Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Titrage d’activité des vaccins par détermination des anticorps après vaccination chez le cobaye
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
9 800 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés sous la peau puis, cinq semaines plus tard, subissent un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie, pour le contrôle qualité de lots de vaccins avant leur mise sur le marché. Le porteur signale que deux à cinq pour cent des animaux recevant les plus fortes doses développent une induration voire un ulcère au point d'injection. Il affirme que ce titrage réglementaire est 'nécessaire' à la libération des lots et qu'aucune méthode in vitro ne l'évalue, la réponse immunitaire exigeant selon lui un 'organisme entier'.
Objectifs
Ce projet est réalisé dans le cadre de contrôle qualité des vaccins avant leur libération sur le marché européen. Il permet le titrage d'activité de vaccins multivalents : activité antitétanique, antidiphtérique, anticoquelucheuse.
Bénéfices attendus
La conformité des résultats d'activité des vaccins pour les différentes valences est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients.
Procédures
Des lots d'animaux sont vaccinés par voie sous cutanée avec plusieurs doses du vaccin à contrôler ou du vaccin de référence. La vaccination d'un animal dure moins de 30s. Cinq semaines plus tard, un prélèvement intracardiaque est effectué sur ces animaux préalablement anesthésiés. L'administration de l'anesthésique dure moins de 30s et environ 5 min après, le prélèvement sanguin est effectué. Il peut prendre environ 2 min par animal. Le dosage des anticops dans tous les sérums récupérés permet in fine de vérifier l'activité du vaccin à contrôler.
Impact sur les animaux
Suite à la vaccination il est possible d'observer des réactions au point d'injection de type induration voire ulcère chez 2 à 5% des animaux recevant les plus fortes doses de vaccins. Une surveillance et des soins (dermaflon ou vétédine) quotidiens et individuels ont donc été mis en place pendant la période d'apparition potentielle des symptômes. Le suivi est tracé.
Devenir
A la fin de l'essai après le prélèvement sanguin sous anesthésie, les animaux sont euthanasiés car ayant reçu une injection de vaccin ils ne peuvent pas être réutiliser dans un essai.
Remplacement
La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer les activités antitétaniques, antidiphtériques et anticoquelucheuses.
Réduction
Ce projet permet de déterminer les activités antitétaniques, antidiphtériques et anticoquelucheuses des vaccins sur les mêmes lots d'animaux ce qui dimunue beaucoup le nombre d'animaux pour contrôler un lot. De plus, plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux : - optimisation des essais: le test de deux lots de vaccins en même temps versus la référence est privilégié en l'absence de contrainte de délais de libération ( mutualisation des lots d'animaux vaccinés avec la référence) -limitation des retests, - à terme possible mise en place de "reducing": contrôle d'un pourcentage de la production et non de tous les lots lorsque la conformité et la stabilité des lots pourront être démontrées statistiquement.
Raffinement
La méthode sérologique a permis de diminuer fortement la douleur en supprimant les challenges (administration des toxines tétaniques et diphtériques) tranditionnellement utilisés pour le tritrage des valences tétaniques et diphtériques. Un enrichissement est mis à disposition des cobayes: foin compressé, balle en plastique.
Choix des espèces
Le cobaye adulte (250-300g) est le modèle retenu par la Pharmacopée Européenne pour le contrôle des vaccins multivalents comportant les valences tétanique, diphtérique et coqueluche pour sa bonne réponse immunitaire aux 3 types de vaccin. A ce stade, le système immunitaire des cobayes est parfaitement fonctionnel et permet donc d’obtenir une réponse anticorps satisfaisante.
Titrage de l’activité anti tétanique des vaccins adsorbés simples ou associés sur souris
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
34 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent un vaccin antitétanique puis une dose de toxine tétanique, et le porteur indique qu'environ la moitié développe une paralysie de la patte injectée, entraînant l'euthanasie dès qu'elle est avérée. Ce titrage sur souris répond à une exigence réglementaire de la Pharmacopée européenne pour libérer les lots de vaccins. Le porteur affirme que la réponse immunitaire nécessite l'"organisme entier" et qu'une méthode sérologique est en développement pour supprimer à terme l'épreuve par la toxine.
Objectifs
Le titrage de l'activité des vaccins antitétaniques est décrit dans la Pharmacopée européenne (Ph Eu 2.7.8: Titrage de l'activité du vaccin tétanique adsorbé, méthode B: épreuve de virulence sur souris). Le contrôle des vaccins tétaniques par un laboratoire officiel de contrôle est règlementaire.
Bénéfices attendus
La conformité des résultats d'activité des vaccins pour la valence antitétanique est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients. A l'issue des essais les animaux ne présentant aucune symptomatologie peuvent être réutilisés pendant une durée maximale à des fins de formation de nouveaux opérateurs à la contention et aux administrations.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections par voie sous-cutanée de solutions vaccinales plus ou moins diluées et d'une dose d'épreuve de toxine tétanique: J0: vaccination de tous les animaux à l'exception de ceux utilisés pour déterminer la dose de toxine tétanique qui paralyse 50 % des animaux: administration de 0,5 mL de vaccin. La vaccination d'un animale dure environ 10s. J28: administration de la toxine à tous les animaux: administration de 0,5 mL de toxine. L'administration dure environ 10s par animal.
Impact sur les animaux
Les actes expérimentaux entrainent la nuisance d'une piqure d'aiguille. Les administrations sous-cutanées ne sont pas accompagnées de réactions au point d’injection ni de modifications du comportement ou de l’apparence des animaux. Les lots d'animaux permettant de déterminer ou de vérifier la DP50 de la toxine tétanique et ceux correspondant aux groupes immunisés avec des faibles doses de vaccin développent une paralysie plus ou moins importante de la patte où a eu lieu l'administration de la toxine. Environ 50% des animaux utilisés vont développer une paralysie.
Devenir
A la fin d'un essai tous les animaux sont euthanasiés car ils ne peuvent être réutilisés en essai.
Remplacement
La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer l'activité des vaccins tétaniques. Ces dernières années la méthode sérologique est développée dans notre laboratoire afin de supprimer à terme le challenge avec la toxine tétanique et de rendre un résultat de conformité basé sur la concentration en anticorps des sérums des animaux vaccinés.
Réduction
Plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux comme le test de deux lots de vaccins en même temps que la référence pour limiter les lots de référence, la limitation des retests et la mise en place du contrôle d'une partie seulement des lots fabriqués pour des vaccins dont la conformité et la stabilité a pu être démontrée au fur et à mesure des années.
Raffinement
Un enrichisseent est mis à disposition des animaux: lanières cartonnées ou rouleau de coton pendant le premier mois puis maisonettes en plastiques rouge transparente la dernière semaine. (Les maisonnettes permettent une meilleure observation de la symptomatologie qui se manifeste après l'épreuve en fin d'essai). Dès qu'un animal en essai présente une paralysie avérée de la patte ayant reçue la toxine il est euthanasié. Un enrichisseent est mis à disposition des animaux: lanières cartonnées, rouleau de coton puis maisonettes en plastiques rouge transparente. Dès qu'un animal en essai présente une paralysie avérée de la patte ayant reçue la toxine il est euthanasié.
Choix des espèces
La Pharmacopée Européenne propose 2 espèces pour réaliser ce test réglementaire (chapitre 2.7.8): le cobaye ou la souris. La méthode mise en place en routine dans notre laboratoire est la méthode B sur souris Les souris peuvent être commandées à un poids de 20 à 22G ou à 5 semaines.
Etudes de toxicologie réglementaire chez le primate
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Macaques rhésus : 85
1 710 primates, 1 625 macaques à longue queue et 85 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyse histopathologique et une soixantaine réutilisée dans d'autres projets. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale ou injectable, de façon quotidienne ou hebdomadaire, avec des prélèvements sanguins et urinaires répétés. L'objectif est l'évaluation réglementaire de la toxicité avant les essais chez l'humain. Le porteur affirme que cette évaluation ne peut pas se faire in vitro et décrit le primate comme "parfois l'unique espèce pertinente", "indispensable" avant toute mise sur le marché.
Objectifs
Le projet réalisé dans un cadre réglementaire a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament dans le cadre de son développement préclinique. Les lignes directrices ICH guideline M3(R2), ICH-S6, ICH-S9 et EMA/CPMP/ICH/286/1995 ; December 2009, rendent indispensable ce projet chez un non-rongeur pour chaque nouveau médicament avant tout essai clinique et mise sur le marché. Selon la guideline ICH Topic S6(R1), EMA/CHMP/ICH/731268/1998 - June 2011, l'espèce primate est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anti-cancer). Ces études sont validées par la direction scientifique de notre laboratoire et celle du sponsor, basées sur des informations complémentaires aux études réglementaires requises pour une phase clinique ou la soumission d'un dossier.
Bénéfices attendus
Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament pendant son développement pré-clinique. Conformément aux lignes directrices ICH guideline M3(R2), ICH-S6, ICH(S9 et EMA/CPMP/ICH/286/1995; December 2009, l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché. Selon la guideline ICH Topic S6(R1), Step 4 Note for Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Products (EMA/CHMP/ICH/731268/1998 - adopted June 2011), l'espèce primate peut même être la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques des composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...). Ces études permettent d’évaluer le schéma thérapeutique envisagé et de réduire le risque potentiel encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration du candidat médicament au cours des premiers essais cliniques.
Procédures
Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec un produit, pour évaluer le potentiel effet toxique de ce produit. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré (exemple : action au niveau du système nerveux central, à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et à des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
Les études de toxicologie incluent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Seule la procédure 1 (études préliminaires) où les animaux participant à des études où une analyse anatomopathologique n'est pas nécessaire pour atteindre les objectifs, et ayant reçu un traitement n'entraînant pas d'effets secondaires ou des effets légers et réversibles, i.e. classe de sévérité réelle =1 (légère) ou 2 (modére) après analyse rétrospective, peut amener à garder les animaux en vie, et possiblement à être réutilisé dans un autre projet après une période de récupération et un aval du vétérinaire. Une estimation est faite en considérant que la moitié des animaux de la procédure 1 seront gardés en vie.
Remplacement
L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage). Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur, …) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement, …). L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire, un antibiotique. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix du primate est justifié par : - les homologies avec l'homme (anatomiques, physiologiques, métaboliques...) et souvent l'impossibilité d'utiliser d'autres espèces telles que le chien ou le porc en raison de l'absence d'homologies - la disponibilité d'études préliminaires dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… Certains composés biologiques, ayant des effets sur le système immunitaire, en particulier les anticorps monoclonaux, protéines thérapeutiques et vaccins thérapeutiques (anti-cancer, anti-Alzheimer…) doivent être testés dans des espèces pertinentes. Le singe est généralement l’espèce non-rongeur de choix car son système immunitaire est le plus proche de celui de l’homme s'il n'existe pas de modèle rongeur humanisé (souris transgéniques). Animaux d’au-moins 24 mois en début d'étude. Age moyen généralement requis dans les études de toxicité. Des animaux un peu plus âgés (jusqu'à 35-40 mois) peuvent être utilisés dans les études standards. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (par exemple nouveau produit contraceptif, des anticancéreux, des immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal plus jeune que 24 mois (études de toxicité juvénile).
Contrôle d’innocuité d’un vaccin sur carnivores domestiques
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Chiens : 80
140 carnivores domestiques, 60 chats et 80 chiens, vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés ou proposés à l'adoption. Chaque lot de vaccin est contrôlé en surdosage sur deux animaux par injections sous-cutanées, avec un suivi de la douleur au point d'injection, de la fièvre et d'une possible prostration. Le porteur indique que ce test d'innocuité a été supprimé en Europe mais reste exigé par la Russie, la Corée, l'Inde et la Chine pour libérer les vaccins. Il affirme qu'il n'existe à ce jour aucune méthode alternative, tout en décrivant des négociations en cours pour supprimer l'essai.
Objectifs
Projet de type répétitif demandé par la réglementation de certains pays et qui doit être réalisé sur chaque lot de vaccin fabriqué avant de le commercialiser Chaque lot de vaccin étant contrôlé en surdosage sur deux animaux pour vérifier sa bonne innocuité, en suivant les animaux sur le plan général et local au point d'injection.
Bénéfices attendus
Commercialisation de produits n’induisant aucune réaction générale et locale au-delà des critères définis dans les Monographies et instructions. Critères de durée et de dimensions selon le type de réaction au point d’injection
Procédures
Un contrôle comporte entre une et quatre administrations sous-cutanées le même jour, d’un volume de deux doses (2 ml) pour les vaccins inactivés ou dix doses(environ 3,2 ml) pour les vaccins vivants Durée : entre 5 et 10 secondes par administration selon le volume à injecter. Une pesée dure environ 5 minutes (transport de l'animal, pesée et retour en box). Une prise de température dure environ 4 minutes (transport de l'animal, prise de température et retour en box).
Impact sur les animaux
Réactions possibles suite à la vaccination : -une douleur à la palpation au niveau du point d’injection du vaccin, une démangeaison. -une augmentation ou une diminution de la température corporelle de l’animal. -une réaction cutanée au point d’injection: oedème, tuméfaction, nodule. -une dépression de l’animal pouvant se traduire par une prostration, un manque de dynamisme. -une perte de poids.
Devenir
Les animaux peuvent : -soit être réutilisés s’ils répondent au critère de la Monographie pour le vaccin rage à savoir ne pas avoir été vaccinés rage -soit être utilisés dans d’autres études -soit être envoyés à l'adoption
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de méthode alternative pouvant remplacer cet essai. En Europe, le test d’innocuité a été supprimé. Certains pays hors Europe demandent de poursuivre la réalisation de l'essai en routine. Les contrôles sont demandés par les autorités pour la libération des vaccins chiens (ex: Russie, Corée, Inde, Chine) et chat (Chine). D’autre part, un travail a été fait et se poursuit pour négocier la suppression de cet essai avec les autorités des pays concernés.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 par test) est une obligation réglementaire ; afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, quand cela est possible (programmation de la fabrication des vaccins, respect des délais de libération des vaccins) plusieurs lots de vaccins sont contrôlés sur un même couple de chiens ou de chats.
Raffinement
Observations quotidiennes des animaux et recours aux points limites, c'est-à-dire l’indicateur le plus précoce d’une éventuelle douleur et/ou détresse chez un animal. L’apparition de cet indicateur entraîne la mise en application de mesures immédiates, visant à éviter ou réduire cette souffrance (ex: traitement). Mise en place d'enrichissement dans les boxes des animaux. Mise en place de période de jeux et socialisation au quotidien. Renforcement positif.
Choix des espèces
Le chien et le chat sont les espèces de destination des vaccins et sont imposés par les Monographies et dossiers d’AMM des pays qui demandent ce contrôle. Le jour de la vaccination, les animaux ont plus de 8 semaines et avant 9 semaines d’âge, correspondant à la primo vaccination revendiquée pour l’ensemble des vaccins contrôlés, sauf pour le vaccin rage (minimum 8 semaines).
Immunisation chez le chat : Études d’efficacité d’un médicament destiné au chat par suivi de la réponse immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
270 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 124 réutilisés et 4 seulement proposés à l'adoption, les autres tués en fin d'étude. Ils reçoivent une à trois administrations d'un vaccin et des prélèvements sanguins répétés, parfois une biopsie sous anesthésie, pour évaluer la réponse immunitaire. Le porteur décrit la contention, les injections et les prises de sang comme sources d'anxiété et de douleur de quelques minutes. Il indique que le nombre de chats est fixé par la réglementation et présente le recours à l'espèce cible comme une "exigence réglementaire".
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité par suivi de la réponse immune d’un vaccin destiné au chat. Les études d’efficacité permettent de voir si le vaccin induit une réponse immunitaire satisfaisante chez l’animal grâce à des paramètres évalués par des analyses de laboratoires. De plus, un certain nombre d'études cliniques s'effectue sur de jeunes animaux, en particulier à partir de 8 semaines d'âge, âge cible minimum d'un certain nombre de produits. Dans ces études, des évaluations subcliniques - en particulier la réalisation de numération formule et/ou analyse d'un certain nombre de paramètres biochimiques sanguins - peuvent être mise en place, en fonction de l'objectif des études, avant de confirmer la possibilité d'inclure les animaux en étude. C'est dans ce contexte une campagne de prélèvements sanguins sur chatons est effectué directement dans l'élevage. Les objectifs sont d'établir des valeurs usuelles pour des paramètres hématologiques/biochimiques sanguins et d'évaluer leur variabilité et de mieux caractériser les chats issus de la colonie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces pour réduire l’impact des maladies infectieuses sur les populations.
Procédures
Des administrations : 1 à 3 administrations pendant la durée de l'étude soit 6 semaines max. L'acte technique a une durée de 1 à 2 minutes. Des prélèvements sanguins 1 à 3 fois en élevage, de 1 à 6 pour les études d'efficacité sérologique et 10 pour les durées d'immunité un an et 20 pour les durées d'immunité 3 ans . L'acte technique a une durée de 1 à 2 minutes. Dans quelques cas rare, lors de protocoles spécifiques, des biopsies punch sous anesthésie peuvent être effectuée. 1 biopsie maximum par étude. La durée de l'acte technique, y compris la phase d'anesthésie est de 15 à 20 minutes
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide, moins douloureuse et moins traumatisante possible. La répétition des administrations et des prélèvements peut occasionner une anxiété et une douleur de quelques minutes. La biopsie une contrainte pour l'animal même si celle-ci est superficielle et effectuée sous anesthésie.
Devenir
Les animaux n’étant pas réutilisés ou adoptés par la suite sont euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, si les points limites sont atteints, les animaux sont euthanasiés pour raison éthique.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car la réponse en anticorps doit être observée sur l’animal. Ces études d’efficacité doivent être réalisées dans l’organisme cible pour que les conclusions soient valides étant donné l’hétérogénéité inter-espèces des réponses immunitaires en fonction du produit administré. Il s’agit d’exigences réglementaires. Lorsque c’est possible, les essais in vitro et in vivo sur espèces alternatives permettent d’obtenir des informations complémentaires et prédictives, mais ne peuvent se substituer complètement à des études in vivo sur l’espèce cible.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre de chats utilisés en limitant le risque d’études non conclusives. L’approche statistique prévue s’appuie sur les référentiels européens en vigueur notamment les lignes directrices sur les principes statistiques pour les essais cliniques vétérinaires (EMA/CVMP/EWP/81976/2010 et EMA/CVMP/IWP/309514/2015). Lorsque cela est possible une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Raffinement
Pour chaque étude (caractérisation en élevage, efficacité immédiate ou durée d'immunité), une période d’acclimatation systématique des chats est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Une surveillance adaptée est mise en place quotidiennement pour assurer une prise en charge rapide des animaux si cela s’avérait nécessaire. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le Directeur d'Etude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. En cas d'atteinte de points limites : respiration agonique, perte de poids de 20%, absence de réactions aux stimulis, l'animal sera immédiatement euthanasié pour raison éthique.. Une anesthésie de l’animal peut être réalisée lors de certains actes. Elle est systématique pour les biopsies. Une tranquillisation, anesthésie, et/ou analgésie peuvent s’avérer utile en fonction de l’individu, de type de prélèvement ou du volume et voie d’administration. La contention est réalisée par du personnel compétent. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chat) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. Les chats utilisés ont entre 7 et 104 semaines au début des études. L’âge dépend des besoins pour les études d’efficacité qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du vaccin testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du vaccin mis sur le marché et des exigences des autorités. L’utilisation de jeunes chats correspond au test de caractérisation dans l'élevage et au test d’efficacité immédiate, c’est-à-dire après administration du vaccin. L’utilisation de chats plus âgés est faite pour des vaccins dont l’âge cible est l’adulte.
Évaluation de l’activité et titrage de formulation vaccinale destinée aux animaux de rente chez le cobaye et la souris.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 7000
22 000 souris et 7 000 cobayes vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections de vaccins, d'agents infectieux ou de toxines, le contrôle reposant sur le développement de la maladie chez les témoins non vaccinés, que le porteur prévoit mortelle pour une partie des animaux, environ 1 500 cobayes et 9 000 souris en gravité sévère. Ces tests d'activité et de titrage servent à libérer des lots de vaccins pour animaux de rente et chiens. Le porteur justifie l'usage par la "nécessité" réglementaire et affirme que ces tests ne sont "pas remplaçables" sans "un changement de la réglementation de tous les pays".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution du dossier d’AMM et pour la fabrication d’un lot commercial. Les tests ont pour but de déterminer l’activité et le titre de vaccins ou de principes actifs destinés aux animaux de rente et chiens qui se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche. Une équivalence entre les modèles animaux (espèce cible et espèce alternative) a été définie. Ceci permet d’utiliser les modèles rongeurs et d’éviter le recours aux espèces cibles afin de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et sûrs.
Bénéfices attendus
Ces tests garantissent la sûreté, l’efficacité et la qualité du produit pour les animaux. Ils permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs. Pour libérer le nombre nécessaire de doses de vaccins vétérinaires nous utiliserons, au maximum, 7000 cobayes et 22 000 souris sur 5 ans. Le nombre utilisé varie d’année en année en fonction du nombre de lots de vaccins ou formules vaccinales à tester, des calibrages de réactifs et des réglementations des différents pays destinataires. A titre d’exemple : - 1 lot de vaccin contrôlé sur 80 souris et 50 cobayes permet la vaccination de 481 000 bovins ou 962 000 ovins/caprins. - 1 lot de vaccin contrôlé sur 20 souris permet la vaccination de 59 500 chevaux ou 119 000 porcs ou chiens.
Procédures
Deux procédures sont prévues dans ce projet ou aucun prélèvement n’est réalisé. Dans la première procédure les animaux seront soumis à deux types d’injections : → Deux injections de vaccins par voie sous cutanée (30 secondes par injection à 28 jours d’intervalle) → Une injection par voie intra-musculaire (30 secondes par animal) . Dans la seconde procédure les animaux seront soumis à une seule injection par voie sous cutanée ou intra-veineuse ou intra-musculaire selon le protocole (30 secondes par animal).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les opérations conduites sur les animaux peuvent générer un stress et une douleur modérée de courte durée en fonction de l’occurrence des administrations et des examens individuels. Les contrôles d’activité d'épreuve et de titrage se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de l’agent infectieux ou de la toxine (les animaux vaccinés sont protégés). Les cobayes témoins non vaccinés en nombre réduit montrent les symptômes liés à la pathologie testée qui induit la mort. Sur 5 ans, nous estimons 1500 cobayes en grade sévère (non vaccinés) et 5500 en modéré (vaccinés). Les souris peuvent montrer des symptômes sévères liés aux toxines testées. Sur 5 ans, nous estimons 9000 souris en grade sévère et 13 000 en modéré. Des points limites sont appliqués et les manipulations sont réalisés par du personnel habilité, compétent pour identifier les cas pour lesquels l'animal ne serait plus dans sa zone de confort.
Devenir
Les animaux ayant terminé une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure. Ainsi, en fin de procédure, ils seront mis à mort.
Remplacement
La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation du pays destinataire. Elle permet de démontrer l’activité et le titre du vaccin ou de la formulation vaccinale. A ce jour, ces tests in vivo ne sont pas remplaçables par un modèle in vitro. La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour la mise sur le marché de lot commercial. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.
Réduction
Le nombre, le statut et le sexe des animaux utilisés est imposé par la réglementation des pays ou par la Pharmacopée. La réduction du nombre est possible grâce à la mutualisation de groupes références et témoins. Les souris et les cobayes sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente et chiens).
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe et soignés quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation et dans une ambiance propice au bien-être des animaux. Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement d’au moins 3 jours pour les souris et d’au moins 14 jours pour les cobayes avant le début du test. Les animaux ont accès à la nourriture et à l’eau à volonté et sont hébergés dans une ambiance musicale. Des enrichissements sont installés dans les hébergements (alimentaire et/ou objets de type huttes, tunnels, palets de foin de Crau et lanières de nidification selon les espèces). Par ailleurs, ces procédures sont mises en œuvre depuis 2005 conformément à la version APAFIS précédente. Des points limites spécifiques aux pathologies sont définis pour les cobayes témoins non vaccinés ou les titrages sur souris. Le personnel compétent vérifie l’évolution de l’état général et applique les points limites définis le cas échéant.
Choix des espèces
Les souris et les cobayes sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests réalisés sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente et chiens) Les cobayes pèsent entre 250g et 450g et les souris entre 18 et 20 g le jour de l'injection (J0). Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.
Evaluation chez la souris, le cobaye et le lapin de l’immunogénicité, du pouvoir immunogène (test de « potency ») et de l’identité d’une formule vaccinale destinée aux animaux de rente.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 1500
Lapins : 3000
3 000 lapins, 1 500 cobayes et 1 000 souris vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections de vaccins puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour des tests d'activité et d'identité exigés par la Pharmacopée avant commercialisation de vaccins destinés aux animaux de rente. Le porteur présente ces espèces comme "alternatives" à l'espèce cible et justifie leur usage par la "nécessité" réglementaire. Il affirme que ces tests in vivo ne sont "pas remplaçables" sans "un changement de la réglementation de tous les pays".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution du dossier d’AMM et pour la fabrication d’un lot commercial. Les tests ont pour but de garantir l’activité sérologique ou l'identité de vaccins ou de principes actifs destinés aux animaux de rente. Ils sont effectués sur espèces alternatives (lapins, souris, cobayes) pour limiter le recours à l'espèce cible (animaux de rente). Une équivalence entre les modèles animaux (espèce cible et espèce alternative) a été définie. Ceci permet d’utiliser les modèles rongeurs et d’éviter le recours aux espèces cibles afin de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et sûrs.
Bénéfices attendus
Ces tests garantissent la sûreté, l’efficacité et la qualité du produit pour les animaux de rente. Ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs. Pour libérer le nombre nécessaire de doses de vaccins vétérinaires nous utiliserons, au maximum, 3000 lapins, 1500 cobayes et 1000 souris sur 5 ans. Le nombre utilisé varie d’année en année en fonction du nombre de lots de vaccins ou formules vaccinales à tester et des réglementations des différents pays destinataires. A titre d’exemple : - 1 lot de vaccin contrôlé sur 20 souris permet la vaccination de 70 000 bovins - 1 lot de vaccin contrôlé sur 5 à 7 cobayes permet la vaccination de 110 000 bovins ou 550 000 ovins/caprins ou 130 000 porcs - 1 lot de vaccin contrôlé sur 20 lapins permet la vaccination de 481 000 bovins ou 962 000 ovins/caprins - 1 lot de vaccin contrôlé sur 3 cobayes permet la vaccination de 525 000 bovins ou 1 300 000 ovins/caprins
Procédures
Quatre procédures sont prévues dans ce projet. Dans deux procédures tous les animaux (souris, lapins) seront soumis à deux types d’interventions : → Deux injections de vaccins par voie sous cutanée (30 secondes par animal) → Un prélèvement de sang terminal sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris). Dans une troisième procédure tous les cobayes seront soumis à trois types d’interventions : → Un prélèvement de sang sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris). → Deux injections de vaccins par voie sous cutanée (30 secondes par animal) → Un prélèvement de sang terminal sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris). Enfin dans la dernière procédure les cobayes seront soumis à une seule injection par voie intra-dermique sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris) et aucun prélèvement n’est réalisé.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les opérations conduites sur les animaux peuvent au plus générer un stress et une douleur légère à modérée de courte durée en fonction de l’occurrence des administrations et des examens individuels. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l'animal ne serait plus dans sa zone de confort.
Devenir
Les animaux ayant terminé une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure comme exigé par leur statut d’animaux EOPS. Ainsi, en fin de procédure, ils seront mis à mort.
Remplacement
La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation du pays destinataire. Elle permet de démontrer l’activité du vaccin ou de la formulation vaccinale. A ce jour, ces tests in vivo ne sont pas remplaçables par un modèle in vitro. La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour la mise sur le marché de lot commercial. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.
Réduction
Le nombre, le statut et le sexe des animaux utilisés est décrit dans les réglementations des pays ou par la Pharmacopée. Le nombre d’animaux utilisés par lot est faible (compris entre 5 et 20 animaux maximum par lot). Les souris, cobayes et les lapins sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente).
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe et soignés quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation et dans une ambiance propice au bien-être des animaux. Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement d’au moins 3 jours pour les souris, d’au moins 14 jours pour les cobayes et d’au moins 21 jours pour les lapins avant le début du test. Les animaux ont accès à la nourriture et à l’eau à volonté et sont hébergés dans une ambiance musicale. Des enrichissements sont installés dans les hébergements (alimentaire et/ou objets de type huttes, tunnels, balles, hochets, plateforme de repos, repose pattes, palets de foin de Crau et lanières de nidification selon les espèces). Par ailleurs, ces procédures sont mises en œuvre depuis 2005 conformément à la version APAFIS précédente.
Choix des espèces
Les souris, les cobayes et les lapins sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente) En fonction des techniques utilisées, les lapins ont entre 3 et 6 mois d'âge, les cobayes pèsent entre 250g et 350g ou entre 350g et 450g et les souris entre 17 et 21 g ou âgées de 8 semaines le jour de l'injection (J0). Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.
Etudes pharmacocinétiques de composés ou de dispositifs médicaux libérant des principes actifs chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
2 250 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections de principes actifs, l'implantation de matériaux sous anesthésie et des prélèvements sanguins, avant d'être mis à mort et autopsiés pour prélever leurs organes, pour déterminer la cinétique et la biodistribution de composés ou de dispositifs médicaux. Le porteur, une société de recherche contractuelle, indique adapter les points limites aux effets toxiques signalés par ses clients. Il affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car les tests in vitro ne renseignent pas sur l'absorption, la distribution ou l'élimination des composés.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d'évaluer la bio-distribution et de déterminer la cinétique ADMET (Absorption, Distribution, Métabolisme, Elimination, et Toxicité) de principes actifs administrés chez des rongeurs. Les principes actifs seront recherchés au niveau systémique, urinaire, fécal, et dans différents organes. Selon les composés évalués, la nature des prélèvements sera modulée. En parallèle, une analyse histopathologique pourra être réalisée sur certains organes afin de confronter les résultats de la bio-distribution et de l'observation des lésions histologiques sur les organes étudiés. Ces études permettront d'améliorer les schémas thérapeutiques d'administration des composés et de définir les métabolites à rechercher pour les études de toxicologie réglementaires ultérieures. Les traitements seront appliqués selon les schémas thérapeutiques spécifiques aux principes actifs étudiés. De même, un produit de référence pourra être utilisé et choisi pour correspondre au mieux aux principes actifs étudiés. Il sera appliqué selon le schéma thérapeutique spécifique au produit de référence choisi. La durée des protocoles variera en fonction des procédures et des principes actifs étudiés allant de 4 jours à 6 mois. Les animaux pourront être sacrifiés à différents points de cinétiques en cours de protocole, selon la nature des principes actifs étudiés. A chaque sacrifice, une analyse macroscopique des cadavres et des organes à prélever sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : -Court terme : chaque étude incluse dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la cinétique ADMET des composés étudiées. -Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet permettra d’améliorer la prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé, ou d'autres anomalies ou de leurs effets chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Les injections des composés en parentérale sont réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés par un mélange isoflurane/air ou suite à la pose de cathéter. La durée des injections varie de 2 à 12 minutes par animal. Les fréquences d’administration dépendent des modes d'action des composés testés. Les différentes injections seront réalisées sur un maximum de 2 mois. Les implantations des matériaux sont réalisées sur animaux anesthésiés par un mélange isoflurane/air. L'implantation dure de 15 à 30 minutes par animal. Un protocole analgésique est également appliqué en péri-opératoire avec de la buprénorhine (Buprecare®). Quelque soit la méthode d’implantation, une seule implantation est réalisée à J0. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés par un mélange isoflurane/air. Les prélèvements sanguins durent 4 à 10 minutes par animal. Certains types de prélèvements nécessite un protocole analgésique (Buprénorphine (Buprecare®). Pour des prélèvements répétés chez les rats, une pose de cathéter connecté à un dispositif chronique de prélèvement peut être réalisé. Les prélèvements sont donc réalisés sur animal vigile directement au niveau du dispositif chronique de prélèvement. Les prélèvements seront réalisés au maximum sur 2 mois. Un volume sanguin de 0,135mL pour une souris de 25g et 1,2mL pour un rat de 250g est prélevé au maximum pour des prélèvements répétés. Une période minimum d’une semaine de récupération est nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement. Les volumes maximaux de prélèvements sanguins seront, pour un prélèvement unique, un volume de 300μl pour une souris de 25g et de 2400μl pour un rat de 250g. Les prélèvements de l’aorte abdominale ne se fera qu’en point final avant sacrifice de l’animal. Les urines peuvent être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où le pool d'urine libéré pendant ce laps de temps sera collecté. Le prélèvement du liquide synovial est réalisé si cela n’affecte pas l’analyse histologique de l’articulation ciblée. Le prélèvement du liquide synovial intra-articulaire se fait sous anesthésie générale par inhalation d'un mélange d'air et d'isoflurane ou sur cadavre en point final.
Impact sur les animaux
Notre société est une société de recherche contractuelle qui mène des études pour l'industrie pharmaceutique, agroalimentaire et biotechnologique. Comptes tenus des prés requis nécessaires à la mise en œuvre d’études in-vivo, nous demandons à nos clients un maximum d’informations permettant d’adapter le design d’étude et les points limites spécifiques aux éventuelles effets toxiques des molécules à tester. Ainsi les effets indésirables attendus sont systématiquements demandés à nos clients avant toute mise en œuvre du projet.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifié, une autopsie minutieuse sera réalisée et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le principe actif et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine par exemple. Les organes seront également utilisés pour doser le principe actif et/ou pour réaliser des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les principes actifs sont généralement, au préalable, testés in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin de vérifier les interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le Métabolisme, mais en aucun cas ne nous renseignent sur l'Absorption, la Distribution, ou l'Elimination de composés ainsi que leurs éventuelles interactions. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres pharmacocinétiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. D'autre part, les ICH exigent la validation de la pharmacocinétique chez les rongeurs.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux traitements, 15 animaux par groupe ont été prévu afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Pour chacune des procédures, un test statistique de Kruskall-Wallis suivit d'un test de Dunn sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’implantation des dispositifs médicaux, des traitements antalgiques pré et post implantation et dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repéré le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et en s’appuyant sur des grilles de bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisi pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les paramètres ADMET étant fréquemment évalués chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats chez l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. D'autre part, les ICH exigent la validation de la pharmacocinétique chez les rongeurs. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Bovins : 970
1 470 moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une substance d'essai puis sont inoculés avec les agents de la fièvre catarrhale ovine, de la diarrhée virale bovine ou du virus respiratoire syncytial, et subissent des prélèvements et des écouvillonnages nasaux, pour évaluer l'efficacité de produits immunologiques vétérinaires. Le porteur indique que l'épreuve virulente peut provoquer boiteries, salivation, pétéchies, érythèmes et jetage, et que tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet car infectés ou vaccinés avec des vaccins vivants. Il présente l'évaluation sur l'"espèce cible" comme une exigence réglementaire.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité de substances d’essai chez les bovins et chez les ovins contre 3 pathologies : la Fièvre Catarrhale Ovine chez les ovins et chez les bovins, contre la Diarrhée Virale des Bovins chez les bovins et contre l’infection au Virus Syncithial Respiratoire chez les bovins. Les études d’efficacité par épreuve consistent dans un premier temps à immuniser les animaux par administration de la substance d’essai puis dans un second temps à inoculer l’agent pathogène de la maladie concernée afin d’évaluer la protection apportée par la substance d’essai testée. Ces études sont des obligations règlementaires menées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de différents guidelines et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Avant de réaliser ces études règlementaires d’efficacité par épreuve, il est nécessaire de mettre au point les modèles d’épreuve et parfois d’amplifier le pathogène in vivo pour constituer un stock suffisant de souche d’épreuve. Aussi, dans un but d’amélioration continue, en fonction de l’évolution des connaissances, de nouvelles études peuvent être réalisées pour optimiser le modèle d’épreuve. Cette optimisation permet d’obtenir un modèle plus fiable, plus reproductif et plus représentatif de la pathologie dans son développement réel. La finalité des études menées au sein de ce projet est la mise au point de vaccins d’un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins sont essentiels en élevage afin de protéger les animaux contre les maladies infectieuses, de diminuer l’usage des antibiotiques et de garantir les performances zootechniques et économiques.
Bénéfices attendus
La finalité des procédures décrites dans ce projet est de valider l’efficacité de produits immunologiques contre 3 pathologies dont les effets sanitaire et économique sont très importants. La disponibilité de produits efficaces permet : - de protéger l’animal en tant qu’individu, - de réduire le nombre d’animaux affectés et/ou la gravité de la maladie, ce qui augmente la protection au niveau du troupeau, - d’améliorer le contrôle de la dispersion géographique de la maladie.
Procédures
Pour la première étape d’immunisation des animaux, l’administration de la substance d’essai est réalisée sur des animaux vigiles, 1 à 3 injections sont réalisés avec 1 à 3 semaines d’intervalles. Ces injections durent de 1 à 2 minutes maximum en incluant la contention. Pour la deuxième étape d’administration, les injections s'effectuent sur animal vigile, une cage de contention pourra être utilisée. Ces administrations durent de 1 à 2 minutes maximum, à l’exeption de l’administration avec une nébulisation électronique qui dure approximativement 5 minutes. Les prélèvements s'effectuent sur animaux vigiles, des cages de contentions pourront être utilisées, un miminum de 48H entre deux prélèvements. Des prélèvements terminaux pourront être réalisés, ils seront toujours réalisés sous anesthésie. Des prélèvements par écouvillonnage nasaux s'effectuent sur animal vigle, des cages de contention pourront être utilisées, un miminum de 24H entre deux écouvillonnages. Ces prélèvements durent de 2 à 3 minutes maximum en incluant la contention. Pour les administrations de substances – de la souche de challenge et/ou pour les prélèvements une tranquilisation des animaux pourra être réalisée si les animaux présentent un niveau de stress important, se caractérisant par un comportement défensif, et/ou de fuite. Des prélèvements terminaux de sang ou de liquide broncho-alvéolaire seront toujours réalisés sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans ce document vont avoir des effets directs et indirects sur les animaux. Les effets directs sont considérés comme peu invasifs car les manipulations (contention, administration) et les prélèvements (prélèvement sanguin, écouvillonnage) sont de courte durée. Les effets indirects découlent des effets potentiels des souches d’épreuve administrées. Pour les effets indirects, lié à l’administration de la souche d’épreuve, les différentes épreuves incluses dans le projet peuvent être classées en deux catégories, celles dont la pathologie reste frustre et sous-clinique, avec des signes cliniques rares et légers et celle qui entrainent des signes cliniques modérées : boiteries, salivation, pétéchies, érythèmes, jetage, fièvre, hyperthermie, toux, dyspnée… ces modèles d’épreuve nécessitent un suivi clinique adapté et des points limites spécifiques permettant d’anticiper la dégradation de l’état général des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du projet, car animaux hébergés, possiblement vaccinés avec des vaccins vivants diffusibles et/ou infectés avec des agents pathogènes.
Remplacement
Ces ruminants représentent les espèces cibles des substances d’essai testées. Les essais in vivo réalisés dans ce projet doivent être conduits chez l’animal afin qu’ils puissent répondre aux exigences règlementaires. Dans le cadre d’études non règlementaires, les procédures expérimentales réalisées chez les espèces cibles permettent d’avoir des résultats plus conclusifs. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible, décrites dans le présent projet, ne disposent pas d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives.
Réduction
Pour les études règlementaires, le nombre d’animaux requis est souvent déterminé par les textes (pharmacopées et/ou autres textes règlementaires concernés). Lors des phases de recherche en amont des études réglementaires, les effectifs sont évalués au plus juste (en fonction de la bibliographie, des guidelines, de l’historique, de la définition des objectifs…) de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont également déterminés de façon à empêcher les études non conclusives.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, la Structure chargée du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques et des conditions de vie pour les animaux. Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans un but d’habituation avec l’environnement et le personnel, afin de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental- animaux devant être manipulés au moment du sevrage, et que l’on préfère laisser le plus possible avec leur mère). Des points limites, spécifiques ou non de la pathologie, ainsi qu’un suivi adapté (observations quotidiennes, bi-quotidiennes…) sont mis en place afin de prendre en charge les animaux le plus rapidement et efficacement possible lors du développement de pathologies entrainant une potentielle douleur chez l’animal. Ces critères sont en constante évolution afin qu’ils reflètent au mieux l’état des connaissances vétérinaires actuelles. Une gêne peut également être occasionnée en fonction de l’occurrence des administrations et/ou prélèvements. Afin de réduire cet inconfort, les opérateurs hautement qualifiés réalisent une contention adaptée (potentiellement incluant anesthésie et /ou analgésie) de l’animal et une alternance des sites d’administrations et/ou de prélèvements peut être mise en place.
Choix des espèces
L’évaluation chez l’espèce cible est une exigence règlementaire. Les bovins et les ovins sont les espèces cibles des substances d’essai étudiées. Les animaux utilisés peuvent être des nouveau-nés, de jeunes animaux en croissance et/ou des adultes (y compris des femelles gestantes). L’âge dépend des besoins pour les études d’efficacité par épreuve, de production de souches et/ou d’études de mise au point de modèle d’épreuve qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, de la substance d’essai testée et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités.
Evaluation de potentiels effets cardiovasculaires de candidats médicaments sur les rongeurs anesthésiés (rats, cobayes et souris)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1350
Cochons d'Inde : 3030
5 730 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une chirurgie puis des mesures de pression artérielle, de fréquence cardiaque et d'électrocardiogramme sous anesthésie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer les effets cardiovasculaires de candidats médicaments avant leur mise sur le marché. Le porteur présente cette évaluation comme un passage "obligatoire" des études réglementaires de pharmacologie de sécurité. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne suffit à étudier les effets d'un composé sur la fonction cardiovasculaire de l'animal entier.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'évaluer les potentiels effets secondaires d'un futur médicament sur le système cardiovasculaire chez le rongeur sous anesthésie. En effet, avant la mise sur le marché d'un nouveau médicament, l'évaluation de ses effets hémodynamiques (sur les pressions artérielle/ ventriculaire et la fréquence cardiaque) et électrophysiologiques (sur l'électrocardiogramme) est indispensable. Ce projet est réalisé dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité précliniques réglementaires.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le processus de mise sur le marché de nouveaux médicaments. L'évaluation de potentiels effets secondaires sur le système cardiovasculaire de l'animal est un passage important et obligatoire avant une administration chez l'Homme. Ainsi, ce projet permet de réaliser des études de pharmacologie de sécurité obligatoire et donc, de vérifier si des substances ont des effets secondaires sur les fonctions cardiovasculaires. Ainsi, les bénéfices attendus du projet sont le développement de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires cardiovasculaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme.
Procédures
La procédure de ce projet décrit différents types d'interventions. Les animaux subiront une chirurgie, sous anesthésie générale, afin de pouvoir faire les mesures des paramètres cardiovasculaires (toujours sous anesthésie). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant cette procédure, sous anesthésie également. Ainsi tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (=procédure sans réveil). La durée totale d'une expérience n'excédera pas 4 heures. Les animaux seront traités avec le futur médicament soit avant la phase de chirugie, soit après.
Impact sur les animaux
La contention de l'animal vigile pour induire l'anesthésie ou administrer le produit peut engendrer un stress mineur à l'animal. Concernant la chirurgie, son protocole est maitrisé et la profondeur de l'anesthésie est suivie tout au long de l'expérience pour éviter toutes douleurs à l'animal (i.e monitoring de l'état de non conscience de l'animal). Dans tous les cas, l’impact négatif pour l’animal sera réduit au maximum depuis l'hébergement jusqu'à la fin de l'expérience.
Devenir
Les procédures décrites dans ce projet sont des procédures sans réveil. Ainsi tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérience.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, le cobaye ou la souris car il n'existe pas de méthode de substitution in silico ou in vitro pour étudier les effets d'un candidat médicament sur la fonction cardiovasculaire des animaux. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre à l'intégralité des objectifs scientifiques du projet. Or, avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier (l'animal) constitue un passage obligatoire pour l'évaluation des effets secondaires sur la fonction cardiovasculaire d'un candidat médicament. A ce jour, le rat, le cobaye et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Ce nombre (en général n=6-8/groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, dont l'anesthésie qui sera si necessaire associée à un anti-douleur (type morphinique/opiacé) ou anti-inflammatoire (en cas d'instabilité des paramètres cardiovasculaires après chirurgie)• Un monitoring complet de l'anesthésie pour éviter la reprise de conscience • la formation du personnel • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Des conditions d’hébergement (avant expérience) adaptées et optimisées pour améliorer le bien-être animal • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
Le rat, le cobaye et la souris sont les espèces animales couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire, de façon à limiter l'utilisation d'espèces animales plus grandes. Ce projet concerne des animaux adultes. Il n’a pas pour objectif d’étudier les effets d'un produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Etude de l’efficacité de la N-acétylcystéine à augmenter l’effet antalgique du paracétamol tout en inhibant son hépatotoxicité
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des tests de seuil de douleur par stimulation plantaire toutes les six heures, des administrations par gavage, la pose d'un cathéter intraveineux, des prélèvements sanguins et des IRM, avant d'être mises à mort par perfusion intracardiaque, pour tester l'ajout de N-acétylcystéine au paracétamol. Le porteur indique que la stimulation plantaire induit une douleur, dont l'animal peut se soustraire en retirant sa patte. Il affirme que les cultures cellulaires et les modélisations informatiques ne peuvent mimer la douleur, appréhendable selon lui uniquement dans l'"organisme entier".
Objectifs
Le paracétamol est un médicament de référence pour le traitement de la fièvre et de la douleur, à tous les âges de la vie et dans de très nombreuses circonstances. La dose actuellement recommandée chez l’adulte est de 3 à 4 grammes par jour, répartis en prises de 1 gramme maximum. Cette dose maximale est limitée par la toxicité, principalement hépatique, qui peut survenir à des doses plus élevées. Cependant, l’élimination par le corps du paracétamol lors d’une prescription classique expose à des périodes d’inefficacité. Pendant ces périodes, il n’est pas possible de soulager la fièvre ou la douleur sans avoir recours à d’autres médicaments, tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou les opiacés. Malheureusement, ces autres médicaments ont un profil d’effet indésirable bien moins bon que le paracétamol et les AINS sont même contre-indiqués lors d’infections bactériennes car ils sont susceptibles d’entraîner des complications pouvant conduire jusqu’au décès. Dans plusieurs études, augmenter la dose de paracétamol de façon très ponctuelle permet effectivement d’augmenter son efficacité. L’enjeu de pouvoir prescrire le paracétamol à forte dose, sur quelques jours ou plus, tout en se préservant de sa toxicité est donc important et n’a pas de solution à l’heure actuelle. La N-acétylcystéine (NAC) est l’antidote de référence lors des intoxications au paracétamol. Elle permet de s’opposer à l’action toxique du paracétamol sans en entraver son efficacité. Ce projet scientifique consiste à utiliser un modèle murin (souris) pour montrer que la combinaison de paracétamol et NAC dans un schéma à 6 administrations par 24h procure une meilleure antalgie dans le temps qu’un schéma classique à 4 administrations par 24h, tout en empêchant la survenue d’une toxicité hépatique.
Bénéfices attendus
L’amélioration de la prise en charge de la douleur est une problématique d’actualité. Permettre une meilleure prise en charge de la douleur grâce à un nouveau schéma thérapeutique du paracétamol permettrait également une réduction de l’utilisation des AINS (non indiqués en cas d’infection et souvent mal tolérés) et des opiacés, souvent mal tolérés et vecteurs de dépendance.
Procédures
1- Test de seuil de la douleur par stimulation plantaire (15 secondes ; toutes les 6h jusqu’à 23h post-traitement). 2- Administration médicamenteuse par gavage (30 secondes ; 4 à 6 administrations selon les groupes). 3- Pose d’un cathéter intraveineux et prélèvement sanguin (15 minutes ; 2 prélèvements). 4- Imagerie par résonance magnétique (IRM) (15 minutes ; 2 examens IRM). 5- Mise à mort par perfusion intracardiaque (15 minutes).
Impact sur les animaux
Test de seuil de la douleur : La stimulation plantaire induit une douleur chez l’animal. Néanmoins, l’animal pourra s’y soustraire en retirant sa patte du dispositif d’expérimentation. Par ailleurs, la procédure expérimentale sera réalisée durant une courte durée de manière à éviter toute lésion tissulaire. Administration médicamenteuse par gavage oral : Tous les moyens seront mis en œuvre pour éviter le stress et les blessures chez l’animal. Avant la procédure, la souris sera habituée à la contention. Une aiguille d’alimentation à bout rond, d’une longueur appropriée à la taille du sujet et flexible sera utilisée. Pour la tolérance de l’administration, l’aiguille sera trempée dans une solution appétente pour la souris (liquide sucré), ce qui stimulera également le réflexe de déglutition. Pose d’un cathéter intraveineux et prélèvement sanguin : L’incision de la queue de la souris est susceptible d’induire une douleur, laquelle sera prévenue par une analgésie locale réalisée avant le réveil de l’animal. Une attention particulière sera apportée afin de permettre aux tissus du site de la ponction de guérir avant le second prélèvement sanguin. Par ailleurs, après chaque prélèvement, l’expérimentateur s’assurera que l’animal ne saigne plus avant de le remettre dans sa cage. Imagerie par résonance magnétique (IRM) : Cette méthode impose des manipulations qui sont autant de stresseurs pour l’animal. De ce fait, l’anesthésie générale sera utilisée durant cette procédure et pratiquée par du personnel expérimenté.
Devenir
Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du protocole. La mise à mort des animaux est nécessaire pour le prélèvement des tissus en fin de protocole.
Remplacement
Les expériences in vitro de cultures cellulaires ou les modélisations informatiques ne permettent pas de mimer la douleur, et excluent les multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux et de l’organisme entier. Ainsi, les procédures expérimentales de ce projet ont un caractère de stricte nécessité visant à étudier la douleur, une pathologie morphologique dépendante de données architecturales et systémiques uniquement appréhendables in vivo. De fait, les expériences ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés (anesthésiant : isoflurane ; analgésiques : lidocaïne, buprénorphine) durant chaque procédure (pose d’un cathéter intraveineux, IRM, perfusion intracardiaque). Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de la douleur. L’anatomie et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la douleur. Le stade de développement des animaux est de 8 à 12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de la douleur.
Etude d’efficacité d’un probiotique administré dans l’alimentation chez le chat
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
14 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite pour un autre projet ou placés. Ils reçoivent un probiotique dans leur alimentation pendant 31 jours, avec trois prises de sang sous sédation et des séjours en cage à métabolisme jusqu'à seize heures pour recueillir les fèces. Le porteur évalue l'effet de ce complément, "FlorEquilibre", sur la digestibilité et la flore intestinale. Il affirme que l'effet sur le microbiote peut difficilement être reproduit hors de l'animal.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet, chez le chat, de la distribution dans l'alimentation d'un probiotique, FlorEquilibre, sur la digestibilité et la flore intestinale. Les paramètres mesurés pour évaluer l'efficacité du probiotique seront la consistance et les analyses chimiques et microbiologiques des fèces, les paramètres hématologiques et biochimiques, la digestibilité, la prise alimentaire et le poids corporel.
Bénéfices attendus
Chez le chat, la flore intestinale peut être perturbée: - lors du sevrage, de la croissance, - lors de changements d'environnement comme l'arrivée dans un nouveau foyer ou un séjour en chatterie, - lors de situations potentiellement stressantes comme un voyage, l'arrivée d'autres animaux dans le foyer, une hospitalisation, - lors d'une vaccination ou de prises de médicaments comme des antibiotiques, - lors d'un changement d'alimentation ou de l'ingestion d'aliments inhabituels par exemple pour les chats qui ingèrent différentes proies. Les animaux âgés, et certaines races prédisposées comme le Sphinx ou le Bengal, ont également une plus grande sensibilité digestive. L'administration de probiotiques présente alors un avantage pour rééquilibrer la flore intestinale et aider l'animal à mieux surmonter ces perturbations.
Procédures
1. Alimentation individuelle pendant toute la durée de l'étude, 1 fois par jour (environ 10 minutes après habituation), 2. Traitement avec un complément alimentaire pour un des groupes, 1 fois par jour pendant 31 jours avec l'alimentation (environ 10 minutes), 3. Examen clinique effectué par un vétérinaire, 1 fois par période x 3 périodes (avant traitement, pendant traitement et post-traitement) (environ 15 minutes), 4. Pesée une fois par semaine (environ 5 minutes), 4. Prélèvement de fèces en cage à métabolisme, 24h maximum x 17 jours (pour la plupart des chats, les fèces seront émises entre 16h la veille et 8h le matin du jour de prélèvement soit 16h en cage à métabolisme), 5. Prélèvements de sang, 1 fois par période x 3 périodes (environ 1 minute).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont: douleur et stress suite aux trois prises de sang (même si le stress sera réduit par une sédation préalable), placement en cage à métabolisme pour le prélèvement de fécès. Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des troubles digestifs liés au traitement probiotique même si la formulation est déjà disponible sur le marché et administré à la dose recommandée.
Devenir
Les animaux auront subi une procédure modérée avec un très faible risque d'effet indésirable. Sauf avis contraire du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur, les animaux pourront être réutilisés pour un autre projet. Cependant, s'il s'avère qu'un animal a du mal à se laisser manipuler et/ou n'est pas très à l'aise dans un environnement avec plusieurs autres congénères, il pourra être placé.
Remplacement
Il est nécessaire pour déterminer l'efficacité d'un probiotique de déterminer son effet sur le microbiote intestinal, un mélange complexe de micro-organismes qui peut difficilement être reproduit en totalité in vitro. De plus, les interactions avec l'organisme, la matrice alimentaire lors de l'administration conjointe à l'aliment, la variabilité interindividuelle, ne pourraient pas être prises en compte. Enfin, pour des contraintes réglementaires, il est impératif de mener trois études indépendantes sur l'espèce cible. Il n'est donc pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En revanche, vu que le probiotique est déjà mis sur le marché, il y a peu de risques d'effets indésirables avec un tel traitement.
Réduction
Le nombre de groupes, soit un sans traitement et un traité avec la dose recommandée, est défni par la guideline de l'EFSA (European Food Safety Authority) "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives". Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé lors des deux essais précédents. Ce nombre de 7 animaux par groupe ne peut donc pas être modifié, les trois essais devant obligatoirement être les mêmes. Cependant, compte-tenu de la procédure effectuée sur ces chats et de l'absence d'effets indésirables du traitement, ces chats pourront ensuite être soit réutilisés pour une procédure légère ou modérée, soit proposés à l'adoption à la fin du projet.
Raffinement
Bien que les prélèvements de fèces soitent réalisés en cage à métabolisme, les cages seront aménagées pour réduire au maximum l'inconfort de l'animal : grille des cages recouverte de tapis caoutchouc et de VetBed, litière pour la récolte des fèces nettoyée immédiatement, jouets et brosses dans la cage, possibilité de sortir chaque chat sous surveillance pour qu'il puisse intéragir avec les manipulateurs et d'autres chats. Les chats seront également habitués aux cages à métabolisme pendant la période de pré-traitement. De plus, si un chat n’a pas fait de fèces le matin, il pourra être sorti des cages à métabolisme après le repas et isolé dans une des parties de la volière commune où ils sont hébergés habituellement jusqu’à récupération des fèces. Pendant toute la durée du projet, les chats seront suivis quotidiennement par un vétérinaire. La douleur et le stress qui pourraient être engendrés par les prises de sang seront attenuées par une sédation préalable. Même si le traitement est administré à la dose recommandée, des effets indésirables liés au traitement probiotique pourraient survenir. Cela devrait être essentiellement des troubles digestifs transitoires. Si les troubles persistent plus de trois jours, l'animal sera exclu de l'étude et des soins adaptés seront mis en place le cas échéant par le vétérinaire en charge du suivi quotidien des animaux.
Choix des espèces
L'espèce choisie est l'espèce cible pour laquelle le probiotique est mis sur le marché Les animaux seront des chats adultes âgés de 1 à 7 ans, comme dans les deux essais précédents. La guideline de l'EFSA "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives" recommande en effet que les animaux utilisés pour les essais soient des animaux en bonne santé et appartenant à un groupe homogène. D'où le choix d'écarter les animaux trop jeunes (en croissance avec un microbiote non mature, non stérilisés) et trop âgés (risque de problèmes de santé accrus).