Toxicologie et autres tests de sécurité

Mis à jeun jusqu'à vingt-quatre heures, puis recevant un candidat médicament par voie orale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire, intraveineuse ou par endoscopie sous anesthésie, 150 chiens subissent des prélèvements de sang sur animal vigile et jusqu'à quarante-huit heures d'hébergement individuel en cage à métabolisme pour le recueil de leurs urines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les effets indésirables des produits testés ne peuvent pas être anticipés au début du projet, et que le protocole dépend du mode d'administration et de la fréquence demandés. Cent chiens seront réutilisés dans d'autres projets après accord du vétérinaire, quarante seront proposés à l'adoption au bout de quatre à cinq ans si leur état de santé le permet, les autres étant tués pour des prélèvements terminaux.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique, après administration chez le chien, d'un candidat médicament grâce à la collecte d'échantillons sanguins et/ou d'urine à différents temps après administration du produit à tester. L'objectif est de mesurer sur ces différents prélèvements la concentration du produit et/ou de ses métabolites, et d'éventuels marqueurs biologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez le chien pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Chien) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé (maximum 24h). Les animaux recevront le candidat médicament via différentes voies (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse) avec -2 min par administration. Dans certains cas, le candidat médicament pourra être administré par endoscopie chez l’animal anesthésié (durée environ 1h). Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement). Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 48h au maximum (généralement 24h).

Impact sur les animaux

Les chiens de ce projet pourront subir : - un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit, - une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration, de l'anesthésie, et des prélèvements - un stress lié à l'hébergement individuel en cage à métabolisme (24h à 48h) pour la collecte d’urine. Les conséquences éventuellement indésirables des produits ne peuvent pas être anticipés au début du projet. Par conséquent, des discussions seront engagés avec les responsables du bien-être animal pour ajuster les méthodes d'observation des animaux, en vue de préparer des traitements pour d'éventuels symptomes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Lorsque les animaux ne peuvent pas être reutilisés (4 à 5 ans après leur arrivée), ils pourront être mis à l'adoption ( généralement via le GRAAL) si leur état de santé le permet. Enfin certains animaux pourront euthanasiés en fin de projet pour réalisation de prélèvements terminaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le chien car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le chien est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’etudier le devenir des médicaments dans l'organisme (analyses pharmacocinétiques). Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 3 à 6 animaux par groupe à raison de 5 études/an. Pour des études exploratoires, un nombre inférieur d’animaux pourra être utilisé. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le chien est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque le chien est utilisé au cours du développement préclinique de ce produit). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Maintenus 5 h 30 sur un portoir de contention, éveillés, 300 lapins reçoivent dans la veine de l'oreille le produit à tester ou son extrait, puis subissent six à neuf prises de température rectale. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, 150 lapins étant tués et 150 réutilisés, un même individu pouvant servir jusqu'à sept tests successifs. L'enjeu est réglementaire, obtenir la mise sur le marché de prothèses, pansements, ovules ou gels lubrifiants, à la demande de clients industriels. Le porteur écrit qu'aucune méthode alternative n'est proposée pour ce test, puis mentionne un test sur monocytes en cours de développement mais non reconnu par les instances, et précise que les lapins sont mis à jeun la veille pour éviter que les défécations ne gênent la prise de température.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (prothèses, pansements, ovule, gel lubrifiant...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa pyrogénécité. La pyrogénicité est la capacité d’un agent chimique ou d’une autre substance à induire une augmentation de température. Une contamination par des toxines bactériennes peut être la source d’une réponse pyrogène. C’est pourquoi, en amont du test in vivo, un dosage de ces toxines est toujours réalisé in vitro afin d’écarter tout biais dû à une élévation de température qui ne serait pas dû aux composants du dispostif mais à une contamination. Ce test est une première étape mais il n’est pas suffisant pour évaluer la capacité pyrogène d’un dispositif c’est pourquoi un test effectué chez le lapin est obligatoire. Ces projets sont décrits dans des textes réglementaires. Afin de répondre aux obligations réglementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du lapin des tests pyrogènes (PYR). Il y a deux manières possibles de traiter les animaux, soit nous utilisons le produit pur, soit sous forme d’extrait. L’extrait est un liquide (NaCl) dans lequel le DM va être immergé pendant une durée et à une température donnée, ces extraits seront ensuite utilisés pour faire les traitements. Cette évaluation est imposée par les instances réglementaires. Pour ces tests de pyrogénicité, le produit ou son extrait est administré par voie intraveineuse chez le lapin, l’élévation de la température corporelle est suivie pendant un laps de temps donné. Les temps sont déterminés par les normes.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, et par conséquent sa biocompatibilité. Le projet découle généralement d’une évaluation du risque réalisée au préalable en tenant compte de l’utilisation des DM et des données fournies par le client. Ce projet fait donc partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Européen 2017/745 et exigée par les organismes notifiés afin d'accorder ou non la mise sur le marché. Ces tests pré-cliniques, voués à évaluer la biocompatibilité des DM, a donc pour but d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

Tous les gestes prévus sont faits sur animal vigile. La contention des animaux dure environ 5h30 selon la norme qui est suivie. Le traitement est administré par voie veineuse dans la veine marginale de l’oreille (2 à 5 minutes). La prise de température par voie rectale dure environ 1 minute. Il y a entre 6 et 9 prises de température en fonction de la procédure. En prenant en compte les prétests et les tests définitifs, les animaux ne présentant aucun signe clinique ou aucun mal-être peuvent être réutilisés jusqu’à sept fois après avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Les tests de pyrogénicité peuvent engendrer une élévation de la température corporelle des animaux. Le traitement se fait par injection intraveineuse dans la veine marginale de l’oreille pouvant engendrer une légère douleur et des saignements. Les animaux sont maintenus sur des portoirs à contention durant toute l’expérimentation pouvant engendrer un stress.

Devenir

En fin d’étude les animaux sont soit mis en réutilisation pour être utilisé dans un autre test pyrogène (en cas de test pyrogène négatif) soit mis à mort (en cas de test pyrogène positif). En effet en cas de test positif cela signifie que le dispositif testé n'est pas biocompatible. Même si l’animal ne présente aucun signe de souffrance et que sa température revient à la normal il nous est impossible de l’utiliser pour tester un autre dispositif car nous ne savons pas combien de temps les relargables toxiques restent dans l’organisme de l’animal et cela pourrait induire un biais lors du test d’un nouveau dispositif.

Remplacement

Pour ce projet, tout matériau ayant un pH ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. A l’heure actuelle, aucune méthode alternative n’est proposée pour évaluer la pyrogénécité due aux matériaux composant les dispositifs médicaux. Un test d’activation des Monocytes, dit MAT, est en cours de développement. Il n’est pour l’instant pas reconnu par les instances réglementaires pour évaluer le potentiel pyrogène des dispositifs médicaux, c’est pourquoi ce test sur lapin reste obligatoire.

Réduction

Avant d’initier tout test de pyrogénécité chez l’animal, un test in vitro sera réalisé afin de s’assurer de l’absence de pyrogénécité liée à une contamination du dispositif par des toxines bactériennes. Les projets sont réalisés par étapes. Dans un premier temps, peu importe la norme qui est suivie, 3 animaux seront testés. En cas de résultat ambigu ne permettant pas de conclure sur la capacité pyrogène d’un dispositif le test sera refait sur 3 ou 5 animaux supplémentaires selon la norme utilisée. Dans le cas où aucune conclusion ne peut être apportée, l’étude pourra être poursuivie en impliquant au maximum 3 ou 4 groupes de 3 animaux en totalité selon la norme suivie également. Ces tests sont effectués sur le nombre minimal d’animaux requis par la norme correspondante. Par ailleurs, les animaux impliqués dans ces études sont, autant que possible (jusqu’à 7 fois après avis du vétérinaire), réutilisés pour de nouveaux tests de pyrogénécité après avis d'un vétérinaire. Ceci afin de limiter le nombre d’animaux utilisés et de réduire le nombre de pré-test permettant l’inclusion des animaux en étude.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage, par groupe de 2, par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien-être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et d’enrichissements, briquette de bois et foin. Si des bagarres entre congénère surviennent alors les animaux pourront être hébergés individuellement pour assurer leur bien-être. Afin d’éviter les défécations pouvant gêner la prise de température, les animaux seront mis à jeun la veille du test, la nourriture leurs sera restitué dès la fin de l’étude. Hors étude, Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le plateau contenant les selles et les urines est recouvert de copaux de bois pour limiter les odeurs et est nettoyé 2 fois par semaine. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser sont imposés par les normes ISO et la Pharmacopée correspondantes. Le lapin reste le modèle de choix utilisé pour les tests de pyrogénécité comme cité dans les normes ISO. Nous utilisons exclusivement des lapins Néo Zélandais. Nous utilisons des jeunes adultes de 9 à 16 semaines. Si des femelles sont utilisées, elles ne doivent jamais avoir mis bas et ne doivent pas être gestante.

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Pesées puis numérotées par poinçonnement de l'oreille sur animal vigile, 600 souris reçoivent une injection dans la veine de la queue, suivie de prélèvements sanguins à dix minutes, six heures, un jour, trois jours et sept jours, puis deux fois par semaine pendant quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit en fin d'étude un prélèvement de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil, qui peut provoquer un arrêt cardiaque, suivi d'une dislocation cervicale. L'objet est de mesurer le passage dans le sang de candidats médicaments anticancéreux, en vue de fixer les doses des premiers essais chez l'être humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole, et celles qui n'ont pas atteint les points limites, sont "reformées" pour l'entraînement du personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min) et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire (maximum 3 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte - de 1 à 5 minutes). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte - de 1 à 5 minutes). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à la dose utilisée. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure pour un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie, soit reformées pour entrainement aux geste techniques sur avis vétérinaire. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entrainement aux geste techniques.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 à 5 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 20% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes à l’injection ou en cas de manque d’homogénéité entre les différents animaux au moment de l’entrée en expérimentation (pouvant mettre en péril les résultats de cette expérience).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’Etablissement Utilisateur (EU) pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE. Un prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) pourra être effectué sous anesthésie/antalgie générale sans réveil suivi d’une mise à mort par dislocation cervicales. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Des dispositifs médicaux dentaires, purs ou sous forme d'extraits, sont appliqués dans les poches des joues de hamsters dorés, un collier maintenu jusqu'à quatre heures les empêchant d'avaler l'élément testé. 570 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour les analyses histopathologiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Leurs joues sont examinées pour repérer un érythème, effet qui peut persister jusqu'à la fin de l'étude en cas d'exposition répétée, l'objet du test étant l'autorisation de mise sur le marché exigée par la réglementation européenne. Le porteur indique renoncer aux témoins positifs et à toute analyse statistique, et ne précise ni le nombre de tests prévus chaque année ni le nombre d'animaux par test, tous deux renvoyés à la norme.

Objectifs

Pour de nombreuses pratiques à visées médicales, les professionnels de santé ainsi que les particuliers utilisent au quotidien des dispositifs médicaux (prothèses, pansements dentaire, produit dentaire...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs médicaux. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa tolérance locale. Ce projet est décrit dans une norme règlementaire. Afin de répondre à ces obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du hamster un test de tolérance sur la muqueuse buccale (test d'irritation). Il y a deux manières possibles de traiter les animaux pour ces tests, soit nous utilisons le produit pur, soit sous forme d’extrait. Pour réaliser ces extraits le DM est immergé dans des solvents (liquide définis par la norme) à une température et pendant une durée donnée, ces extraits seront ensuite utilisés pour faire les traitements. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes. Pour les tests de tolérance locale ou d’irritation, le produit à tester ou son extrait est appliqué dans les poches des joues des hamsters. Cela afin de vérifier, par l’observation d’érythème et autres signes cliniques locaux, si une réaction d’irritation apparaît.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un dispositif médical, autrement dit sa biocompatibilité. Ce projet fait partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Europpéen et exigée par les organismes notifiés afin d’accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

Les animaux sont pesées deux fois: en début et en fin d'étude (1minute/pesée), un vidage du contenu des poches des joues et rinçage (1 à 2minutes) est effectué avant le début du premier traitement journalier, les animaux sont manipulés avant chaque traitement afin d'observer l'aspect des abajoues (30 secondes), des traitement successifs espacé de minimum 1h sont effectués (de 30 seconde à 1minute) le nombre de traitement dépendra de l'utilisation clinique du disposistif. Lorsque des dispositifs solides ou pâteux sont testés la mise en place d'un collier est nécessaire pour que l'animal n'ingurgite pas l'élément (placement du collier 1min), ce collier reste en place jusqu'à ce que l'élément soit retirés ou que le test soit terminé (maximum 4h).

Impact sur les animaux

Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude lors d’une exposition répétée, la durée du traitement varie en fonction du projet.

Devenir

Les tests de tolérance sur muqueuse buccale conduisent à la mise à mort des animaux puisque des analyses histopathologiques sont nécessaires à la conclusion de l’étude.

Remplacement

Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH (potentiel hydrogène: acide, neutre ou basique) ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. Dans des cas exceptionnels où une caractérisation/évaluation des risques est nécessaire malgré cela, ces cas doivent être justifiés et documentés. Par ailleurs, les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent pas être obtenues par d’autres moyens. Aujourd’hui, aucun test in vitro n’est accepté par les autorités règlementaires pour évaluer l’effet irritant d’un dispositif médical sur la muqueuse buccale. Une veille technologique et scientifique est effectuée régulièrement par le groupe afin de rester attentif à des avancés scientifique et parution de nouvelles normes qui permettrait d'utiliser des méthodes in vitro à la place de methode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne faisons pas de témoins positifs. Les études précédentes présentant des scores nous servent de témoins positifs. Le nombre d'animaux par étude est exigé par la norme et le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vue du nombre de test effectué les années précédentes. Aucun test statistique n'est utilisé dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont enrichies avec un tunnel en carton, d'une balençoire et des frisottis. Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau et la litière est change 1 fois par semaine. Des points limites sont définis afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le hamster reste le modèle de choix utilisé pour les tests de tolérance sur muqueuse buccale comme cité dans la norme règlementaire. Nous utilisons exclusivement des hamsters Golden Syrian. Nous utilisons des jeunes adultes de 7 à 9 semaines, le stade de développement étant également réagi par la norme règlementaire à suivre.

Élevés par un fournisseur installé sur le même site que le laboratoire, 300 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis restent disponibles pour d'autres expériences après une période de repos. Chacun subit douze à trente prélèvements de sang, quatorze possibles sur les seules 24 premières heures d'après la description des procédures et seize d'après celle des nuisances, l'administration du produit testé, et parfois trois à six ponctions de la vessie à travers la paroi abdominale sous anesthésie locale. Le porteur reconnaît que le stress engendré par ces prélèvements répétés sera "non négligeable" pour l'animal. Aucune analyse statistique n'est prévue, le nombre d'animaux étant ajusté et justifié par le "Donneur d'Ordre" pour chacune des deux à cinq études menées chaque année.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouveaux produits vétérinaires chez le chien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux produits permettant de mieux protéger/traiter les chiens face à différentes maladies canines.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur l'ensemble des chiens : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la procédure (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement éventuel d’urine par ponction de la vessie échoguidée à travers la paroi abdominale sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendus suite à l’administration du produit d’essai dont la non-toxicité et la tolérance locale aura au préalable été vérifiée par le Donneur d'Ordre. Selon la voie testée (Sous-cutanée, Intra-musculaire), seule l’administration des produits pourra entrainer une nuisance correspondant à l’introduction de l'aiguille pour l’injection entraînera une douleur légère de courte durée . Les prélèvements des animaux peuvent entrainer un stress physique de l’animal lié à sa contention répétée et l’introduction de l’aiguille entraînera une douleur légère et transitoire au point de prélèvement. Jusqu’à 16 prélèvements sanguins pouvant être réalisés les 24 premières heures, le stress engendré par cette action répétée sera non négligeable pour l’animal.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du traitement. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament vétérinaire.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes (EMA/CVMP/EWP/133/1999-Rev.1 et EMA/CHMP/CVMP/JEG :450091/2012). Le nombre d’animaux sera ajusté et justifié par le Donneur d’Ordre pour chaque étude en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques et des données bibliographiques existantes sur la molécule testée. Le nombre d’animaux pourra être réduit par des études en cross-over après un temps de repos suffisant.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les condition d'alimentation des animaux pourront être standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations internationales de bonnes pratiques. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique inatendu chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale. Ce projet incluant 300 animaux permettra de réaliser 2 à 5 études par an.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du nouveau traitement. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens en bonne santé de plus de 6 mois, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement vétérinaire.

Des souris immunodéficientes reçoivent des injections de composés qui tuent les cellules de leur foie, puis une greffe de cellules hépatiques humaines ou d'implants, avec un risque d'hémorragie accru quand l'injection passe par la veine porte. 7950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, où des candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques sont administrés par voie respiratoire, orale ou injectable. Le porteur indique que l'humanisation n'aboutit que dans environ 50 % des cas, écrit que le nombre de souris par étude sera "réduit au maximum", et précise que le total a été fixé en anticipant une croissance chaque année, "en accord avec le plan commercial". 200 souris pourront être réutilisées dans d'autres projets de l'établissement, dont un projet de formation interne aux gestes techniques, les autres étant tuées parce qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé, selon le porteur.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.

Procédures

1 ou plusieurs injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le MESRI dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 7950 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 78 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 150 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 145 souris pour la mise en place du modèle d’insuffisance hépatique et l’évaluation de l’efficacité du patch. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes (PE1)) et donc l’utilisation de moins d’animaux.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Un prélèvement sanguin de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil et pouvant provoquer un arrêt cardiaque, attend chaque souris en fin d'expérience. 1 440 souris CD-1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et environ 288 d'entre elles, écartées du protocole faute d'un poids suffisant ou à cause d'un problème à l'injection, sont d'abord utilisées pour l'entraînement à des gestes techniques avant d'être tuées. Les autres reçoivent une injection dans la veine de la queue puis quatre prélèvements de sang par éraflure de cette même veine, sur vingt-huit jours, pour mesurer la tolérance de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

Projet en sévérité modérée: # Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement). Ces prélèvements faibles sont généralement très bien tolérés par l'animal. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de poils…). Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal et que la dose maximale de cette étude est plafonnée à une dose considérée comme bien tolérée en clinique pour cette classe de médicaments. # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

# Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. # Les animaux non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g... env 20%), seront réutilisées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort selon les critères de la formation sous controle de la SBEA et/ou controle vétérinaire.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et la mise à mort de l'animal sera assurée par surdose d'anesthesiques. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 100 d'entre eux pouvant être réutilisés dans un autre projet après accord vétérinaire, les 400 autres tués pour des prélèvements d'organes et de fluides. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale, chaque jour pendant trois mois ou jusqu'à deux fois par jour pendant six mois, avec jusqu'à huit prises de sang par jour sur six jours. Ils passent deux tests de mémoire et un test d'anxiété que le porteur ne nomme pas, un test où ils doivent s'accrocher à un axe en rotation et huit séries d'observations neurologiques. Le but est de vérifier que des composés agissant sur certaines cellules du cerveau ne provoquent pas de troubles dégénératifs ou psychiatriques, avant un premier passage chez l'humain que le porteur décrit comme une étape "indispensable". Il range aussi parmi les bénéfices une amélioration des connaissances scientifiques "pour le rat", alors que 400 des 500 rats sont tués à l'issue.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur la mémoire, l’anxiété, le comportement général de l’animal, l’activité locomotrice, la coordination motrice, les différents réflexes neurologiques, sur la température corporelle et le poids chez le rat d’un candidat médicament induisant des modifications au niveau des cellules spécifiques du cerveau. Ces cellules fournissent un mécanisme contre les blessures et les infections, mais l'activation chronique ou excessive est considérée comme préjudiciable et a été impliquée dans de nombreux troubles dégénératifs et psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de vérifier que des composés activant les cellules spécifiques du cerveau n’induisent pas de troubles dégénératifs et psychiatriques en fonction des expositions dans le sang.. Ce projet permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour le rat grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par voie orale (-2 min par administration généralement 1 administration / jour pendant 3 mois et jusqu’à 2 administrations par jour pendant 6 mois au maximum) puis auront 2 tests de mémoire d’une durée maximale de 40 min et 4 fois par test en 6 mois. Les animaux seront évalués d'un point de vue neurologique par une série d'observation pour une durée maximum d’1h et 8 fois en 6 mois. Enfin, l’anxiété sera évaluée pour une durée maximum de 5 minutes et 4 fois en 6 mois. Des prélèvements de sang sur animal vigile ou anesthésié pourront être effectués (2 minutes par prélèvement) avec un maximum de 8 prélèvements par jour et 6 jours non consécutifs sur 6 mois et des prélèvements de tissus pourront être réalisés sur animaux anesthésiés en fin d'expérience.

Impact sur les animaux

La manipulation lors du passage en cage d’hébergement aux arènes de test ou pour induire l’anesthésie ou lors de l’administration du composé à tester pourra induire un stress mineur de courte durée. Lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie, ainsi que lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. L'administration par voie orale qui se fera sur plusieurs mois pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L’anesthésie peut induire un stress à l’endormissement. Dans le test de coordiantion motrice, les animaux pourraient ressentir un léger stress par le fait de devoir s’accrocher à un axe en rotation. Ils pourront également resssentir un stress léger lié à la chute de l’axe ou de l'arène surélevée. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'établissement d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 60 (30 mâles et 30 femelles) / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (manipulation des animaux, habituation à la contention et habituation aux arènes expérimentales)• L'utilisation d'anesthésie adaptée associée à une analgésie pour la réalisation des prélèvements

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la mémoire, l'anxiété et les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central, la coordination motrice, l'activité locomotrice spontannée du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.