Toxicologie et autres tests de sécurité

39 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'un antibiotique, le méropénème, puis un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque sous anesthésie, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, pour reconstituer la courbe pharmacocinétique du produit. Le porteur indique que la dose n'est pas toxique et qu'une souris montrant une douleur intense lors de la ponction serait tuée immédiatement. Il affirme que le recours à l'animal est une étape "obligatoire et réglementaire" du développement des médicaments.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine du méropénème sur une période de 5h post-injection, après deux administrations intra-péritonéales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de reconstruire la courbe pharmacocinétique du méropénème sur 24h chez la souris et ainsi d’adapter les fréquences d’administration dans un modèle de pneumonie à CRAb. En effet, la suite cette étude (qui fera l’objet d’un autre projet) sera d’évaluer l’efficacité du méropénème en association avec la rifampicine qui a déjà montré une diminution bactérienne dans les poumons de souris infectées à CRAb dans d’autres études.

Procédures

L’injection du méropénème se fera par voie intra péritonéale par du personnel expérimenté. La dose administrée est non toxique pour les animaux. Les souris seront ensuite soumises à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylazine 10mg/kg). La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par pression des voutes plantaires. Malgré tout, si l’animal présente un signe de douleur intense lors de la ponction cardiaque (ex : l’animal se recroqueville sur lui-même lors de l’injection), alors il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Après l’injection du méropénème, les animaux seront observés sur la totalité de l’étude (jusqu’à 5h). Par ailleurs, il s’agit d’une inoculation sans infection et d’une dose non toxique. Les prélèvements sanguins par ponction intracardiaque auront lieu sous anesthésie fixe de kétamine (50 mg/kg) et xylazine (10mg/kg), administrée par voie IP. La méthode de mise à mort sera appliquée par dislocation cervicale après exsanguination par une ponction cardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 5h après le début de l’expérience

Remplacement

Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante de la rifampicine chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). Or, cet antibiotique ne peut être administré en monothérapie à cause de la sélection de mutants qu’il génère. Une des dernières lignées thérapeutiques serait de l’associer à un carbapénème (ici le méropénème) pour lutter contre ces infections à CRAb. La mesure de l’efficacité de ces molécules ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses et permettre une analyse statistique robuste a été réduit à 3 par groupe grâce à l’expérience acquise lors d’études précédentes.

Raffinement

Un gros travail bibliographique a été réalisé en amont de cette étude afin de s’assurer que la dose utilisée ne soit pas toxique pour les animaux. Il s’agira d’une étude sans infection où aucune toxicité n’est attendue. De plus un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance accrue sera également réalisée pour cette étude. Des critères d’arrêts de l’étude ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris Balb/c représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Acinetobacter baumannii dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

6 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur œil est exposé à un laser d'imagerie dont la puissance dépasse d'un facteur dix la norme au niveau de la cornée, le porteur indiquant que des ulcères, des lésions ou une cataracte peuvent apparaître, puis ils sont tués pour analyse histologique des tissus oculaires. L'objet est de vérifier l'innocuité d'un dispositif développé par une entreprise avant un éventuel passage chez l'humain. Le porteur affirme que ce test doit "obligatoirement" être mené in vivo, aucun modèle ex vivo ne pouvant reproduire l'œil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) permettant d'effectuer des images proches de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer l'innocuité sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin)comme la constipation (absence de fèces), selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'œil sous sédation. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois : à J0 (x2 + imagerie avec la nouvelle technique d'OCT), J2 et J7 pour le groupe 1 ou J0 préop post, J2 et J21 pour le groupe 2. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT (docking + imagerie) durera 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 0.82 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35).Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'imagerie indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (séfdation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentative de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

99 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pour développer une stéatohépatite non alcoolique, avec une administration orale quotidienne et des prélèvements sanguins étalés, avant des prélèvements d'organes post mortem. Le porteur décrit une étude menée pour un client afin de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un composé. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et les troubles métaboliques.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée 2 fois par semaine de D-21 à D-1 - une pesée 3 fois par semaine à partir de D1 - une administration orale quotidienne à partir de D-7 - un prélèvement sanguin à la queue à D1, D29 et D57 - un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale à D-7, D29 et D57

Impact sur les animaux

L'allopécie peut survenir dans ce modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Elle semblerait être un conséquence phénotypique de cette maladie métabolique. Du moment que la peau a un aspect normal et est intact de toute lésion, aucun traitement n'est requis. Les souris peuvent être utilisé en expérimentation. Les prélèvements à D-7, D29 et D57 (7.5% du volume sanguin total) sont assez espacés dans le temps afin de permettre aux animaux de récupérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages en groupe, de par le caractère social de l'espèce. Les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

18 404 animaux non-humains, dont 13 048 rats, 2 780 souris et 2 576 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un produit par gavage quotidien pendant jusqu'à seize semaines, les femelles subissent des lavages vaginaux répétés et une partie des animaux a été ovariectomisée ou castrée, pour évaluer la toxicité de produits sur la reproduction selon des lignes directrices réglementaires. Le porteur indique que le produit testé peut altérer l'accouplement, la gestation, la mise bas et le développement des descendants, et que la nature des nuisances dépend de chaque substance. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces essais et les présente comme "indispensables" à la mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet doit permettre l’évaluation de la toxicité d’un produit chez le rongeur et le lagomorphe sur les fonctions de reproduction notamment, et/ou sur la santé, conformément aux lignes directrices : - ICH M3 (R2), S5 (R2). - OCDE 421 et/ ou 422. - OCDE 440 et/ou 441. Les procédures peuvent être indispensables pour une mise sur le marché ou un enregistrement de produit, et permettre la sélection de doses pour des études postérieures. Les études de cette procédure permettent aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition en fournissant des informations sur les effets toxiques majeurs (détermination d’une dose sans effet adverse, d’une marge de sécurité pour l’utilisation/exposition humaine).

Bénéfices attendus

Ces études permettent d’intégrer globalement l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce). En effet, à ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais des études in vivo restent indispensables pour une évaluation complète de l’exposition maternelle à certains produits. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441 correspondent au Niveau 3 de test de screening in vivo dans le contexte du « Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens » (GD 150 (OCDE, 2018)) et ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires dans le contexte de la démarche et dans la suite des tests précédents, comme test de screening essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien.

Procédures

Les animaux sont traités le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière (jusqu’à 16 semaines, mais dépend du type d’étude), avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux (jusqu’à 5 semaines). Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle (jusqu’à positivité du test), observations ophtalmologiques (en général 1 occasion par étude), mesures de pattes (1 à 2 fois par semaine jusque l’âge adulte), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels, en général 1 occasion par étude). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur. Chaque technique (administration par voie orale, réalisation d’un frottis vaginal, examen ophtalmologique, mesure de la longueur de la pattes, évaluation du comportement) dure moins d’une minute par paramètre par animal. Les animaux utilisés dans le cadre des OCDE 440/441 pourront avoir fait l’objet d’une chirurgie (femelles ovariectomisées ou mâles castrés), tel que demandé par les lignes directrices. Cette chirurgie aura été réalisée chez le fournisseur d’animaux, selon autorisation du fournisseur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, des difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, des altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. La toxicité du produit administré peut cibler chaque phase. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ces types de procédure en raison de la complexité que représente un organisme vivant et celle des processus de développement des concepti et des échanges dynamiques entre mère et descendance. Ces études in vivo, ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires au cours de cette démarche et dans la suite des évaluations et tests précédents. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441, font partie d’une batterie d’essais in vitro et in vivo permettant d'identifier les substances susceptibles d’interagir avec le système endocrinien, et, à terme, d’évaluer les risques et les dangers pour la santé humaine ou l’environnement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est en moyenne de 20 par sexe afin d'obtenir au moins 16 portées par groupe permettant d'avoir des résultats cohérents. Au-dessus de 20-24, il n'y a pas d'amélioration de la cohérence et de la précision des résultats. Ce nombre de portées par groupe (entre 16 et 20-24) est recommandé par la ligne directrice ICH. Le nombre d’animaux par groupe est lui aussi celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état de santé des animaux est contrôlé tous les jours et évalué par rapport à des points limites définis de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e). Si nécessaire, un vétérinaire peut intervenir, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable (i.e., en conformité avec la réglementation en vigueur). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. En cas de plaie et/ou douleur, possibilités de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les lagomorphes ou rongeurs, notamment le rat, sont les espèces de choix car : - recommandées par les lignes directrices et pertinentes pour atteindre les objectifs des études, - présentent notamment une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de descendants par portée, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rat, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - font l’objet de données historiques robustes, - l'utérus des rattes est considéré (notamment par les lignes de l'OCDE 440) comme un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et des antagonistes des œstrogènes, puisque les tissus utérins répondent par une croissance rapide et vigoureuse à la stimulation par les œstrogènes, - l’emploi de rats castrés et des cinq tissus sexuels cibles est jugé pertinent par les lignes directrices de l'OCDE 441 pour le dépistage in vivo d’agonistes et d’antagonistes des androgènes et d’inhibiteurs de 5α-réductase. Le produit sera administré à des animaux juvéniles ou adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement), car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements et doivent correspondre aux âges requis par les lignes directrices. Dans les OCDE 440/441 : conformément aux exigences des lignes directrices associées, le produit pourra être administré à des animaux ayant subis une chirurgie (femelles ovariectomisées ou males castrés), car l’activité endocrine endogène des animaux doit être réduite au minimum afin de pouvoir évaluer l’effet du produit seul. Les petits qui naissent dans le cadre de certaines études (OCDE 421/422), seront gardés pendant une partie de la lactation (selon les lignes directrices ; observation du développement des petits pendant les premières périodes de vie).