Tests réglementaires

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales sous contention pour déclencher une superovulation, puis sont tuées pour prélever leurs embryons. Ces embryons servent à un test réglementaire d'embryotoxicité vérifiant l'innocuité de matériels et de produits en contact avec les gamètes humains lors de la procréation médicalement assistée. Le porteur présente ce test comme réalisé en partenariat avec un industriel et affirme qu'aucune méthode validée par la loi ne peut s'y substituer.

Objectifs

Le test d'embryo toxicité chez la souris (Mouse Embryo Assay) est utilisé pour attester de l'absence de toxicité et vérifier la fonctionnalité des milieux, du matériel de laboratoire, des produits jetables ou de tout dispositif pouvant entrer en contact avec des gamètes ou des embryons pendant les processus de la procréation médicalement assistée.

Bénéfices attendus

Ce projet établi en partenariat avec un industriel permettra de délivrer sur le marché des lots de matériels, de produits jetables ou dispositifs qui entrent en contact avec les gamètes ou embryons humains pendant les process procréation médicalement assistée.

Procédures

Les animaux femelles seront soumis à des contentions pour pratiquer les injections IP. Deux injections séparées de 48h seront faites (0,1 ml chacune, aiguille 26G, en IP) par du personnel compétent.

Impact sur les animaux

Le processus de superovulation ne génère pas de douleur. Les nuisances résultent de la contention des animaux pour procéder aux 2 injections intrapéritonéales (0,1ml) qui seront effectuées par du personnel rompu à ce geste.

Devenir

La procédure aboutit au prélèvement d'embryons donc à la mise à mort des animaux.

Remplacement

Il n'existe pas en l'état actuel de test validé par la loi qui permette une substitution au MEA. Le test nécessite des embryons que la connaissance du modèle murin et de la superovulation permettent de se procurer facilement tout en utilisant un minimum d'animaux.

Réduction

La loi exige 2 lots chacun de 20 embryons (1 essai, 1 contrôle) et n'impose pas une lignée murine de référence pour ce test. Aussi nous avons chois la lignée B6CBAF1/J qui présente un taux naturel de fécondité élevé qu'il est possible d'augmenter par superovulation (obtention de plus de 10 embryons par femelle). Pour chaque test nous utiliserons 4 femelles qui seront mises en accouplement avec 2 mâles.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 1 semaine avant de débuter le protocole de superovulation. Les animaux seront hébergés par couple avec eau et aliments ad libitum. La température, l'humidité et la luminosité sont contrôlées et du matériel de nidification sera systématiquement introduit dans les cages. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être.

Choix des espèces

Le test sur embryon de souris est requis par la loi. La souris B6CBAF1/J est une souris qui répond très bien au protocole de superovulation réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux seront commandés au stade pré-pubère (soit 4-6 samaines). Après une semaine d'acclimatation, les animaux femelle seront à un âge optimal pour répondre à un traitement de superovulation. Les mâles seront à cette même période des animaux pubères produisant des spermatozoïdes fécondants.

700 animaux non-humains, 600 cobayes et 100 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection sous-cutanée ou intrapéritonéale d'un vaccin ou d'un adjuvant, puis sont mis à mort en raison de leur statut EOPS qui interdit toute réutilisation. Le porteur présente ces tests d'innocuité comme menés sur des espèces alternatives pour épargner les animaux d'élevage et les chiens, et chiffre qu'un lot contrôlé sur quelques individus libère la vaccination de centaines de milliers d'animaux d'élevage. Il affirme que la Pharmacopée européenne exige ces tests et qu'aucun modèle in vitro ne peut les remplacer sans changement réglementaire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution du dossier d’AMM et pour la fabrication d’un lot commercial. Les tests ont pour but de confirmer l’innocuité et de vérifier la toxicité de vaccins ou principes actifs, et de confirmer l’innocuité d’adjuvants entrant dans la composition de vaccins vétérinaires. Ils sont effectués sur espèce alternative (souris, cobayes) pour limiter le recours à l’espèce cible (animaux de rente). Une équivalence entre les modèles animaux (espèce cible et espèce alternative) a été définie par les Pharmacopées. Ceci permet d’utiliser les modèles rongeurs et d’éviter le recours aux espèces cibles afin de garantir une commercialisation de vaccins sûrs.

Bénéfices attendus

Ces tests garantissent la sûreté et la qualité du produit pour les animaux de rente. Ces tests permettent la libération d’un maximum de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs. Pour libérer le nombre nécessaire de doses de vaccins vétérinaires nous utiliserons, au maximum, 600 cobayes et 100 souris sur 5 ans. Le nombre utilisé varie d’année en année en fonction du nombre de lots de vaccins ou formules vaccinales à tester et des réglementations des différents pays destinataires. - 1 lot de vaccin contrôlé sur 5 souris et 3 cobayes permet la vaccination de 89 500 chevaux ou 119 000 porcs ou chiens - 1 lot de vaccin contrôlé sur 17 cobayes permet la vaccination de 481 000 bovins ou 962 000 ovins/caprins ou 200 000 équins

Procédures

Deux procédures sont prévues dans ce projet liés aux deux espèces. Les animaux seront soumis à une injection soit par voie sous-cutanée soit intra-péritonéale. Aucun prélèvement n’est réalisé.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les opérations conduites sur les animaux peuvent au plus générer un stress et une douleur légère de courte durée en fonction de l’occurrence des administrations et des examens individuels. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l'animal ne serait plus dans sa zone de confort.

Devenir

Les animaux ayant terminé une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure comme exigé par leur statut d’animaux EOPS. Ainsi, en fin de procédure, ils seront mis à mort.

Remplacement

La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation du pays destinataire. Elle permet de démontrer l’innocuité et l’absence de toxicité du vaccin ou de la formulation vaccinale. A ce jour, ces tests in vivo ne sont pas remplaçables par un modèle in vitro. La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour la mise sur le marché de lot commercial. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.

Réduction

Le nombre, le statut et le sexe des animaux utilisés est décrit dans les réglementations des pays ou par la Pharmacopée. Le nombre d’animaux utilisés par lot est faible (compris entre 3 et 17 animaux). La réduction du nombre est possible grâce à la mutualisation des groupes témoins. Les souris et les cobayes sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente et chiens).

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe et soignés quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation et dans une ambiance propice au bien-être des animaux. Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement d’au moins 3 jours pour les souris et d’au moins 14 jours pour les cobayes avant le début du test. Les animaux ont accès à la nourriture et à l’eau à volonté et sont hébergés dans une ambiance musicale. Des enrichissements sont installés dans les hébergements (alimentaire et/ou objets de type huttes, tunnels, palets de foin de Crau et lanières de nidification selon les espèces). Par ailleurs, ces procédures sont mises en œuvre depuis 2005 conformément à la version APAFIS précédente.

Choix des espèces

Les souris et les cobayes sont des espèces alternatives, décrites dans la Pharmacopée Européenne et les réglementations pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente et chiens). En fonction des techniques utilisées, les cobayes pèsent entre 250g et 350g ou entre 350g et 450g et les souris entre 17 et 22 g le jour de l'injection (J0). Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis à un régime gras et sucré, ils subissent des mises à jeun, des gavages de glucose avec prélèvements de sang répétés à la queue et des isolements de 24 heures pour l'analyse vidéo de leurs déplacements. Le projet, mené pour une entreprise, teste si une eau traitée par électrolyse limite le syndrome métabolique. Le porteur présente le rat comme un "donneur" d'organes et affirme qu'une étude in vitro n'aurait "pas d'intérêt" ici.

Objectifs

La prévalence de l'obésité ne cesse de croître. D'ici 2030, on prévoit que 40% de la population mondiale sera en surpoids et 20% sera obèse. L'obésité est un facteur de risque important pour de nombreuses maladies non transmissibles, notamment : les troubles métaboliques (par exemple, le diabète et la résistance à l'insuline), les maladies pulmonaires (syndrome d'hypoventilation lié à l'obésité, apnée du sommeil), les maladies cardiovasculaires, les maladies digestives (stéatose hépatique non alcoolique) et les cancers. De nombreux mécanismes expliquent ces complications, mais l'inflammation associée à l'obésité figure parmi les principaux. En effet, l'obésité se caractérise par un dysfonctionnement immunitaire, une altération de la perméabilité intestinale (qui favorise la translocation bactérienne et l'inflammation systémique). Cette inflammation de bas grade va avoir un impact sur le métabolisme, notamment en favorisant le développement d'une résistance à l'insuline et le développement d'un syndrome métabolique (première étape vers le diabète de type 2). Ainsi, toute stratégie permettant de limiter l'inflammation de bas grade au cours du syndrome métabolique permettra de limiter ses conséquences délétères. Parmi ces stratégies, l'apport d'une eau de boisson traitée pour éliminer tout matériel organique pourrait contribuer à diminuer l'inflammation de bas grade. Nous proposons d'évaluer le potentiel d'une telle eau traitée par un procédé innovant dans un modèle de syndrome métabolique et d'obésité chez le rongeur. Le 1er critère sera de déterminer la capacité de cette eau à limiter et/ou à prévenir le syndrome métabolique évaluée par une meilleure tolérance au glucose déterminée par un test de charge orale en glucose. Afin de contrôler l'impactéventuel d'une modification de lactivité locomotrice, celle-ci sera déterminée à l'aide d'un système de video-tracking.

Bénéfices attendus

Selon l'entreprise sollicitant cette prestation, cette eau traitée pourrait permettre de limiter l'inflammation de bas grade associée au syndrome métabolique permettant ainsi de limiter ses conséquences délétères.

Procédures

Certains animaux seront soumis à un régime riche en graisses et en sucres. Ils recevront également soit l'eau du réseau de ville qui répond aux critères très stricts dictés par le Ministère de la Santé et le Conseil supérieur du secteur d’Hygiène Publique soit cette même eau traitée par électrolyse, durant 8 à 16 semaines, selon les groupes concernés. Tous les animaux seront soumis à 3 tests de tolérance au glucose en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement. Les animaux seront mis à jeun à 16 heures, la veille de chaque test. De l’eau sera laissée à leur disposition. Le matin du test, vers 8 heures, les animaux seront pesés puis laissés au calme pendant 30 minutes. Le test débutera par une prise de sang à la queue sur animal vigile. Une goutte de sang suffit pour le dosage de la glycémie en direct grâce à un glucomètre (T0). Le test se poursuit par l'administration d'une dose de glucose en fonction du poids de chaque animal par gavage oral (niveau de douleur 0). Une goutte de sang est ensuite prélevée 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 90 et 120 min après l'administration de la dose de glucose pour le dosage de la glycémie. Après le test, le site de prélèvement est désinfecté à la Chlorhexidine. L'activité locomotrice spontanée des animaux sera déterminée à partir de l'enregistrement de leur déplacement pendant 24h à l'aide d'un système de video-tracking en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement). Pendant cette mesure, les animaux seront placés en cage individuelle, de modèle identique à celui utilisé pour le reste de l'hébergement. Pendant le durée de l'étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine nécessitant brièvement une préhension et une lègère contention réalisée par du personnel habitué à effectuer ces gestes.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’effets indésirables de cette eau traitée. Le régime gras et sucré utilisé sur les animaux favorisera la prise de masse grasse et le développement d'un syndrome métabolique. Ceux recevant l'eau traitée devraient montrer des symptomes moindres que ceux recevant de l'eau classique. Il est attendu des nuisances légères liées à : - l'isolement en cages individuelles pendant 24, prévu pour l'analyse de l'activité locomotrice spontanée par videotracking - la mise à jeune à 3 reprises pendant la durée du projet, préalable aux tests de tolérance au glucose - le prélèvement de sang selon les détails indiqués dans la procédure 1.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure 1. Le sang et divers tissus d'intérêt sont prélevés sur l'animal une fois mort, pour être conservés en vue d'analyses futures.

Remplacement

Ce projet étudie les conséquences d'un modèle d'induction de syndrome métabolique sur les différents organes ou systèmes physiologiques. Le recours à l’utilisation de modèles alternatifs comme des cellules en culture ne permet pas d'étudier les relations inter-organes ni d'avoir une approche fonctionnelle des organes. Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur ce modèle d'induction du syndrome métabolique sur cette espèce. Le rat est utilisé comme "source" de tissus d'intérêt en vue de constituer une tissuthèque permettant des analyses ultérieures. Il n’est pas possible d’évaluer un effet in vitro, car une eau ultra pure sera fortement hypo-osmotique et entrainera une mort cellulaire immédiate. Si elle est diluée dans un mélange complexe, elle n’a plus d’intérêt.

Réduction

Nous prendrons le soin d’utiliser le nombre minimal d’animaux mais qui permette cependant de tirer des conclusions statistiques avec une puissance suffisante. Le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base d’études publiées, qui utilisent le même modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres. Les expériences ont été soigneusement planifiées (par rapport aux données bibliographiques et à nos résultats préalables) pour permettre la collecte d’un maximum d’informations à partir des individus étudiés. De plus, les organes non utilisés seront congelés pour des études complémentaires éventuelles.

Raffinement

Ce protocole ne fait appel qu’à des procédures expérimentales légères ou sans réveil (après anesthésie gazeuse à isoflurane puis exsanguination) et à des prélèvements de tissus sur animal mort ne pouvant donc pas entraîner de douleur ou une douleur ou une contrainte légère et très brève (manipulation/contention). Outre la surveillance réglementaire quotidienne, nous suivrons très précisément l’état général des animaux, leur poids ainsi que leur prise alimentaire à raison de 2 fois par semaine tout au long du protocole. S’il s’avérait que l’un d’entre eux perde du poids de façon importante (15% au cours d'une semaine), soit blessé ou souffrant, il sera exclu du projet et mis à mort. Une autopsie sera réalisée pour identifier plus précisément les causes de cet état ayant justifié la mise à mort le cas échéant, de façon à optimiser nos procédures pour d'éventuelles études futures. La décision sera prise par un des responsables du projet.

Choix des espèces

Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur le modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres sur cette espèce. Pour ces études, le rat est utilisé comme « donneur » d’organes. C'est également une des espèces la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous n’utilisons que des rats males car il est difficile de maitriser le cycle menstruel chez la rate et celui-ci modifie le métabolisme en particulier le métabolisme du glucose qui nous intéresse particulièrement. De plus, nous utiliserons une souche connue dans la littérature pour être plus sensible à l’installation d’un syndrome métabolique sous régime gras et sucré que d’autres souches.

Deux veaux vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet pose sur l'animal vigile une pompe en élastomère reliée à un cathéter jugulaire maintenu par deux points cutanés, pour administrer un véhicule en continu pendant dix jours et valider le dispositif. Les veaux restent isolés pendant ces dix jours. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer le dispositif en conditions réelles, en vue d'un projet futur.

Objectifs

Ce projet a pour but de déterminer la faisabilité d'une administration intraveineuse continue pendant 10 jours en utilisant une pompe en élastomère chez le veau.

Bénéfices attendus

Ce projet est nécessaire pour pouvoir valider la technique d'administration intraveineuse en continue pendant 10 jours. Ce système de perfusion placé sur l'animal evite qu'il ne soit entravé pendant les 10 jours Cette technique de perfusion sera utilisée dans le cadre d'un projet futur.

Procédures

Ce projet consiste à placer une pompe en élastomère sur l'animal. Le placement de la pompe se fera sur animal vigile et sera non invasif. Cette pompe permettra d'administrer à l'animal du véhicule pendant 10 jours au rythme de 20 mL/jour/animal. Le temps estimé pour le placement de la pompe est d'environ 20 - 30 minutes. 100 mL de véhicule seront administrés sur 5 jours ( volume maximal pour la pompe). Au bout des 5 jours, la pompe sera rechargée ou changée pour administrer les 100 mL suivants sur les cinq autres jours. Temps estimé pour recharger/ changer la pompe: 10 minutes environ. L'acces veineux se fera par la pose d'un catheter jugulaire, celui sera maintenu en place par deux points cutanés. Temps de pose par animal: une 10 ene de minutes environ

Impact sur les animaux

Isolement des animaux pendant 10 jours. Légère douleur de courte durée lors de la ponction de la veine jugulaire pour introduire le cathéter et lors de la suture du cathéter, pas de nuisances attendues lors du changement de pompe ou de sa recharge.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour pouvoir évaluer du bon fonctionnement du dispositif dans les conditions réelles d'utilisation

Réduction

Dix animaux seront inclus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour valider cette faisabilité (repetabilité)

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation d'environ trois semaines. Dès leur arrivée, les veaux seront logés en groupe, pendant la période d'acclimatation, les animaux seront manipulés plusieurs fois par semaine afin de minimiser le stress lors de la pose et des contrôles de la pompe. Un suivi au minimum quotidien sera mis en place. En cas de signes d'infection locale au niveau du cathéter, un traitement antiseptique local adapté sera appliqué. En cas d'échec de ce traitement local ou en cas de signe d'infection générale, l’essai sera arrêté pour l’animal concerné, le cathéter sera retiré et un traitement adapté sera appliqué ( antibiotique par voie generale et un antiinflammatoire en cas d'hyperthermie ou de douleur). Un système de litière profonde, de la paille propre seront fournis. Une attention particulière sera portée au raffinement et à l’enrichissement du milieu autant que possible, Un suivi au minimum quotidien sera mis en place. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Choix des espèces

Cette espèce est celle qui sera utilisée dans un futur projet utilisant ce système Animaux de 200 kg.( Jeune bovin) qui sera le poids cible des animaux pour le futur projet