Contrôles de qualité

53 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux greffes de tissu adipeux humain sur les flancs, est anesthésiée à quatre reprises pour la chirurgie et des scanners, puis tuée au bout de deux mois pour analyser le greffon, afin de tester un dispositif de lipofilling destiné à être commercialisé. Le porteur relie le projet à un "réel besoin" en chirurgie reconstructrice. Il affirme qu'un modèle in vitro ne peut pas reproduire la rétention du greffon dans un organisme vivant.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester le dernier dispositif de lipofilling de notre sponsor. Un modèle de xénogreffes sur souris immunodéprimées a été choisi, en s’appuyant sur la bibliographie existante. 100 xénogreffes (2 par souris, sur 50 souris) seront réalisées à partir du tissu adipeux prélevé sur 10 patients par lipoaspiration à l’aide du nouveau dispositif testé. Un lot de 5 souris sera utilisé pour chaque lipoaspiration. Nous avons décidé de travailler sur un modèle de souris nude, athymique et donc immunodéprimée. Ceci nous permettra de nous abroger des risques de rejet de la greffe. Notre étude bibliographique a permis de mettre en avant divers obstacles au maintien des xénogreffes. Ainsi, tous les paramètres physiques liés aux étapes d'aspiration, de préparation du tissu adipeux mais aussi d'injection influencent la prise de greffe. Les paramètres physiques choisis par notre sponsor seront donc ici testés. De même, divers paramètres biologiques influencent la prise de greffes : le statut des donneurs et la présence de maladies métaboliques notamment. De même, la mise en place d’une vascularisation de qualité améliore la rétention de la greffe et donc son maintien. Les donneurs prélevés lors des liposuccions seront donc exempts de maladies métaboliques et seront tous d’un IMC inférieur à 30. La vascularisation mise en place au niveau de la greffe sera observée après récupération du tissu et coloration. D’autres paramètres seront alors étudiés en histologie (quantité et diamètre des adipocytes dans le tissu greffé, qualité et quantité de la matrice extracellulaire mise en place, présence de zones de nécrose éventuelles, …). Enfin, l’emplacement de la greffe ainsi que son suivi par imagerie a fait l’objet d’une recherche bibliographique. Nous souhaitions pouvoir suivre son évolution et quantifier son éventuelle résorption au fil du temps. Le suivi par micro-CT (examen tomodensitométrique par rayons X) a été mis au point sur un modèle de xénogreffes au niveau du calvarium. Nous souhaitions cependant garder les flancs comme zones de xénogreffes car celles-ci présentent plusieurs intérêts. Cette zone sera donc testée lors d'un premier screening, réalisé sur un premier groupe de 3 souris. L'étude utilisera donc un total de 3+50 = 53 souris sur l'ensemble du projet.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait permettre de valider le nouveau dispositif de lipoaspiration, dans le but de le commercialiser. La technique de lipofilling serait alors utilisée en médecine humaine à la suite d'interventions chirurgicales délabrantes (Tumeurs mammaires par exemple, retrait de masses, ...) pour des chirurgies reconstructrices et répond donc ici à un réel besoin. Une étude clinique sera réalisée en complément de cette étude préclinique afin de valider l'utilisation du nouveau dispositif chez l'homme.

Procédures

Chaque souris sera anesthésiée une première fois (Durée : 30 minutes), dans le but de réaliser les deux xénogreffes (une sur chaque flanc). 4 injections sous-cutanées seront réalisées :1 injection SC d'analgésique sera réalisée le jour de la chirurgie et 3 injections SC d'antibiotiques seront réalisées à raison d'une par jour à partir du jour de la chirurgie. Les souris seront anesthésiées 3 fois de plus (Durée : 10 minutes), afin de les imager (CT-scan). Elles seront enfin mises à mort à la suite de la dernière imagerie donc au bout de 2 mois afin de récupérer le tissu greffé pour analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues de cette étude sur les 53 souris utilisées seront : - Les deux xénogreffes réalisées sur les souris, à raison d'une greffe par flanc sur chacune des 50 souris - La douleur éventuelle associée à cette chirurgie - Les anesthésies réalisées (1 pour la chirurgie (Durée : 30 min) et 3 pour les imageries (Durée : 10 minutes)) et l'hypothermie éventuelle en résultant - 4 injections sous-cutanées minimum (1 pour l'analgésie, 3 pour l'antibiothérapie) - Le stress éventuel tout au long des différentes étapes de la procédure - La mise à mort en fin d'étude pour la récupération du tissu greffé. Une attention particulière sera cependant portée aux animaux : tout signe de douleur, stress, et/ou tout comportement anormal sera pris en compte. De plus, la chirurgie se déroulera sous anesthésie volatile (Isoflurane) et analgésie (Buprénorphine 0.05mg/kg) et une antibiothérapie permettra d'atténuer voire d'éviter tout risque d'infection (Amoxicilline 15mg/kg, durant 3 jours)

Devenir

Les souris seront maintenues en vie à la suite de la chirurgie et des différentes imageries. Elles devront cependant être mises à mort dans les jours suivant la dernière imagerie afin de récupérer le tissu adipeux greffé et d'en faire une analyse histologique.

Remplacement

Remplacer : Pour répondre à notre objectif scientifique, un modèle in-vitro ne peut être mis en place. Nous avons en effet besoin d’un modèle animal afin d’étudier le processus de rétention des greffes dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir dans un système vivant (Inflammation locale, nécroses éventuelles, …).

Réduction

Réduire : L’utilisation de l’imagerie nous permet de suivre la rétention de la xénogreffe sans avoir besoin de sacrifier l’animal, ce qui nous permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés a été minimisé grâce au calcul préalable effectué sur R à partir de la bibliographie et de la fonction power.t.test, nous permettant ainsi d’utiliser un nombre réduit de 5 animaux par groupe. De même, le nombre d'animaux nécessaires à l'étape de screening a été minimisé.

Raffinement

Raffiner : Une étude pilote (screening) sera réalisée afin d’optimiser les protocoles de chirurgie, d’imagerie et d’histologie, sur un premier groupe de 3 souris. Elle nous permettra ainsi d’affiner les techniques utilisées pour l'étude. Ainsi, les expérimentateurs pourront s’entraîner à la technique chirurgicale et les comportements anormaux éventuels des animaux suite aux différentes procédures seront pris en compte. La liste des points limites sera de même actualisée si besoin. Elle comprend pour points limites spécifiques au projet : - Mauvaise cicatrisation cutanée suite à la xénogreffe et/ou Infection cutanée suite à la xénogreffe - Hypothermie persistante, avec une température inférieure ou égale à 34°C de façon durable - Réveil incomplet supérieur à 2h à la suite de la chirurgie - Perte de poids supérieure à 20% Afin de diminuer les éventuelles douleurs pouvant survenir suite à la chirurgie et le risque d'infection, une analgésie et une antibiothérapie seront mises en place (par injection sous-cutanée). De plus, les souris seront étroitement surveillées pendant la phase de réveil puis dans les jours qui suivront la chirurgie. Elles seront hébergées en cages groupées afin de satisfaire leurs besoins sociaux, sur des portoirs ventilés afin de tenir compte de leur phénotype dommageable. Un enrichissement adapté à l'espèce (paille, tunnels, dômes, ...) sera mis dans les cages afin de leur laisser exprimer les comportements naturels de l'espèce (enfouissement par exemple).

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour cette étude est la souris. C’est une espèce largement utilisée dans la recherche préclinique, en chirurgie notamment. La lignée nude choisie pour cette étude est une lignée de souris sans poils et athymique. Ceci nous permettra notamment de nous abroger des risques d’incompatibilité inter-espèces et donc de rejet de la xénogreffe. La lignée choisie est de plus facile à élever et à manipuler. Elle est peu coûteuse et largement utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale. C’est également une lignée ne présentant pas de phénotype dommageable à l’état basal. La physiologie de la souris ressemblant à celle de l’homme, ceci facilitera la translation. De plus, la souris nude étant peu grasse, il sera plus simple de constater l’évolution des xénogreffes de cellules adipeuses sur cette souche. Enfin, le modèle de la souris immunodéprimée est un modèle standard connu pour la xénogreffe. A leur arrivée, les souris seront âgées de 6 semaines. La greffe sera réalisée 2 semaines après réception, afin d'effectuer une semaine de quarantaine puis d'habituation des animaux. Ainsi, les souris nude seront âgées de 8 semaines au moment de la chirurgie, pour un poids moyen de 20 grammes. A ce stade de développement, les organes des souris seront matures. De plus, nous nous abrogeons des problèmes éventuels liés à la vieillesse de notre modèle.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par des souches vivantes de Brucella pour leur faire produire des anticorps, puis mis à mort par ponction cardiaque afin de récupérer leur sang et leurs organes. Le porteur indique que l'infection provoque une fièvre intermittente, une baisse d'appétit et une perte de poids, et présente cette production de sérums mutualisée en Europe comme visant à limiter le nombre de lapins utilisés. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" de production de ces anticorps, tout en évoquant une piste à partir des cellules de rate pour "s'affranchir" à l'avenir de l'animal.

Objectifs

La brucellose est une maladie qui se transmet de l'animal à l'homme, et vice versa, causée par la bactérie Brucella, qui touche un très large spectre d’hôtes, incluant les hommes, de nombreuses espèces de mammifères et même les amphibiens. L'une des étapes du diagnostic consiste en l’identification de la souche de Brucella responsable de la maladie par un test rapide d'identification sur lame appelé typage bactériologique. Ce typage nécessite l'utilisation de sérums contenant des anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella, dit sérums monospécifiques. Notre premier objectif est la préparation de sérums monospécifiques contre quatres espèces de Brucella : deux espèces lisses de Brucella (B. abortus et B. melitensis), une espèce rugueuse (B. ovis) et une nouvelle espèce (BO3). Il permettra également de produire un sérum négatif (sans anticorps) pour la validation du biotypage (contrôle négatif) permettant l’identification du genre Brucella. L’expérimentation permettra également la production d’un sérum négatif indispensable pour la validation du biotypage. La production de sérums mono-spécifiques est mutualisée à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale de lapins vivants et devrait permettre d’obtenir une quantité de sérum visant à maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans. Cette préparation de sérums monospécifiques sera réalisée en trois étapes : immunisation/inoculation de lapins au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées ; prélèvement du sang des animaux infectés et des contrôles négatifs pour arriver à obtenir une concentration en anticorps suffisante pour la suite des étapes ; et élimination des anticorps non-spécifiques des sérums afin d’obtenir un sérum spécifique d’une seule espèce bactérienne. Ce projet permettra également de collecter les organes (foie, poumons, ganglions lymphatiques et organes reproducteurs) des animaux après mise à mort afin de constituer une collection de tissus positifs pour chacun des genres de Brucella qui serviront de contrôles positifs pour la validation des méthodes de diagnostic. Enfin, les cellules de la rate qui produisent des anticorps mono-spécifiques seront utilisées afin de développer un protocole de production in vitro d’anticorps mono-spécifiques et ainsi réduire si possible la nécessité d'utiliser des animaux.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire des réactifs (sérums monospécifiques et témoin négatif) permettant l’identification de l’espèce bactérienne de Brucella lors d’une suspicion de brucellose. Quatre sérums monospécifiques seront produit grace à ce projet, chaque sérum monospécifique étant constitué d’anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella. Un sérum « contrôle négatif » (sans anticorps) sera également produit. Ces sérums sont indispensables pour le typage bactériologique, et notamment pour une espèce récemment décrite (souche zoonotique de Brucella BO3) qui n’est à ce jour pas identifiable à l'aide des sérums existants, et pour laquelle les anticorps ne sont pas détectables par les méthodes d’immuno-sérologie classiques. Ces sérums seront utilisés comme réactifs par l’ensemble des laboratoires de référence de l’Union Européenne pour les diagnostiques de brucelloses animales. À ce jour, il n'existe pas de méthode in vitro de production d'anticorps et le recours à une infection expérimentale est le seul moyen d'obtenir ces anticorps spécifiques. Un autre bénéfice attendu du projet est d’obtenir à partir de la rate des lapins infectés des cellules productrices d’anticorps spécifiques contre le genre Brucella qui pourraient permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques avec l’objectif de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.

Procédures

Tous les animaux utilisés (12 animaux au mimimum et 15 animaux au maximum) seront soumis à des prélèvements sanguins (1 mL) avant infection (à J-5), puis à J6 post-infection et éventuellement à J8 et J10 selon les résultats de la concentration sérique des prélèvements. Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intra-musculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 - 10 minutes. Soit au maximum 4 prélèvements par animal. À J0, les animaux dans l’animalerie A3 (8 animaux, par série de 2 animaux à la fois) seront infectés par une des 4 souches de Brucella dédiées (2 animaux infectés pour chaque souche). Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 minutes. Soit une seule injection par animal. La technique de mise à mort est appropriée pour les lapins (selon l’annexe IV). Les lapins sont anesthésiés par un mélange Xylazine (35 mg/Kg) et de Kétamine (10 mg/Kg) injecté par voie intramusculaire pendant 15 minutes. L’anesthésie est confirmée par les tests de réflexe de retrait de la patte et de réflexe de la paupière. La mise à mort des lapins est assurée par une injection intracardiaque de 5 mL de barbiturate (Doléthal) après exsanguination par ponction cardiaque. Soit deux injections pour la mise à mort par animal.

Impact sur les animaux

Les lapins sont des animaux sensibles à l’infection par Brucella spp. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l'infection par Brucella spp.. La dose proposée est calibrée en fonction de la réaction du système immunitaire des lapins pour provoquer une forte réponse immunitaire (production d’anticorps par l’organisme) mais la durée de l’infection n’est pas suffisante pour que des symptômes non spécifiques se développent. D’après les expériences similaires décrites dans la littérature, la courte période de l’expérimentation et la dose infectieuse utilisée nous attendons chez les lapins les effets indésirables suivants : une fièvre intermittente de quelques jours, baisse d’appétit et par conséquent perte de poids. Après inoculation des agents pathogènes, l'état clinique des animaux sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

La production de sérums monospécifiques n’est possible qu’à partir de l’immunisation d’animaux au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées. En effet, la production d'anticorps spécifiques nécessite la stimulation de l'ensemble du système immunitaire pour la maturation des anticorps dans un modèle animal vivant sous conditions contrôlées. Cette production n’est réalisée que rarement, tous les 10 ans en moyenne, en mutualisant l’utilisation des réactifs à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux. Nous profiterons de cette série de production pour isoler les cellules de rate, productrices des anticorps spécifiques contre la souche de Brucella inoculée, et les immortaliser. Cette étape pourrait nous permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques et ainsi de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.

Réduction

La production de sérums monospécifiques est mutualisée à l’échelle européenne afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux vivants. Le modèle lapin a été choisi au regard de la quantité de sérum qui pourra être produite (50 mL de sérum monospécifique attendu pour un prélevement de sang total de 80 mL par lapin) et qui sera suffisante pour couvrir les besoins en sérum monospécifiques pour une longue durée tout en utilisant le moins d’animal possible. Le nombre minimal de lapins a été calculé pour chaque sérum monospécifique (2 lapins infectés et 1 animal témoin pour chaque espèce de Brucella), avec l’objectif d’obtenir une quantité de sérum permettant de maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans, correspondant à une quantité d’environ 100 mL pour chaque sérum monospécifique.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins étant très sensibles à la manipulation, ils seront surveillés et approchés quotidiennement pendant les sept jours d’acclimatation par les animaliers et les expérimentateurs pour les habituer à leur présence et aux manipulations. Après la periode d’acclimatation, les lapins destinés à l’infection seront transférés dans la zone confinée de niveau de sécurité biologique 3 de l’animalerie et placés dans des cages avec des branches en bois et des branches végétales comme enrichissement. Durant l’expérimentation, l'état clinique des animaux sera contrôlé quotidiennement, afin de suivre l’évolution de la température corporelle, l’évolution du poids, la prise de nourriture et l’état général des animaux. Avant tous prélèvements sanguins, prise de température et pesée, les animaux seront tranquillisés par une injection en intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg).

Choix des espèces

Les lapins sont sensibles à l’infection par de nombreux agents pathogènes, dont les espèces classiques du genre Brucella. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l'infection par Brucella spp. Les lapins utilisés pour l’expérimentation sont des adultes (race New Zealand White) présentant un poids de 3,5 à 4 Kg afin d’optimiser la quantité de sérum obtenue par animal.

83 200 souris et rats vont être utilisés, la plupart tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'environ quinze minutes sous anesthésie générale, pour servir de mères porteuses. Le porteur indique que ces femelles réimplantées sont tuées au sevrage des petits, sauf quelques-unes gardées comme sentinelles sanitaires, et que 156 rates sont réutilisées. Il justifie la voie chirurgicale par un taux de naissance 2,5 fois supérieur à la méthode non invasive, qu'il juge sans réelle "valeur ajoutée éthique".

Objectifs

Ces transferts d’embryons ont pour but de mettre à disposition de la communauté scientifique des animaux sains. En effet, la présence de contaminants dans les colonies de rongeurs de laboratoire peut introduire un biais dans les résultats obtenus et leur analyse, ainsi qu'avoir des conséquences néfastes sur le bien être de ces animaux. La cryoconservation et le transfert d’embryons permettent de réduire considérablement les populations de rongeurs de laboratoire, en ciblant la naissance d'une majorité d'animaux d'intérêt scientifique. En effet, à partir d’embryons décongelés, de sperme suivi d’une fécondation IN VITRO ou encore de collecte d’embryons post accouplements naturels, les embryons collectés et lavés en milieux stériles appropriés sont réimplantés dans des femelles pseudogestantes qui vont en assurer le développement IN UTERO et leur élevage jusqu’au sevrage. Enfin, au-delà des 2 arguments cités ci-dessus, le transfert d’embryons permet également d’autres améliorations telles que le retour à un microbiote caractérisable, améliorer les conditions d’élevage, sécuriser sanitairement les échanges lors de collaboration,… Ce projet est donc un élément de base dans la gestion et l'élevage des colonies de rongeurs de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d'obtenir rapidement des rongeurs d'intérêt scientifique et de haute qualité sanitaire issus de femelles réimplantées ayant la capacité de donner les meilleurs taux de naissances possibles post transfert embryonnaire par voie chirurgicales.

Procédures

Les animaux subissent une procédure chirurgicale unique d'une durée moyenne de 15 minutes après anesthésie générale

Impact sur les animaux

La chirurgie de transfert d'embryon est composée d’un protocole chirurgicale unique et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum.

Devenir

Les femelles réimplantées seront mises à morts au sevrage des petits sauf quelques-unes qui seront utilisées en tant que sentinelles pour le contrôle du statut sanitaire des portées. Les animaux sevrés seront envoyés au donneur d’ordre pour des fins scientifiques.

Remplacement

Des solutions commerciales de kits de transfert d'embryons par voie naturelle sont proposées par différentes compagnies. Les méthodes dites "non invasives" (par voies naturelles) offrent des taux de naissance de l'ordre de 2.5 fois moins comparativement à la méthode chirurgicale. Cela nécessite donc l'utilisation d'un plus grand nombre de donneuses d'embryons et de mères porteuses pour obtenir un même résultat. Les taux de naissances obtenus et les spécificités techniques associées à leur utilisation ne permettent donc pas encore une réelle valeur ajoutée éthique pour les transferts d'embryons par des quantités réduites d'animaux au strict minium pour atteindre les objectifs scientifiques souhaités. Les transferts d'embryons dans des femelles pseudgestantes B6CBA/F1 permettent également la réalisation de shéma d'accouplement (IN VIVO ou IN VITRO) avec des taux d'animaux d'intérêts supérieurs à ceux issus d'accouplements naturels. Ces transferts évitent ainsi de nombreux accouplements naturels pour une cible finale en terme de nombre d'animaux d'intérêt identique dont les femelles du modèle ne pourraient pas: ovuler, assurer une gestation ou encore allaiter correctement.

Réduction

L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction au strict minimum nécessaire de femelles réimplantées pour atteindre des objectifs fixés par les utilisateurs finaux. Les revitalisations de modèles maintenus au format congelé lorsqu'ils ne sont pas en études actives, les décontaminations par transfert embryonnaires, les expansions rapide de colonies par fécondation IN VITRO,... sont toutes des solutions qui répondent complètement aux 3R et à l'objectif de réduction d'animaux en élevage. La production d’animaux expérimentaux par des méthodes alternatives, intégrant des transfert d’embryons, permet de rationaliser les besoins des chercheurs : - en évitant les élevages permanents desquels une infime partie des animaux produits est utilisée. - en offrant une homogénéité des lots, une qualité génétique et sanitaire supérieure, et un microbiote standardisé. - en permettant de réduire la quantité d’animaux produite aux uniques besoins. Un élevage moyen d’un modèle produit environ 500 animaux par an, ce qui arriverait à une quantité de 2 500 000 animaux nés sur 5 ans pour 1000 modèles. Pour le même nombre de modèle, le transfert embryonnaire pour produire les lots d’animaux expérimentaux sur 83 700 mères porteuses permet une réduction minimale de 10 fois la quantité d’animaux produite en élevage continue. Cette méthode répond efficacement aux attentes d’une démarche 3R.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application d'une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux avec une grille d’évaluation adaptée pour déceler tout signe clinique et atteinte des points limites, par un hébergement avec enrichissement adapté à l'espèce et à son état physiologique et par un protocole analgésique maitrisé lors de la chirurgie. D'après notre historique, les taux de gestations et taux de naissance sont similaires à ceux d'accouplements naturels et nous avons une absence de mortalité post chirurgie. Ces éléments témoignent d'une procédure maitrisée.

Choix des espèces

L’espèce choisie doit être identique à celle du modèle scientifique et pour lesquel le recours à cette technique est nécessaire. Parmi les rongeurs, les espèces les plus utilisées par la communauté scientifique sont les souris et les rats. Pour les souris, nous avons choisi l’hybride B6CBA/F1 qui est la plus reconnue scientifiquement pour ses qualités reproductrices pour assurer une gestation et un sevrage d'un plus grand nombre de petits avec un gabarit homogène et donc une standardisation optimale du process. Pour les rats, la souche Sprague Dawley est reconnue comme étant la plus appropriée pour cette même technique et pour ses qualités reproductrices. L’âge est déterminé par l'âge de maturité des fonds génétiques et la faculté des animaux utilisés à mener à bien la production d’une portée jusqu’à son sevrage : -Rats: Sprague Dawley de 10 à 12 semaines -Souris: B6CBA/F1 de 10 à 15 semaines

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sédatés, reçoivent une injection unique de fer dans le muscle, puis sont tués pour prélever et analyser ce muscle, dans le cadre d'un test exigé par la Pharmacopée Chinoise pour commercialiser des produits vétérinaires en Chine. Le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive n'existe, tout en indiquant qu'un objectif du projet est de démontrer que les contrôles physico-chimiques français suffiraient à s'affranchir de ces lapins. Le protocole prévoit deux lapins par lot testé, soit 300 animaux sur cinq ans.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Bénéfices attendus

1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Procédures

Les animaux utilisés seront sédatés avant de recevoir une injection unique de produit testé. La sédation va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Ceci facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. Après euthanasie des animaux, des prélèvements du muscle étudié seront réalisés afin d’analyser ce muscle et obtenir les résultats du test d’absorption. Les interventions seront de courte durée et ne seront réalisées qu'une seule fois par animal puisqu'ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). Sur 5 ans, il a été estimé que 150 lots seraient testés (environ 30 par an) soit 300 lapins au total.

Raffinement

Méthodes de raffinement: 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera sédaté avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. 4) Surveillance accrue de l’animal durant la sédation et l’injection. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, la manipulation sera réalisée dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

9 800 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés sous la peau puis, cinq semaines plus tard, subissent un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie, pour le contrôle qualité de lots de vaccins avant leur mise sur le marché. Le porteur signale que deux à cinq pour cent des animaux recevant les plus fortes doses développent une induration voire un ulcère au point d'injection. Il affirme que ce titrage réglementaire est 'nécessaire' à la libération des lots et qu'aucune méthode in vitro ne l'évalue, la réponse immunitaire exigeant selon lui un 'organisme entier'.

Objectifs

Ce projet est réalisé dans le cadre de contrôle qualité des vaccins avant leur libération sur le marché européen. Il permet le titrage d'activité de vaccins multivalents : activité antitétanique, antidiphtérique, anticoquelucheuse.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats d'activité des vaccins pour les différentes valences est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients.

Procédures

Des lots d'animaux sont vaccinés par voie sous cutanée avec plusieurs doses du vaccin à contrôler ou du vaccin de référence. La vaccination d'un animal dure moins de 30s. Cinq semaines plus tard, un prélèvement intracardiaque est effectué sur ces animaux préalablement anesthésiés. L'administration de l'anesthésique dure moins de 30s et environ 5 min après, le prélèvement sanguin est effectué. Il peut prendre environ 2 min par animal. Le dosage des anticops dans tous les sérums récupérés permet in fine de vérifier l'activité du vaccin à contrôler.

Impact sur les animaux

Suite à la vaccination il est possible d'observer des réactions au point d'injection de type induration voire ulcère chez 2 à 5% des animaux recevant les plus fortes doses de vaccins. Une surveillance et des soins (dermaflon ou vétédine) quotidiens et individuels ont donc été mis en place pendant la période d'apparition potentielle des symptômes. Le suivi est tracé.

Devenir

A la fin de l'essai après le prélèvement sanguin sous anesthésie, les animaux sont euthanasiés car ayant reçu une injection de vaccin ils ne peuvent pas être réutiliser dans un essai.

Remplacement

La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer les activités antitétaniques, antidiphtériques et anticoquelucheuses.

Réduction

Ce projet permet de déterminer les activités antitétaniques, antidiphtériques et anticoquelucheuses des vaccins sur les mêmes lots d'animaux ce qui dimunue beaucoup le nombre d'animaux pour contrôler un lot. De plus, plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux : - optimisation des essais: le test de deux lots de vaccins en même temps versus la référence est privilégié en l'absence de contrainte de délais de libération ( mutualisation des lots d'animaux vaccinés avec la référence) -limitation des retests, - à terme possible mise en place de "reducing": contrôle d'un pourcentage de la production et non de tous les lots lorsque la conformité et la stabilité des lots pourront être démontrées statistiquement.

Raffinement

La méthode sérologique a permis de diminuer fortement la douleur en supprimant les challenges (administration des toxines tétaniques et diphtériques) tranditionnellement utilisés pour le tritrage des valences tétaniques et diphtériques. Un enrichissement est mis à disposition des cobayes: foin compressé, balle en plastique.

Choix des espèces

Le cobaye adulte (250-300g) est le modèle retenu par la Pharmacopée Européenne pour le contrôle des vaccins multivalents comportant les valences tétanique, diphtérique et coqueluche pour sa bonne réponse immunitaire aux 3 types de vaccin. A ce stade, le système immunitaire des cobayes est parfaitement fonctionnel et permet donc d’obtenir une réponse anticorps satisfaisante.