Maintien des lignées génétiquement modifiées

Pour entretenir une lignée de souris porteuses d'une maladie génétique rare des vaisseaux, 3 030 animaux vont être utilisés dans des procédures classées légères. Chaque petit est identifié par une puce sous la peau et génotypé par une biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Chez les souris atteintes, le porteur indique que la mort survient brutalement, sans signe annonciateur. Les animaux sont expédiés vers d'autres utilisations ou tués quand leur génotype ne convient pas, quand la colonie est assez grande ou en cas d'anomalie.

Objectifs

L'objectif de ce projet est l’étude de modèles souris reproduisant une maladie génétique rare vasculaire du tissu conjonctif qui provoque une souplesse anormale des articulations, une peau très élastique et des tissus fragilisés dont les vaisseaux sanguins. Chez l’Homme, la majorité des décès est due à des ruptures artérielles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de valider des essais de différents traitements médicamenteux ayant permis d'améliorer la survie des souris développent cette maladie. A terme, les résultats de ce projet permettraient de mieux comprendre les mécanismes conduisant à ces ruptures artérielles afin de proposer des thérapies et d'améliorer le diagnostic, le confort de vie des patients et le traitement.

Procédures

Chaque petit obtenu sera marqué par injection sous cutanée d’une puce électronique pour un suivi individuel et sera génotypés pour identifier les animaux d’intérêt. L'injection de la puce est rapide et se fait par voie sous-cutanée dans la région du cou ; la contention de l'animal dure moins d'une minute. Le prélèvement de bout de queue et/ou d'oreille dure également moins d'une minute. Le prélèvement se fait sur animaux vigiles, avant le sevrage pour le prélèvement d'un bout de queue et après l'âge de 14 jours pour le prélèvement d'oreille. De manière générale, une seule biopsie est réalisée par animal, en cas de nécessité de refaire la caractérisation génétique, une deuxième biopsie par animal pourrait être réalisée en suivant les préconisations liées à l'âge de l'animal.

Impact sur les animaux

Dans le cas des souris développent la maladie, la mort survient subitement sans aucun symptôme identifié. La biopsie, en particulier le prélèvement d'un bout de queue, peut causer de la douleur et de l'inconfort aux animaux. Même si la procédure est rapide, la coupure d'un bout de queue ou la perforation de l'oreille peut être douloureuse. La manipulation des animaux pour biopsie peut causer du stress et de l'anxiété. Suite à la biopsie, les animaux pourraient être temporairement limités dans leurs activités normales, notamment si la douleur ou l'inconfort les affecte.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés en vue de leur utilisation, soit mis à mort lorsque les résultats du génotypage ne sont pas conformes, lorsque la taille de l’élevage souhaitée est atteinte ou lorsqu’ils présentent une anomalie congénitale. Si des animaux d'intérêts ne peuvent pas être expédiés (du fait par exemple d'une annulation de l'expérience), ils seront mis à mort.

Remplacement

L’étude sur cellules en culture ne permet que d’explorer des modifications limitées dans des conditions de culture particulière. L'étude des conséquences des mutations sur animal entier est donc indispensable pour la compréhension des mécanismes globales de la maladie.

Réduction

Afin de réduite la quantité d'animaux utilisé dans ce projet, nous produirons les lots uniquement par Fécondation In Vitro (FIV). La production d'animaux par FIV permet de réduite au minimum le nombre d'animaux utilisé pour la production des lots (au vu des données que nous avons et de notre expertise nous estimons que le sperme collecté sur 2 mâles permettra de produire environ 350 petits). De plus, aucun stock d'animaux ne sera conservé pour le maintien d'une colonie ; les animaux produits par FIV seront uniquement destinés à l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des grilles de score de surveillance avec des points limites suffisamment prédictifs seront renseignées.

Choix des espèces

Ce modèle de souris transgéniques a déjà été créé et caractérisé. Nous avons donc besoin de poursuivre les études sur ce dernier. Les mâles utilisés pour les cryoconservations de sperme seront utilisés entre 10 et 20 semaines d'âges. Les mâles produits seront eux envoyés en expérimentation à 4 semaines d'âge. Seuls les mâles seront utilisés pour l'expérimentation car les ruptures artérielles spontanées sont observées essentiellement chez les souris mutées mâles (de l’ordre de 50% à 24 semaines) vs les souris femelles (de l’ordre de 20%), et un effet spécifique de la testostérone a été observé et en cours d’analyse.

Privées de système immunitaire par construction, donc incapables de repousser une infection, 1 000 souris vont être utilisées pour l'élevage, dans des procédures classées légères. Cette lignée sert à fournir aux équipes du site des animaux capables de porter des greffes de tumeurs humaines sans les rejeter. Le porteur indique qu'une infection peut évoluer vers une perte de poids marquée, une atteinte sévère d'un organe et la mort, tout en affirmant maîtriser ce risque par des conditions barrières. Les reproductrices de plus de onze mois sont tuées, les autres versées vers des protocoles expérimentaux qui les mettront à mort.

Objectifs

Les cancers du sang, comme les leucémies et les lymphomes (une forme de leucémie localisée à un organe, comme la rate ou l'estomac), étaient autrefois très souvent mortels. Aujourd’hui, une nouvelle approche, appelée thérapie par cellules CAR-T, a profondément changé la donne. Elle consiste à prélever des cellules du système immunitaire du patient, à les modifier en laboratoire pour qu’elles reconnaissent et attaquent les cellules cancéreuses, puis à les réinjecter au patient. Grâce à cette technique, certaines personnes peuvent aujourd’hui guérir. Cependant, ce traitement peut parfois provoquer des effets secondaires importants. Notre projet vise à réduire ces effets indésirables en améliorant et en modifiant génétiquement ces cellules afin de les rendre plus sûres. Avant de pouvoir proposer ces nouvelles cellules à des patients dans le cadre d'un essai clinique, nous devons toutefois vérifier leur efficacité et leur sécurité. Pour ce faire, il est indispensable d'utiliser un modèle expérimental chez la souris. Nous travaillons avec une lignée de souris dépourvue de système immunitaire. L'absence de système immunitaire permet à ces lignées murines de supporter la greffe de tumeurs humaines sans risque de rejet. Il est ainsi possible d'amplifier les tumeurs obtenues à partir de prélèvements de patients (des cellules qui ne peuvent pas être cultivées en éprouvette) et de reproduire une pathologie proche de la leucémie humaine afin de tester l'efficacité des nouvelles thérapies. Notre projet a été approuvé par deux agences d'évaluation de la recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet d’élevage permettra de fournir des souris sans système immunitaire (appelées souris immunodéficientes) aux équipes de recherche de notre site. Ces souris sont indispensables pour tester de nouveaux traitements contre le cancer dans des conditions proches de la réalité, avant de pouvoir les proposer à des patients.

Procédures

Ce projet consiste dans l'élevage d'une lignée de souris. Un mâle sera mis en couple avec 2 femelles et les souriceaux seront séparés après le sevrage (3 à 4 semaines d'âge). Les souris n'auront aucun prélèvement.

Impact sur les animaux

En raison de leur immunodéficience, ces souris sont sensibles aux infections. Les animaux immunodéprimés ne sont pas en mesure de se débarrasser des infections qu'ils contractent. Dans certains cas, les signes cliniques restent modérés, mais l’infection peut rapidement évoluer vers une dégradation brutale de l’état général, une perte de poids et une atrophie musculaire marquées, ainsi qu'une atteinte sévère de l’organe infecté (difficulté à respirer pour les poumons, plaies sanguinolentes pour la peau, etc.). En l’absence de traitement, l’infection persistante peut entraîner la mort. Tenant compte du statut sanitaire de la colonie et de la mise en place des conditions barrières strictes les risques infectieux seront reduits au minimum.

Devenir

Les souris reproductrices qui auront plus de 11 mois seront euthanasiées. Les souris qui présenteront des plaies dues à des bagarres et qui en souffriront seront également mises à mort. Globalement, au cours de la procédure d'élevage, une attention extrême sera portée pour qu'aucune souris ne se retrouve en état de souffrance. Les souris impliquées dans d'autres procédures expérimentales, en dehors de l'élevage, seront mises à mort en fonction des points limites explicitement précisés dans les protocoles écrits pour ces manipulations, en dehors du projet d'élevage.

Remplacement

L'étude des cellules leucémiques de patients n'est pas possible in vitro (en éprouvette), car les conditions de culture actuelles ne permettent pas de les maintenir et de les faire se développer. De plus, l'évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de traitements contre le cancer nécessite l'utilisation de modèles animaux permettant de reproduire les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement cellulaire (c'est-à-dire les autres cellules de l'organisme en contact avec la tumeur). À ce jour, l'utilisation de souris immunodéficientes reste obligatoire pour de nombreux projets de recherche fondamentale et translationnelle, c'est-à-dire une recherche qui vise à trouver de nouvelles méthodes de traitement.

Réduction

Nous adapterons l'élevage aux besoins des équipes de recherche. Nous connaissons bien cette lignée de souris immunodéficientes (nombre et taille des portées), ce qui nous permet de gérer l'élevage de manière optimale. Pour chacun des projets des autres DAP, 80 souris sont nécessaires pour évaluer un type de thérapie cellulaire (40 souris témoins et 40 souris traitées). Cet effectif a été calculé en tenant compte de la variabilité interindividuelle observée dans les modèles tumoraux, afin de permettre la réalisation d’un test t de Student (niveau de signification : 5 %, puissance : 90 %, moyenne du groupe témoin : 10, moyenne du groupe expérimental : 7, écart-type : 4,1) (https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes afin de respecter leur comportement naturel. Ils seront hébergés dans des portoirs ventilés en surpression, c'est-à-dire dans des endroits qui les protègent des agents infectieux. Ils recevront de la nourriture irradiée conditionnée en double emballage, ce qui les protège des infections. Leur manipulation se fera systématiquement sous une hotte (endroit stérile) afin d'éviter toute contamination par des microbes. De plus, l'ensemble des pièces d'hébergement sont en surpression, ce qui signifie qu'aucun microbe ne peut y pénétrer. Les souris feront l'objet d'une surveillance quotidienne afin de détecter d'éventuels signes de souffrance liés à une infection, en tenant compte de leur apparence et de leur comportement. Des contrôles sanitaires (trois à quatre fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière sanitaire et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Un contrôle sanitaire signifie pour les souris une analyse en laboratoire de biologie de leurs urines, selles et serum, afin de détecter d'éventuelles infections.

Choix des espèces

L'utilisation de souris immunodéficientes pour mettre en place un modèle de greffe de cellules cancéreuses humaines est largement décrite dans la littérature scientifique. Ces modèles sont robustes et reproductibles. Les souris seront accouplées à partir de 8 semaines d'âge (maturité sexuelle) et gardées en couple jusqu'a 11 mois. Nous allons utiliser exclusivement des souris sans apparition du phénotype dommageable En tout cas, tenant compte du statut sanitaire de la colonie et de la mise en place des conditions barrières strictes le risque d’apparition du phénotype dommageable est reduit au minimum.

Tuées si leur génotype n'a pas d'intérêt, gardées pour la reproduction sinon, 80 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance légère. Le seul acte est un prélèvement de poil sous anesthésie de courte durée, répété sur les souriceaux jusqu'à ce que la lignée transgénique soit établie. Le RNT prévoit un suivi clinique pour détecter un éventuel effet inattendu de la modification génétique. L'opération relève de la gestion d'élevage, produire et trier des animaux modifiés, plus que d'une expérience à proprement parler.

Objectifs

Génotyper les animaux de génotype(s) inconnu(s) suite à des croisements en vue d'établir une lignée simple transgénique

Bénéfices attendus

Différencier les souris homozygotes mutantes, homozygotes non mutante et hétérozygotes pour la mutation. Ceci permettra de sélectionner uniquement les souris de génotypes d'intérêts.

Procédures

Prélèvement de poil sous anesthésie: L’induction dure environ 1 à 2 minutes, le maintien le temps du prélèvement 1 à 3 minutes, et le réveil intervient généralement en 2 à 5 minutes. La durée totale de la procédure, incluant l’anesthésie et le réveil, est en moyenne de 5 à 10 minutes. Tous les animaux F1 seront concernés jusqu'à ce que la lignée soit établie.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations (ex:génotypage), et restent légères. Aucun effet indésirable majeur n'est prévu du fait de la modification génétique, mais un suivi clinique sera mis en place pour détecter tout phénotype innatendu. Des mesures seront prises si des signes de souffrance ou de gêne apparaissent, en accord avec les critères d'arrêt définis.

Devenir

Les souris de génotypes qui ne sont pas d'intérêts (hétérozygotes) seront mise à mort ou utilisées pour de la mise au point dans le cadre des projets de recherches. Les autres souris ( mutante et non mutante/sauvage) serviront à la reproduction ou à l'expérimentation.

Remplacement

Le génotypage est indispensable pour différencier les génotypes d'intérêts et établir les lignées. Le prélèvement de poil sera privéliégié dès que c'est possible, lorsque la mise au point du protocole de génotypage sera terminé.

Réduction

Le nombre d'individu à été calculé au minima pour permettre la création de la lignée sans devoir épuisée les géniteurs (si effectif trop petit, plus de portée par géniteur) ni surproduire (si nombre trop important).

Raffinement

L'enrichissement sera adapté aux besoins de cette nouvelle lignée. Des tests d'enrichissement nous permettra d'établir le choix préférentiel de la lignée et donc de respecter ses besoins et préférences. Le prélèvement de poil sera utilisé au détriment de la biospie, dès que la mise au point du protocole de génotypage sera terminé.

Choix des espèces

La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Reproduction à partir de souches déjà établies au laboratoire. Les animaux seront génotypés à partir de 4 semaines de vie

Produits par une unité qui fournit des modèles animaux à la demande des laboratoires, 143 000 souris et rats sont utilisés sur cinq ans, chacun soumis une fois à une biopsie de la queue pour génotypage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux qui portent le génotype recherché sont restitués aux équipes pour leurs expériences, les autres réutilisés ailleurs ou mis à mort. Le résumé décrit un élevage calibré pour produire un maximum d'animaux "utiles" et limiter les surnuméraires. Le nombre de 143 000 découle du volume de croisements lancés, sans calcul statistique à ce stade, que le porteur renvoie aux projets ultérieurs.

Objectifs

L'unité de service met, à disposition de la communauté scientifique, un ensemble de prestations liées à l’utilisation de modèles animaux à des fins scientifiques. Des modèles rongeurs sont générés, hébergés, développés et maintenus dans les locaux, pour les besoins de la communauté scientifique qui, pour réaliser sa recherche fondamentale et biomédicale, doit disposer de modèles précliniques permettant de comprendre diverses fonctions biologiques dans les pathologies humaines (maladies immunitaires, métaboliques, infectieuses inflammatoires, cancéreuses, etc). Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. L'utilisation de rongeurs génétiquement modifiés nécessite d'avoir recours à un génotypage et donc de réaliser une biopsie caudale. Le projet néccessite une modification car des rats doivent maintenant être génotypés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont : 1) réaliser une identification permanente de qualité sur les rongeurs afin de les distinguer en fonction de leur génotype 2) réaliser une biopsie de qualité permettant un génotypage sans contamination croisée entre deux individus 3) identifier et récupérer une biopsie sur les rongeurs de manière à optimiser au maximum le bien-être animal 4) permettre aux utilisateurs des équipes de recherche de faire un suivi individuel des animaux en fonction de leur génotype. L’élevage de ces animaux est nécessaire dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société (domaines de recherche : pathologies respiratoires, musculaires, du système nerveux, métaboliques, cardiovasculaires ou génétiques).

Procédures

Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudale pour génotypage. Ces actes ne durent que quelques secondes. Dans de rare cas, un reprélèvement à l'oreille pourra être réalisé et ne durera que quelques secondes. Dans de rares cas, un prélèvement sanguin d'un faible volume sera réalisé (1 seul fois dans la vie de l'animal, acte de quelques secondes). Ces actes sont réalisés sur animal vigil.

Impact sur les animaux

Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation ainsi que pour les parents. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements pour génotypage (biopsie caudale et pavillon de l'oreille) et au point de prélèvement pour les prélèvements sanguin.

Devenir

Les animaux avec un génotype d'intérêt seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère. Les autres animaux du mauvais génotype qui n'auront pas pu être utilisés dans d'autres projets seront euthanasiés par une méthode réglementaire adaptée à l'âge des animaux ainsi que les anciens reproducteurs. Les animaux passant dans les projets de recherche autorisés seront alors en utilisation continue. Les accouplements sont réalisés pour produire au maximum des animaux d'intérêt.

Remplacement

Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. Le rongeur est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies.

Réduction

L'établissement d'élevage lance environ 700 cages de croisements de lignées par an pour lesquelles l'identification individuelle et le génotypage sont nécessaires. En considérant que chaque accouplement donne en moyenne 5 portées de 8 souriceaux/an, notre établissement générera environ 28 000 animaux qui devront être identifiés et génotypés par an. Dans l'établissement, 20 cages de croisements de rats par an pour lesquelles l'identification individuelle et lé génotypage sont nécessaires, seront lancés. En considérant qur chaque accouplement donne en moyenne 5 portées de 10 ratons, l'établissement générera 3000 rats. Le projet comprend donc 143 000 animaux sur 5 ans. Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. Les demandes d'accouplements sont donnés par les équipes de recherche via un logiciel de gestion de lignées afin d'accoupler les animaux des génotypes d'intérêt pour leurs projets de recherche. Le nombre d'accouplements lancés est systématiquement revu en fonction du nombre d'animaux déclarés dans les projets de recherche. Les animaux sans génotype d'intérêt seront réutilisés en priorité (projets d'autres équipes de recherche ou projet de tutorat). Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien être animal (SBEA). Sans justificiation scientifique du maintien en élevage d'une lignée, la cryoconservation de sperme sera systématiquement proposée. Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des petits par la mère seront vérifiés. Des points limites suffisamment prédictifs ont été déterminés pour éviter tout inconfort ou souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus utilisés par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. En effet, il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés pour de très nombreuses pathologies humaines. Tous les souriceaux et les ratons, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés à partir de 7 jours de vie (plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée). Pour certains projets de recherche, il est déconseillé d'utiliser de le tatouage car l'encre pourrait migrer dans différents tissus ou encore il est déconseillé de toucher aux phalanges des animaux. Dans ces conditions, l'identification après 15 jours de vie sera privilégiée.

Génétiquement modifiées pour porter des lymphocytes T reconnaissant une cible unique, 600 souris de la lignée P14 sont utilisées sur un an dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit au sevrage une ponction de sang à la joue pour vérifier qu'elle porte bien le transgène. Les souris qui ne l'ont pas sont mises à mort sans autre usage, les autres élevées puis tuées à leur tour pour prélever leur rate et étudier in vitro l'effet d'une enzyme immunosuppressive sur les lymphocytes T. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne fournit ces populations de lymphocytes spécifiques et présente cet élevage comme une façon de "réduire" le recours à l'animal.

Objectifs

Ce projet a pour but de maintenir une colonie de souris génétiquement modifiées appelées P14. Ces souris possèdent des cellules du système immunitaire spécialement programmées pour reconnaître une seule cible précise. On parle alors d’une population de cellules « monoclonale », c’est-à-dire toutes identiques dans leur fonctionnement. Pour s’assurer que ces caractéristiques sont bien présentes, un petit prélèvement unique sanguin est réalisé chez les souris après le sevrage. Les analyses permettent de vérifier que les souris portent toujours cette modification génétique et de distinguer celles qui l’ont conservée de celles qui l’ont perdue. Dans d’autres expériences, les cellules immunitaires prélevées sur ces souris après leur mise à mort seront étudiées en laboratoire. L’objectif est d’évaluer comment une enzyme ayant un effet immunosuppresseur influence l’activation des cellules immunitaires, leur spécialisation et leur éventuel épuisement. L’utilisation de ces souris génétiquement modifiées permet d’obtenir des résultats fiables tout en évitant des expériences plus lourdes sur animaux vivants. Cette approche contribue ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des « 3R » (Remplacer, Réduire, Raffiner), qui vise à limiter autant que possible l’expérimentation animale

Bénéfices attendus

Avec ces prélèvements nous pourrons identifier les vrais animaux transgéniques utilisables dans nos expériences. L’utilisation de cette souris transgénique P14 dans des expériences ex vivo et in vitro permettra d’obtenir des données pertinentes tout en limitant le recours à des expérimentations in vivo plus complexes et douloureuses pour les animaux, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés par nos projets conformément au principe des 3R.

Procédures

Un seul prélèvement d'une durée de maximum 10 secondes, par ponction de la veine sous-mandibulaire au moment du sevrage, est prévu.

Impact sur les animaux

Stress lié aux manipulations. Les animaux doivent être contenus pour le prélèvement effectué par le personnel de l'animalerie qui est formé et rapide dans l'acte

Devenir

Tous les animaux porteurs du transgène seront élevés dans l’animalerie. Tout animal ne présentant pas le transgène sera mis à mort. Aucun prélèvement sera effectué sur les animaux mis à mort car ne portant pas le gène d’intérêt.

Remplacement

Les lymphocytes T issus de ces souris P14 permettront de tester in vitro nos hypothèses sur l’effet d’IL4I1 sur l’activation lymphocytaire et diminuer le nombre d’expériences in vivo chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera strictement limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. L’utilisation de souris transgéniques P14 permet d’obtenir une population de lymphocytes T homogène et spécifique d’un antigène unique, réduisant la variabilité expérimentale et, par conséquent, le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats interprétables. Les analyses principales seront réalisées in vitro à partir de cellules isolées après mise à mort, ce qui permet de limiter le recours à des expérimentations in vivo répétées ou de longue durée. Par ailleurs, la vérification du statut transgénique par un prélèvement sanguin unique au moment du sevrage permet d’optimiser la sélection des animaux nécessaires aux expériences, évitant ainsi l’utilisation d’animaux non conformes au phénotype requis. Pour nos expérimentations nous avons besoin de 15-20 souris femelles P14 par mois, qui seront utilisées après mise à mort pour prélever des cellules de la rate à utiliser in vitro. Sur la base de l’expérience que nous avons sur cette lignée, il nous faudra tester 50 souris par mois. Donc pour une période de 1 an, le total de l’expérimentation représente 600 animaux.

Raffinement

L’hébergement se fait dans les conditions habituelles de l’animalerie : cinq souris sont hébergées par cage et un enrichissement du milieu est effectué par l’utilisation de Nestlets, d’un smart home ainsi que de Bed-r'nest, des outils qui améliorent le bien-être des animaux. Les Nestlets sont des petits morceaux de matériau qui permettent aux souris de construire des nids et de suivre leurs instincts naturels. Le Smart Home contrôle automatiquement la température, la lumière et l’activité dans la cage pour maintenir un environnement stable. Pour finir, le Bedr’nest offre un espace douillet où les animaux peuvent se reposer et se sentir en sécurité. Ensemble, ces dispositifs rendent les conditions plus confortables et moins stressantes pour les souris. Les animaux élevés dans notre animalerie seront manipulés par du personnel expert de l’équipe pour éviter/limiter tout stress.

Choix des espèces

Les souris transgéniques P14 possèdent des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement l’antigène GP33. Après mise à mort sans procédure préalable, les lymphocytes T seront isolés à partir de la rate afin de réaliser des expérimentations in vitro. Le modèle P14, exprimant un récepteur T transgénique, est particulièrement pertinent pour étudier les effets de l’enzyme immunosuppressive IL4I1 sur l’activation, la différenciation et l’épuisement des lymphocytes T. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’obtenir des populations lymphocytes T spécifiques d’un antigène unique. Les animaux seront testés une seule fois au moment du sevrage (environ 3 semaines).