Toxicologie et autres tests de sécurité

4 200 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et environ 200 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un candidat médicament par différentes voies, parfois sous chirurgie, puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des ponctions de liquide céphalorachidien, pour mesurer la pharmacocinétique de molécules en développement. Le porteur indique que les effets indésirables des produits ne sont pas prévisibles au départ et seront gérés au cas par cas. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico n'existent pas ou ne suffisent pas, sans autre justification.

Objectifs

Chaque étude de ce projet a pour objectif principal d’étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez la souris, lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule (pharmacocinétique). Pour cela, au cours de chaque étude, des prélèvements sanguins répétés et/ou un prélèvement de liquide céphalorachidien (LCR) sont réalisés chez l’animal vigile ou transitoirement anesthésié après l’administration par différentes voies du candidat-médicament comparé ou non à une autre molécule. Ces prélèvements sont utilisés pour mesurer dans le temps la concentration du candidat médicament administré et éventuellement la concentration de différents autres marqueurs biologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (quelques secondes à 1-2 min), sous anesthésie (1 à 5 min) ou au cours d’une chirurgie (10 à 30 min). L’administration du candidat-médicament nécessitant une chirurgie ne sera réalisée qu’une seule fois. Les autres voies pourront être utilisées plusieurs fois en suivant les recommandations éthiques. Puis, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins répétés et/ou de LCR (Liquide Céphalo Rachidien). Concernant les prélèvements, les volumes prélevés, la fréquence de prélèvement et les temps de récupération suivent les recommandations éthiques. En général, la durée du prélèvement sanguin (contention et prélèvement) n’excède pas 2 min.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Dans ce projet, les administrations nécessitant une chirurgie est composée d'un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d'un suivi post-opératoire adapté, ce qui permet de limiter au maximum l'impact négatif sur l'animal. Après récupération, les animaux seront maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Les animaux seront généralement mis à mort à la suite de l’étude pour la réalisation de prélèvements terminaux (sang, tissus). En l’absence de prélèvements terminaux, certains animaux pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée, si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés et après l’avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique qui sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : - le recours à des procédures les moins invasives possibles - le suivi d’éventuel signes cliniques - la recherche des points limites - le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire - la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse .

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’étude de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir du produit testé lorsque ces rongeurs sont utilisés au cours du développement préclinique de ce produit. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

840 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection d'azoxyméthane pour déclencher une cancérogénèse colorectale, puis les animaux ingèrent des additifs alimentaires et passent trois jours isolés en cage à métabolisme individuelle. Le porteur indique qu'aucune étude in vitro n'évalue les effets d'additifs sur le métabolisme et le microbiote d'un "organisme entier", et affirme que les agences de sécurité des aliments ont "besoin" de ces résultats. L'objet reste de tester des additifs déjà autorisés dans l'alimentation humaine.

Objectifs

Des données récentes de la littérature suggèrent que certains additifs alimentaires, retrouvés surtout dans les aliments ultra-transformés pourraient être reliés à des risques associés de cancers. Le but de ce présent projet consiste à analyser certains de ces additifs. Les résultats obtenus avec un seul additif, testé à plusieurs concentrations, sur plusieurs matrices (alimentation, eau de boisson) et sur l'initiation ou la promotion du cancer colorectal, permettra de fournir de nouvelles informations afin de guider les décisions des agences de santé publique et de contribuer à la prévention des cancers.

Bénéfices attendus

Les agences nationales de sécurité des aliments ont besoin de résultats mis à jour sur des molécules alimentaires pour pouvoir établir de nouvelles recommandations nutritionnelles en termes de prévention ou d'interdiction de certains additifs. Ce même type de recherche a déjà permis d'identifier un potentiel nouveau danger pour un additif ce qui a abouti à son interdiction suite à un avis de l’EFSA en 2020.

Procédures

Aucun prélèvement invasif n'est prévu sur les animaux, seulement la récupération des urines et des fèces. En tout début de procédure, certains groupes d'animaux seront injectés avec de l'AOM (azoxyméthane), dans le but d'induire une cancérogénèse. Cette injection unique (quelques centaines de microlitres) est réalisée en moins d'une minute par rat.

Impact sur les animaux

Les additifs testés étant déjà des molécules autorisées pour l'alimentation humaine, le risque lié à leur ingestion reste mineur. Les animaux pour lesquels la cancérogénèse aura été induite chimiquement ne sont gardés que 100 jours, ce qui correspond à un délai suffisant pour qu'il y ait une initiation de la cancérogénèse mais largement insuffisant pour qu'ils développent des tumeurs douloureuses. Les animaux sont gardés 3 jours en cage à métabolisme individuelles, ce qui induit un stress lié à la taille de la cage et à l'isolation. La durée d'hébergement dans ces cages est réduite au plus strict minimum, les cages transparentes permettent un contact visuel et olfactif des animaux et une attention très particulière est portée aux animaux lors de ce passage. Enfin l'injection d'AOM qui peut entrainer un stress pour les animaux est réalisée avec des aiguilles les plus fines possibles afin de minimiser l'impact sensoreil, les animaux seront manipulés la veille pour les habituer à la contention et réduire le stress.

Devenir

A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés afin que le sang et plusieurs organes soient prélevés pour analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Des études in vitro sur des cellules ont été réalisées en amont afin d'identifier les possibles effets toxiques des additifs qui seront testés. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de composés issus de l'alimentation comme les additifs alimentaires, sur la physiologie et le métabolisme et le microbiote d'un organisme entier.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été évalué à son minimum afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables. Notre expérience sur le même type études nutritionnelles a montré qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire.

Raffinement

Le bien-être de l'animal est en permanence au centre de nos préoccupations. Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont surveillées quotidiennement, la nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum, la litière changée de manière hebdomadaire. Les rats étant des animaux sociaux, ils seront maintenus à 2 par cage (paroi transparente) pour ne pas souffrir d'isolement, leur environnement enrichi. Avant chaque intervention expérimentale, les animaux seront habitués à être manipulés.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le rat est l’animal dont la physiologie est la plus proche de la situation humaine, tant au niveau digestif que pour les processus de cancérogénèse. Pour éviter les effets hormonaux liés aux cycles des femelles, seuls les mâles seront utilisés. L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes, afin de pouvoir comparer avec nos précédentes données, il est important de ester au même stade de développement.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'une thérapie ou de cellules souches, puis des prélèvements sanguins répétés, dans des études réglementaires de biodistribution, toxicité et tumorigénicité menées pour des sponsors avant une demande d'essai clinique. Le porteur décrit des points limites incluant une perte de 20 % du poids ou une tumeur dépassant 2 000 mm³, et indique que les souris sont mises à mort par dislocation cervicale en fin d'étude. Il affirme que cette étude réglementaire sous contrôle de l'ANSM ne peut "pas, pour l'instant, être remplacée" par d'autres moyens.

Objectifs

Le projet consiste à étudier les effets de tumorigénicité, toxicologie et biodistribution d'un traitement (thérapie innovante ou cellules souches) dans le but d'obtenir l'autorisation de l'ANSM pour les essais cliniques sur des adultes ou des enfants.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ces études est de pouvoir mettre sur le marché des médicaments à usage humain qui sont soit plus efficaces que ceux existants ou qui répondent à une demande pour pallier un manque au niveau thérapeutique.

Procédures

Tatouage : une fois par étude, pour tous les animaux. Cet acte est effectué lorsque l'animal est anesthésié. Il ne dure qu'une minute. Injections : une fois par étude, pour tous les animaux. Ces injections sont pratiquées par voie veineuse (à la queue (5 minutes)) ou par voies intra-péritonéale ou intra-dermique. Les prélèvements sanguins pourront être effectués sur les animaux vigiles (région mandibulaire) ou anesthésiés par Isoflurane (sinus rétro-orbital) et n'excèdreont pas la minute. Quelle que soit l'étude, un prélèvement sera réalisé en début et en fin (au moment de la nécropsie) ; selon sa durée, trois prélèvements intermédiaires pourront être demandés par le sponsor. Pour une souris de 25 g le volume prélevé sera de 150 µl maximum.

Impact sur les animaux

Lors des tatouages, les animaux sont anesthésiés. Ils sont observés par un zootechnicien jusqu’à leur réveil complet. En cas d'apparition d'une anomalie, la surveillance de l’animal sera renforcée et une note sera mise sur la cage. Les injections de l'élément d'essais par voie intraveineuse peuvent présenter une douleur en cas d’administration à la veine caudale. Une analgésie locale type Lurocaïne sous forme de pommade, sera déposée sur le lieu d’injection. Pour les gavages et dans la mesure du possible et pour diminuer toute irritabilité, l'élément d'essais sera dilué dans une substance "gélifiante". Plusieurs prélèvements seront nécessaires au cours de l’étude et les volumes seront adaptés selon leur fréquence et selon la stature de l'animal. Ils s’effectueront par voie mandibulaire ce qui ne nécessite pas d’anesthésie, en alternant côtés gauche/droit. S’il est besoin de faire des analyses d’urines parfois demandées pour les études de toxicité, les animaux seront mis durant 24 heures dans une pièce dédiée et calme, dans des cages métaboliques permettant la séparation de l’urine et des fèces. Les souris garderont le contact visuel avec leurs congénères.

Devenir

Après le tatouage les animaux sont remis dans leur cage, avec leurs odeurs et le même groupe social. Après les injections et les prélèvements, dans le cas de petits saignements, nous nettoyons le site du prélèvement ou de l'injection pour qu'il ne reste aucune trace de sang qui pourrait stresser les autres animaux de la cage. Ensuite les animaux sont remis dans leur cage dans les mêmes conditions que pour le tatouage. A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort. Les méthodes de mises à mort sont soit par dislocation cervicale soit, les animaux sont préalablement anesthésiés pour récupération du sang total suivi d'une dislocation cervicale.

Remplacement

Une étude BPL est la dernière étude menée sur les animaux avant de passer à la phase clinique du développement d'un médicament. Cette étude est règlementaire. Elle est menée sous la surveillance de l'Agence Nationale du Médicament et des produits de santé (ANSM). Elle ne peut pas, pour l'instant, être remplacée par d'autres moyens. Par contre, avant de mettre en oeuvre cette étude, des tests in vitro ont été menés.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans une étude BPL est le nombre minimum nécessaire pour avoir des statistiques sûres et quelques animaux de plus pour remplacer ceux qui risquent de décéder durant l'étude. Cela nous permet de pouvoir mener et suivre l'étude jusqu'à son terme et de pouvoir retirer une conclusion sur la nocivité du produit étudié dans un rapport envoyé aux autorités. Le nombre prévu ne peut pas être réduit aux risques de devoir commander à nouveau la totalité des animaux. Par contre, le savoir faire des zootechniciens, qui est contrôlé par plusieurs acteurs, nous permet de limiter au maximum ce nombre d'animaux.

Raffinement

out au long de leur vie au sein de l'Etablissement hébergeant les animaux, une surveillance est mise en place. Chaque animal est suivi et tracé via un logiciel. Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées avec l'eau et l'aliment ad libitum. A minima, de l'essui-tout et du sizzle-net est mis dans la cage pour que les souris puissent nidifier. Les animaux ne sont séparés qu'en cas de stress ou de blessures ou pour prélèvement d'urines. Sinon, ils sont gardés dans leur groupe social. En cas de bagarre, nous rajoutons de l'enrichissement comme des igloos, des bâtonnets de bois à ronger ou des carrés de coton. Les points limites mis en place sont les suivants : rostration, poil hérissé, perte de poids correspondant à au moins 20% de poids des animaux contrôles, infection ou ulcération et taille de la tumeur excédant 2000 mm3. Des analgésiques de surface de type Lurocaïne seront utilisés lors des injections via la veine caudale. L'anesthésie à l’isoflurane sera pratiquée pour les prélèvements et injections via le sinus rétro-orbitaire ou lors des tatouages.Tout le personnel intervenant sur ces animaux a reçu une formation théorique diplômante, est formé sur le terrain via un système de compagnonnage et est audité avant de pratiquer un geste sur l'animal dans le cadre de ces études. Lors des analyses hématologiques ou biochimiques le volume des prélèvements est réduit au minimum par l'utilisation d'automates développés pour l'application chez les rongeurs.

Choix des espèces

Nous utilisons des rongeurs car ils font partie des espèces animales sur lesquelles les éléments d'essais doivent être testés dans le cadre d'études non cliniques règlementaires. Les études se feront sur des animaux sevrés, âgés de 1 jusqu'à 18 mois. 1 mois pour "mimer" une étude clinique réalisée chez les enfants et 18 mois dans le cadre de médicaments développés en gériatrie.

Tués puis autopsiés à la fin de la procédure, pour évaluer en histopathologie l'impact de la chirurgie et des ponctions, 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie d'environ 1 h 30 sous anesthésie, avec intubation, pour poser un cathéter intrathécal au niveau lombaire ou de la cisterna magna, puis des injections et des prélèvements de liquide céphalo-rachidien réalisés éveillé, en siège de contention pendant 15 à 20 minutes, jusqu'à huit prélèvements en 24 heures. Le porteur reconnaît que ces actes "peuvent engendrer des atteintes neurocomportementales et de la douleur" et présente le projet comme la validation d'une technique destinée aux études réglementaires de toxicologie. Il décrit pourtant ces ponctions sur primate éveillé comme réalisées "avec un minimum d'impact sur les animaux", l'absence d'anesthésie faisant partie de son argument.

Objectifs

L’objectif du projet est le développement et la validation du cathétérisme intrathécal (lombaire et cisterna magna) pour l’administration de candidat médicament chez le primate non-humain. Ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires dans le cadre de l’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques utilisant des stratégies thérapeutiques innovantes du système nerveux centrale qui seront injectés par voie intrathécale chez l’homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle de cathétérisme intrathécal chez le primate non-humain va permettre le développement d’études de toxicologie reglémentaires qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intrathécale chez l’homme). Le cathétérisme va permettre de réaliser des administrations et/ou prélèvements de LCR (liquide céphalo-rachidien) répétés avec un minimum d’impact sur les animaux (pas d’anesthésie car les animaux seront vigiles et la contention physique minimale). De plus, de part le nombre de prélèvements de LCR possible par animaux (maximum 8 prélèvements en 24h), le modèle de cathétérisme permettra de minimiser le nombre d’animaux par groupe nécessaire à l’évaluation de la sécurité du médicament et de son profil toxicocinétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie de mise en place d’un cathéter intrathécal sous anesthésie volatile (après intubation endotrachéale), avec surveillance anesthésique, fluidothérapie et analgésie périopératoires. La durée estimée de la chirurgie est 1H30 environ. Les administrations intrathécales et les prélèvements de LCR seront réalisés sur animal vigile en utilisant un siège à contention adapté, afin de maintenir de bonnes conditions d’asepsie de la peau en regard du port d’accès. La contention sur siège sera d’environ 15-20 min.La procédure chirurgicale et les administrations/prélèvements de LCR peuvent engendrer des atteintes neurocomportementales et de la douleur chez les animaux. Par conséquent, une analgésie préventive, des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale et les administrations/prélèvements de LCR peuvent engendrer des atteintes neurocomportementales et de la douleur ches les animaux. Par conséquent, une analgésie préventive, des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront autopsiés à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure chirurgicale et des administrations/prélèvements de LCR d’un point de vue histopathologique. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animal permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité (notamment systémique et neurocomportementale) des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapie innovante, tel que la thérapie génique. Le macaque cynomolgus est un modèle animal phylogénétiquement proche de l'Homme et avec de grande similitude permettant le développement de candidats-médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie. L’utilisation de ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires permettant de démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis dans les études reglementaires de toxicologie. 3 animaux par type de procédure chirurgicale (implantation du cathéter en zone lombaire ou cisterna magna) correspondent au nombre minimum avec le meilleur compromis entre pertinence scientifique et puissance statistique dans les études de toxicologie, et est suffisant pour la validation du modèle.

Raffinement

Des points limites basés sur le comportement, l’état clinique et la perte de poids sont décrits dans des procédures interne et présentés dans la section point limites de ce projet (section 4.2). Dans le cadre de développement de la technique chirurgicale, un suivi postopératoire sera réalisé (observation clinique et du site d’implantation de manière quotidienne) et des analgésiques sont administrés en per et postopératoire. L’implantation du cathéter sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique et fluidothérapie. En raison du potentiel impact des procédures, une évaluation neurocomportementale sera réalisée à deux occasions après chaque adminisration ou prélèvement de LCR.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est un modèle animal phylogénétiquement proche de l'Homme et présente une grande similitude avec l'Homme permettant le développement de candidats-médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie. Or, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine du système nerveux central (SNC) nécessite l’utilisation de voie d’administration spécifique tel que la voie intrathécale. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques actuelles du SNC nécessite une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation de modèle alternatif non-rongeur (tel que porc et le chien) est innapropriée. La validation du modèle de cathétérisme intrathécal chez le primate non-humain est donc justifié car il permettra l’évaluation préclinique de nouvelle stratégie thérapeutique pour le SNC. Animaux jeunes adultes/adultes mis à disposition par l’établissement utilisateur et représentatifs du stade de développement des animaux utilisés dans des expérimentations ultérieures.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.

60 souris génétiquement modifiées, rendues obèses et diabétiques, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules pendant 78 jours, elles reçoivent un régime gras, un gavage quotidien pendant huit semaines, des mises à jeun répétées et des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, avant une ponction cardiaque terminale, pour évaluer un composé anti-obésité pour le compte d’un laboratoire client. Le porteur situe la finalité du côté d’un dossier d’autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu’aucune méthode de substitution ne permet d’étudier l’effet d’un composé sur le poids et le métabolisme et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ce composé induit une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris génétiquement modifiées obèses et diabétiques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée trois fois par semaine sur une durée de 11 semaines - une administration orale quotidienne pendant 8 semaines - une mise à jeun de 4h pour un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale (2 fois ; durée du prélèvement : 1-2 min) - une analyse de la composition corporelle de l'animal vigile (3 fois ; durée de la mesure : 1-2 min). - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) (1 fois ; durée totale de l’OGTT : 16h) [Mise à jeun pendant 12-14h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Administration orale (durée : 1 min)] - un test de tolérance à l'insuline (ITT) (1 fois ; durée totale de l’ITT : 8h) [Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Injection intrapéritonéale (durée : 1 min)]

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés individuellement sur l’ensemble de l’étude (78 jours). De par leur caractère social, ce type d’hébergement les prive de leur liberté d’expression d’un comportement normal de leur espèce. Le régime alimentaire riche en gras (71 jours) et l’obésité induite peuvent conduire à un inconfort sur les animaux. Les interventions ci-après peuvent constituer une source de stress sur l’animal. Le poids corporel [1 min] sera mesuré sur l’ensemble de l’étude, deux fois par semaine. De J22 à J28, l’ensemble des animaux recevront quotidiennement une administration orale [1 min] de véhicule afin de les habituer à cette voie d’administration. A J26, J50 et J70, une mesure de la composition corporelle sera mesurée sur animal vigile (durée de la mesure : 1-2min). A J26 et J50, à l’issue de l’analyse, les souris seront mises à jeun (atteinte à l’absence de faim) pendant 4h, et auront un prélèvement sanguin [5 min] pour mesurer leur glycémie et récupérer du plasma. A partir de J29, les animaux recevront une administration quotidienne [1-2 min] per os de leur composé d'intérêt ; ceci impliquerait potentiellement une perte de poids. A J58, les animaux seront mis à jeun toute la nuit (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance au glucose [2h30] sera réalisée. Ceci consiste à mesurer la glycémie 30 min avant, et immédiatement avant (0 min) administration per os du glucose [1 min] puis 5 min, 20 min, 60 min, 90 min et 120 min après administration du glucose. Du plasma sera également récupéré pour mesurer l’insulinémie sera mesurée immédiatement avant (0 min) puis 20 et 60 minutes après administration du glucose. A J65, les animaux seront mis à jeun 6h (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance à l’insuline sera réalisé [2h]. Ceci consiste à mesurer la glycémie immédiatement avant (0min) l'injection intrapéritonéale d'insuline [1 min] puis 15, 30, 45, 60 et 120min après administration de l'insuline. A J71, les souris seront mises à jeun pendant 4h (atteinte à l’absence de faim), pour mesurer leur glycémie [1min]. Après une anesthésie à l'aide d'un mélange kétamine/xylazine pouvant créer un inconfort, un prélèvement par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal. Ainsi, la durée de l’anesthésie avant sacrifice durera environ 15min.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements post-mortem sont nécessaires à l'étude afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques sur les tissus.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, test de tolérance au glucose par voie orale, test de tolérance à l’insuline, poids des différents organes, analyses sur plasma.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dôme en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. A la fin du protocole, après une anesthésie à l'aide d'un mélange d'anesthésique/analgésique, un prélèvement sanguin par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.

2040 rongeurs, 1440 souris et 600 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intoxication au paracétamol leur est provoquée pour léser le foie, puis ils reçoivent un candidat médicament et jusqu'à cinq prélèvements de sang en une journée, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de tester des traitements de l'insuffisance hépatique aiguë. Le porteur affirme que ces lésions du foie ne sont pas douloureuses et décrit une baisse d'activité et de température pendant au moins vingt-quatre heures. Il indique qu'aucune méthode de substitution ne modélise cette atteinte multi-organes et que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain.

Objectifs

L’intoxication au paracétamol est la première cause d’insuffisance hépatique aigue (IHA) dans les pays industrialisés. Elle se traduit par une attaque brusque et massive du foie chez les patients. Il s’agit de situations d’urgence qui peuvent nécessiter une transplantation du foie dans les plus brefs délais. Le paracétamol est un composé chimique utilisé comme antalgique (anti-douleur) et antipyrétique (anti-fièvre), qui figure parmi les médicaments les plus utilisés et prescrits au monde. En cas de surdose, le paracétamol provoque une sévère toxicité pour le foie par la production d’une molécule toxique pouvant entrainer la mort des cellules du foie et donc une insuffisance hépatique aïgue (IHA). Aucun traitement efficace n'est actuellement disponible. Le but de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l'intoxication au paracétamol. Ainsi, la capacité de candidats médicaments à stopper ou ralentir l'atteinte du foie et/ou à favoriser sa guérison sera évaluée. Pour cela, le modèle d’hépatite induite par une exposition aigue au paracétamol chez le rongeur (souris et rat) sera utilisé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter l'insuffisance hépatique aïgue due une intoxication au paracétamol pour laquelle il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales à ce jour.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : -Une administration d'acetaminophène (APAP) à dose contrôlée par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou orale (1 fois/animal) -Une administration du candidat médicament en une ou plusieurs administrations (1 fois /animal) -Une série de prélèvement de sang (maximum 5 prélèvements /24h) en respectant les recommandations du NC3R’s pour les volumes. -La mise à mort avec ou sans anesthésie préalable en fonction des prélèvements terminaux à effectuer. Ces interventions auront toutes une durée maximum de 2 min.

Impact sur les animaux

L'administration d'APAP entraine des lésions du foie chez l'animal. Ces lésions du foie ne sont pas douloureuses (pas de signes de douleur chez l'animal et documenté chez l'Homme). Une hypoactivité associée à une hypothermie pourra être observée dans les 2h suivant l'administration d'APAP et se poursuivre pendant au moins 24h. Ces signes cliniques sont la conséquence des effets antipyrétique (anti-fièvre) et analgésique (anti-douleur) de l'APAP. Les candidats médicaments qui seront testés devraient théoriquement améliorer l'état de santé des animaux. Toutefois, les effets potentiellement indésirables du/des candidats médicament font l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'hépatite aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette pathologie est un processus complexe faisant intervenir différents organes de l'organisme et n'est donc pas modélisable in vitro ou in silico. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 7-12 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi régulier de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rongeur (souris et rat) est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur l'insuffisance hépatique aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette espèce permet en effet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de candidats médicaments sur la prévention et/ou la thérapie de la pathologie. Les études sont réalisées sur des animaux adultes car elles nécessitent des animaux avec une fonction hépatique normale (mature) et ont pour but de traiter une pathologie qui affecte surtout des adultes.