Toxicologie et autres tests de sécurité

Le développement de médicaments vétérinaires génériques passe ici par 200 chiens, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et remis ensuite à disposition pour d'autres protocoles. Chaque étude leur impose 12 à 30 prélèvements sanguins, avec jusqu'à 14 en 24 heures, des administrations réglées sur la posologie du fabricant, et 3 à 6 prélèvements d'urine par ponction de la vessie sous échographie, l'animal n'étant qu'anesthésié localement. Les chiens sont mis à jeun jusqu'à seize heures avant l'administration pour standardiser l'absorption. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour ce type de test et présente le passage par l'espèce cible comme une "étape obligatoire" pour la mise sur le marché du générique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouvelles formulations vétérinaires chez le chien et de comparer cette cinétique à des produits déjà commercialisés dans le cadre de développement de génériques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de médicaments vétérinaires génériques permettant de pallier à la rupture de stock de certains produits.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la cinétique (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement d’urine par cystocentèse échoguidée sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la cinétique.

Impact sur les animaux

Aucune réaction sévère n’est attendue, le principe actif étant déjà commercialisé, les éventuels effets secondaires sont déjà connus. Les nuisances attendues liées aux prélèvements des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du générique doit être comparée avec celle du produit de référence afin d’être commercialisé avec le même champs d’action. L’étude sur l’espèce cible est donc une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché du générique vétérinaire.

Réduction

Le nombre d'animaux sera justifié par le Donneur d’Ordre dans le protocole de chaque étude. Il sera basé sur le nombre nécessaire pour avoir la plus grande amplitude de variabilité et/ou de différence dans les moyennes des résultats. Lorsque le risque d’exclusion d’animaux est élevé (perte de produit à l’administration ou vomissement), des animaux supplémentaires pourront être inclus afin de maintenir une puissance statistique appropriée et ne pas avoir à renouveler l’étude. Le nombre d’animaux sera minimisé grâce au cross-over mis en place après un temps de repos suffisant. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude pourra être réduit par la conduite d’étude exploratoire préliminaire permettant d’évaluer la variabilité des résultats inter-individus, et donc d’ajuster au mieux le nombre d’animaux à inclure pour obtenir des résultats interprétables. Ce projet incluant 200 animaux permettra de réaliser 1 à 2 études par an.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à de l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les conditions d’alimentation des animaux seront standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront le bien-être des animaux en fonction de la voie d’administration. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du générique doit être comparé à celle du médicament de référence pour le bon développement du nouveau générique. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens d'âge correspondant à celui indiqué pour le traitement.

Pour humaniser leur foie, des souris d'une souche immunodéficiente, porteuse d'une mutation qui permet de faire mourir leurs propres cellules du foie, reçoivent des cellules hépatiques humaines. 7 850 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux injections d'un composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules ou d'implants, des candidats médicaments administrés par voie pulmonaire, digestive, cutanée, tumorale ou par injection, des prises de sang, et parfois des jeûnes jusqu'à 12 heures par semaine. L'effectif permet par exemple 80 études de 50 souris, l'humanisation ne réussissant que chez la moitié des souris environ, et le porteur indique l'avoir fixé en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial". 200 souris sont déclarées réutilisées dans une formation interne aux gestes techniques, sous réserve d'un avis vétérinaire favorable, et les 7 650 autres sont tuées, le porteur estimant qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.

Procédures

1 ou 2 injections(s) de composé induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, la greffe des cellules, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 7850 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 80 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 50 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 45 souris pour l’évaluation de l’efficacité du patch.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de chaque procédure, réparties en groupes de quatre à raison de dix études par an. Chacune peut recevoir jusqu'à trois injections des molécules testées, dans la veine de la queue sous contention ou sous la peau de la nuque, sans anesthésie, puis subir jusqu'à quatre prises de sang éveillée et jusqu'à sept séances d'imagerie de fluorescence sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une société y développe des molécules qui se fixent sur des récepteurs cellulaires pour y acheminer des médicaments, et affirme répondre à une "demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique". Les retombées pour les patients restent au conditionnel : le porteur évoque, à terme, un bénéfice attendu qui "pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical".

Objectifs

A l'heure actuelle, beaucoup de besoins médicaux restent malheureusement insatisfaits, sans aucun traitement curatif ou palliatif, et peuvent devenir de véritables enjeux de santé publique dans le futur. Il existe ainsi une demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique pour l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules, permettant des approches ciblées. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à identifier des récepteurs exprimé sur les cellules que l'on veut cibler et de développer des molécules capables de les reconnaitre et s'y fixer. Nous pourrons ensuite conjuguer des médicaments sur nos molécules afin de les faire passer les barrières physiologiques naturelles et atteindre plus efficacement les tissus cibles. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces car ils n'atteignent pas de manière spécifiques les tissus voulus. Cette demande de projet a pour objectif le développement et l’amélioration de nos molécules pour faciliter le passage des médicaments à travers les membranes cellulaires. Le fait d'accrocher nos molécules à des proteines fluoresecentes permet de suivre leur localisation.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nos molécules permet d'obtenir une localisation plus spécifique et d'éviter des effets sur les tissus non voulu et cela constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont les suivantes : -L’administration de nos molécules se fera sur animaux éveillés en une dose ou plusierus doses répétées (maximum x3). Ces dernières se feront : - Au niveau de la veine de la queue pour l'animal vigil en contention, geste rapide (≤ 2min). - Ou au niveau de la nuque pour les sous-cutanées, animal vigile, libre sans contention ; geste rapide (≤ 2min). L'injection intrapéritonéale (1 fois lors de la mise à mort des individus) -Les prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux vigiles : au maximum 4 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7 jours et ≤20% sur 14 jours. Pour chaque imagerie la souris est anesthésiée. Il y aura à minima 1 imagerie et cela peut aller jusqu'à 7 imageries. Les différents types d'imagerie prendront quelques minutes (entre 2 et 25min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : - La contention des animaux dans le cas des administrations intraveineuses et sous-cutanées. - Les différentes administrations réalisées : intraveineuses ou sous-cutanées et intrapéritonéales (lors de la mise à mort des individus). - Les prélèvements sanguins intermédiaires

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de caractériser ex vivo la biodistribution mais aussi l'efficacité selon le type de molécule couplée.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités, mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 10 études par an, nous aurons besoin de 40 animaux par an (n mixte=4 *10), soit un total de 200 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les imageries se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal tout en ayant un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale. Le bien être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, ou morceau de bois afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour des animaux adultes, ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade adulte présente un poids moyen de 17-28g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Pour vérifier qu'un lot de vaccin ne contient pas de substance provoquant de la fièvre avant sa mise sur le marché, 80 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque essai commence par l'introduction d'une sonde thermique par voie rectale, puis une injection du produit dans la veine de l'oreille. Un produit est testé sur trois lapins, avec jusqu'à trois séries supplémentaires de trois animaux en cas de résultat intermédiaire, pour environ seize tests prévus. Le porteur indique que l'objectif européen est le remplacement complet des lapins en 2026, et précise que les animaux dont la température monte de plus de 1,2 °C sont mis à mort, les autres étant gardés jusqu'à trois mois pour être réutilisés dans d'autres contrôles.

Objectifs

L'essai des pyrogènes est un essai de sécurité requis pour la libération de lots sur le marché de certains vaccins. Il permet de s'assurer que les lots mis à disposition des patients ne contiennent pas de substances susceptibles d'induire de la fièvre et de nuire à leur santé.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats de l'essai est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins concernés, c'est à dire avant la mise à disposition des patients.

Procédures

Les lapins sont soumis aux interventions suivantes: -introduction d'une sonde de température enduite de vaseline par voie rectale: mise en place de 10 à 30 s. - injection dans la veine de l'oreille: une administration par lapin et par essai: durée entre 30s et 2 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'inconfort lié à la contention, au port de la sonde rectale et à la vaccination par voie intraveineuse. La vaccination peut causer une légère douleur transitoire. En cas de produit non conforme contenant des substances pyrogènes, une augmentation transitoire de la température corporelle peut se produire.

Devenir

Les lapins n'ayant pas présentée une élévation de température supérieure à plus de 1,2°C sont gardés en vie en fin de test pour pouvoir éventuellement être réutilisé dans les 3 mois suivants pour le contrôle d'un ou ou plusieurs autres produits (fonction des réceptions des échantillons et des délais de libération de lots). Les lapins arrivés depuis environ 3 mois et ceux pour lesquels la réponse indiviuelle lors d'un essais est supérieure à 1,2°C sont mis à mort.

Remplacement

Progressivement des méthodes alternatives à l'essai des pyrogènes sont validées pour les différents types de vaccin chez les fabricants et en parallèle dans nos laboratoires. L'objectif européen est le remplacement complet de l'utilisation des lapins en 2026.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot est réglementairement fixé. Le test d'un produit se fait sur 3 lapins. En cas de résultat intermédiaire (supérieur à la limite de conformité mais inférieur à la limite de non conformité) un à 3 retests peuvent être effectués à chaque fois sur un lot de 3 lapins différents pour un total de 12 animaux. Environ 16 tests sont prévus pour la durée du projet.

Raffinement

Les lapins sont habitués très progressivement à la contention (période d'environ 3 semaines entre la réception dans nos locaux et l'utilisation en essai): mise en place d'abord d'une collerette dans la cage puis habituation progressive aux boites de contention.

Choix des espèces

L'’essai des pyrogènes doit être réalisé sur des lapins adultes de plus de 1,5 kg. Nous commandons les lapins à 10 semaines environ, donc adultes ce qui correspond à des lapins d’un poids d’environ 2 kg. Des lapins plus jeunes, donc plus vifs, s’habitueraient moins bien à la contention. Des lapins trop âgés ne tiendraient pas dans les boîtes de contention et seraient trop gênés par la collerette.

Caler la dose, la formulation et la voie d'administration avant les études de plus grande ampleur : 300 souris, 300 rats et 180 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à deux administrations par 24 heures pendant quatre semaines, jusqu'à huit prélèvements sanguins par jour, et pour certains une chirurgie de 20 à 45 minutes pour implanter cathéters ou mini-pompe, suivie d'un hébergement isolé pendant toute l'étude. Le porteur mentionne aussi la privation de nourriture et l'isolement en cage de mise à jeun, et reconnaît qu'aucune analyse statistique ne sera conduite sur ces tests pilotes. 650 animaux seront tués, les 130 autres pouvant être réutilisés dans d'autres projets, la formation par exemple, s'ils n'ont pas montré d'effets marqués.

Objectifs

Lors des premières étapes du développement de nouveaux médicaments, des tests préliminaires sur de petits groupes d'animaux vigiles sont souvent nécessaires pour établir des paramètres clés tels que la dose, la formulation et la voie d'administration. Ces essais préliminaires servent à évaluer l'impact de ces changements de paramètres sur le rongeur vigile (rats, souris, cobayes) par des études de peu d'animaux, avec une surveillance accrue des effets secondaires. L'objectif est de s'assurer que les changements apportés dans ces paramètres n'entraînent pas de réactions indésirables majeures. Ces essais initiaux permettent de réduire les risques d’effets secondaires lors des études ultérieures de plus grande envergure qui suivront, et s'assurer qu'elles aient un impact conforme à celui envisagé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes sur le profil du candidat médicament et d’évaluer les éventuels effets secondaires locaux et généraux sur un petit groupe d'animaux avant de pouvoir passer aux premières administrations chez un plus grand nombre d'animaux. Ceci est donc une étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Selon leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Rongeurs) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Lors de ce projet, les animaux seront soumis à une ou des administrations de produit, avec moins de 3 minutes par administration (2 administrations/ 24h maximum, sur 4 semaines maximum). Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal (environ 2 minutes par prélèvements). Ces expériences (administration et prélèvements de sang) pourront être réalisées sur animal vigile ou anesthésié, en respectant un volume maximal de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. Les fréquences des prélevements sont en fonction du volume et mode de prélèvement, sans dépasser 8 prélèvements par 24h. Un prélèvement sanguin ou de tissu terminal sous anesthésie pourra être éventuellement réalisé (durée entre 4 et 6 minutes). Chirurgie d'implantation de cathéters et/ou de minipompe (pour prélèvements et/ou administration). Cette chirurgie durera environ 20-45min.

Impact sur les animaux

Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint : pour l'administration du composé à tester et pour d'éventuels prélèvements de sang, éventuellement pour induire une anesthésie. Ces contentions peuvent donc engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations et lors des prélèvements sanguins. La chirurgie d'implantation de cathéters et de minipompes chez le rat et le cobaye peut induire des douleurs post-chirurgicales. Post-chirurgie d'implantation de cathéters, les animaux seront hébergés individuellement sur la durée de l'étude pour récupérer. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée. De plus, les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'isolement en cage de mise à jeun. Les effets potentiellement indésirables font l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la suite d’effets marqués des produits testés. Tous les animaux implantés avec des cathéters ou avec une mini-pompe seront euthanasiés. Ce sera également le cas pour les animaux avec prélèvements terminaux (tissus et prélèvements sanguins). Les animaux non-implantés (cathéters et/ou mini-pompe) ou les animaux n'ayant pas subi de prélèvements terminaux pourront être réutilisés si ils n'ont pas présenté d'effets marqués après traitement . Leur réutilisation pour d'autres projets (ex : formation) sera possible si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets systémiques ou locaux d’une nouvelle molécule sur l'homme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou des effets secondaires d'un candidat médicament.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Aucune analyse statistique ne sera réalisée sur les résultats d’expérimentation des tests pilotes, car le nombre d'animaux utilisés par groupe est faible et l'objectif de ces tests est principalement de détecter des effets indésirables sur une petite échelle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, du poids et des signes cliniques • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire , • La mise en groupe des animaux , • Un raffinement spécifique à ce projet sera réalisé par la mise en application d’ une grille de cotation spécifique à l'espèce permettant d'objectiver la douleur et la contrainte subie par l'animal.

Choix des espèces

Ce projet pratique sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le rongeur est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets potentiels d'un candidat médicament, notamment par sa facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Une biopsie de peau, la greffe d'un feuillet d'épiderme humain sous anesthésie, puis six semaines d'isolement en cage individuelle parce que les rats rongent l'implant de leurs congénères. 136 rats nude, dépourvus de défenses immunitaires, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tués et autopsiés, 16 n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique étant réutilisés dans d'autres projets. L'étude est une toxicologie réglementaire, prérequis administratif aux essais cliniques d'un implant cutané destiné aux ulcères de la peau. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable important, tout en prévoyant la mise à mort des animaux en cas de nécrose cutanée, de rejet du greffon ou de douleur sévère, et rapporte l'effectif à des lignes directrices internationales dont il ne dit pas ce qu'elles exigent.

Objectifs

Réaliser une étude de toxicologie réglementaire, chez le rat immunodéficient, d’une greffe de tissu humain avant administration à l’Homme pour traiter les ulcères de la peau, c'est à dire évaluer la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de la greffe de cellules souches pluripotentes humaines.

Bénéfices attendus

L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est le prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III. C’est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet donc de démontrer l’absence de risque du modèle de d’implant avant de le réaliser chez l’Homme. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines) Elle permettra de collecter des données sur la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles permettant d’obtenir toutes ses données. Il permet de récolter des données réglementaires pour la préparation des essais cliniques. En effet, ces études permettent d’augmenter les chances de tester cliniquement un produit dépourvu d’effets toxiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie et analgésie adaptées : une biopsie de la peau est effectuée et d’un greffon de cellules épidermique humain est mise en place sur la zone biopsiée La durée de la chirurgie est d’environ 30 min. Un suivi post opératoire bi quotidien est ensuite réalisé avec administration d’un analgésique pendant 3 jours (doses pouvant être augmenté si nécessaire). Des prélèvements sanguins seront effectués sur l’ensemble des animaux pendant la durée de l’étude (au maximum 26 semaines) : jusqu’à 4 prélèvements, sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’effets indésirables importants lié à l’implant de tissu épidermique chez l’animal en raison d’une procédure d’anesthésie/analgésie mise en place par un vétérinaire, d’une chirurgie de courte durée (environ 30 minutes) effectué par un personnel compétant et un suivi post-opératoire et quotidienne pendant l’ensemble de la durée de la procédure. L’utilisation d’animaux immunodéficients réduits le risque d’inflammation importante et le risque de rejet de l’implant de tissues épidermiques. De plus, les prélèvements sanguins effectués au cours de la procédure sont des gestes peu invasifs et peu douloureux d’autant plus lorsqu’ils sont effectués par du personnel expérimenté selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Cependant, en cas de signes d’infections, de rejet du greffon, ou d’effets toxiques importants liés à l’implant (perte de poids importante, inflammation sévère, nécrose cutanée, douleur sévère) l’animal sera euthanasié afin de procéder à un examen anatomopathologique dans le cadre de l’étude de toxicité réglementaire, selon les recommandations l’ICH/EMA.

Devenir

Les animaux n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique (non invasif) pourront être réutilisés dans d'autres projets. Les animaux ayant subi la chirurgie sont euthanasiés et autopsiés, comme définit par les lignes directrices ICH/EMA encadrant le déroulement des études de toxicologie règlementaire.

Remplacement

L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA, prérequise aux essais cliniques de phase I, II et III. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines). Les études de toxicologie règlementaire doivent être effectuées sur des modèles animaux selon les guidelines ICH/EMA, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser par groupe est fixé par les lignes directrices ICH/EMA. Il est considéré comme le minimum acceptable des études réglementaires afin de permettre une interprétation scientifique des données et d’évaluation précise des possibles effets toxiques.

Raffinement

Afin de réduire les nuissances liés à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera biquotidienne, et inclus l’administration d’analgésie injectable (si nécessaire) et par voie orale (dans l’eau de boisson) systématiquement durant 2 à 3 jours. Un hébergement individuel est requis pendant 6 semaines pour éviter tout risque de destruction de l’implant qui a été observé lors des études préliminaires avec hébergement collectif : les rats rongent systématiquement l’implant du congénère lors des 1ères semaines post-opératoires. L’hébergement sera enrichie (object en bois spécifiques pour les rongeurs de différentes formes et tailles, en plus des enrichissements déjà prévus pour une hébergement collectif - tunnel, matériaux de nidification, bois à ronger - et une litière de cellulose favorisant le confort des rats nude) pour maintenir le bien être de l’animal sous supervision de la SBEA. Les animaux seront isolés dès la semaine d'acclimatation, afin d'éviter tout risque de blessures cutanées liées à un jeu ou une bagarre et réduire l'impact de l'isolement au réveil de la chirurgie. Les prélèvements de sang seront réalisés sous sédation par inhalation d’isoflurane, afin de limiter le stress induit par la contention manuelle ou des lésions vasculaires lorsqu’un animal est agité. Enfin, pour réduire les nuissances liés à la greffe et la chirurgie (principalement l'inflammation et le rejet du greffon), une souche de rat immunodéprimé est utilisée. Comme cette souche peut être plus sensibles aux agents pathogènes, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages type III H permettant à l'animal de se redresser (dimension 374x214x185 prévue intialement pour 2 à 4 rats) sous couvercle filtrant , puis en groupe dans des portoirs ventilés. Les salles d'hébergements et de test utilisées seront dédiées à cette souche uniquement avec d'éviter des contaminations croisées et l'ensemble de l'étude se déroulera dans une zone SPF (Specific Pathogen Free). Des points limites ont été définies afin de permettre la mise en place d'actions correctives afin d'éviter tout souffrance.

Choix des espèces

Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires in vivo (régies par les lignes directrices ICH M3(R2) et ICH S3A et ICH S6(R1)) qui nécessitent l’utilisation d’au moins une espèce animal. Le rat nude immunodéficient permet d’implanter en sous cutanée l’implant de cellule humaine sans risque de rejet immédiat et il permet l’évaluation de la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles avant de faire les essais cliniques chez l’Homme A partir de 6 semaines, selon l’âge recommandé par les lignes directrices ICH/EMA

Cinq lapins reçoivent dans l'œil, à quatre reprises, un laser dont l'éclairement dépasse d'un facteur dix la limite fixée par la norme ISO, avec une lame de verre posée sur la cornée. Ces séances de quarante-cinq minutes se déroulent sous anesthésie générale et relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des ulcères de l'épithélium cornéen, des lésions de l'endothélium et une cataracte par effet thermique comme atteintes possibles, et précise que l'étude est faite "justement" pour en constater la survenue. Tous les lapins sont tués pour histologie oculaire, leurs os et leur cochlée partant à d'autres équipes, afin qu'une startup française puisse déposer un dossier d'autorisation pour son appareil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) nommée LC-OCT permettant d'effectuer des images proche de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer la safety sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte ou prise de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme des selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'oeil sous sédation et l'animal sous anesthésie général. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT durera 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 820 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35). Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires. D'autres équipes de recherche récupéreront les os et la cochlée des animaux.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Tout d'abord nous utilisons l'oeil gauche de chaque animal comme oeil contrôle réduisant de moitié le nombre d'animaux nécessaire. Ensuite, Compte tenu de la faible variabilité interindividuelle habituellement observée dans les études ophtalmologiques utilisant l'imagerie non invasive, ainsi que de notre objectif de comparer, par suivi clinique et histologie post-mortem, l'état des tissus oculaires des yeux contrôles (OG) et des yeux analysés (OD) pour chaque animal à l'aide d'une échelle de graduation semi-quantitative, et afin d'obtenir un échantillonnage suffisant pour effectuer une analyse statistique avec des tests de rangs non paramétriques (OG vs OD), nous avons déterminé qu'un minimum de 5 animaux est nécessaire pour tirer des conclusions valables. En effet, avec moins de 5 lapins, les tests statistiques perdent de leur pertinence, tandis qu'un nombre supérieur à 5 semble excessif.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

Six prélèvements sanguins pour chaque rat, trois pour chaque souris, tous réalisés sous anesthésie gazeuse. 16 rats Wistar et 40 souris vont être utilisés, tous tués six heures après le dernier prélèvement pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif tient en une mesure de cinétique sanguine sur une nanoémulsion de fénoldopam, molécule candidate contre les complications vasculaires de la polykystose rénale. Le porteur mentionne parmi les effets attendus l'exérèse du rein gauche et un gavage, deux actes absents de sa description des procédures, et justifie le recours aux animaux en une seule phrase.

Objectifs

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie rénale héréditaire ayant une prévalence estimée à 4 sujets sur 10 000 en Europe.1 Dans la PKRAD, le développement de kystes rénaux altère progressivement la fonction rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale chez 1/3 des patients qui représentent 10% des dialysés et des transplantés. Ces patients développent précocement une hypertension artérielle et des complications cardiovasculaires avec une fréquence beaucoup plus élevée que dans la population

Bénéfices attendus

Malheureusement, les effets centraux de la rotigotine restent un frein à son utilisation dans la PKRAD et donc à l’évaluation de cette stratégie pharmacologique sur la structure et la fonction rénale à long terme. Une molécule plus intéressante au plan pharmacologique est le fénoldopam (FENO) qui est un agoniste spécifique des récepteurs DR1 et DR5 ne franchissant pas la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule est notamment utilisée aux USA pour la prise en charge des crises hypertensives ou des hypertensions post-opératoires. A ce jour, le FENO est uniquement administré sous forme intraveineuse du fait de son métabolisme rapide et de sa faible demi-vie. Afin d’évaluer dans notre unité l’intérêt du FENO dans la PKRAD, celui-ci a été administré de façon chronique au moyen de mini-pompes chez des souris invalidées pour la polycystine-1 spécifiquement au niveau endothélial (VE-Cadh/Pkd1fl/fl). Celui-ci a permis de restaurer la dilatation-débit dépendante d’artères mésentériques isolées et de prévenir l’augmentation de la pression artérielle induite par la déficience en polycystine-1 endothéliale (Hamzaoui M et al. Hypertension 2022). L’ensemble de ces travaux montre que la stimulation des récepteurs dopaminergiques D1-like constitue une nouvelle approche thérapeutique d’intérêt pour la prise en charge des complications vasculaires de la PKRAD. Dans la mesure où les mécanismes de mécanotransduction sont communs, cette approche pourrait être également intéressante pour ralentir le déclin de la fonction rénale chez ces patients. Cependant, il n’existe actuellement aucun agoniste dopaminergique des récepteurs D1-like ayant des propriétés pharmacocinétiques permettant une utilisation par voie orale pour le traitement de la PKRAD.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront effectués 6 fois sur les rats lors de la pharmacocinétique et 3 fois chez la souris . Tout les prélement serons réalisé sous-anesthésie gazeuse (isoflurane 2 %) de courte durée.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2, ainsi que l’exérèse du rein gauche pourront occasionner des effets secondaire. Les effets indésirables suite au prélèvement de sanguin sont de la fatigue chez les animaux et le gavage peut induire une petite prostration de l'animal

Devenir

Tout les animaux après le dernier temps de prélèvement au temps 6h serons mis à mort dans les deux procédures pour la récupération des organes et l'analyse des tissus .

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude de mettre au point une cinétique sur un produit pharmacologique

Réduction

Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex-vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaires

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=4 pour les rat et n=5 pour les souris ) par cage, dans un environnement stabilisé (température 21°C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux, durée du cycle de lumière (12h/12h)). Tout au long de l’étude, les animaux sont nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs ventilés avec de l’enrichissement (plaque de cellulose vierge, tunel, papier krafs et maison en carton). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole pour les rats . Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mis en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et nous appliqueront une grille d’évaluation du bien-être animal séparément pour chaque individu (Annexe I).

Choix des espèces

Le choix du rat Wistar pour les premières analyses se justifie par la probabilité importante d’obtenir des prélèvements permettant une analyse pharmacocinétique détaillée afin de réaliser une translation optimale vers l’étude chez les souris transgéniques. Le choix de la souris pour les analyses complémentaires se justifie par l’abondante littérature, sur l’expérience du laboratoire et sur la possibilité de recourir aux animaux transgéniques pour approfondir les résultats du travail (modèle de souris invalidées pour le gène codant la protéine d’intérêt). Afin de permettre une étude pharmacocinétique chez des animaux adultes, avec la possibilité de recueils sanguins suffisants, le poids des animaux sera : -Rats Wistar (N=16) : 400g -Souris C57Bl6J (N=40): 20g