Toxicologie et autres tests de sécurité

2 688 chiens vont être utilisés pour des études réglementaires de toxicologie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit un candidat médicament de façon unique ou répétée, subit des prélèvements de sang, parfois la pose de cathéters ou d'implants enregistrant ses paramètres physiologiques, et des effets toxiques légers à modérés sont attendus. La plupart seront tués pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation, 200 réutilisés dans d'autres études, une dizaine renvoyés à l'élevage et une vingtaine placés. Ces essais sur le chien sont présentés comme une obligation réglementaire avant tout passage à l'humain.

Objectifs

La réalisation d’études de toxicologie (générale, de reproduction, juvénile, de pharmacologie de sécurité) est une obligation réglementaire avant de réaliser des essais cliniques avec un médicament à visée humaine ou pour obtenir une Autorisation de Mise sur le Marché pour les dispositifs médicaux, médicament vétérinaire ou produit chimique. Ces études consistent à administrer le candidat médicament de manière unique ou répétée, puis de réaliser des observations régulières des animaux incluant des pesées corporelles, un suivi des paramètres sanguins ou urinaires, une évaluation des fonctions respiratoires, musculaires et cardiovasculaires. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit, mais aussi de choisir ou ajuster de manière raisonnée les doses et les protocoles d’études réglementaires avant les essais chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie dans lesquelles un candidat médicament est évalué, sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales. Elles représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (d’abord sur des volontaires sains, puis sur des patients à moyen et long terme) ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique). Pour les médicaments (humains et vétérinaires) et dispositifs médicaux, ces études sont des pré-requis indispensables aux essais cliniques. Elles visent à définir la toxicité ou la tolérabilité des produits à tester et donc de rendre les essais cliniques plus sûres pour les patients ou volontaires participants à l'essai. Les résultats récoltés permettent aussi de définir le niveau de dose (marge de sécurité) pour la première administration à l’homme ou l’animal (dans le cadre de médicament vétérinaire). Ces études incluent des évaluations toxicocinétiques pour déterminer les taux d’exposition entrainant une toxicité. Ce projet permettra également d’évaluer la sécurité des molécules chimiques dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal comme demandé par la loi et par les lignes directrices Européennes. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’homme, les animaux ou les plantes et de contribuer à l’évaluation de la sécurité des produits chimiques.

Procédures

Ces études consistent en administration unique ou répétée du produit à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine). La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes, pour les administrations orales, sous-cutanée ou intraveineuse en bolus. Les administrations peuvent être faite avec échoguidage si nécéssaire. Elles peuvent parfois être plus longue pour les perfusions (de plusieurs minutes à continue). Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux (plusieurs fois par jours), pesées corporelles (généralement de 1 fois par jour à 1 fois par semaine), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires (généralement 1 à 4 fois par étude), sur le développement neurocomportemental, squelettique et des fonctions reproductives, évaluation des fonctions respiratoires et cardiovasculaires et histopathologique. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté. Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés pour examen macroscopique, pesée des organes et collecte des organes/tissus pour analyse microscopique.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter - Stress, ou inconfort lié à à l'enregistrement de certains paramètres physiologiques (ECG, BP par exemple) ou certaines administrations nécessitant le placement en hamac ou le port d’un gilet contenant une pompe ou des dispositifs d’enregistrement, ou la mise en place d'électrodes ou de brassards. Modification ponctuelle et de courte durée du cycle nycthémèral lorsque des actes d’études (prise de sang pour de la bioanalyse, par exemple) doivent se faire pendant la période nocturne - Pour des cas exceptionnels, stress, inconfort lié à la mise dans un compartiment individuel pour une durée maximum de 16 h pour recueil d’urines/fèces - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques (par exemple pression artérielle, ventriculaire, pleurale, ECG, EMG ou autres) - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie).

Devenir

En accord avec le plan d’étude, les animaux pourront être : 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examen et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retournent en zone d’hébergement hors étude suite après avis vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude qui sera conditionnée par un examen vétérinaire favorable.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux permettant de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. Il est nécessaire d’avoir accès à un modèle expérimental, tel que le chien, pouvant mimer au mieux les interactions biologiques et physiologiques complexes observés chez l’Homme. L'utilisation du chien répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Le choix du chien est fait en fonction des données de pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamiques disponibles ainsi qu’en fonction des similitudes entre l’homme et l’animal. Pour les produits à usage vétérinaire administré chez le chien, on choisira et utilisera cette espèce cible. De plus, dans ces études, un relevé des signes cliniques et un suivi des paramètres sanguins et une observation microscopiques des organes post-mortem sont requis ce qui serait impossible à faire via des méthodes alternatives. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son intégralité pour évaluer les effets du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables. Ce nombre est adapté selon le nombre de produits testés, le nombre de doses testées et de la présence ou non d’une période de réversibilité (effet à long terme). Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est réduit au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits. Le nombre d’animaux est revu par le Directeur d’étude et est mentionné dans le plan d’étude.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les chiens seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les chiens seront hébergés dans des boxes équipés de planchette de repos et ont à disposition des jouets (dont le renouvellement est effectué régulièrement). Pour se défouler, les chiens bénéficient d’un temps d’activité/exercice dans une zone dédiée plusieurs fois par semaine. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (fréquence et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux seront observés au moins 1 fois par jour (incluant les week ends et jours fériés) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques par un personnel d’étude formé et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur. En cas de signes cliniques ayant un impact sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple, euthanasie si nécessaire).

Choix des espèces

Il s’agit d’une justification réglementaire. En effet, le chien est une espèce non-rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix de cette espèce répond à des critères scientifiques précis telles que des données de pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamiques disponibles mais aussi en fonction des similitudes entre l’Homme et l’animal. De la naissance à adulte mature. En fonction du type d’étude, de la population visée (ou animaux visés si médicament vétérinaire), l’âge le plus adéquat sera choisi.

Ces études répondent à une obligation réglementaire avant le premier essai chez l'enfant: 2 708 souris transgéniques du syndrome de Sanfilippo vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent chaque semaine, pendant quatre à vingt-six semaines, un candidat médicament par voie intraveineuse, précédé d'un antihistaminique contre les réactions allergiques. Les souris porteuses de la mutation seront tuées pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation. Plus de deux mille autres, hétérozygotes ou non mutées, seront réutilisées pour entraîner le personnel aux gestes expérimentaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires non cliniques nécessaires pour permettre la première administration à l’homme du candidat médicament pour le traitement d’une maladie génétique sans traitement actuellement et touchant les jeunes enfants, la mucopolysaccharidose MPSIII de type IIIA ou syndrome de Sanfilippo. Cette maladie provoque une neurodégénérescence progressive, chez les jeunes enfants, avec complications neurologiques sévères, perte de la mobilité et de la communication et une espérance de vie réduite (adolescence ou début d’âge adulte. Ce projet sera conduit sur le modèle de souris transgénique Sgsh D31N x hTfR afin de répliquer les caractéristiques physiopathologiques de la maladie. Des études preuves de concept ont déjà été réalisées chez le laboratoire développant le candidat médicament et les résultats concluant permettent d’avancer dans les étapes suivantes de développement Les études de ce projet permettront d’avoir les données de sécurité suffisantes pour démarrer les premiers essais cliniques chez les jeunes enfantsdés l’âge de 2 ans.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance et de la sécurité du candidat médicament dans l’espèce rongeur transgénique la plus adaptée. - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez le patient dés l’âge de 2 ans avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la disponibilité pour les patients d’un médicament pour le traitement de la MPSIII ou syndrome de Sanfilippo, maladie génétique avec espérance de vie courte, très invalidante et sans traitement actuellement en dehors de traitements symptomatiques

Procédures

Ces études consistent en l’administration hebdomadaire pendant 4 à 26 semaines, du candidat médicament. L’administration est une injection bolus, donc rapide, dans la veine de la queue qui ne nécessite pas d’anesthésie préalable. Les animaux recevront une injection (courte intraveineuse ou sous cutanée) d’un antihistaminique préalablement à chaque traitement pour limiter le risque de réactions allergique. Des prélèvements de sang seront réalisés pour dosage des concentrations et recherche d’anticorps, 2 à 3 occasions par étude. Les animaux pourront subir des anesthésies de quelques minutes et réveil d’anesthésie (incoordination) lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie. Des test neuro comportementaux (incluant mais non limités aux tests d’apprentissage et mémoire, sensoriales [ex: auditif], activité locomotrice et batterie d’observations fonctionnelles [FOB]) peuvent être réalisé (durée du test de quelques minutes à 1 heure).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes: - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang (pouvant être réalisée sous anesthésie) ou lors des tests de maturation sexuelle et/ou frottis vaginaux. Des effets liés au modèle spécifique de cette souche de souris transgénique et pouvant arriver potentiellement avec l’âge, principalement neurocomportementaux, seront surveillés par les vétérinaires. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament (perte de poids, baisse d’activité, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Stress lors de changement d’environnement, confrontation à une situation inconnue et modification des conditions de luminosité (obscurité partielle ou totale avec utilisation possible d’une lumière rouge) et de température lors d’évaluations neurocomportementales. Des signes d’hypersensibilité possible notés dans les études préalables chez le sponsor et si confirmés dans les études en cours seront prises en charges par l’administration préalable systématique d’un antihistaminique.

Devenir

Les animaux homozygotes mutés seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes, de sang ou de tissus, tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles. Les animaux hétérozygotes ou Wild Types pourront être éventuellement réutilisés dans un autre projet pour la formation du personnel aux procédures expérimentales.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la toxicité de substances sur un organisme entier, ni de déterminer sa distribution et la dose sans effet adverse. Dans ces études sur les animaux adultes ou juvéniles, un relevé de poids, des signes cliniques et observation spécifique du développement d’animaux jeunes est requise par les lignes directrices en vigueur (ICH S11), ainsi que l’examen histologique complet des animaux en fin d’étude et en relation avec leur exposition dans le sang (ICH M3 (R2) et ICH S6) et dans le cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les guidelines.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des recommandations des lignes directrices en vigueur, des objectifs de l’étude, de la spécificité de la souche qui va demander 2 groupes contrôle dans les études chroniques pour obtenir une quantité de données suffisante pour l’évaluation des groupes traités (demande FDA). La possibilité de réaliser l’étude chronique 26 semaines en démarrant sur des animaux juvéniles de 3 semaines d’âge, permet d’éviter de dupliquer deux études chroniques et de limiter ainsi le nombre d’animaux dans le programme. La possibilité de livrer les animaux juvéniles homozygote sera privilégiée et le process sera validé dans l’étude préliminaire. Ceci permettra de laisser à disposition de l’éleveur les animaux hétérozygotes pour continuer leur phase d’amplification. L’option de la livraison de la portée entière ne sera utilisée qu’en cas de retard des résultats génétique, afin de ne pas perdre la portée entière. Le nombre d’animaux utilisés pourra donc être nettement réduit et l’élevage optimisé.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, mouchoirs, tunnel, …). Le traitement des animaux par voie intraveineuse engendre peu de stress ou d’inconfort et sur une durée la plus courte possible (quelques secondes). La fréquence de traitement hebdomadaire est limitée. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. Une observation minimum sera faite les jours de traitement Une information spécifique sera apportée aux techniciens et sur le modèle pathologique pour identifier les signes liés au modèle et faire un suivi adapté. Un examen vétérinaire adapté à réception des animaux et à une fréquence régulière pourra être mis en place, compte-tenu du modèle pathologique spécifique. En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. Les femelles seront hébergées socialisées. Au sevrage, les males seront hébergés isolément selon les procédures en vigueur, avec ajout de balles de bois comme enrichissement Afin de limiter les nuisances pour les animaux en cas de réaction d'hypersensibilité qui ont été reportées occasionnellement dans le laboratoire ayant effectué des études de pharmacologie, une administration préalable d'anti-histaminique pourra être réalisée . Le volume d’administration et de prélèvement de sang de cette étude se basent sur les recommandations éthiques.

Choix des espèces

Le rongeur est une espèce acceptée par les agences réglementaires. La sélection de la souche de souris transgénique du modèle exprimant le gène déficient permet d’avoir le modèle pharmacologique le plus adapté et proche de l’homme pour répondre aux objectifs d’évaluation de la sécurité. L’âge des animaux au démarrage des études permettra de couvrir le traitement des patients dès l’âge de 2 ans.

Soumis à des prises de sang répétées, à des ponctions de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie et à l'implantation chirurgicale de cathéters, 315 animaux non-humains sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré : 180 macaques à longue queue, 90 chiens et 45 cochons. Le protocole induit chez eux des états fébriles ou inflammatoires pour mesurer l'effet de candidats médicaments avant les essais chez l'humain. Le porteur classe l'ensemble des animaux en réutilisation, retour à l'élevage ou adoption, tout en indiquant que certaines études imposent des prélèvements terminaux d'organes. Il ajoute que l'adoption est rarement envisagée pour les macaques, plutôt réutilisés dans d'autres laboratoires.

Objectifs

Ce projet regroupe l’ensemble des procédures techniques (administration de substances et prélèvements de matériels biologiques) permettant aux différents axes thérapeutiques d’évaluer et de caractériser les effets pharmacologiques d'un composé chez l'animal et de les relier à leur pharmacocinétique (cinétique d’exposition au produit). Ces informations sont nécessaires pour affiner les stratégies de développement précliniques, puis cliniques chez l'Homme. Pour chaque composé étudié, ces études permettent de déterminer les modifications de biomarqueurs d’efficacité caractéristiques de la cible d’intérêt et de les associer aux expositions à chaque dose et voie d’administration du produit testé (concentrations maximales et temps d'élimination associés). Ces deux informations sont combinées grâce à des analyses de modélisation pour vérifier le potentiel des candidats médicaments, et de déterminer les meilleures doses à tester dans les études de sécurité précliniques, puis la première dose qui pourra être administrée à l'Homme (volontaire sain ou patient). Dans le souci de réduire le nombre d’animaux commandés, des animaux issus d’autres projets ou procédures pourront être utilisés dans ce projet. Ce projet devrait être utilisé pour environ 35 études supportant une quinzaine de projets scientifiques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rassembler les premières informations d’exposition des candidats médicaments après administration sur un animal. Elles permettront de justifier l’espèce non-rongeur choisie pour les tests réglementaires précliniques, la gamme de dose qui devra être considérée dans ces études et les potentiels signes cliniques à anticiper. Combinées aux indicateurs et biomarqueurs d’efficacité disponibles dans la phase préalable de pharmacologie in vitro et in vivo, les données aident à évaluer le potentiel des candidats à activer ou désactiver leur cible biologique dans les études cliniques à venir. Elles permettent donc de vérifier la probabilité de succès du candidat médicament, et de ne tester pour les étapes ultérieures de Toxicologie chez l’animal et de Sécurité chez l’Homme que les candidats les plus prometteurs.

Procédures

La procédure de ce projet associe essentiellement des phases d’administrations de produits et de prélèvements divers. Les modes d’administration sont ajustées à celles prévues chez l’Homme, elles peuvent être multiples et utilisées en parallèle pour déterminer la biodisponibilité du produit ou simplement celle la plus à même d’assurer une bonne exposition au produit d’étude. Les prélèvements répondent aux besoins d’analyse et sont le plus souvent des prélèvements sanguins, mais d’autres matrices comme le liquide céphalo-rachidien, la peau ou d’autres tissus peuvent être nécessaires. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur animaux vigiles, sur des durées d’études de 3 à 28 jours selon les produits testés. Le nombre de prélèvements sanguins est de l’ordre de 6 à 8 lors de la première journée de l’étude, puis s’espace avec un rythme de prélèvements quotidiens pendant les trois jours suivants, puis environ deux fois par semaine pour les durées d’études les plus longues. Chaque phase de prélèvement ne dure que quelques minutes sur des animaux vigiles. Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien sont réalisés sous anesthésie générale et à raison de 2 prélèvements maximum la première journée, puis un ou deux prélèvements plus espacés à partir du deuxième jour (pas plus d’un par jour). Ils durent environ 15 à 20 minutes. Les prélèvements urinaires sont effectués sur animaux vigiles, en isolant les animaux dans des cages à métabolisme pendant 4 à 16 heures. Ils sont réalisés une fois dans les deux premiers jours de l’étude, avec un ou deux recueils pendant la période d’isolement. Les prélèvements de tissus sont réalisés sous anesthésie et les conditions sont définies par les bonnes pratiques d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie sous la supervision d’un vétérinaire qui assure le protocole le plus approprié. Ces interventions durent entre 30 et 60 minutes. Pour faciliter les prélèvements et les rendre moins stressants, il peut être décidé d’implanter des cathéters veineux ou céphalo-rachidiens, ou des implants permettant d’enregistrer des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque ou respiratoire, pression artérielle, température…) au cours d’une opération chirurgicale environ deux semaines avant le début de l’étude, permettant de compléter les soins post-opératoires et la récupération de l’animal. La durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie est alors d’environ une à deux heures.

Impact sur les animaux

La phase d’administration des produits peut générer une phase d’inconfort léger et transitoire (les doses prévues dans ce projet ne sont pas censées induire des effets indésirables notoires). L’inconfort est limité par le respect des bonnes pratiques d’administration et le soin pris à la sélection des doses et à leur bonne condition de formulation. L’objectif du projet comprenant l’induction d’états mimant les pathologies visées, différents effets peuvent être observés. On peut citer à titre d’exemples : - Induction d’un état fébrile mimant une infection par administration de substances : les signes cliniques observés comprennent une hyperthermie, souvent accompagnée d’une hypoactivité et d’une baisse d’appétit. - Induction d’une réaction inflammatoire par administration de composés mimant les essais d’immunothérapie : les animaux sont soumis à une phase initiale (quelques heures à quelques jours) comportant des épisodes d’hypo ou d’hyperthermie et d’hypotension, reflétées par des baisses d’activité ou d’apathie et une possible perte de poids et d’appétit. Pour certains produits d’origine biologique, des réactions immunitaires peuvent survenir (intolérance, ou réaction allergique). Enfin, les prélèvements de tissus ou les éventuelles implantations de cathéters ou d’autres dispositifs de mesures sont pratiquées en conformité avec les bonnes pratiques chirurgicales. Ces opérations sont susceptibles d’entrainer dans les premiers jours post-opératoires une douleur légère, une baisse d’appétit et une légère baisse d’activité. Pour certaines phases d’études, les animaux peuvent être isolés pour faciliter l’enregistrement de paramètres ou la collection d’urine.

Devenir

Ce type d’étude nécessite parfois des prélèvements terminaux d’organes vitaux (notamment de cerveau et/ou de foie) pour évaluer les atteintes sur l’activité pharmacologique sur les organes et tissus, ainsi que la quantification de l’exposition tissulaire du candidat médicament. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces prélèvements que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. Le pourcentage est un peu plus élevé chez le chien et le miniporc qui sont rarement exposés à des produits biologiques. Chez le primate non-humain sur lesquels ces produits sont préférentiellement testés, des anticorps contre les produits testés peuvent être induits et viennent compliquer un peu plus la réutilisation. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes, ces options sont systématiquement évaluées chez le chien et chez le miniporc, mais beaucoup moins chez les primates non-humains qui peuvent plutôt être proposés à la réutilisation dans d’autres laboratoires.

Remplacement

Le principe même de la procédure décrite dans ce projet est de déterminer le devenir et l’impact des candidats médicaments dans un organisme vivant, c’est donc l’objet même des projets utilisant ces procédures que d’utiliser des animaux. Seul l'animal permet d'observer les interactions entre systèmes physiologiques (cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, etc.) des candidats médicaments. Cependant, des phases préalables systématiques se déroulent par simulation sur ordinateur (modélisation) ou à l’aide de cultures cellulaires afin de caractériser les produits les plus susceptibles de pouvoir atteindre les phases cliniques. Ces tests préalables permettent aussi de choisir l’espèce non-rongeurs à privilégier pendant la phase d’évaluation de la sécurité préclinique réglementaire. Ils permettent en particulier de limiter l’utilisation des primates non-humains chaque fois qu’une autre espèce non-rongeur peut être utilisée.

Réduction

La première source de réduction du nombre d’animaux intégrés dans ce projet est la limitation du nombre de candidats médicaments testés sur les modèles animaux, suite à la mise en place de cascades de tests de modélisation ou de cultures cellulaires. Ainsi, seules les molécules le plus prometteuses ou permettant de valider les attentes thérapeutiques des projets scientifiques sont testées chez l’animal. Les effectifs des lots expérimentaux sont réduits le plus souvent à trois animaux, minimum garantissant la validité des observations en tenant compte de la variabilité des processus biologiques entre animaux. Ces effectifs sont définis sur la base d’analyses statistiques et garantissent de ne pas devoir reproduire ou compléter des études non conclusives. Le choix d’augmenter le nombre d’animaux dans des lots doit être justifié par une variabilité attendue ou déjà observée sur les paramètres mesurés. La diminution du nombre d’animaux passe aussi par la mise en place de stratégies de réutilisation dans le cadre d’une étude (test de plusieurs doses ou produits chez le même animal) et/ou dans des études différentes après une période d’élimination et un accord vétérinaire garantissant la bonne récupération des animaux. Ces stratégies de réutilisation reposent sur des expertises scientifiques évaluant le risque d’incompatibilité ou d’effets croisés entre les produits testés et sur l’amélioration de la sensibilité des dosages, afin de garantir que les résultats de chaque étude seront bien interprétables et utilisables dans les documentations réglementaires.

Raffinement

L’un des objectifs principaux des procédures du projet étant de collecter des échantillons de fluides ou de tissus biologiques, un grand soin est pris à améliorer et optimiser les techniques de prélèvements. Pendant les études, les mesures suivantes font partie des procédures opératoires : -Habituation des animaux aux conditions expérimentales (gavage, bruit de la tondeuse, mise en hamac ou en chaise de contention, salle de procédure, table d’examens…) -Administration sur un premier animal décalé pour un produit ou une dose testée pour la première fois -Réduction du nombre de prélèvements et des volumes prélevés -Utilisation de protocole d’anesthésies très courts (flash) -Mise en place de vidéo-monitoring ou d’enregistrement continue de paramètres (télémétrie) pour identifier précisément et rapidement les effets indésirables Chaque manipulation est associée à un renforcement positif sous forme de récompenses physiques (caresses, encouragements vocaux) et/ou alimentaires, selon la compatibilité avec le protocole. En complément de leur alimentation quotidienne, les animaux reçoivent des enrichissements alimentaires spécifiques. Pour les primates non humains, ces enrichissements sont distribués individuellement à la main, dès leur arrivée afin de favoriser l'établissement d'une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Pour les administrations, et sauf à ce que la dose administrée ait déjà été testée dans une autre étude, un animal sera traité avant les autres pour vérifier qu’aucun effet indésirable n’apparait avant de traiter les autres animaux (décalage du premier animal). Les prélèvements sanguins et urinaires peuvent nécessiter des isolements temporaires hors du groupe afin de respecter les temps de prélèvements. Ces isolements sont limités au strict minimum et les animaux sont conservés en contact visuel et olfactif. Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien ou les biopsies (peau, muscle, moelle osseuse, ganglion …) sont réalisés sous anesthésie la plus courte possible. Des points limites, supervisés conjointement par le scientifique et le Vétérinaire clinicien, sont établis pour garantir que les animaux ne subissent pas de contrainte supérieure à un niveau modéré.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce se base sur la nécessité d’expression de la cible thérapeutique, qui doit être vérifiée ou identifiée dans la littérature avant de lancer les études. Pour la partie des effets indésirables, la législation oriente les choix de façon assez précise puisqu’il faut disposer d’informations au moins sur une espèce non-rongeur. Le choix se base sur la bonne expression de la cible thérapeutique et la compatibilité du produit à administrer dans l’espèce. Le chien ou le miniporc doivent être privilégiés et les primates non-humains utilisés uniquement en dernier recours et sur justification scientifique particulière. Pour les produits biologiques, comme les anticorps ou dérivés des anticorps, la proximité des systèmes immunitaires de l’homme et du primate non humain fait de cette espèce un choix préférentiel. Des animaux génétiquement altérés peuvent être utilisés afin de bénéficier de l’inactivation ou de la surexpression de gènes d’intérêt dans certains modèles scientifiques. Le stade de développement des animaux doit être pertinent pour une comparaison aux personnes qui seront incluses dans les essais cliniques, et les animaux sont donc généralement de jeunes adultes.

Pour choisir les doses de futures études réglementaires de toxicité, 12 000 rates gestantes vont être utilisées, toutes mises à mort, dans des procédures classées de souffrance légère à modérée. Chaque femelle est gavée quotidiennement pendant seize jours de gestation, avec jusqu'à six micro-prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Le porteur présente cette étude préliminaire comme un moyen d'écarter tôt les molécules toxiques et d'éviter des tests plus larges. Les rates sont mises à mort au vingt-et-unième jour de gestation et leurs fœtus tués, y compris viables, pour l'examen du squelette.

Objectifs

L?objectif de ce projet est d??valuer le potentiel de toxicit? de substances chimiques sur le d?veloppement embryonnaire et f?tal au sein d'un organisme vivant complet. En d?tail ce projet a ainsi 2 objectifs. Le premier est d' Identifier et abandonner rapidement les mol?cules ? potentiel embryofoetaux toxique pour ?viter des tests inutiles ? plus grande ?chelle et ainsi s?lectionner les mol?cules les moins risqu?es. Le deuxi?me est de d?terminer les doses pr?cises qui permettront de r?aliser les ?tudes r?glementaires obligatoires sans causer de souffrance excessive (effets s?v?res) aux animaux et ainsi d?finir les doses de s?curit? pour les futures ?tudes r?glementaires.

Bénéfices attendus

Cette ?tude conduite avec un nombre restreint d?animaux permet de d?finir les doses qui seront utilis?es ult?rieurement dans l??tude r?glementaire de Toxicologie du D?veloppement demand?e par les autorit?s comprenant plus d?animaux. Cette ?tude tr?s pr?coce permet aussi de mettre en ?vidence le potentiel profil de toxicit? du produit sur l'embryo ou le foetus afin de pouvoir arr?ter le d?veloppement de mol?cules qui pourraient pr?senter des alertes importantes de toxicit? sur la reproduction et le d?veloppement et ainsi ?viter des ?tudes plus importantes avec plus d'animaux.

Procédures

Les femelles gestantes vigiles seront gav?es journali?rement ? l?aide d?une sonde souple adapt?e ? leur taille et ?ge, pendant maximum 16 jours (g?n?ralement du jour 6 au jour 20 ou 21 de la gestation). Cette proc?dure est r?alis?e en moins de 15 secondes. Durant la fin de la p?riode de gestation (entre GD17 et GD21), des pr?l?vements sanguins d?une dur?e inf?rieure ? 2 minutes, pourront ?tre r?alis?s sur animaux vigiles et/ou animaux anesth?si?s. Ce pr?l?vement peut ?tre unique ou r?p?t? en respectant les dur?es de la r?cup?ration physiologique. Chaque femelle pourra faire l?objet d?un maximum de six micro-pr?l?vements sanguins (50 ?L chacun) en 24h. Un pr?l?vement sanguin plus important, correspondant ? un volume maximal de 15 % du volume sanguin total, pourra ?tre r?alis? au jour 20 ou 21 de la gestation. Pour les pr?l?vements d?organes et de f?tus, les femelles sont mises ? mort (jour 21 de la gestation).

Impact sur les animaux

Un stress l?ger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des femelles gestantes. Le gavage effectu? ? l?aide d?une sonde souple peut induire un l?ger inconfort et tr?s rarement une irritation de l??sophage. Plusieurs ?chantillons de sang peuvent ?tre pr?lev?s au cours d'une p?riode de 24h pour l?analyse des concentrations de la substance ? tester sur animaux vigiles par ponction ? la veine saph?ne. Des pr?l?vements peuvent aussi ?tre faits en fin de gestation apr?s anesth?sie par ponction ? la veine submentale ou ? la veine sublinguale. Les pr?l?vements de sang peuvent induire une douleur l?g?re et de l?gers h?matomes au point de pr?l?vement. Les effets toxiques attendus sur les femelles gestantes sont mod?r?s car les mol?cules ont d?j? ?t? test?es sur des animaux dans l??tude de tol?rance. N?anmoins, des signes de toxicit? mod?r?s peuvent appara?tre en cours d'?tudes incluant des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, augmentation ou diminution de la mobilit?, tremblements ou impact sur la temp?rature corporelle. Par la suite, les f?tus sont endormis puis ? mort pour les examens ult?rieurs.

Devenir

En raison du but de l??tude qui est d??valuer les effets sur la gestation et le d?veloppement des f?tus, toutes les femelles gestantes sont mises ? mort pour pr?l?vements d?organes et de f?tus. Les f?tus vivants sont ?galement mis ? morts afin de r?aliser l?examen du squelette. Si l?examen du squelette n?est pas demand?, les f?tus seront ?galement mis ? mort car m?me s?ils sont viables ils ne pourraient pas survivre sans leur m?re.

Remplacement

Avant de r?aliser cette ?tude sur le mod?le animal, de nombreux essais in vitro (C. Elegans reprotox assay, Cell line compendium, devTox quick Predict assay, Reprotracker) ou in silico sont utilis?s pour pr?dire le potentiel embryo-foeto toxique d?une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexit? tissulaire ou la composition biologique compl?te d?un organisme entier, conduisant ou pas ? l?induction d?effets embryo-foeto-toxiques, ni la gravit? des effets induits par l'exposition au produit. Diff?rents param?tres doivent donc ?tre mesur?s chez l?animal. L??tude d?crite dans ce projet sert ? pr?parer la r?alisation de l??tude r?glementaire de toxicologie du d?veloppement, indispensable ? l?homologation de substances.

Réduction

Ce projet se fait dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux bas? sur l?exp?rience du laboratoire : 8 femelles accoupl?es par groupe, en comparaison plus de 20 femelles gestantes par groupe sont utilis?es dans l??tude r?glementaire. L?objectif reste ?galement de ne tester chez l?animal que des mol?cules s?lectionn?es comme non dangereuses par des m?thodes alternatives et donc de r?duire le nombre d?animaux utilis?s dans le processus de recherche et d?veloppement.

Raffinement

Les conditions d?h?bergement enrichies et adapt?es aux femelles rattes gestantes (mat?riel de nidification), le personnel form? ainsi que l?utilisation d?une manipulation douce des animaux permettent de r?duire le stress pr?-proc?dural au strict minimum. Les femelles gestantes sont h?berg?es en individuel pour ?valuer pr?cis?ment leur consommation alimentaire mais si des donn?es de consommation alimentaire existent (issues d?une ?tude pr?c?dente de tol?rance) elles seront h?berg?es 2 par cage afin de r?duire le stress li? ? l?isolement. Les femelles gestantes sont observ?es quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particuli?re pendant la phase de traitement (au moins 2 observations dans la journ?e). Elles sont pes?es ? intervalles r?guliers pendant la gestation pour v?rifier leur croissance et leur bien-?tre. La consommation de nourriture est ?galement mesur?e ? intervalles r?guliers. Des points limites suffisamment pr?dictifs et adapt?s aux femelles gestantes seront appliqu?s. Des micro-pr?l?vements sanguins seront privil?gi?s. Lors des prises de sang, l?usage d?un tapis chauffant pourra ?tre utilis? pour maintenir la temp?rature corporelle des animaux sous anesth?sie. Le jour pr?c?dent leur mise ? mort les femelles gestantes sont d?plac?es dans une salle proche de la salle de n?cropsie pour ?viter le stress du transfert le jour m?me. Les pr?l?vements de sang sont r?alis?s dans une salle s?par?e et diff?rente de celle utilis?e pour la mise ? mort.

Choix des espèces

Les mod?les rongeurs et notamment le rat sont recommand?s par la communaut? scientifique et les instances r?glementaires. Des donn?es historiques issues des ?tudes pr?c?demment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l?esp?ce et la souche choisie (Rat Wistar). Ces caract?ristiques permettent d'obtenir une grande quantit? d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. De jeunes rattes (8-12 semaines au d?but de l??tude) seront utilis?s dans ce projet comme dans les futures ?tudes de toxicologie du d?veloppement conform?ment aux recommandations des guidelines internationales (OECD 414). Ces ?tudes visent ? ?tudier le potentiel toxique d?une substance sur le d?veloppement et seront r?alis?es pendant la gestation puisque l?objet de l??tude porte sur le d?veloppement de l?embryon et du f?tus lors d?une exposition in utero.