Toxicologie et autres tests de sécurité

8 800 souris vont être utilisées sur quatre ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées et 200 réutilisées dans d'autres projets. On remplace leurs cellules hépatiques par des cellules humaines pour tester des candidats médicaments, après des injections détruisant leurs propres hépatocytes. Le porteur présente ce modèle comme plus acceptable que le recours aux primates non-humains. Il reconnaît n'avoir mené aucun calcul statistique, l'effectif reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur un plan commercial de croissance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Le protocole dépend du candidat médicament et de la durée de traitement demandée, dix substances devant être évaluées sur cinq ans. 80 chiens adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est anesthésié une à deux heures pour l'implantation chirurgicale d'un cathéter intraduodénal relié à une chambre sous-cutanée ou la pose d'une sonde nasogastrique, puis subit jusqu'à douze prélèvements sanguins en 24 heures et des administrations répétées pendant des jours ou des semaines, avec un hébergement en box individuel estimé à deux semaines. Le porteur retient le chien pour son anatomie digestive proche de celle de l'humain et pour sa taille, qui autorise des cathéters permanents et des prises de sang répétées, et prévoit de réutiliser ces animaux après accord du vétérinaire.

Objectifs

L’administration intraduodénale est une méthode permettant d’administrer une substance directement dans la première portion de l’intestin grêle, en contournant la dégradation gastrique. Cette voie est utilisée en pharmacologie expérimentale, en nutrition entérale, et dans certains protocoles thérapeutiques vétérinaires. Cependant, les techniques d’accès au duodénum (utilisation temporaire d’une sonde nasoduodénale ou pose d’un cathéter à demeure) présentent des variations méthodologiques importantes, souvent non standardisées. Le présent projet vise à décrire la mise en oeuvre de deux approches pour réaliser les administrations intraduodénales. Même si les 2 approches permettent la réalisation de plusieurs administrations duodénales chez le même animal, la première approche (sonde naso-gastrique) est d'avantage envisagée dans le cas d'études nécessitant des traitements répétés de courte durée (probablement 2 semaines maximum). La seconde approche (cathéter intraduodénal relié à une chambre sous cutanée de type Access port) est d'avantage envisagée pour des taritements répétés chroniques (au delà de 2 semaines). L'obectif de ce projet est donc double. Il permettra de déterminer la faisabilité technique, la stabilité post-opératoire, la tolérance clinique, la reproductibilité et la sécurité des administrations. Ce projet permettra également d'étudier la pharmacocinétique de 10 substances d'essais évalulées, sur 5 ans, dans chacune des deux techniques.

Bénéfices attendus

La voie intra-duodénale permet aux éléments testés de contourner l'estomac et de les diriger vers l'intestin grêle, afin d’éviter l’inactivation du candidat médicament par l'acidité gastrique, le retard d’absorption, et les interactions avec le contenu gastrique. Cette voie d’administration est ainsi couramment utilisée lors d’études de pharmacocinétiques (absorption intestinale pure), pour l’administration de nutriments ou médicaments sensibles à l’acidité gastrique et l’évaluation de l’effet de substances sur la muqueuse intestinale. Ce projet pemettra d'établir les profils pharmacocinétiques de candidats médicaments. Ce projet nous fournira également des données expérimentales permettant de définir et de choisir, en fonction du candidat médicament et de la durée du traitement, la meilleure approche pour assurer les administration intra-duodénales chez le chien. De plus, le projet contribuera à diminuer la douleur et le stress des animaux dans les futurs protocoles et des essais répétés et d’optimiser les conceptions expérimentales futures. Ce projet contribuera également à l'amélioration du bien-être animal grâce à l’optimisation des soins anesthésiques, antalgiques et postopératoires.

Procédures

Les animaux seront anesthésié (généralement entre 1 et 2 heures) et subiront une intervention chirurgicale afin de placer un dispositif permettant de délivrer des candidats médicaments dans le duodénum. Après réveil et une période de récupération (de 2 à 7 jours selon la technique utilisée), des prélèvements sanguins veineux seront réalisés après administration de la substance à évaluer (12 prélèvements maximum sur 24 heures; volume et fréquence adaptés à l'espèce) elon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes. Les administrations intraduodenales sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration devrait être inférieure à une minute. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité des substances testées. Pour que les animaux soient au calme pendant la phase de réveil post-chirurgicale, de faciliter les soins et protéger le dispositif d'administration, ils seront hébergés en box individuel (estimation 2 semaines maximum). Un enrichissement sera mis en place et les animaux seront hénergés à proximité de congénères (maintien visuel, olfactif et auditif avec les congénères).

Impact sur les animaux

La phase de chirurgie sous anesthésie (et mise à disposition de ration journalière de nourriture après le réveil), la phase de réveil post-chirurgicale, l'hébergement individuel (estimée à 2 semianes maximum), les administrations ou les prélèvements sanguins (sous contention légère) peuvent entrainer un stress ou une douleur légère.

Devenir

Les animaux pourront être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire) afin d'évaluer la tolérance locale des candidats médicaments. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer la pharmacocinétique et les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-concentration/effet (si plusieures doses sont testées). Dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la ou des substances testées), plusieurs doses d'une même substance (ou de substances différentes), ainsi qu'un contrôle négative et/ou positif (si nécessaire) peuvent être testés chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans le cas des études de pharmacocinétique, un groupe de traitement comprend classiquement entre 3 et 6 animaux (nombre basé sur les standard des études de pharmacocinétiques).

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. De plus, suite à la phase de chirurgie, un formulaire interne spécifique à l’espèce sera complété. Il intègre une évaluation de l’appétit, du poids, de l’attitude, de l’activité, et du comportement général de l’animal, ainsi que l’évaluation du comportement vis-à-vis de la zone de chirurgie et de la réaction lors de la palpation de la zone de chirurgie. Ce formulaire d’évaluation de la douleur permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. litière, plateformes, bacs de repos, jouets et musique, présence de congénères...). Pour les phases chirurgicales, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- et post-opératoires complets. Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de vérifier et adapter (si nécessaire) la catégorie éthique et les méthodes de raffinement.

Choix des espèces

Le chien présente une anatomie gastro-intestinale (taille, pH intestinal, motricité) et un temps de transit plus proches de l'humain que ceux des petits rongeurs, facilitant ainsi l'extrapolation des résultats. La taille du chien permet également la pose de cathéters intraduodénales permanents ainsi que des prélèvements sanguins répétés (sans saignées excessives) afin d'établir une courbe pharmacocinétique complète. Chiens adultes, conformément à la littérature scientifique et aux pratiques dans les études de pharmacocinétiques.

Choisis parce qu'ils sont l'espèce cible du médicament testé, 240 bovins, 240 cochons, 96 chèvres et 96 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir le produit deux fois par jour pendant sept jours et subir jusqu'à 40 prélèvements sanguins, auxquels s'ajoutent jusqu'à 14 prélèvements de fèces effectués dans le rectum ou à l'anus après stimulation. L'objet reste réglementaire : constituer le dossier d'autorisation de mise sur le marché de médicaments vétérinaires, génériques compris. Le porteur indique que les animaux jugés en bon état après un produit déjà autorisé retourneront au circuit d'élevage ou seront réutilisés ailleurs, que ceux ayant reçu un produit sans autorisation pourront être adoptés sous engagement de ne pas les abattre pour la consommation, et que les autres seront tués.

Objectifs

Les études pharmacocinétiques réalisées chez l'espèce cible du produit à tester permettent de caractériser l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion du ou des principes actifs du produit testé. Ces études sont particulièrement utiles pour établir le régime d'administration (voie d'administration, dose, fréquence et nombre d'administrations, etc.) et à l'adapter à certains paramètres de la population (par exemple l'âge, le stade physiologique ou la maladie). Les études de bioéquivalence ont pour objectif d’obtenir des paramètres pharmacocinétiques permettant la comparaison de les concentrations plasmatiques du ou des principes actifs entre formulations et/ou entre voies d’administration. Lorsqu'il est démontré que le produit testé et le produit de référence sont équivalents sur le plan pharmaceutique et bioéquivalents, ils peuvent être considérés comme équivalents sur le plan thérapeutique. Les études de bioéquivalence sont requises au dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) des médicaments génériques afin de permettre le rapprochement des données de sécurité et d’efficacité associées à un médicament vétérinaire de référence.

Bénéfices attendus

Les études pharmacocinétiques réalisées chez l'espèce cible sont en règle générale nécessaires au dossier d'AMM des médicaments vétérinaires. L'étude des concentrations plasmatiques permet de déterminer les conditions d'utilisation du produit (doses, fréquence et durée du traitement) chez chaque espèce cible afin d'utiliser les médicaments avec un maximum d'efficacité et de sécurité. Par ailleurs, les études de bioéquivalence permettent de limiter l'utilisation d'animaux puisque les essais de sécurité et d'efficacité ne sont plus nécessaires au dossier d'AMM lorsque le médicament générique a prouvé sa bioéquivalence avec le princeps.

Procédures

Les études de pharmacocinétique et de bioéquivalence impliquent d'administrer à l'animal le produit à tester et/ou un produit de référence. La contention de l'animal sera adaptée à l'espèce et à la voie d'administration. L'administration du produit est réalisée sur animal vigile maintenu en contention. Le nombre maximal d'administrations est de 2 par jour, pouvant se répéter sur un maximum de 7 jours. Les prélèvements de sang et de fèces sont effectués sur animal vigile avec une contention adaptée. Le nombre maximal de prélèvements sanguins sur un même animal est fixé à 40. Les prélèvements de fèces peuvent être répétés jusqu’à 2 fois par jour avec un maximum de 14 prélèvements sur la durée de l'étude. Les prélèvements de lait sont effectués sur le lait collecté lors de la traite quotidienne. Dans la majorité des cas, les prises de sang sont effectuées dans une salle séparée des salles d'hébergement. Quelle que soit l'espèce, la durée de la contention pour l'administration de produits est d'environ 30 secondes, et entre 30 et 60 secondes pour une prise de sang ou une collecte de fèces.

Impact sur les animaux

La seule souffrance attendue correspond à l'administration du produit d'étude et aux prélèvements de sang effectués à intervalles réguliers sur les animaux. La souffrance attendue dépendra du nombre de prélèvements, de leur fréquence, du volume collecté, de l'espèce et du stade physiologique. Dans le cas de prélèvement de lait, la souffrance attendue est nulle puisque les prélèvements sont effectués lors de la traite quotidienne. Les prélèvements de fèces sont faits directement dans le rectum ou à l'anus après stimulation anale au doigt ou avec l'embout d'un thermomètre (pas de douleur attendue). La manipulation des animaux pour les pesées, l'administration des traitements, les prises de sang ou de fecès peuvent induire un stress. La durée de la contention pour les administrations, les prises de sang ou la collecte de feces ou de lait est de moins d'une minute.

Devenir

- Les animaux ayant reçu un produit avec AMM chez l'espèce à la posologie prévue par le fabricant et jugés en bon état général à la fin de la procédure expérimentale par un vétérinaire seront gardés en vie. Ils pourront retourner sur le circuit d'élevage ou éventuellement être réutilisés dans un autre projet. - Les animaux ayant reçus un produit sans AMM chez l'espèce, ou un produit avec AMM chez l'espèce mais à une posologie différente de celle prévue par le fabricant pourront être placés par l'intermédiaire d'une association spécialisée dans la réhabilitation des animaux de laboratoire ou adoptés par des particuliers. Dans les deux cas, le repreneur s'engage à ce que les animaux ne soient pas abattus pour la consommation. - Les animaux ne pouvant pas être replacés dans le circuit d'élevage (parce qu'ils présentent un risque sanitaire) ou ne pouvant pas être ré-utilisés ou ne pouvant pas être adoptés seront euthanasiés en fin de procédure. - Les animaux atteignant les points limites seront euthanasiés dans les plus brefs délais.

Remplacement

L'utilisation de modèles in-vitro, ex-vivo ou de simulations informatiques ne permet pas de répondre aux objectifs du projet. En effet, l'évaluation de la pharmacocinétique ou de la bioéquivalence d'un médicament ne peut être évaluée qu'après administration de celui-ci à des animaux vivants. L'absorption, la distribution, la métabolisation et l'excrétion sont des processus complexes ne pouvant pas être reproduits en globalité par des modèles ex-vivo ou informatiques. Les études de pharmacocinétique ou de bioéquivalence sont nécessaires au dossier de demande d'AMM et doivent être réalisées chez l'espèce cible correspondant aux indications thérapeutiques du produit à tester. Il n'y a donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux est généralement fixé par le Donneur d'ordre de l'étude en fonction des données en sa possession (études conduites chez d'autres espèces, études pilotes chez l'espèce cible ou données bibliographiques). En principe, le nombre d'animaux utilisé est calculé de telle sorte que les résultats soient interprétables, en tenant compte de la variabilité biologique individuelle. Il n'y a pas de groupe non-traité dans les études de pharmacocinétiques ou de bioéquivalence.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront adaptées aux besoins physiologiques des animaux et leur permettront d'exprimer le plus possible leur gamme normale de comportements. Sauf indications particulières dans le protocole d'étude, les animaux seront hébergés en groupe d'au moins deux individus. La contention sera réalisée par du personnel expérimenté à l'aide de matériel adapté et visera à minimiser le stress des animaux. Lorsque les conditions le permettent, les animaux seront familiarisés aux procédures expérimentales (administrations, prélèvements, pesées) en amont de l'étude et un système de récompense pourra être mis en place. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par le personnel en charge des animaux. Des points-limites adaptés ont été définis afin de limiter et de prendre en charge précocement toute souffrance.

Choix des espèces

Dans le cadre d’essais réglementaires pour la mise sur le marché de médicaments vétérinaires, l’étude doit être menée sur l’espèce cible du médicament à tester. Pour les études de pharmacocinétique, le stade de développement des animaux utilisés doit concorder avec le stade cible d’administration du produit vétérinaire selon la réglementation européenne. Si le produit est destiné à être administré à de jeunes animaux immatures, alors les animaux utilisés devront avoir un âge correspondant à l’âge minimal d’administration visé pour le produit. Sinon, les animaux utilisés sont généralement de jeunes adultes. Pour les études nécessitant des prélèvements de lait, les animaux utilisés seront des femelles en lactation.

Pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie, des maladies métaboliques ou l'insuffisance hépatique, des souris immunodéficientes reçoivent des cellules du foie humaines à la place des leurs, parfois avec des cellules souches qui leur donnent un système immunitaire humain. 8800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 étant déclarées réutilisées, notamment pour une formation interne aux gestes techniques, et les autres tuées parce qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé", selon le porteur. Chez les souris humanisées, les cellules du foie sont détruites par une mutation de leur souche et par quatre à sept injections d'un composé, avant la greffe de cellules humaines, notamment par la veine porte, puis viennent selon les protocoles l'induction de maladies, l'administration des candidats médicaments, des prises de sang et des jeûnes pouvant atteindre 6 heures d'affilée et 12 heures par semaine. Le porteur indique avoir fixé l'effectif sans approche statistique, d'après le nombre d'études des années antérieures et une croissance annuelle anticipée "en accord avec le plan commercial", en comptant sur une humanisation réussie chez la moitié environ des souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

[MODIFICATION] 4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par [MODIFICATION] l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de [MODIFICATION] 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum [MODIFICATION] sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Pour évaluer la toxicité pulmonaire de trois substances candidates à un revêtement antimicrobien autodésinfectant, 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent la substance par voie respiratoire sous anesthésie générale, trois fois en une semaine, et sont pesés et observés jusqu'à une fois par jour. Le porteur indique que ces expositions peuvent provoquer une inflammation, une perte de poids et des signes cliniques anormaux touchant la respiration et les muqueuses, et que des points limites déclencheront des mesures correctives. La mise à mort sert à ouvrir les animaux et prélever des échantillons, et le porteur annonce que les résultats pourront donner lieu à des brevets protégeant les formulations développées.

Objectifs

Le projet dans lequel est inclus cette étude vise à concevoir et développer des produits intégrant des nanoparticules biosourcées aux propriétés antimicrobiennes, efficaces contre de nombreux pathogènes, tout en garantissant la sécurité pour l’humain et l’environnement. Il s’appuie sur une évaluation des dangers et des risques, combinant des nouvelles approches méthodologiques, notamment des tests in vitro et des études in vivo en vue d’une future validation réglementaire. Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’évaluer la toxicité et la toxicocinétique de l’exposition par voie pulmonaire de trois substances candidates au développement d’un revêtement antimicrobien autodésinfectant chez le rongeur (rats).

Bénéfices attendus

Le projet dans lequel est inclus cette étude a pour objectif de développer des produits intégrant des nanoparticules biosourcées aux propriétés antimicrobiennes, efficaces contre de nombreux pathogènes, tout en garantissant la sécurité pour l’humain et l’environnement. Il s’appuie sur une évaluation des dangers et des risques, combinant des nouvelles approches méthodologiques, notamment des tests in vitro et des études in vivo en vue d’une future validation réglementaire. Cette étude permettra en particulier de caractériser les effets sur la santé liés à une exposition par voie pulmonaire à des nanoparticules candidates au développement d’un revêtement antimicrobien autodésinfectant. Les résultats du projet seront publiés dans des revues scientifiques et pourront trouver des applications à court terme, tandis que des brevets pourront être déposés pour protéger les formulations développées.

Procédures

Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Administration par voie respiratoire sous anesthésie générale (moins de 10 min par administration) : 3 fois durant 1 semaine à raison d’1 fois/jour tous les 2 à 3 jours (traitement mercredi, vendredi et lundi).

Impact sur les animaux

Administration par voie respiratoire (modérée) : stress lié à l’anesthésie, et inflammation potentiellement induite par la méthode d’administration et l’administration par voie respiratoire des substances d’essai. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront les administrations (effets habituellement relevés suite à l’application de cette méthode d’administration par voie respiratoire chez des animaux témoins de même souche, âge et sexe). Les expositions aux substances d’essai pourront également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser un examen interne, et prélever et analyser des échantillons biologiques.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité subaiguë et la toxicocinétique de nanoparticules suite à une exposition par voie pulmonaire et qui soient reconnues d’un point de vue réglementaire et scientifique. La complexité du système respiratoire, la nécessité d’une évaluation intégrée et dynamique, les propriétés spécifiques des nanoparticules, les limites actuelles des méthodes alternatives et les attentes réglementaires justifient le recours à des études in vivo. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les études d’exposition par inhalation (utilisation de rats mâles et femelles) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.

Réduction

Les modalités d’essai ont été définies compte tenu des résultats d’études antérieures in vitro réalisées dans le cadre du projet, des données toxicologiques et physico-chimiques disponibles sur les substances d’essai, et des objectifs de l’étude. Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé conformément aux recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’évaluation de la toxicité par inhalation, ainsi qu’en fonction de l’effectif nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente et robuste des données ex vivo de pathologie clinique et de toxicocinétique qui seront générées. Les groupes seront comparés par les tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution. Plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.

Raffinement

A réception des animaux au laboratoire, une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée. Ils seront hébergés à plusieurs par cage (2 ou 3 selon leur poids) par modalité d’essai pour leur socialisation. Un animal sera séparé de ses congénères en cas de lésions, d’agressivité, de respiration anormale ou de comportement anormal. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et limiter le stress des expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement. Les administrations par voie respiratoire seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront chaque administration, et jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur et des actions correctives visant à soulager les animaux ont été définis en adéquation avec les informations toxicologiques disponibles sur les substances étudiées et les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets respiratoires et systémiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques d’évaluation de la toxicité par inhalation, d’utilisation d’animaux jeunes adultes, mâles et femelles, âgés au moment du traitement de 7 à 12 semaines.

Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.