennement, avec une surveillance renforcée des individus porteurs du génotype 3 (altérations de P53, PTEN et NBS sous le contrôle de Nestin-Cre), susceptibles de développer un phénotype délétère, notamment neurologique et/ou tumoral. Une attention particulière est portée à la détection précoce de toute altération de l’état général (perte de poids, piloérection, modifications du comportement, troubles locomoteurs). Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de limiter la douleur, la souffrance et le stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux stables lorsque leur état le permet, avec enrichissement du milieu (matériaux de nidification, abris). Les manipulations sont limitées au strict nécessaire et réalisées par du personnel formé, afin de réduire le stress lié à la contention. Pour les animaux présentant des signes cliniques, les conditions d’hébergement sont adaptées afin de limiter les contraintes et prévenir toute aggravation : accès facilité à la nourriture et à l’eau (dispositifs abaissés si nécessaire), réduction de la compétition alimentaire et surveillance accrue. Un isolement temporaire peut être réalisé lorsque nécessaire afin de prévenir les interactions délétères, tout en veillant à limiter le stress induit. La durée de maintien des animaux présentant un phénotype altéré est réduite au strict minimum nécessaire. La prise en charge de la douleur et de la souffrance repose sur une détection précoce et une adaptation rapide des conditions d’hébergement. En cas de dégradation de l’état général dépassant le niveau de gravité défini, une mise à mort réglementaire par CO₂ est réalisée conformément à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Dans ce contexte ce modèle n’est pas remplaçable. Sagissant de reproduction d'animaux, ils seront utilisés à l'âge minimum de 9 semaines de vie. Pour le developpement de tumeurs les souris seront utilisees entre 20 semaines et 52 semaines.
Restauration d’une ovogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par une nouvelle thérapie in vivo 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Les souriceaux chez qui apparaît un phénotype jugé dommageable sont mis à mort aussitôt, et la lignée entière peut l'être. 594 souris vont être utilisées, 522 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 72 d'un niveau léger, pour tester une injection d'ARN messager dans l'ovaire censée restaurer la fertilité. Les mâles subissent une vasectomie de trente minutes puis sont utilisés pendant un an pour rendre des femelles pseudo-gestantes, les femelles reçoivent deux injections hormonales puis une chirurgie de vingt minutes pour la réimplantation d'embryons, ou une chirurgie de trente minutes pour l'injection intra-ovarienne. Le porteur affirme que "l'infertilité en elle-même n'entraîne pas d'effet indésirable pour les animaux", alors que les femelles sont tuées pour la récupération de leurs ovocytes et que les ovaires sont prélevés pour vérifier la restauration. Une partie des souris pseudo-gestantes est gardée en vie pour l'allaitement ou pour des tests menés par d'autres utilisateurs.
Objectifs
La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.
Bénéfices attendus
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.
Procédures
Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.
Raffinement
Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique
Choix des espèces
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.
Restauration d’une ovogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par une nouvelle thérapie in vivo 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Les souris qui développent un phénotype dommageable pendant la création des lignées sont tuées immédiatement, et le porteur prévoit de supprimer la lignée entière le cas échéant. 594 souris vont être utilisées pour mettre au point une injection d'ARN messager dans l'ovaire, censée restaurer la fertilité de femmes dépourvues d'ovocytes, dont 522 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent deux injections hormonales, une chirurgie de vingt minutes pour recevoir des embryons ou de trente minutes pour l'injection intra-ovarienne, et des mâles sont vasectomisés en trente minutes d'opération. Une partie est tuée pour prélever ovocytes ou ovaires, quelques femelles restent en vie pour allaiter ou pour d'autres tests, et les animaux circulent entre deux établissements.
Objectifs
La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.
Bénéfices attendus
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.
Procédures
Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.
Raffinement
Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique
Choix des espèces
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.
Prélèvement invasif de tissu pour la caractérisation de lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des pathologies osseuses
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une biopsie d'oreille, un tatouage sur les coussinets, et pour les souris dont la mâchoire inférieure pousse trop en avant, une coupe des dents jusqu'à deux fois par semaine. 20 400 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un projet qui ne couvre que l'élevage, le marquage et l'analyse des gènes de lignées destinées à l'étude des maladies osseuses. La mâchoire déformée est un phénotype dommageable produit par la modification génétique elle-même, et le porteur ramène la coupe des dents à une douleur et un stress de courte durée. Les animaux trop âgés pour se reproduire, stériles, ou dont le génotype n'est pas celui attendu sont tués.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création et le maintien de lignées de souris génétiquement modifiées permettant l’étude des mécanismes impliqués dans la formation de l'os dans un contexte physiologique mais aussi pathologique. Cette demande de projet concerne strictement l’élevage, le marquage et l’analyse des gènes de ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de générer et de maintenir des modèles de souris permettant l’étude des mécanismes impliqués dans les maladies osseuses afin d'envisager des approches thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes permettra d’améliorer les traitements à destination des patients atteints de ces maladies.
Procédures
Prélèvement de tissu à l'oreille sur animal vigile (1 fois, 5 secondes); tatouage sur les coussinets (1 fois, 5 secondes); coupe de dents pour les animaux présentant une mâchoire inférieure trop avancée (maximum 2 fois par semaine, 15 secondes); application d'une solution de désinfection et de pommade anti-septique si une infection est constatée à l'endroit de la biopsie (1 fois par jour, maximum 3 jours de suite).
Impact sur les animaux
La contention, la biopsie et le tatouage peuvent provoquer un stress léger chez l’animal. La coupe des dents due au phénotype dommageable (mâchoire inférieure trop avancée) provoque une douleur et un stress de courte durée.
Devenir
A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux trop âgés pour se reproduire ou stériles sont mis à mort, ou si leur génotype n’est pas celui attendu.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant, car le squelette entier à différents âges est étudié. Il s’agit ici d’études sur la formation et la croissance osseuse, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle hors du vivant, ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien les projets de recherche. Les modèles souris miment de nombreuses pathologies et sont impliqués dans de différents projets.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi adapté. Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Des points limites spécifiques ont été établis. Tout animal en souffrance recevra un soin adapté (compression, application de pommade anti-septique). Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du squelette, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux de son développement du squelette entre les rongeurs et l’Homme. De plus, de nombreux outils d'analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Afin de permettre l’identification des souris et l’analyse de leurs gènes avant leur sevrage, le tatouage des coussinets et le prélèvement d'oreille sont effectués entre 7 et 10 jours de vie.
Prélèvement de tissu pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour la caractérisation du rôle des phospholipases A2 sécrétées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Renouveler l'autorisation d'une méthode de prélèvement de tissu : cet objectif engage 1 500 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Deux millimètres du bout de la queue leur sont coupés sur animal vigile, en dix secondes, avant le vingt-et-unième jour de vie. Celles dont le génotype ne correspond pas à ce qui est recherché sont tuées, les autres partent vers un projet autorisé, restent en élevage pour maintenir la lignée, ou sont tuées avec ou sans prélèvement. Le porteur affirme que les méthodes non invasives testées par son équipe n'ont pas donné de résultats exploitables, sans dire lesquelles.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale. Dans le cadre de certains projets scientifiques, des lignées d’animaux sont développées et élevées. Pour maintenir ces lignées et fournir des animaux adaptés à ces projets, il est donc important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer des lots expérimentaux homogènes et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasives. L’objectif de ce projet est de renouveler l'autorisation pour la méthode de prélèvement utilisée par notre équipe afin de caractériser les souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une sélection des animaux d’intérêt et ainsi une optimisation de la gestion et de l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour les projets scientifiques autorisés.
Procédures
Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress inhérent à la préhension et à la contention des animaux et la douleur lors du prélèvement du tissu.
Devenir
Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas donné de résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre de projets scientifiques autorisés.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans des projets scientifiques autorisés ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - Seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement entre individus de même génotype).
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée, ce qui permet de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de poser de nombreuses questions scientifiques en biologie fondamentale, environnementale, santé humaine et animale avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces, dont l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives...). Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés dans les 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité distale de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Création d’un modèle de souris mutante pour l’étude des capacités antivirales d’un facteur immunitaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tout ce projet consiste à fabriquer deux lignées de souris invalidées pour un gène de défense antivirale. 412 souris y sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent jusqu'à cinq injections hormonales en 48 heures, certaines subissent une chirurgie de quinze minutes, et des mâles sont vasectomisés pour rendre des femelles pseudogestantes. 24 souris transgéniques de troisième génération sont conservées pour propager les lignées et subir une infection grippale, tout le reste est tué, y compris les mâles vasectomisés devenus trop vieux à la fin du projet.
Objectifs
Ce projet cherche à établir une lignée de souris transgéniques qui permettra de comprendre comment une protéine d’intérêt aide notre corps à se défendre contre les virus. Des premiers résultats montrent qu’elle pourrait empêcher les virus de se multiplier dans nos cellules. Mais pour vraiment comprendre son rôle, il faut observer ce qui se passe dans un organisme entier, car le système immunitaire est très complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à créer des animaux génétiquement modifiés qui permettront de mieux comprendre comment notre corps se défend contre les virus qui attaquent nos poumons. Le but est d'observer comment l'absence ou la présence de cette protéine modifie la façon dont l'organisme réagit à une infection. Ces recherches permettront de mieux comprendre comment lutter contre les virus et pourraient aider à développer de nouveaux traitements. À long terme, elles pourraient aussi nous aider à mieux faire face aux épidémies et aux infections graves.
Procédures
Pour les injections, chaque souris est injectée au maximum 5 fois (sur une durée de 48h). Ces interventions sont rapides (une injection dure quelques secondes). Les interventions chirurgicales sous anesthésie générale sont réalisées une fois et durent une quinzaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les souris concernent : (1) douleurs liées aux injections, et 2) risques d’infection ou hémorragies et douleurs liées aux interventions chirurgicales. Les souris pourront subir jusqu’à cinq injections, pouvant provoquer une légère douleur comparable à une piqûre. Certaines auront également une intervention chirurgicale d’environ 15 minutes, entraînant des douleurs modérées pendant quelques jours le temps de la cicatrisation. Aucun effet négatif particulier lié aux hormones n’est attendu, mais le bien-être des animaux sera surveillé attentivement.
Devenir
Tous les animaux ayant servi à la création et au développement des lignées seront mis à mort, à l’exception de 4 mâles et 8 femelles transgéniques (troisième génération) qui seront conservés pour chacune des deux lignées afin de propager ces lignées et réaliser l’analyse de leur résistance à une infection virale influenza. A la fin du projet, les mâles vasectomisés seront trop vieux pour être utilisés et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Notre recherche porte sur le rôle d’un gène dans la défense contre les virus. Pour bien comprendre son fonctionnement, nous devons étudier ce qui se passe dans un organisme vivant entier, et pas seulement sur des cellules en laboratoire. En effet, la réponse du corps face à une infection est très complexe. Elle implique la coopération de plusieurs systèmes (comme le sang, les ganglions lymphatiques et les tissus infectés) et la mobilisation coordonnée de différentes cellules immunitaires. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière fiable en dehors d’un organisme vivant. De plus, certains aspects importants (comme la manière dont un virus se propage dans le corps, les organes qu’il infecte, ou encore les réactions inflammatoires) ne peuvent être observés que chez un organisme complet. C’est pourquoi nous utilisons des modèles animaux, en particulier des souris génétiquement modifiées qui ne possèdent pas ce gène. Cela nous permet de mieux comprendre son rôle réel dans la défense contre les infections et dans la mémoire immunitaire.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire au projet a été optimisé pour permettre la production de huit souris mutantes pour un gène d’intérêt et l’obtention au final de deux lignées de souris invalidées pour le gène d’intérêt. Ces lignées de souris n’existent pas actuellement. Ce nombre est basé sur l’expérience du laboratoire pour la production de lignées de souris transgéniques avec ces outils et à l’aide des principes généraux fournis par le guide européen « animaux génétiquement altérés » pour la procédure d’évaluation du bien-être animal des deux lignées créées.
Raffinement
Toutes les souris (mâles, femelles et juvéniles) seront élevées en groupe avec un enrichissement dédié dans chaque cage (maison en carton et coton). Les souris mâles adultes vasectomisées utilisées pour les accouplements seront hébergés avec des femelles de compagnie (souvent de vieilles femelles). Une observation quotidienne des animaux sera réalisée pour évaluer leur bien-être et en cas de douleur suspectée par l’évaluation quotidienne des animaux, une injection d’analgésique sera administrée en sous-cutanée. Des analgésiques seront administrés en pré-opératoire et en post-opératoire en sous-cutané. Du gel sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire au cours des interventions chirurgicales. Les interventions chirurgicales seront réalisées sur un tapis thermorégulé afin d’éviter toute hypothermie, sous anesthésie et analgésie. Des points limites seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour deux raisons principales. D'abord, c'est un animal dont on peut facilement modifier l'ADN en manipulant des œufs juste après fécondation: cela nous permet de « désactiver » certains gènes pour comprendre leur rôle et de modifier ainsi le génome dans toutes les cellules de l’animal, y compris les cellules germinales (transmission alors du génotype par reproduction sexuée). Ensuite, la souris est un modèle couramment utilisé pour étudier la réponse aux infections grippales. Le virus s'attaque aux mêmes organes et provoque une maladie respiratoire très proche de celle de l'être humain, ce qui en fait un excellent modèle pour tester des traitements. Pour la production de la lignée génétiquement modifiée, nous utiliserons des souris adultes. Pour la caractérisation du bien-être de la lignée, nous utiliserons des souris des stades nouveau-né à adulte.
Production des lots expérimentaux et maintien de lignées murines d’intérêt pour l’étude de la myélinisation et de la remyélinisation, avec prélèvement invasif pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un prélèvement de tissu de quelques secondes, pratiqué sur des souriceaux de 7 à 10 jours maintenus éveillés : c'est tout l'objet de ce projet, qui engage 13 206 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le geste sert à trier les animaux selon leur génotype pour alimenter des recherches sur la myéline. 3 285 souris porteuses des mutations recherchées sont maintenues en vie et transférées vers d'autres projets, les autres sont proposées en don à d'autres équipes ou tuées, le porteur indiquant qu'il ne sera pas possible de les replacer du fait de leur modification génétique. Une partie des lignées porte un risque accru d'infection, conséquence de la modification elle-même.
Objectifs
La myéline agit comme une gaine isolante autour des prolongements des cellules nerveuses pour permettre une conduction rapide de l’influx nerveux et assurer une protection des fibres nerveuses. Lorsqu’elle est lésée cela engendre des atteintes neurologiques sévères qui se traduisent par des troubles moteurs, sensitifs et cognitifs, tels que ceux rencontrés dans la sclérose en plaques (environ 2,9 millions de personnes dans le monde). Nous nous intéressons aux mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la formation et la réparation de la gaine de myéline dans le cerveau et la moelle épinière. L’objectif de nos projets est tout d’abord de comprendre le rôle de certaines protéines et de gènes dans ces processus et de les étudier dans un contexte in vivo au cours du développement et de la réparation de lésions de la gaine de myéline. Nous étudions également l’efficacité de certaines approches thérapeutiques pour favoriser la réparation de la gaine de myéline. Pour répondre à ces différentes questions scientifiques, il est nécessaire de recourir à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. L’objectif de ce projet sera donc d’identifier le patrimoine génétique des souris génétiquement modifiées à l’aide d’un prélèvement invasif afin de pouvoir ensuite utiliser les souris porteuses des mutations génétiques d’intérêt pour nos projets de recherche.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice de ce projet sera de connaitre les animaux porteurs des mutations génétiques d’intérêt nécessaires pour la réalisation de nos projets de recherche. Les bénéfices à plus long terme sont donc directement liés à ces différents projets. Les études réalisées à partir de ces animaux permettront d’acquérir des nouvelles connaissances sur les mécanismes de formation de la gaine de myéline en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue scientifique cela pourra permettre d’identifier l’implication de certains gènes ou mécanismes cellulaires dans les processus de myélinisation au cours du développement (formation de la gaine de myéline) ou dans les processus de démyélinisation et remyélinisation du système nerveux (respectivement lésions et réparation de la gaine myéline). Les animaux produits nous permettront également d’évaluer de nouvelles molécules à visée thérapeutiques agissant sur la remyélinisation. Si des molécules s’avèrent efficaces chez ces souris cela pourra participer à l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour promouvoir la remyélinisation chez des patients atteints de maladies démyélinisantes, comme la sclérose en plaques.
Procédures
Un petit prélèvement de tissu sera réalisé sur l‘ensemble des animaux afin de connaitre leur patrimoine génétique. Cette procédure a lieu sur animaux vigiles, une seule fois et dure quelques secondes. En cas de problème technique (très rare) un deuxième prélèvement pourrait être fait (1 seule fois, moins d’une minute, animal vigile).
Impact sur les animaux
L’animal pourra ressentir une légère douleur lors du prélèvement pour connaitre son patrimoine génétique. Il existe également un risque rare de saignement. De plus l’animal peut ressentir un léger stress lors de la prise en main pour la réalisation du geste. La mutation génétique d’une petite partie des animaux sera associée à un risque augmenté de contracter des infections.
Devenir
Les animaux ayant les modifications génétiques d’intérêt pour nos projets de recherche seront maintenus en vie et transférés dans ces projets pour une utilisation continue (3285). Tous les animaux qui n’entreront pas dans nos projets seront proposés en don à d’autres équipes de recherche ou seront euthanasiés car il ne sera pas possible de les réutiliser ou les replacer du fait de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre les mécanismes de réparation de lésions de la myéline du système nerveux central en prenant en compte toute sa complexité. Suivant le principe de remplacement, des études in vitro sont réalisées et permettent de comprendre certains aspects et mécanismes impliqués dans les processus étudiés avant le passage au modèle animal. En revanche, il est indispensable dans le cadre de nos questions scientifiques, de passer par une approche chez le mammifère vivant afin de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau et de leurs interactions . De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision le moment d’activation ou d’inactivation de gènes d’intérêt afin de répondre à nos questions scientifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux de ce projet (13206) sera limité au strict nécessaire pour permettre de fournir les lots expérimentaux nécessaires pour nos projets de recherche en cours ou à venir. Dans ces projets les effectifs d’animaux ont été calculés pour chaque type d’analyse afin d’obtenir des données statistiquement exploitables. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin d'obtenir uniquement le nombre de petits nécessaires. Nous privilégierons certains types de croisements pour éviter de générer des animaux non porteurs des modifications génétiques d'intérêt. Dans l’esprit d’une réduction, nous proposerons aux autres équipes de recherche en don nos animaux qui ne seraient pas porteurs des modifications génétiques d’intérêt pour nos projets. Si certaines lignées n’ont plus besoin d’être utilisées provisoirement elles pourront être cryo-préservées, permettant de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Une période d’acclimatation de 1 semaine sera respectée lorsqu’ils proviendront de fournisseurs extérieurs. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement composé au minimum d’un carré de coton et de bâtonnet de bois à ronger. Ils bénéficieront d’eau et de nourriture (adaptée au stade physiologique) à volonté. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant que toute anomalie soit transmise à l’équipe de recherche, à la structure chargée du bien-être animal et au vétérinaire afin d’assurer une prise en charge optimale de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Le prélèvement de tissu réalisé pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera rapide et de la plus petite taille possible. Le geste est pratiqué en routine par du personnel expérimenté, dans une pièce dédiée, au calme. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal afin d’éviter tout risque d’infection ou de contamination croisée. Les petits seront déplacés dans leur cage et avec leur mère, et replacés immédiatement après le geste avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. Nous les surveillerons immédiatement après le geste puis environ 20 à 30 minutes après. La modification génétique de certaines lignées peut dans certains cas entrainer une mortalité chez les animaux, afin d’éviter cela nous choisirons des schémas d’accouplement permettant d’éviter tout risque. Pour d’autres cela engendrera un risque augmenté d’infection dans ce cas nous adapterons les conditions d’hébergement pour prévoir tout développement d’infection. En effet, ces animaux seront hébergés en zone protégée des organismes pathogènes et opportunistes, les pratiques seront raffinées contre les risques de contamination (asepsie lors des chirurgies, changements de gants réguliers) et enfin en cas de signes de mauvaise santé (stress, comportements anormaux ou signe d’infection), nous solliciterons un avis auprès des vétérinaires pour adapter la prise en charge au signe observé.
Choix des espèces
Dans notre projet de recherche, nous utilisons des modèles alternatifs in vitro (cultures cellulaires) et ex vivo (cultures tranches de tissus). Cependant, il est indispensable de comparer ces données avec un modèle in vivo de cerveau de mammifère. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche sont disponibles essentiellement chez cette espèce. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à nos projets sont aussi uniquement disponibles chez la souris. L’utilisation de ces lignées de souris génétiquement modifiées nous permettra d’étudier la fonction de gènes spécifiques et leur rôle dans les processus de lésion ou de réparation de la myéline. Dans ces projets expérimentaux dédiés nous utiliserons les animaux à différents âges en fonction de nos objectifs scientifiques et analyses. Dans le présent projet les animaux seront prélevés d’un petit bout de tissu pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre leurs modifications génétiques très tôt.
Étude fonctionnelle de gènes pertinents dans l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique chez le poisson-zèbre – EU1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un supplément de 30 % est ajouté à l'effectif pour absorber la mortalité et les variations du sex-ratio, ce qui porte le projet à 27 116 poissons zèbres, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Douze gènes sont inactivés séparément pour provoquer des déformations de la colonne vertébrale, un morceau de nageoire caudale est prélevé sous anesthésie pour le génotypage, et chaque poisson attend seul dans son bac jusqu'à quatorze jours le résultat de cette analyse. Les animaux font ensuite jusqu'à dix trajets vers un centre d'imagerie et cinq passages sous anesthésie, à 8 semaines puis à 3, 4, 6 et 12 mois, pour suivre la progression de la déformation. Le porteur retient le poisson zèbre justement parce qu'il n'a pas de membres pour compenser une torsion de la colonne, contrairement aux quadrupèdes, et attend une déformation qui n'empêche ni de nager ni de se nourrir.
Objectifs
La scoliose idiopathique adolescente est une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale qui touche 1 à 3 pourcents des enfants et adolescents, et dont l’origine reste aujourd’hui inconnue. Notamment, les mécanismes génétiques conduisant à cette déformation sont très mal élucidés. Ce projet aura pour objectif de mieux les comprendre. Il repose sur l’étude de familles présentant des cas de scoliose idiopathique, ainsi que sur l’analyse de modèles de poisson-zèbres mutants ayant développé des déformations vertébrales. L’analyse familiale, combinant l’analyse des déformations et une analyse génétique, a permis l’identification de six gènes d’intérêt. Par ailleurs, six autres gènes ont été mis en évidence à partir de lignées de poissons-zèbres mutants présentant des déformations vertébrales. Nous utiliserons dans ce projet des poissons zèbre et inactiverons séparément les gènes d’intérêt identifiés comme impliqués dans la déformation de la colonne vertébrale, afin d’étudier leur rôle dans l’apparition de la scoliose. Nous réaliserons chez ces poissons une analyse clinique par imagerie visant à détecter des déformations similaires à celles observées chez les patients, et nous étudierons leur comportement. Ce projet se réalisera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la scoliose idiopathique et, à terme, sa prise en charge. En étudiant le rôle de douze gènes candidats à l’aide de modèles de poissons-zèbres mutants, il permettra d’identifier les mécanismes biologiques à l’origine des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale et de mieux caractériser les facteurs génétiques impliqués. La validation de l’implication de certains gènes contribuera à enrichir les connaissances fondamentales sur la physiopathologie de cette pathologie encore largement méconnue. Ces avancées pourraient, à plus long terme, avoir des retombées cliniques significatives. D’une part, une meilleure identification des déterminants génétiques pourrait permettre le développement d’outils diagnostiques plus précoces et plus précis, fondés sur l’analyse du génome. Cela favoriserait une meilleure anticipation de l’évolution de la scoliose, notamment en termes de sévérité, et une adaptation plus précoce de la prise en charge. D’autre part, l’identification des voies moléculaires impliquées pourrait ouvrir la voie, à plus long terme, à des approches thérapeutiques ciblées. Ce projet s’inscrit ainsi dans une perspective de médecine personnalisée, visant à mieux évaluer le risque individuel en fonction du profil génétique des patients et à adapter en conséquence les stratégies de suivi et de traitement, qu’il s’agisse de mesures conservatrices (comme le port d’un corset) ou d’interventions chirurgicales. En résumé, ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances sur les facteurs de risque de la scoliose idiopathique afin d’améliorer, à terme, le diagnostic, le suivi et la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux sera testée sur le comportement (Etablissement 1) alors qu’une partie sera imagée pour caractérisation des déformations de la colonne vertébrale (Etablissement 2). Etablissement 1 : Afin de connaitre le patrimoine génétique des poissons zèbre génétiquement modifiés, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale est réalisé sous anesthésie générale. Un seul prélèvement est effectué par animal et ce en moins de 2 minutes. En attendant les résultats du génotypage (14 jours maximum), les poissons sont hébergés individuellement afin de garantir leur identification et d’éviter des confusions d’identification. Pour les études des comportements, les poissons seront transférés individuellement dans les arènes afin d’être filmé dans un temps limité (1h, 4 sessions au total). Etablissement 2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (établissement 1) jusqu’au centre d’imagerie (établissement 2) pour la réalisation d’une imagerie aux stades de 8 semaines, puis 3 ,4, 6, 12 mois. La durée du trajet est inférieure à 1h (animal vigile, 10 trajets au total). L’imagerie a lieu sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes pour chaque animal (5 sessions au total). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création (6 gènes) ou la maintenance (6 gènes) de lignées mutantes pour ces 12 gènes au total (établissement 1), le phénotype dommageable attendu correspond à une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale sans impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter. Nous ne pouvons pas exclure que l’inactivation d’un des gènes puisse entrainer en outre des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance ou leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique (établissement 1) est une petite plaie associée à un inconfort de courte durée. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale qui génèrera un potentiel risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie, ce risque sera minime en raison de la très courte durée de l’anesthésie ainsi que la faible profondeur de narcose. Les animaux devront être hébergés seuls dans l’attente des résultats du génotypage (14 jours maximum) ce qui génèrera un stress. Le protocole d’imagerie (établissement 2) est réalisé sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes, ce qui peut entrainer un risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie. Les tests comportementaux (établissement 1) seront associés à un stress social pour les poissons en raison du changement d’environnement et de l’individualisation (1h) nécessaire pour le test. La manipulation des poissons à l'aide d'une pipette en plastique peut également être source de stress et présenter un risque de blessure mécanique pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés, une partie afin de faire des analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, et l’autre partie car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Les études de l’effet de mutations génétiques sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la forme de la colonne vertébrale ni de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de l’absence de contact au sol via des membres, sont facilement susceptibles de développer des torsions axiales de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) et constituent ainsi un modèle de choix pour l’étude des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale rappelant les scolioses idiopathiques chez l’humain.
Réduction
Le projet prévoit l’utilisation de 27 116 poissons zèbres. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, l’effectif a été défini en tenant compte : (i) des stades clés du développement pertinents pour tester les hypothèses du projet en incluant des poissons mâles et femelles ; (ii) de la répartition génétique attendue lors de croisements ; (iii) du nombre minimal d’animaux requis pour détecter des effets morphologiques, estimé à partir d’analyses statistiques issues d’études pilotes; (iv) du taux de mortalité entre le stade larvaire (6 jours) et l’âge adulte (3 mois) lié à la sensibilité de l’espèce aux conditions environnementales durant le développement précoce et v) des variations de l’environnement impactant la survie, la reproduction et le ratio male-femelle. Pour réduire le nombre d’animaux à élever, nous mettrons en place un protocole de génotypage au stade larvaire, en commençant par les gènes tph2 et uts2r. La réussite de ce protocole pourrait permettre de génotyper les animaux dès le stade larvaire, puis de n’élever que ceux nécessaires à la procédure 2 et la procédure 3. L’identification rapide des mutations impliquées dans des anomalies du développement reposera sur l’analyse de larves âgées de 2 à 6 jours (hors champ de la directive). L’inactivation du gène d’intérêt sera réalisée par une méthode d’édition génétique ciblée permettant d’observer rapidement les effets phénotypiques chez les larves et les jeunes poissons de la première génération. Pour nos calculs de puissance, nous utilisons nos résultats précédents sur des gènes impliqués dans les déformations. Nous utilisons un calculateur basé sur un t-test indépendant qui compare des animaux injectés contrôles à des animaux chez lesquels le gène ciblé a été modifié. Les tests statistiques utilisés dans nos publications sont des modèles linéaires à effets mixte qui tiennent compte de la taille de la ponte, de l’effet ponte en plus du génotype. Nous utiliserons au maximum 27 116 poissons zèbres, répartis en quatre lots expérimentaux. Du fait de variations de l’environnement impactant la survie et le ratio male/femelle, un delta maximum de 30 pourcents est ajouté.
Raffinement
Afin de limiter les procédures invasives, le prélèvement pour identifier le patrimoine génétique des poissons génétiquement modifiés sera réalisé préférentiellement sur de très jeunes larves par une méthode non invasive. Si cela n’est pas possible nous aurons recours à un prélèvement invasif sur les poissons adultes. Dans ce cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal sous anesthésie générale, par manipulation atraumatique, avec un prélèvement le plus petit possible et à l'aide d'instruments désinfectés. Les poissons seront maintenus en hébergement individuel uniquement pendant la durée nécessaire à l'identification génétique, pour une durée typiquement de 7 jours et exceptionnellement jusqu' à 14 jours maximum en cas de difficultés rencontrées pour les analyses. Cette durée sera toujours la plus courte possible, dès les résultats connus les animaux seront remis en groupe. Les poissons de lignées génétiquement modifiés présenteront une déformation de la colonne vertébrale qui ne doit pas impacter leur capacité à se nourrir ou se déplacer. Nous assurerons un suivi et une prise en charge spécifique pour ces animaux, si nécessaire, pour limiter au maximum l’impact de cette déformation sur leur bien-être et leur état général. Lors des tests comportementaux les poissons seront habitués à la salle de comportement pendant 30 minutes avant le début des tests afin de réduire leur stress. Lors des analyses morphologiques, le transport des poissons vers un site d'imagerie est organisé de manière à limiter le stress, avec des contenants adaptés, un contrôle de la température et un temps de trajet réduit au minimum. Toutes les manipulations seront réalisées de manière douce et calme, avec le matériel adapté et de façon à réduire au maximum le stress induit pour les animaux. Tous les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration entre les équipes de recherche, l’équipe vétérinaire et la structure chargée du bien-être animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des poissons.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre partage environ 70 pour cent de son génome avec l'humain et peut être modifié génétiquement avec succès par injection d'outils d'édition génique dans ses œufs. Dès l’âge de 3 mois, les poissons zèbre se reproduisent fréquemment, avec un seul couple adulte pouvant pondre plusieurs centaines d'œufs. Dans le cadre de l'étude de la scoliose, une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont peu adaptés. Le soutien apporté par leurs membres antérieurs leur permet de compenser partiellement cette déformation et d'en limiter la progression. Le poisson-zèbre, en revanche, constitue un modèle pertinent pour l'étude des déformations vertébrales. Sa colonne vertébrale présente des similitudes structurelles avec celle de l'humain, avec une organisation longitudinale composée de vertèbres mobiles et de disques intervertébraux organisés en plusieurs segments. L'analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par tomodensitométrie chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études antérieures. La génération et le maintien des lignées seront réalisés à partir de poissons âgés de 3 à 18 mois. Le prélèvement pour génotypage sera effectué au stade larvaire (2 à 3 jours jours post-fécondation) lorsque possible ou sur des adultes de 3 à 6 mois, âge optimal permettant une bonne récupération après anesthésie et limitant l’impact du prélèvement grâce à leur taille. L’analyse comportementale portera sur les stades larvaires de 1 à 4 semaines, période durant laquelle le comportement de recherche de nourriture est essentiel au développement, alors que les altérations morphologiques ne sont pas encore visibles. Cette fenêtre permettra de détecter d’éventuelles anomalies comportementales précoces. L’évolution du phénotype de scoliose sera étudiée par imagerie à 2 mois (stade juvénile à forte croissance, comparable à l’aggravation pubertaire chez l’humain), puis à 3, 4, 6 et 12 mois (stade adulte). Cette approche longitudinale permettra de suivre la progression de la déformation spinale au cours du temps. Le génotypage sera effectué au stade adulte et quand c’est possible sur des larves âgées de 1 à 6 jours post-fécondation.
Production des lots expérimentaux et maintien de la lignée murine modèle de l’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1, avec prélèvement invasif pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Génétiquement modifiées pour reproduire une ataxie neurodégénérative rare, une partie des souris développe des troubles moteurs légers dès huit jours. 4 392 animaux vont être utilisés dans des procédures classées légères, pour maintenir et génotyper cette lignée modèle de la maladie AOA1. Le génotypage repose sur un prélèvement de tissu invasif, réalisé une fois par animal sur souris vigile. Selon leur patrimoine génétique, certaines sont orientées vers d'autres projets de recherche, les autres tuées faute de pouvoir être réutilisées ou placées.
Objectifs
L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurodégénérative rare caractérisée par une dégénérescence d’une zone cérébrale spécifique. Cette pathologie est liée à une mutation génétique qui conduit à une incapacité à réaliser des mouvements volontaires et un handicap moteur sévère. La mise au point d’un traitement pour l’AOA1 est cruciale pour les patients atteints de cette maladie qui ne bénéficient actuellement d’aucune solution thérapeutique. Il existe un modèle murin de la pathologie pertinent pour l’évaluation de stratégie thérapeutique avant leur évaluation chez l’Homme. L’objectif du projet sera de réaliser des prélèvements invasifs de tissu permettant de connaitre le patrimoine génétique des animaux produits afin de maintenir la colonie de ce modèle murin génétiquement modifié, pour permettre par la suite de tester différentes approches thérapeutiques dans des projets dédiés.
Bénéfices attendus
L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurodégénérative rare de la famille des ataxies cérébelleuses autosomiques récessives. Ce trouble neurologique héréditaire se caractérise par une ataxie cérébelleuse à début précoce (âge moyen d’apparition : environ 4 ans) et entraine un handicap moteur sévère, avant l’âge de 25 ans. A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour les patients. Le bénéfice du projet sera de connaitre le patrimoine génétique des animaux que nous produisons afin de maintenir une lignée de souris génétiquement modifiées, modèle de cette pathologie. Ceci nous permettra de générer des lots expérimentaux pour différents projets de recherche portant sur l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’AOA1. A plus long terme ce projet pourrait donc permettre d’améliorer les connaissances sur l’AOA1 et contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
Afin de connaitre leur patrimoine génétique tous les animaux produits auront un petit prélèvement de tissu, effectué une fois sur animal vigile (moins d’une minute par animal). Dans de très rares cas (problème technique), un deuxième prélèvement pourra être nécessaire (1 fois, moins d’une minute par animal, vigile). Une partie des animaux présentera des troubles moteurs légers détectables à partir de l’âge de 8 jours mais qui ne présenteront pas d’impact significatif sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique. Il existe également un risque de saignement à la suite du prélèvement. Ils pourront ressentir un stress lors des manipulations. Une partie des animaux du projet peuvent présenter des légers troubles moteurs liés à leurs modifications génétiques (phénotype dommageable) observables à partir de l’âge de 8 jours, mais qui n’entrainent pas d’effets indésirables significatifs.
Devenir
En fonction de leur patrimoine génétique, une partie des animaux sera dirigée vers d’autres projets de recherche, en utilisation continue. Tous les autres animaux seront euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets ou replacés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Il a été démontré qu’un modèle cellulaire d’AOA1 peut être généré à partir de cellules souches de patients. Bien que ce modèle cellulaire constitue un outil pertinent pour l’étude des altérations moléculaires et cellulaires associées à la pathologie, il présente des limitations majeures. En particulier, il ne permet pas de reproduire le phénotype ataxique ni d’évaluer les conséquences fonctionnelles et comportementales de la maladie. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal apparaît indispensable afin de reproduire de manière adéquate les troubles moteurs et neurodégénératifs observés chez les patients. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de recourir à des études pré-cliniques chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’AOA1 et pour évaluer des approches thérapeutiques, notamment de thérapie génique, susceptibles de ralentir la progression de la maladie et potentiellement la guérir. Étant donné qu’un modèle de l’AOA1 associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a déjà été créé chez cette espèce, ce modèle constitue un outil particulièrement pertinent et approprié pour nos études de recherche.
Réduction
Du fait de la nature du projet (prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux), il n’y aura pas de tests statistiques. Nous piloterons notre élevage afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour correspondre à nos besoins stricts pour les projets de recherche et le maintien de notre lignée. Nous prévoyons donc de produire au cours du projet un nombre total maximal de 4392 souris afin de constituer nos cohortes d’étude (contrainte de génotype). Nous contrôlerons les accouplements pour générer uniquement les animaux nécessaires, ainsi, en fonction de nos besoins expérimentaux au cours des 5 années du projet il est possible que nous produisions finalement moins que ce nombre maximal. Les animaux produits seront en utilisation continue dans des projets d’évaluation de thérapies dans lesquels les effectifs par groupe auront été définis à l’aide de tests statistiques afin d’inclure uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus nous inclurons dans ces groupes les mâles et les femelles, en effet nous pouvons utiliser les 2 sexes dans ce modèle murin préclinique car la mutation d’intérêt n’est pas liée au sexe, ce qui limitera le nombre d’animaux à produire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils auront à disposition de l’eau et de la nourriture à volonté, ainsi qu’un enrichissement de leur environnement (bâtonnet de bois à ronger et coton pour nidifier au minimum). Les animaux en provenance d’un fournisseur bénéficieront d’une semaine d’acclimatation avant leur mise en accouplement. Une attention particulière est portée aux animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne par la zootechnie, la mise en place de points limites et de soins adaptés. Le prélèvement pour le génotypage est de la plus petite taille possible et réalisé sur de jeunes animaux (moins de sensibilité à la douleur et cicatrisation rapide), c’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé par des personnes compétentes dans un endroit calme dédié. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. Ils sont surveillés immédiatement puis environ 30 minutes après pour s’assurer de l’absence de saignement et de la bonne prise en charge par la mère. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination croisée. Une partie des animaux pourra présenter des troubles moteurs en lien avec leur modification génétique (phénotype dommageable). Ces troubles ne seront réellement impactant qu’à partir de l’âge de 200 jours environ or les animaux concernés seront transférés dans des projets dédiés aux expérimentations dès l’âge de 21 jours environ. Les techniques de raffinement spécifiques à ce phénotype dommageable sont donc prévues exclusivement dans les projets expérimentaux.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal fiable pour reproduire et étudier la pathologie et pertinent pour tester par la suite différentes approches thérapeutiques. La souris est un modèle bien connu, son génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines. Dans notre cas cette espèce représente un modèle pertinent puisqu’un modèle de l’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a été créé chez cette espèce. Cette lignée permet de reproduire les signes observés chez les patients atteints d’AOA1. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours. Cet âge nous permettra de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre très tôt leur génotype afin de les transférer dans les projets d’expérimentation à partir du sevrage.