Toxicologie et autres tests de sécurité

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des souches bactériennes dans l'eau de boisson pendant vingt-sept jours, hébergées seules pour mesurer leurs prises alimentaire et hydrique, et subissent un prélèvement de sang à la queue puis un prélèvement terminal par ponction cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que l'apport bactérien pourrait perturber le transit intestinal et que la prise de sang initiale représente 15 % du volume sanguin. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans le développement de composés thérapeutiques visant à moduler ou restaurer le microbiote afin de produire une hormone spécifique. Cette étude se déroulera en deux étapes avec une étape préliminaire ayant pour but de sélectionner la souche bactérienne la plus efficace. Dans un second temps, à partir de cette souche-candidat, une dose-réponse sera effectuée afin de déterminer la dose optimale pour les études futures.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés thérapeutiques visant l'humain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouveau composé modulant ou restaurant le microbiote permettant la production d'une hormone spécifique.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types de prélèvement, un prélèvement sanguin à D0 par la veine caudale (2x100µL) sur animal vigile et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque sur animal anesthésié par l'administration d'un mélange de kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.). Par ailleurs, les animaux auront des souches bactériennes par l'eau de boisson de D0 à D27. Les 24 souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

La nécessité de mesures individuelles de la prise alimentaire et de la prise hydrique implique l'hébergement individuel des animaux. L'administration des souches bactériennes par eau de boisson de D0 à D27 pourrait engendrer des modifications du transit intestinal (non prévue initialement dans l'étude). La seule manipulation pouvant engendrée une nuisance est le prélèvement sanguin à D0 (200µL) par la veine caudale (représentatif de 15% du volume sanguin total). L'ensemble des souris seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/Kg; i.p.). Les souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d'un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et hydrique et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudés sont les suivants : le poids corporel, la prise alimentaire, la prise hydrique, la cytokine IL-10 (serum) et l'hormone ocytocine (plasma). De plus, l'étape 1 du projet nous permet de réduire drastiquement le nombre d'animaux à utiliser pour la dose-réponse de l'étape 2. Cette étape préliminaire est indispensable pour le respect de la règle des 3R.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitement seront administrés via la nourriture ou la boisson, permettant de limiter les manipulations et le stress liés à l'administration des traitements. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois spécialement conçus pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine notamment). L'ensemble des souris sera euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J est le modèle de souris le plus classiquement utilisés et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 7 semaines, au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population de jeune adulte.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur implante par chirurgie un capteur d'électrocardiogramme, leur administre par gavage des molécules anticancéreuses connues pour leur cardiotoxicité et suit leur cœur par échocardiographie sous sédation. Toutes sont ensuite euthanasiées pour prélever le cœur. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'étude du cœur dans un organisme "entier", tout en menant en parallèle des travaux sur cardiomyocytes issus de cellules humaines.

Objectifs

Le projet consistera à évaluer de nouvelles options thérapeutiques pour traiter le cancer. Il concerne le développement d’approches basées sur la nanotechnologie, en particulier l’incorporation des molécules dans des formulations nanostructurées. Il s’agira d’étudier les effets bénéfiques espérés de deux nouveaux systèmes de vectorisation pour une molécule déjà utilisée dans la maladie de Chagas et repositionnée pour traiter le cancer, et pour une autre molécule de référence très efficace mais cardiotoxique. Nous évaluerons les effets bénéfiques des deux formulations chez la souris.

Bénéfices attendus

La nanomédecine est une stratégie innovante émergente. Elle vise à mieux contrôler le niveau plasmatique de médicaments et à réduire leur toxicité tout en préservant leur efficacité. Par exemple, des molécules incorporées dans des nanostructures séjournent plus longtemps dans l´organisme ; ce qui améliore leur efficacité à dose plus faible et leur tolérance. L’un des deux médicaments testés est déjà utilisé pour traiter la maladie de Chagas. Il est actuellement évalué dans une stratégie de repositionnement comme traitement d'appoint anticancéreux. Son incorporation dans dans une formulation nanostructurée est prometteuse. Nous comparerons les effets de ce médicament nanoformulé avec ceux d’une molécule de référence, qui sera elle aussi nanoformulée pour supprimer ou atténuer sa cardiotoxicité latente. Nous déterminerons la meilleure option thérapeutique possible pour traiter le cancer. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les animaux auront deux à trois échocardiographies (de 15 à 20 minutes chacune) au cours des traitements et, si nécessité de suivre une évolution de leur statut cardiaque, entre une et trois échocardiographies en post-traitement. Les enregistrements se font sous anesthésie légère et sont non-invasifs. L’acquisition d’ECG se fera en ambulatoire (animal vigile, libre de mouvement, dans son environnement) avant et au cours du traitement. Il n’y a aucun intervention particulière (enregistrement neutre pour l’animal). Une chirurgie préalable est réalisée en amont (10 jours avant le premier enregistrement) pour l’implantation du capteur-émetteur de l'ECG.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés sont une source potentielle d’effets indésirables chez les animaux. Nous limiterons ces nuisances par un traitement à une dose moyenne et de durée minimale permettant toutefois d’avoir un effet détectable, quantifiable, et actionnable avec des points limites bien définis. L’une des molécules testée est utilisée chez l’homme pour traiter la maladie de Chagas, elle-même source d’insuffisance cardiaque et d’arythmies. Sa cardiotoxicité est donc difficile à apprécier et donc peu documentée. Nous avons montré des effets cellulaires qui pourraient, possiblement, affecter la contraction cardiaque et induire des troubles du rythme. La cardiotoxicité subclinique de l’autre molécule testée, mieux connue chez l'homme, est définie par échocardiographie cardiaque. Elle est donc plus ou moins attendue chez la souris et devra être surveillée. Il est à noter que les deux formulations avec ces deux molécules sont censées diminuer toute toxicité éventuelle. Le gavage peut également une cause de stress qui peut cependant être limité (brièveté de l’acte, expertise de l’expérimentateur). L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Elle est non-invasive. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo et rend possible un suivi des animaux au cours du temps. Le stress subi par les animaux se limite à la manipulation (période courte, 10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie, l’animal est vigile et maintenu dans son environnement habituel, sans stress. Cette approche permet de gérer de façon optimale la période post-opératoire après implantation des capteurs de télémétrie. La nuisance que représente l'étape chirurgicale au cours et après l'implantation sous-cutanée des capteurs est prise en charge par sédation/analgésie. Le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie pratiquée au cours de l’étude, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal, et une diminution des artéfacts.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin des procédures pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

L'une des deux molécules testées est un médicament anticancéreux de référence, mais entaché d’effets cardiotoxiques. Des approches in-vitro et in-vivo ont permis d’envisager l’utilisation d'une autre molécule déjà utilisée pour traiter la maladie de Chagas. L’évaluation d’éventuels effets cardiotoxiques est fondamentale pour poursuivre cette piste. Des études antérieures, réalisées dans notre laboratoire, ont montré des effets cellulaires pouvant être source d'arythmies cardiaques in vivo. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution idéale pour l’évaluation des effets cardiaques dans un organisme « entier ». Le cœur est un organe complexe, en interaction avec de nombreux autres systèmes (systèmes nerveux autonome, neuroendocrines, etc…). L'approche in vivo est donc nécessaire pour étudier des molécules libérées à partir de nanostructures comme cela est notre cas. Nous comparerons les effets potentiels de notre molécule d'intérêt repositionnée avec ceux de notre molécule anticancéreuse de référence, après incorporation dans des nanostructures censées diminuer leur cardiotoxicité. En parallèle, nous mènerons des études mécanistiques sur des cardiomyocytes dérivés de cellules iPS humaines pour limiter les investigations chez l’animal. Les données seront replacées dans leur contexte d'utilisation et des connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix utilisées chez l’homme en clinique : l’électrocardiograhie (ECG) et l’échocardiographie. Elles permettent un suivi de la fonction cardiaque au cours du temps. Cela permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour des mesures répétées et peu, voire non-invasives, au cours du temps. Les animaux ne sont pas sacrifiés après chaque examen (étape) nécessaire à l’étude. Chaque animal est son propre témoin. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études précédentes similaires. Pour limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, nous étudierons aussi les effets électrocardiographiques avec une méthode d’enregistrement simplifiée de l’ECG. Cette approche a de nombreux avantages : elle est techniquement simple, peu coûteuse, avec un court temps de mesure et facile à mettre en œuvre pour un dépistage d’altérations évidentes. En cas d’altérations significatives, et seulement si, une mesure d'ECG en ambulatoire (sur des animaux vigiles) serait alors mise en œuvre pour approfondir les effets. Notre expérience et une analyse statistique a permis de définir le nombre minimum mais suffisant d'animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental pour les deux procédures. Chaque animal étudié sera utilisé en fin de protocole après sacrifice pour mesurer des caractéristiques histologiques, biochimiques et moléculaires. Les données numériques seront moyennées +/- l'écart-type. Nous exécuterons un test normalité de D'Agostino-Pearson (symétrie et distribution Gaussienne) pour chaque ensemble de données indépendantes avec une analyse des variances pour les comparaisons par one-way ANOVA et un test post-hoc (Bonferroni or Tukey) pour comparer les paires de données.

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives et performantes (échocardiographie, électrocardiographie) utilisées chez l’homme afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques acquis. Notre objectif est également de réduire au strict minimum la quantité de détresse imposée aux animaux. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, à savoir en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), enrichissement du milieu (jouets, tunnel, cell nest; carrés de coton pré-découpés, etc…) pour répondre à leurs besoins physiques et comportementaux, détresse éventuelle, points limites et arrêt anticipé de la procédure en particulier si des effets indésirables intervenaient durant le protocole.

Choix des espèces

Les modèles murins sont utilisés en laboratoire pour des études pré-cliniques, et en particulier pour des investigations pharmacologiques. D’une manière générale, le modèle souris est de très loin le plus utilisé de tous les modèles animaux. Les paramètres cardiaques morphologiques et fonctionnels chez la souris normale sont parfaitement connus, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante; ce qui élargit les possibilités de comparaison et d’interprétation des résultats avec les études déjà effectuées dans le domaine. Nous utiliserons des souris Swiss, une souche hétérogène avec un pourcentage élevé d'hétérozygotie au niveau des allèles, car elles imitent le mieux la variabilité génétique de la population humaine typique. Les animaux seront réceptionnés au stade adulte, à 2 mois. Ils seront utilisés après la phase d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal).

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, avec une perte de poids pouvant conduire à la mort et une mise à mort à 20 % du poids perdu, avant le prélèvement des poumons et de la rate. Le porteur situe le projet dans un consortium européen et revendique un "besoin" de générer un maximum de données. Il affirme que les essais précliniques reposent sur le recours à l'"organisme entier".

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris par des souches virulentes de bacilles tuberculeux est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours par semaine pendant 4 à 8 semaines. Il y a 1 gavage par jour par souris. Le nombre de gavages total par souris au cours de l’expérience variera selon qu’une souris soit un contrôle du niveau d’infection ou bien reçoive un traitement de 8 semaines, ou encore permette d’obtenir des données pharmacodynamiques à des stades intermédiaires, par conséquent de 0 à 40 gavages. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués au niveau de la queue pour l'étude de la biodisponibilité́ des composés. Un faible volume de sang (~ 30 µl) sera prélevé au niveau d’une incision faite sur la veine caudale. L’animal, vigile, est pour cela placé dans un dispositif l’immobilisant et ne laissant dépasser que la queue. Une pression est ensuite effectuée au niveau de l’incision avec une compresse imbibée d’alcool pour stopper le saignement. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – pour chaque souris sélectionnée pour l’étude pharmacologique. Il s’agit d’un acte rapide qui doit prendre 1 à 2 min. 4. Pour l’analyse de biomarqueurs, des prélèvements de sang seront effectués par ponction cardiaque sur animaux anesthésiés avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Sont concernés l’ensemble des animaux de l’expérience (maximum 120). Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

20 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules à tester en administration unique ou répétée jusqu'à quinze jours, puis sont tués dans les quatre heures pour prélever des structures cérébrales et en mesurer les neuromédiateurs. Le porteur indique que les composés peuvent provoquer prostration, hyperlocomotion, perte de poids, stéréotypies, agressivité voire convulsions, auquel cas les animaux sont écartés et tués. Il justifie le recours au rongeur par la "nécessité" d'un système nerveux "intègre" pour évaluer les molécules.

Objectifs

La communication entre les différentes cellules du système nerveux central s’effectue via la libération de molécules, des neuromédiateurs, se liant à des récepteurs localisés sur les cellules cibles. Les nouveaux composés à tester, agissent sur ce système de transmission entre cellules nerveuses en activant ou inhibant la libération de neurotransmetteurs, en activant ou bloquant les récepteurs cibles. Afin de connaitre l’action de nos nouveaux composés sur l’activité de ces systèmes neurochimiques nous avons besoin d’évaluer les contenus en neuromédiateurs (dopamine, noradrénaline, acétylcholine, histamine…) et leurs métabolites (molécules résultant de leur dégradation) dans le cerveau ou des zones particulières du cerveau (hippocampe, hypothalamus, striatum, cortex…) de rongeurs. Pour ce faire nous avons besoin d’administrer nos composés à des rongeurs afin d’observer leurs effets sur les contenus en différents neuromédiateurs cérébraux.

Bénéfices attendus

La technique de neurochimie va permettre d'orienter la recherche de nouvelles molécules à visée thérapeutique - en permettant de vérifier leurs actions positives sur des systèmes neurochimiques connus pour être défaillants dans certaines pathologies psychiatriques (trouble du sommeil, dépression, anxiété, schizophrénie...). - au contraire en vérifiant leur absence d'effet délétère sur certains systèmes neurochimiques pouvant être impliqués dans des effets indésirables (addiction, hypolocomotion...). - en aidant la chimie médicinale à déterminer les familles de molécules ayant le plus d'activité sur un système neurochimique ciblé et à optimiser le(s) composé(s).

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration aigüe ou chronique (maximum 15 jours, deux fois par jour) de molécules à tester. La mise à mort se fera au maximum 4 h après la dernière administration de composé.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de sélectionner les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être une prostration ou une hyperlocomotion, une perte de poids (si traitement chronique), des stéréotypies, de l'agressivité voir des convulsions. Si ces signes sont détectés, les animaux sont écartés de l'expérimentation et euthanasiés.

Devenir

L'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever les différentes structures centrales d'intérêt.

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour les mesures de neurochimie est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système nerveux intègre. En effet, le fonctionnement neurochimique du cerveau est particulièrement complexe avec de nombreuses interactions entre les différents systèmes neurochimiques des différentes régions du cerveau.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

L'euthanasie des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien-Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors l’euthanasie de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Dans le cas d'une expérimentation chronique, en plus de la surveillance continue pendant 1h30 post-traitement, une fiche de suivi journalier est mise en place : tout signe de mal être (prostration, poils hérissés, perte de poids supérieure à 15% dans le cas des traitements chroniques, convulsions) entraînera l'exclusion de l'animal du protocole et son euthanasie (par exposition à une concentration croissante de CO2).

Choix des espèces

- La taille adéquat de l’animal : les rats et les souris présentent une taille suffisante pour permettre des microdissections de structures déterminées du cerveau. - Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée et documentée chez le rat et la souris. Les études de neurochimie pourront être menées aussi bien sur de jeunes animaux sevrés que sur des animaux adultes en fonction des objectifs.

Déjà essayé sur 33 patients, un dispositif qui traite par ultrasons le rétrécissement de la valve aortique va être appliqué à 30 cochons de 14 à 16 semaines, pour tester sa nouvelle version et une séance allongée à 105 minutes. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués un mois après la séance pour rechercher à l'autopsie des effets indésirables invisibles à l'échographie. Sous anesthésie générale, ils reçoivent 80 ou 105 minutes d'ultrasons à travers le thorax, avec échocardiographies et prises de sang avant, après et un mois plus tard, et vivent seuls en cage. Le troisième objectif, documenter la facilité d'utilisation de l'appareil, vise à satisfaire "les exigences de la Food and Drug Administration (FDA)", l'autorité sanitaire américaine, écrit le porteur.

Objectifs

Notre dispositif est destiné à permettre de traiter de manière non invasive les patients souffrant de rétrécissement aortique calcifié, maladie durant laquelle la valve aortique se rigidifie. Cette pathologie est à l’heure actuelle traitée de manière invasive soit par chirurgie à cœur ouvert soit par cathétérisme afin de remplacer la valve malade. Ces interventions sont lourdes et parfois difficiles voire impossibles à supporter pour des sujets âgés. En focalisant les ultrasons de manière non-invasive sur la valve des patients notre thérapie permettrait de dérigidifier la valve et d’améliorer son fonctionnement sans effets secondaires. De premiers essais cliniques (« First In Human ») de notre prototype d’investigation clinique ont été réalisés en Europe sur 33 patients souffrant de rétrécissement aortique calcifié sévère, inopérables avec les techniques invasives existantes. Les résultats de ces essais sont très encourageants tant du point de vue de l’innocuité de notre thérapie avec aucun évènement indésirable à court et long terme (suivi jusqu’à 24 mois) lié à notre dispositif médical, que des signaux d’efficacité très encourageants. Cependant la performance de la thérapie pourrait encore être améliorée. La durée de la thérapie pour obtenir l’efficacité avait été déterminée in vitro car il n’existe pas de modèle animal du rétrécissement aortique calcifié. Nous avions ensuite vérifié l’innocuité de cette durée sur porcs sains. Notre hypothèse est qu’une durée de thérapie supérieure est nécessaire sur les patients du fait des obstacles aux ultrasons (peau, muscles, côtes, poumons, etc…) qui ne peuvent être reproduits in vitro. Suite aux essais cliniques et à l’analyse des résultats cliniques intermédiaires, nous avons significativement amélioré notre dispositif médical afin d’améliorer sa performance, son innocuité, son usabilité et sa maintenance, en particulier avec un nouveau système d’imagerie, une modification de la forme de l’interface acoustique facilitant la transmission des ultrasons et une nouvelle interface graphique. Nous avons donc trois objectifs : 1) Vérifier l’innocuité de notre thérapie per et post procédure à 30 jours avec le nouveau prototype d’investigation clinique 2) Déterminer si une durée plus longue de 105 minutes de notre thérapie reste sans danger. 3) Vérifier l’usabilité de la version améliorée de notre dispositif.

Bénéfices attendus

L’application de notre thérapie par ultrasons sur des pathologies cardiaques, et sa validation, ouvrirait des nouvelles perspectives pour la prise en charge de ces pathologies chez l’homme (cardiopathie valvulaire) normalement traitées par chirurgie ou cathétérisme. Cela permettrait de proposer à long terme une solution thérapeutique noninvasive et indolore (uniquement par ultrasons), sans chirurgie ni cathétérisme. Cette nouvelle approche si elle s'avère positive transformera la prise en charge des patients avec rétrécissement aortique calcifié.

Procédures

Sous anesthésie générale et analgésie, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Thérapie non-invasive par ultrasons transthoraciques d’une durée de 80 ou 105 minutes suivant les lots. 2) Echocardiographies de contrôle avant et après thérapie ainsi qu’un mois après thérapie, d’une durée approximative de 15 minutes chacune. 3) Prélèvements sanguins avant et après thérapie ainsi qu’un mois après thérapie, quatre tubes de 5 ml à chaque prélèvement, durée approximative deux minutes à chaque point de contrôle.

Impact sur les animaux

Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Sur la base des essais précliniques et cliniques précédents, nous n’anticipons pas de douleurs au réveil ni de perte de poids ou de mobilité. Cependant lors de l’expérimentation des douleurs liées à l’application prolongée de la sonde d’imagerie dans l’espace intercostal sont possibles. Certains patients ont également rapporté une douleur lors de l’émission des ultrasons thérapeutiques qui cesse dès l’arrêt de l’émission.

Devenir

A l’issue de la thérapie, les animaux seront maintenus en vie pour observation et suivi à un mois afin de détecter d’éventuels effets indésirables de notre thérapie. Après le suivi à un mois, les animaux seront mis à mort afin de procéder à une analyse anatomopathologique permettant de détecter d’éventuels effets indésirables de notre thérapie, non détectables par les méthodes non-invasives (échocardiographie) ou minimalement invasives (prélèvements sanguins) mises en œuvre avant la mise à mort.

Remplacement

L’application de notre thérapie in vitro (sur tissus statiques) a déjà été réalisée à de multiples reprises. Nous devons travailler sur le vivant car le mouvement cardiaque et l’obstacle produit par les tissus thoraciques sont les principales difficultés pour l’application de cette technologie, et la réaction des tissus traités sur un mois n’est pas modélisable in silico ou in vitro. De plus, il va être crucial de démontrer l'innocuité (in vivo) de notre thérapie avec la version 2 de notre dispositif chez l’animal à moyen terme pour pouvoir ensuite l’appliquer sur la cardiopathie valvulaire humaine. Enfin, il est important d’évaluer les effets potentiellement indésirables de notre thérapie ce qui n’est possible que in vivo et de vérifier l’activité cardiaque à court et moyen terme (par échocardiographie et biochimie sanguine) avant d’utiliser notre dispositif sur l’homme avec une durée de thérapie plus longue que celle actuellement autorisée. Pour analyser et interpréter notre expérimentation, nous avons deux nécessités : 1) rendre l’expérimentation possible, donc il nous faut un animal d’un poids suffisant, avec une fenêtre de thérapie accessible ; 2) obtenir des résultats extrapolables à l’homme, donc avoir accès à une anatomie comparable aux caractéristiques humaines en effet la profondeur de la valve aortique de porc est de 5 à 10 cm, correspondant à celle de l’homme et c’est un animal qui présente une grille costale comparable à celle de l’homme également. Cela permettra de tester un dispositif identique à celui qui sera utilisé sur les patients. Une des limites actuelles de notre technologie est la taille de notre zone thérapeutique (5 à 10 mm). Travailler sur des animaux plus petits nous exposerait à une difficulté de précision de thérapie et une impossibilité d’extrapoler à l’humain les résultats obtenus.

Réduction

La vérification de l’innocuité de notre thérapie avec notre nouveau prototype d’investigation clinique, sera effectuée dans les mêmes conditions qu’avec la version précédente : 80 minutes de thérapie sur porcs sains, groupe de 15 porcs avec un suivi d'un mois après thérapie par ultrasons. La vérification du deuxième objectif sera réalisée sur 15 porcs exposés à une durée de 105 minutes de thérapie avec un suivi d'un mois après thérapie par ultrasons. Les améliorations d’usabilité de notre dispositif version 2 doivent faire l’objet d’évaluations formatives et sommatives afin de satisfaire les exigences de la Food and Drug Administration (FDA), troisième objectif de cette étude. Dans le cadre des 3R et en particulier de la Réduction, les animaux utilisés pour les deux premiers objectifs permettront de valider et documenter l’usabilité de la nouvelle version de notre dispositif, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de 30 animaux en deux groupes de 15 est légitime pour garantir la preuve de concept sur une série (Réduction). Nous nous basons en particulier sur notre étude précédente ayant permis de détecter à l’histologie des effets microscopiques sur la valve de 5 des 16 porcs traités. Travailler sur plus d’animaux n’aurait pas d’intérêt scientifique. Travailler sur moins d’animaux nous exposerait au risque de ne pas aboutir à la preuve de concept, donc de sacrifier inutilement. Une étude statistique sera réalisée avec des tests adaptés afin d’évaluer les effets du traitement sur l'insuffisance aortique et la surface valvulaire pour chaque groupe. De même ces tests seront appliqués pour les évaluations de biochimie sanguine.

Raffinement

Toutes les manipulations chez l’animal seront sous anesthésie générale et analgésie, pour une pénibilité minimale. Sur la base des essais précliniques et cliniques précédents, nous n’anticipons pas de douleurs au réveil ni de perte de poids ou de mobilité. Une fois anesthésiés, les animaux sont intubés et placés sous ventilation contrôlée. Après réveil, les points limites seront basés sur l’examen visuel: état de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; émaciation prononcée et atrophie musculaire ; difficultés respiratoires (sifflements, râle, respiration rapide); position anormale (dos voûté, couché sur le côté); et réduction de la mobilité (faiblesse, incoordination, tremblements, paralysie). Si ces signes sont observés, le vétérinaire (qui effectue aussi une visite par semaine) déterminera la procédure à suivre: - soit analgésie dont le traitement sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours -soit euthanasie, sous anesthésie et analgésie. Une alimentation en poudre est administrée afin de faciliter la déglutition suite à l’intubation. Hébergement en cage individuelle, des jeux (boule avec granule, jeux de mordillements) sont fournis.

Choix des espèces

Pour analyser et interpréter notre expérimentation, nous avons deux nécessités : 1) rendre l’expérimentation possible, donc il nous faut un animal d’un poids suffisant, avec une fenêtre de thérapie accessible ; 2) obtenir des résultats extrapolables à l’homme, donc avoir accès à une anatomie comparable aux caractéristiques humaines en effet la profondeur de la valve aortique de porc est de 5 à 10 cm, correspondant à celle de l’homme et c’est un animal qui présente une grille costale comparable à celle de l’homme également. Cela permettra de tester un dispositif identique à celui qui sera utilisé sur les patients. Une des limites actuelles de notre technologie est la taille de notre zone thérapeutique (5 à 10 mm). Travailler sur des animaux plus petits nous exposerait à une difficulté de précision de thérapie et une impossibilité d’extrapoler à l’humain les résultats obtenus. Nous travaillerons sur des cochons jeunes adultes de 14 à 16 semaines d’âge car leur poids compris entre 45-55 kg permettra de tester la faisabilité de notre thérapie ultrasonore sur une anatomie similaire à l’homme.

Pour mesurer les effets de candidats médicaments sur la fonction cardiovasculaire, 84 macaques, soit 72 macaques à longue queue et 12 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit l'implantation chirurgicale d'un émetteur de télémétrie, puis reçoit les produits par différentes voies, avec des prises de sang et, le cas échéant, des tests "neuro-comportementaux" que le porteur ne détaille pas. Il compte parmi les bénéfices attendus, pour les macaques eux-mêmes, des "outils de raffinement de plus en plus adaptés". Tous sont destinés à être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire, y compris un projet "sans réveil", c'est-à-dire mené sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardio-vasculaires chez le primate non-humain vigile en utilisant la télémétrie, méthode d'enregistrement de différents paramètres permettant de laisser l'animal totalement libre de ses mouvements dans la volière pendant les mesures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire . Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (le primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Dans ce projet une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté sera réalisée sur les animaux. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. Les animaux auront également des administrations de produits par différentes voies ainsi que des prélèvements de sang. Des tests neuro-comportementaux pourront également être réalisés.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non humain car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces de non-rongeurs adaptée à ce type de modèle.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • l'utilisation de la technique de télémétrie permettant de recueillir des informations sans manipulations animaux, •la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le primate non humain est, pour certains candidats-médicaments, l’espèce animale la plus adaptée car la plus proche de l’homme en termes de métabolisme et d’exposition. Le système cardiovasculaire du primate non humain est également très proche de celui de l'homme, donc les effets observés sont plus facilement extrapolables. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

71 086 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par gavage quotidien, les femelles subissent des lavages vaginaux et les petits nés sont suivis jusqu'à l'âge adulte, avant mise à mort pour examen des organes. Le porteur présente ces tests de toxicité sur la reproduction comme "indispensables" et "nécessaires" réglementairement pour la mise sur le marché de produits. Les effets attendus incluent des atteintes de la gestation, de la mise-bas et du développement des descendants.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché ou d'enregistrement d'un produit et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).

Bénéfices attendus

A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.

Procédures

Les animaux (adultes principalement, parfois des juvéniles) sont traités, le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle, observations ophtalmologiques, mesures de pattes, évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. Le produit administré peut cibler chaque phase du cycle de reproduction. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés à l’âge des animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage, tube de contention). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation, etc.

Choix des espèces

Bien que le rat soit l’espèce la plus fréquemment utilisée, le rat et la souris sont des espèces de choix car : - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits générés par gestation, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).

9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.

Objectifs

Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.

Bénéfices attendus

Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.

Procédures

Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.