Tests réglementaires

Injectées de plasmides par voie hydrodynamique, soumises à des prélèvements sanguins répétés puis infectées par le virus de la fièvre jaune, 1 000 souris, dont des lignées immunodéficientes et des lignées humanisées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection de plasmides provoque des hématomes, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, et que l'infection peut entraîner perte de poids, hypothermie, paralysie des membres postérieurs et mort. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique : il est estimé à partir du nombre d'études des années précédentes et d'une croissance anticipée, "en accord avec le plan commercial". Deux cents souris pourront être transférées vers un protocole de formation interne aux gestes techniques, à condition de n'avoir pas été infectées, les autres étant tuées en atteignant les points limites ou sur décision du vétérinaire.

Objectifs

La fièvre jaune est une maladie virale transmise par les moustiques, principalement dans les régions tropicales. Elle peut causer de la fièvre, des douleurs musculaires et des nausées. Dans 15% des cas, la maladie évolue vers une forme grave, caractérisée par une jaunisse et des hémorragies pouvant entraîner le décès du patient. Il n’existe pas de traitement antiviral pour soigner cette maladie, mais la vaccination est efficace pour la prévenir. Le vaccin est préparé à partir d’un virus vivant atténué. Les objectifs de ce projet sont multiples : - Modéliser et caractériser l’infection par le virus de la fièvre jaune dans des souris - Evaluer l’innocuité de composés de recherche à visée prophylactique ou thérapeutique (traitements ou vaccins) - Caractériser les réponses immunitaires induites par ces composés de recherche - Evaluer l’efficacité antivirale de ces composés de recherche chez des souris infectées par le virus de la fièvre jaune Pour répondre à ces objectifs, nous utiliserons des souris conventionnelles non-humanisées (immunocompétentes ou immunodéficientes), ou des souris dites humanisées (système immunitaire ou foie), ou doublement humanisées (système immunitaire + foie).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle préclinique prédictif permettant d'étudier le virus de la fièvre jaune ainsi que l’efficacité de composés de recherche innovants.

Procédures

Des administrations de composés à visées thérapeutiques seront réalisées avec une fréquence définie par le protocole d’étude. Leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection de plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de virus : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). L’infection par le virus de la fièvre jaune peut entraîner une perte de poids, une hypo-activité, une diminution de la température corporelle, une paralysie des membres postérieurs traduisant une atteinte neurologique, et la mort. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés soit parce qu’ils atteignent les points limites, soit par décision du vétérinaire. Certains animaux pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve que les souris n’aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection hydrodynamique et qu’elles n’aient pas été infectées avec le virus. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et le virus de la fièvre jaune, permettant de reproduire l’infection du virus tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés de recherche destinés à son traitement ou sa prévention. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 20 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études, ou pour le nombre total d’animaux dans le projet, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Le modèle murin a été choisi en raison de sa capacité à reproduire des aspects clés de la pathogénie de l’infection par le virus de la fièvre jaune, notamment en conditions d’immunodéficience ou après adaptation virale. Certaines souches ou lignées modifiées permettent de mimer la susceptibilité humaine (atteinte hépatique, réponse inflammatoire), ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation de composés antiviraux ou prophylactiques. Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines, première apparition des hépatocytes dans le foie.

Produire des parasites pour un réactif de diagnostic exigé lors des mouvements internationaux de chevaux : 735 rats vont être infectés par Trypanosoma equiperdum, l'agent de la dourine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection les tue en quelques jours. Ce sont d'anciens reproducteurs de plus de 500 grammes, choisis pour la quantité de sang qu'on peut leur prélever, soumis à deux prélèvements quotidiens sous anesthésie gazeuse avant d'être mis à mort. Le porteur indique que la mise à mort intervient quand la parasitémie atteint son maximum et "autant que possible" avant l'apparition de signes cliniques, un rendement élevé par animal réduisant le nombre de protocoles à lancer. La finalité affichée est d'éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait la circulation commerciale des équidés.

Objectifs

Cette demande d’autorisation à expérimenter sur animaux vivants porte sur la production sur rats de parasites Trypanosoma equiperdum, agent infectieux responsable de la dourine. La dourine est une maladie sexuellement transmissible qui affecte les équidés et qui engendre un fort taux de mortalité ; elle est non transmissible à l’homme. Les procédures utilisées sont celles décrites par les instances internationales et ont pour objectif de produire les réactifs nécessaires au diagnostic officiel permettant d’empêcher la propagation de la dourine lors de mouvements internationaux d’équidés. Les parasites produits pourront également être utilisés dans le cadre de projets de recherche ayant pour vocation l’amélioration du diagnostic de la dourine et l’amélioration des connaissances sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Bien qu’un résultat sérologique négatif soit exigé vis-à-vis de la dourine pour permettre les mouvements internationaux d’équidés, seuls quelques laboratoires au monde sont en mesure techniquement de produire les réactifs nécessaires à la réalisation de ce test. Ainsi l’approvisionnement en réactif pour le diagnostic de la dourine est une réelle problématique dans de nombreux pays du monde. Ainsi ce bénéfice apporté par ce projet est de maintenir notre capacité de production d’antigènes afin d’éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait le contrôle du statut sanitaire des équidés vis-à-vis de la dourine qui pourrait impacter fortement les mouvements internationaux d’équidés.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection de parasite T. equiperdum sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - deux prélèvements quotidiens d’une goutte de sang sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - une mise à mort sous anesthésie gazeuse complétée par d’une anesthésie profonde (2 min).

Impact sur les animaux

Afin de limiter les signes cliniques causés par le parasite (Trypanosoma equiperdum), la mise à mort est programmée avant que les animaux ne présentent des signes d’affaiblissement. Pour cela un suivi au moins deux fois par jour est réalisé. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort et son sang récolté. Une fiche individuelle de suivi est complétée à chaque intervention sur l’animal.

Devenir

L’infection par le parasite Trypanosoma equiperdum est mortelle au bout de quelques jours pour les rats inclus dans le protocole. Ainsi, pour éviter toute souffrance inutile, des animaux sont mis à mort soit quand la quantité de parasites dans le sang atteint le seuil recherché, soit quand des signes de souffrances sont observés chez l’animal.

Remplacement

Afin de garantir le statut sanitaire des équidés lors de leurs déplacements internationaux, des tests de diagnostic de la dourine sont exigés au niveau mondial. À ce jour, seul le test de fixation du complément (TFC) est reconnu par l’Organisation mondiale de la santé animale (OMSA) pour le diagnostic sérologique de cette maladie. Les quantités de réactifs requis pour la mise en œuvre du TFC, combinés au nombre élevé d’équidés circulant à l’échelle mondiale, font que de grandes quantité de parasites doivent être produites pour répondre à la demande. La seule alternative à l’infection de rats pour produire ces parasites est la culture in vitro. Cependant, les caractéristiques biologiques des parasites limitent fortement les rendements obtenus par cette méthode, rendant la production in vitro insuffisante pour répondre à la demande mondiale en antigènes. Dans le but de réduire (voire de suspendre) le recours à la production sur animaux, notre programme de travail inclut le développement d’un test ELISA standardisé pour la dourine, test pour lequel les quantités d’antigènes utilisés sont compatible avec les capacités de production in vitro. Une fois validé, ce test pourra être proposé à l’OMSA en vue de sa reconnaissance comme méthode officielle de diagnostic, au même titre que le TFC dourine. Dans l’attente de cette reconnaissance, la production d’antigènes sur rats reste à ce jour la seule solution permettant d’assurer la continuité des contrôles sanitaires lors des mouvements internationaux d’équidés.

Réduction

Le nombre d’animaux par production de parasites (21 rats) est défini par les protocoles décrit dans les réglementations internationales. De plus nous apportons un soin particulier à ce que la mise à mort des animaux soit réalisée de manière à obtenir le meilleur rendement de production de parasites, pour permettre de réduire au maximum le nombre de protocoles réalisés.

Raffinement

Les rats sont hébergés en zone de confinement A2, dans une pièce dédiée aux rats, en portoir ventilé, dans des cages permettant la position bipède. Chaque cage possède une plateforme, les rats en fonction de leur poids sont réunis par groupe de 2 ou 3. Pour chaque cage, l’enrichissement du milieu est apporté par : un tunnel, des matériaux de nidification, des os à ronger, ainsi que des buchettes bois à ronger. Afin de limiter la souffrance des animaux, tout acte invasif est effectué sur des animaux anesthésiés. La mise à mort des rats a lieu quand le nombre de parasites comptés dans le sang de l’animal a atteint son niveau maximum et autant que possible avant que les animaux ne développent des signes cliniques. En effet, plus le nombre de parasites collectés par animaux est important, moins nous aurons de protocoles de productions à mettre en place. Pour cela nous surveillons les animaux et réalisons des comptages de parasites de manière régulière. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort (point limite) et son sang récolté ; et ce, indépendamment de sa parasitémie.

Choix des espèces

Notre protocole suit les recommandations internationales quant à l’espèce animale sélectionnée (le rat). Cette espèce a été sélectionnée car elle est assez grande pour récolter des quantités importantes de sang (contrairement à la souris) tout en restant un animal dont l’utilisation est assez répandue pour permettre de standardiser la production d’antigènes. Dans ce contexte les animaux utilisés sont des rats adultes de poids supérieur à 500 grammes (anciens reproducteurs) afin de pouvoir prélever la plus grande quantité de sang possible et ainsi récupérer le plus de parasites par animal.

Deux injections, une incision de la peau sous anesthésie, la pose d'un implant de titane recouvert d'un polymère, deux points de suture, puis une plaie inspectée chaque jour pendant trois jours et deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort. 27 souris femelles de huit semaines suivent ce parcours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour un prélèvement de tissu. Le porteur attend surtout des effets locaux, retard de cicatrisation, nécrose, infection, œdème ou hématome, et indique avoir réduit les groupes de cinq à trois animaux au vu de l'homogénéité des résultats antérieurs. Le choix de l'espèce vient d'une commande, le RNT précisant que "la demande de l'industriel a porté sur l'utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines".

Objectifs

Les infections bactériennes associées à la présence d’un biofilm représentent l'une des complications les plus graves suite à l'implantation de dispositifs médicaux. En particulier, les infections sur prothèse orthopédique sont particulièrement redoutées en clinique car elles sont associées à des échecs thérapeutiques et une morbi-mortalité importante. En effet, le biofilm qui recouvre ces prothèses est une matrice composée d’exopolysaccharides et de bactéries en dormance, présentant une sensibilité réduite aux antibiotiques et une faible accessibilité mécanique, ce qui donne lieu à des infections chroniques, extrêmement difficiles à combattre. Ainsi, l’inhibition de la formation de biofilm est un élément clé de la prévention des infections ostéoarticulaires sur matériel. Dans ce cadre, différents matériaux constituant les prothèses et présentant des caractéristiques antibactériennes sont actuellement à l’étude. Plusieurs polymères ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. Toutefois, des essais doivent maintenant être conduits chez l’animal pour en vérifier la tolérance locale (et par la suite l’activité antibactérienne, en fonction des résultats obtenus). L’objectif du présent projet vise donc à évaluer la tolérance locale d’implants en titane, recouverts de différents polymères antibactériens, chez la souris, après implantation sous-cutanée.

Bénéfices attendus

A long terme, le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir développer un matériel innovant, permettant de d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme (ex : dispositifs médicaux ou prothèses). Avant cela, il est nécessaire d’en vérifier l’innocuité. Aussi, à court terme, le bénéfice attendu est de pouvoir sélectionner un ou plusieurs polymères antibactériens n’ayant pas de toxicité chez la souris parmi plusieurs candidats.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Deux injections (durant 2 secondes chacune) avant le geste chirurgical - Incision cutanée et suture sous anesthésie fixe

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger implanté en sous-cutané, les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaire (retard de cicatrisation, nécrose ou infection au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire chez les animaux serait davantage due au polymère recouvrant le titane mais les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents polymères. Par ailleurs, des essais similaires ont déjà été réalisés (implant titane recouverts d’autres polymères) et aucun effet indésirable n’a été enregistré.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (27). Un prélèvement tissulaire sera réalisé post-mortem.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité des différents polymères de cette étude a déjà fait l’objet d’investigations menées in vitro sur des modèles cellulaires. Également, l’environnement complexe (tissu sous-cutané, cellules immunitaires …) est difficilement modélisable dans un autre système que le modèle animal. Aussi, l’utilisation du modèle animal est requise.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé pour établir la preuve de concept et discriminer rapidement un échantillon relevant de polymères. Les travaux précédents sur un modèle similaire avait requis l’utilisation de 5 animaux par groupe ; les résultats de l’analyse histopathologique ont montré une très bonne homogénéité et de ce fait, il a été décidé de n’utiliser que 3 animaux par groupe dans cette nouvelle étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Lors de la mise en place de l’implant, les souris recevront une analgésie de palier 2 et une anesthésie fixe. Après l’incision, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leur réveil. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie puis 2 fois par semaine jusqu’à la mise à mort. Nos expériences précédentes nous informent que les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Toutefois, une grille de score nous permet de suivre individuellement chaque animal et d’établir un point limite défini par un score égal ou supérieur à 8.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 22g (+/- 2g) et un système immunitaire mature. Également, dans un souci de comparaison avec les résultats antérieurs d’une autre étude, la souris sera choisie comme modèle dans cette étude.

600 rats et 480 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun suivi jusqu'à vingt-quatre mois, tous tués pour prélever leurs organes. À 3, 6, 12, 18 puis 24 mois, ils subissent trois prises de sang dans une même journée sur animal vigile, une quatrième sous anesthésie, et jusqu'à seize heures d'isolement pour recueillir leurs urines, les rats étant privés de nourriture. Des tumeurs apparaissent, spontanées ou provoquées par le produit testé, et le porteur indique que les animaux sont gardés en vie tant qu'elles ne remettent pas en cause leur déplacement, leur capacité à boire ou à manger, et qu'aucune ulcération n'apparaît. Le produit peut aussi provoquer chez le rat une opacité de la cornée et une cécité. Cette étude sert à faire entrer une molécule chimique sur le marché, et le porteur précise que les deux groupes supplémentaires exigés par les lignes directrices chinoises ne seront pas utilisés puisque la molécule n'y est pas destinée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les risques pour la santé liés à l’exposition à un produit chimique spécifique tout au long de la vie de l’espèce considérée, avant sa mise sur le marché. Pour cela, nous réaliserons une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité. Ce projet permet de recueillir des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris son potentiel cancérogène, tout en identifiant les potentiels organes cibles et la possibilité d’accumulation du produit dans ces derniers. De plus, il peut fournir une estimation de la dose sans effet nocif observé pour les effets toxiques, ainsi que, dans le cas de substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Ces estimations sont cruciales pour établir des critères de sécurité concernant l'exposition humaine et donc le potentiel effet cancérogène pour l’homme. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle ainsi que la toxicité chronique de ce produit chimique, l’installation d’essai intègre toutes les informations disponibles sur la substance à tester.

Bénéfices attendus

Les études d’exposition chroniques et de cancérogenèse vont permettre : l’identification des propriétés cancérogènes d'un produit chimique susceptible d'augmenter les risques de tumeurs, la fréquence de survenue de tumeurs bénignes ou malignes ou la diminution du temps nécessaire à leur apparition, par rapport au groupe témoin non traité ; l’identification de la toxicité chronique d’un produit chimique ; l’identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la toxicité chronique et de la cancérogenèse ; la caractérisation de la relation dose-effet ; l’identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé ou du point de départ de l’effet pour l’établissement d'une dose de référence ; l’extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine correspondant à de faibles doses ; la prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux de doses représentatifs de l'exposition humaine ; l’obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le mode d’action de la molécule. Toutes ses données seront rapportées, soumises aux autorités internationales et serviront à l’analyse du risque pour l’homme.

Procédures

Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 3 prélèvements sanguins sont réalisés au cours d'une même journée en moins de 2 minutes sur animaux vigiles. Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 1 prélèvement sanguin est réalisé en moins de 2 minutes sur animaux anesthésiés. Aprés 3, 6, 12 et 18 ou 24 mois environ au cours de l’étude, les animaux peuvent être isolés pour une durée maximale de 16h (avec mise à jeun pour les rats) pour le recueil de leurs urines. La mise à mort précédée par une administration d'un analgésique et d'une anesthésie.

Impact sur les animaux

Les niveaux de doses sont fondés sur les résultats des études précédentes. Le choix de la forte dose doit permettre l’évaluation d’une dose bien tolérée par les animaux et induisant une toxicité légere à modérée. Les prelevements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prelevement. Pour la mesure et le prelevement d’urines, les animaux sont isolés pendant 16h maximum (avec mise à jeun pour les rats). La veille des autopsies prévues, les rats n’ont plus accès à la nourriture pendant 16 h maximum ce qui peut induire un stress léger ainsi qu’une baisse de poids. Compte tenu de l’objectif de l’étude et de sa durée, des tumeurs bénignes ou non , spontanées ou induites par le produit peuvent apparaitre, les animaux seront gardés en vie tant que la taille des tumeurs ne remet pas en cause leur déplacement, et leur capacité à boire ou à s'alimenter(

Devenir

En raison du but de l’étude qui est d’évaluer l’atteinte au niveau des tissus, des organes de l’animal et l’apparition de tumeurs, tous les animaux seront mis à mort pour prelevement d'organes .

Remplacement

Malgré les nombreux tests in silico ( évaluation grace à des calculs/modéles complexes informatisés), in-vitro (essais réalisés sur micro-organismes, organes ou cellules) , et in-vivo conduits lors du developpement de cette molecule qui ont permis de mettre en évidence le mode d’action et les organes cibles de la molécule, ces études animales restent une obligation avant la mise sur le marché d’une nouvelle molécule chimique. Il n’existe pas aujourd’hui de tests substitutifs validés et acceptés par les autorités relatifs à l’évaluation de tumeurs après une exposition chronique.

Réduction

L'essai combiné dans l’étude rat ou l’ajout d’un sous-groupe pour mise à mort intermédiaire (phase chronique) dans l’étude souris permet une meilleure efficacité en temps et en coûts, et un moindre recours aux animaux, par rapport à la conduite de deux essais séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la phase de cancérogenèse. La taille des groupes est la taille minimale requise par la ligne directrice. La molecule n’étant pas destinée au marché chinois, les groupes supplémentaires requis par les guidelines chinoises (2 groupes de 10 animaux par doses et par sexes mis à mort après 6 et 18 mois d’exposition) ne seront pas nécessaires.

Raffinement

Compte tenu de la durée de l’étude, une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée et une attention particulière sera portée à l’apparition de tumeurs spontanées ou induites par le produit. Ces tumeurs seront recherchées, observées et mesurées au moins 1 fois/semaine afin de suivre leur progression et/ou l’apparition de zone de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Lors des prises de sang en cours d’étude l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Des micro prélèvements seront utilisés pour l’évaluation des paramètres toxicocinétiques. Le jour précédent leur mise à mort les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Afin d’éviter toute douleur, les animaux seront mis à mort après une analgésie à l’aide d’un opioïde de type méthadone suivi d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Les rongeurs sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précdemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec les espèces et souches choisies (Rat Wistar et souris C57Bl6J). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les animaux utilisés sont de jeunes animaux sevrés à l’arrivée sur le lieu de l’expérimentation dont l’âge après la période d’acclimatation doit être inférieur à 8 semaines compte tenu de l'objectif et de la durée de l'étude (exposition pendant toute la vie de l'animal). Cet age est requis par les lignes directrices internationales.

Incluses dans les études dès le sevrage, à partir de quatre semaines, 2 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est immunodéficiente ou porte un système immunitaire et un foie humanisés, obtenus par greffe de cellules humaines. Elles reçoivent des injections de plasmides que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, subissent des prélèvements de sang répétés avec risque d'anémie et d'hématome, et pour certaines un prélèvement terminal sous anesthésie suivi de leur mise à mort. Sur la réduction, le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et que l'effectif découle du nombre d'études des années précédentes, ajusté selon "le plan commercial". Deux cent cinquante de ces souris pourront ensuite être transférées vers un projet de formation interne aux gestes techniques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser la pharmacocinétique de composés de recherche après administration à des souris. En particulier, nous nous intéresserons à leurs absorptions, biodistribution, métabolisme et élimination. Ces analyses sont cruciales pour déterminer les doses efficaces et la posologie d’un médicament. Pour ce faire, nous utiliserons des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir des données essentielles sur la biodistribution et la durée de vie de composés de recherche dans l’organisme. Grâce à ces données, nous pourrons définir les doses et posologies à tester dans des études d’efficacité.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement sans réveil suivi d’une euthanasie sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre à la main. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Les administrations de traitements dureront quelques secondes et seront effectuées avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Leur nombre dépendra du protocole ‘étude et sera validé par le vétérinaire. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

- Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmidess (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. - Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible d’étudier l’absorption, la biodistribution, le métabolisme et l’élimination de composés de recherche sans les injecter in vivo. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 2200 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 44 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant toute procédure potentiellement douloureuse. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang.