Production de routine

Produire des parasites pour un réactif de diagnostic exigé lors des mouvements internationaux de chevaux : 735 rats vont être infectés par Trypanosoma equiperdum, l'agent de la dourine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection les tue en quelques jours. Ce sont d'anciens reproducteurs de plus de 500 grammes, choisis pour la quantité de sang qu'on peut leur prélever, soumis à deux prélèvements quotidiens sous anesthésie gazeuse avant d'être mis à mort. Le porteur indique que la mise à mort intervient quand la parasitémie atteint son maximum et "autant que possible" avant l'apparition de signes cliniques, un rendement élevé par animal réduisant le nombre de protocoles à lancer. La finalité affichée est d'éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait la circulation commerciale des équidés.

Objectifs

Cette demande d’autorisation à expérimenter sur animaux vivants porte sur la production sur rats de parasites Trypanosoma equiperdum, agent infectieux responsable de la dourine. La dourine est une maladie sexuellement transmissible qui affecte les équidés et qui engendre un fort taux de mortalité ; elle est non transmissible à l’homme. Les procédures utilisées sont celles décrites par les instances internationales et ont pour objectif de produire les réactifs nécessaires au diagnostic officiel permettant d’empêcher la propagation de la dourine lors de mouvements internationaux d’équidés. Les parasites produits pourront également être utilisés dans le cadre de projets de recherche ayant pour vocation l’amélioration du diagnostic de la dourine et l’amélioration des connaissances sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Bien qu’un résultat sérologique négatif soit exigé vis-à-vis de la dourine pour permettre les mouvements internationaux d’équidés, seuls quelques laboratoires au monde sont en mesure techniquement de produire les réactifs nécessaires à la réalisation de ce test. Ainsi l’approvisionnement en réactif pour le diagnostic de la dourine est une réelle problématique dans de nombreux pays du monde. Ainsi ce bénéfice apporté par ce projet est de maintenir notre capacité de production d’antigènes afin d’éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait le contrôle du statut sanitaire des équidés vis-à-vis de la dourine qui pourrait impacter fortement les mouvements internationaux d’équidés.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection de parasite T. equiperdum sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - deux prélèvements quotidiens d’une goutte de sang sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - une mise à mort sous anesthésie gazeuse complétée par d’une anesthésie profonde (2 min).

Impact sur les animaux

Afin de limiter les signes cliniques causés par le parasite (Trypanosoma equiperdum), la mise à mort est programmée avant que les animaux ne présentent des signes d’affaiblissement. Pour cela un suivi au moins deux fois par jour est réalisé. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort et son sang récolté. Une fiche individuelle de suivi est complétée à chaque intervention sur l’animal.

Devenir

L’infection par le parasite Trypanosoma equiperdum est mortelle au bout de quelques jours pour les rats inclus dans le protocole. Ainsi, pour éviter toute souffrance inutile, des animaux sont mis à mort soit quand la quantité de parasites dans le sang atteint le seuil recherché, soit quand des signes de souffrances sont observés chez l’animal.

Remplacement

Afin de garantir le statut sanitaire des équidés lors de leurs déplacements internationaux, des tests de diagnostic de la dourine sont exigés au niveau mondial. À ce jour, seul le test de fixation du complément (TFC) est reconnu par l’Organisation mondiale de la santé animale (OMSA) pour le diagnostic sérologique de cette maladie. Les quantités de réactifs requis pour la mise en œuvre du TFC, combinés au nombre élevé d’équidés circulant à l’échelle mondiale, font que de grandes quantité de parasites doivent être produites pour répondre à la demande. La seule alternative à l’infection de rats pour produire ces parasites est la culture in vitro. Cependant, les caractéristiques biologiques des parasites limitent fortement les rendements obtenus par cette méthode, rendant la production in vitro insuffisante pour répondre à la demande mondiale en antigènes. Dans le but de réduire (voire de suspendre) le recours à la production sur animaux, notre programme de travail inclut le développement d’un test ELISA standardisé pour la dourine, test pour lequel les quantités d’antigènes utilisés sont compatible avec les capacités de production in vitro. Une fois validé, ce test pourra être proposé à l’OMSA en vue de sa reconnaissance comme méthode officielle de diagnostic, au même titre que le TFC dourine. Dans l’attente de cette reconnaissance, la production d’antigènes sur rats reste à ce jour la seule solution permettant d’assurer la continuité des contrôles sanitaires lors des mouvements internationaux d’équidés.

Réduction

Le nombre d’animaux par production de parasites (21 rats) est défini par les protocoles décrit dans les réglementations internationales. De plus nous apportons un soin particulier à ce que la mise à mort des animaux soit réalisée de manière à obtenir le meilleur rendement de production de parasites, pour permettre de réduire au maximum le nombre de protocoles réalisés.

Raffinement

Les rats sont hébergés en zone de confinement A2, dans une pièce dédiée aux rats, en portoir ventilé, dans des cages permettant la position bipède. Chaque cage possède une plateforme, les rats en fonction de leur poids sont réunis par groupe de 2 ou 3. Pour chaque cage, l’enrichissement du milieu est apporté par : un tunnel, des matériaux de nidification, des os à ronger, ainsi que des buchettes bois à ronger. Afin de limiter la souffrance des animaux, tout acte invasif est effectué sur des animaux anesthésiés. La mise à mort des rats a lieu quand le nombre de parasites comptés dans le sang de l’animal a atteint son niveau maximum et autant que possible avant que les animaux ne développent des signes cliniques. En effet, plus le nombre de parasites collectés par animaux est important, moins nous aurons de protocoles de productions à mettre en place. Pour cela nous surveillons les animaux et réalisons des comptages de parasites de manière régulière. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort (point limite) et son sang récolté ; et ce, indépendamment de sa parasitémie.

Choix des espèces

Notre protocole suit les recommandations internationales quant à l’espèce animale sélectionnée (le rat). Cette espèce a été sélectionnée car elle est assez grande pour récolter des quantités importantes de sang (contrairement à la souris) tout en restant un animal dont l’utilisation est assez répandue pour permettre de standardiser la production d’antigènes. Dans ce contexte les animaux utilisés sont des rats adultes de poids supérieur à 500 grammes (anciens reproducteurs) afin de pouvoir prélever la plus grande quantité de sang possible et ainsi récupérer le plus de parasites par animal.

Jusqu'à trente-six prélèvements de sang par an, à 1 % du poids vif à chaque fois, et deux à cinq injections annuelles d'antigène en émulsion avec un adjuvant huileux : 15 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous les gestes sont pratiqués sur animal vigile, dès le jour de la naissance pour les dix-sept premières injections, et l'adjuvant provoque des inflammations locales douloureuses que le porteur dit suivre quotidiennement. Il indique que les chèvres sont ensuite gardées jusqu'à la fin de leur vie, la réinjection des globules rouges permettant de prolonger les prélèvements sur les mêmes animaux et d'en utiliser moins. Leur plasma alimente la fabrication de kits de dépistage de la toxoplasmose, de la rubéole et des hépatites A et B, une production de routine que le porteur déclare non reproductible in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire des anticorps polyclonaux anti-immunoglobulines (Ig) humaines issus de caprins dans le but de fabriquer des kits de diagnostic in vitro pour la détection d’anticorps et le diagnostic de maladies en santé humaine. Il s’agit des tests de dépistage de la Toxoplasmose, la Rubéole, l’Hépatite A et l’Hépatite B. C’est une technique immuno-enzymatique où ces anticorps anti-Ig humaines servent à capturer les anticorps dans le sang des patients.

Bénéfices attendus

Les anticorps obtenus sont utilisés pour la fabrication de kits immuno-enzymatique permettant la détection d’anticorps et le diagnostic de maladies, en santé humaine : la Toxoplasmose, la Rubéole, l’Hépatite A et l’Hépatite B. La toxoplasmose est généralement bénigne ou asymptomatique chez les sujets immunocompétents, mais peut avoir des conséquences graves si elle se produit chez des sujets immunodéficients ou des fœtus. L’infection par le virus de la rubéole, chez les enfants comme chez les adultes, est bénigne et de courte durée. Elle peut cependant avoir des conséquences très sévères pour le fœtus si elle est contractée par une femme enceinte, surtout si l’infection survient pendant les trois premiers mois de grossesse. L’ infection par le virus de l’hépatite B est un problème majeur de santé publique. Le bénéfice est donc de produire les anticorps nécessaires à la confection de ces kits et ainsi tester un maximum de patients, afin de mettre en place un traitement médicamenteux, suffisamment prédictif, en cas de résultats positifs, pour éviter à ces patients de développer des symptômes graves de la maladie. Il n’existe pas de méthode in-vitro connue à ce jour pour obtenir des anticorps polyclonaux anti-immunoglobulines humaines ayant la spécificité et l’affinité requises.

Procédures

Tous les gestes sont réalisées sur animal vigile. De la naissance à 2 mois : 17 injections (10 secondes par injection) A l’âge adulte : 2 à 5 injections par an (1 minute 30 par injection). Prélèvement de sang pour contrôle du titre : 15 secondes 4 fois par an. Prélèvement de sang (1% du poids vif maximum) pour la production des plasmas : 10 minutes par prélèvement à raison de maximum de 36 prélèvements par an. Ré-injection des globules rouges (technique de plasmaphérèse) : 15 minutes par ré-injection en rapport avec le nombre de prélèvement de sang

Impact sur les animaux

Les injections d’antigène aux cabris durant les 2 premiers mois de vie peuvent entrainer des douleurs au moment de l’injection (piqûre). A l’âge adulte, les injections de l’émulsion de l’antigène avec de l’adjuvant huileux, créent une douleur, car cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, sont suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont gardés jusqu’à la fin de leur vie.

Remplacement

Ces kits de diagnostics utilisent des anticorps polyclonaux anti-immunoglobulines (Ig) humaines ayant une forte spécificité et une forte affinité qui ne sont pas reproductible en vitro. Le fait de rendre le cabri tolérant à l’antigène dès son plus jeune âge n’est pas reproductible in-vitro. Dans l’état actuel des connaissances scientifiques, cette méthode de production d’anticorps n’est pas reproductible in-vitro à ce jour.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est fonction des besoins de production et est optimisé au plus juste. Les animaux sont prélevés avec la technique de plasmaphérèse qui consiste à prélever le sang total et à séparer les globules rouges pour les ré-injecter à l’animal. Ainsi cette technique permet de prolonger la durée des prélèvements sur le même animal en réduisant le nombre d’animaux. Aucune étude statistique n’est prévue.

Raffinement

Les animaux sont élevés en groupes constitués et stables permettant aux animaux une vie hiérarchique et sociale avec la possibilité de se percher. Ils sont hébergés sur une aire paillée avec un accès à la nourriture (foin) et à l’eau constante. Un concentré leur est apporté quotidiennement et fractionné. Un suivi quotidien est réalisé par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire (protocole de soins spécifique) qui assure par ailleurs un suivi régulier. De plus la réinjection systématique des globules rouge par la technique de plasmaphérèse permet de maintenir l’animal sur un plus long terme, sans atteindre les points limites.

Choix des espèces

L’espèce caprine a été choisie car c’est un modèle répondant correctement à ce type d’antigènes. La chèvre est un animal docile et patient permettant, d’obtenir un volume important de plasma hyper-immun avec un faible nombre d’animaux. Les animaux sont sélectionnés à la naissance, puisqu’ils doivent être injectés le jour de leur naissance.

1 776 cochons génétiquement modifiés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir douze injections d'immunogènes et subir vingt prélèvements sanguins, jusqu'à 10 % de son volume sanguin par prise, avec fièvre, inflammation au point d'injection et malaise général parmi les effets décrits. La mise à mort se fait par exsanguination sous anesthésie profonde, pour récupérer le maximum de sérum, le projet visant 70 kilos d'anticorps purifiés destinés à des essais cliniques. Le porteur écrit avoir cherché des méthodes sans animaux et conclut que les techniques in vitro ne sont "pas encore suffisamment développées".

Objectifs

Le projet vise à générer des anticorps porcins glyco-humanisés dirigés contre des cellules tumorales humaines (utilisation en oncologie) ou des cellules immunitaires (utilisation en transplantation pour palier au rejet de greffes). Le projet utilise des porcs génétiquement modifiés par l'inactivation de deux gènes intervenant dans la chaîne de glycosylation des protéines. Les anticorps produits par les animaux présentent des glycosylations similaires aux glycosylations humaines et donc moins immunogènes pour l’homme. L’administration répétée des pools d’antigènes tumoraux ou lymphocytaires (cellules du système immunitaire) induit une réponse immunitaire robuste chez les porcs, produisant des sérums riches en anticorps spécifiques ciblant les cellules tumorales ou les cellules du système immunitaire (lymphocytes). Ces anticorps pourraient constituer de nouveaux candidats médicamenteux pour répondre à des besoins médicaux non satisfaits en transplantation et en cancérologie. Avec les animaux prévus au projet, environ 70 kg d’anticorps specifiques purifiés seront produits pour être évalués au cours d’études cliniques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer des anticorps polyclonaux antitumoraux en utilisant des porcs DKO (double knock-out) hyperimmunisés avec des cellules tumorales, ce qui pourrait représenter une avancée significative en thérapie oncologique. Les porcs DKO, modifiés génétiquement pour améliorer la compatibilité immunitaire, permettent la production d'anticorps moins immunogènes et donc plus efficaces contre une variété de cellules cancéreuses. En utilisant ces modèles animaux, nous espérons générer des anticorps polyclonaux qui peuvent cibler plusieurs épitopes des cellules tumorales, augmentant ainsi les chances de neutraliser les cellules cancéreuses et réduisant le risque d'échappement tumoral. Ces anticorps pourraient offrir des alternatives ou des compléments aux thérapies actuelles, comme les monoclonaux, avec une meilleure réponse immunitaire et une réduction des effets secondaires. Le bénéfice attendu est donc une amélioration notable des options thérapeutiques pour les patients atteints de cancer, ouvrant la voie à des traitements plus personnalisés et potentiellement plus efficaces.

Procédures

Au cours des programmes d’immunisation, les animaux sont soumis à l’injection de pools d’immunogènes et à des prélèvements sanguins. Un animal inclus dans un programme peut subir au maximum 12 injections de pools d’immunogènes (1 injection toutes les 2 semaines) et 20 prélèvements sanguins (1 prélèvement par semaine ou toutes les 2 semaines). Les interventions sont réalisées sur des animaux vigiles ou sur des animaux anesthésiés en fonction de leur poids et du type d’intervention. Pour les animaux pesants entre 70 et 120 kg, les prélèvements sanguins sont réalisés sous analgésie. Le temps d’intervention est d'environ 15 minutes par porc. Pour les animaux de 120 à 200 kg, les prélèvements sanguins et les vaccinations seront réalisés sous analgésie et anesthésie. L’anesthésiant est administré par injection intramusculaire et par la mise en place d’un masque pour l’anesthésie gazeuse. Le temps d’intervention est d'environ 35 minutes par porc incluant le temps pour le réveil de l’animal. Lors des anesthésies les animaux sont isolés dans une salle thermorégulée où la température est augmentée afin d’éviter l’hypothermie des porcs.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins peuvent être fréquents, ne dépassant pas les 10% du volume sanguin total de l'animal. Ces prélèvements peuvent provoquer des effets cliniques modérés et nécessitent une période sans prélèvements pour reconstitution du volume sanguin (selon le volume prélevé ex : une semaine de récupération pour 7.5% du sang total prélevé). Les vaccinations sont également fréquentes, impliquant l'injection de cellules tumorales avec adjuvant. Les animaux peuvent présenter des réactions cliniques modérées à la suite de ces injections. L'animal peut éprouver du stress dû à la manipulation et à l'injection répétée de substances. Une attention particulière sera portée à l'utilisation de techniques minimisant la douleur et le stress (utilisation de sédatifs ou d'anesthésiques locaux). Les symptômes cliniques modérés peuvent inclure de la fièvre, une inflammation au site d'injection, et un malaise général. Les animaux seront surveillés de près pour détecter toute réaction indésirable.

Devenir

À la fin du programme d'immunisation, l'euthanasie par exsanguination finale sous anesthésie profonde est justifiée par la nécessité de collecter une quantité maximale de sérum hyperimmun, essentiel pour la production de substances médicamenteuses. Cette procédure permet de garantir une qualité optimale du sérum sans compromettre le bien-être des animaux. L'euthanasie est également prévue en cas de non-réponse aux vaccinations ou une atteinte au bien-être de l'animal. Dans ces cas-là, elle est réalisée en utilisant un euthanasiant pour assurer une fin de vie des animaux de manière indolore et éthique.

Remplacement

Une recherche exhaustive a été menée pour identifier des méthodes alternatives sans utilisation d’animaux. Malheureusement, pour la production de sérum hyper-immunisé, les méthodes in vitro disponibles ne sont pas encore suffisamment développées pour remplacer complètement l'utilisation des animaux.

Réduction

Une planification statistique rigoureuse est utilisée pour déterminer le nombre minimum d'animaux nécessaires. Les essais préliminaires in vitro aident à affiner les protocoles expérimentaux et à réduire le nombre d’animaux requis. Les prélèvements sanguins sont planifiés de manière à maximiser la quantité de sérum collecté par animal, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. En outre, dans cette étude nous souhaitons optimiser le protocole d’immunisations des animaux. L’objectif de ce protocole est d’induire une meilleure réponse immune humorale par rapport aux protocoles précédemment utilisés, en améliorant l’utilisation des adjuvants, la quantité d’antigène injectée et les voies d’injection. Obtenir un protocole optimisé nous permettra d’obtenir une meilleure réponse humorale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de doses thérapeutiques d’anticorps. Les protocoles de collecte sont optimisés pour minimiser les interventions répétées.

Raffinement

Les porcs sont hébergés dans des environnements enrichis pour favoriser leur bien-être. Cela inclut des espaces suffisants pour se déplacer, des matériaux de fouissage et d’enrichissements (brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc spécifiques pour le porc, arbustes en pot), et la possibilité d’interagir socialement avec d’autres porcs. L’élevage est également à température adaptée à chaque catégorie de porc (climatisation et chauffage). Les animaux sont surveillés quotidiennement et individuellement pour détecter et traiter rapidement tout signe de détresse ou de maladie. Des soins vétérinaires sont effectués sur tous les animaux qui le nécessitent. Les animaux sont manipulés avec précaution et respect. Des procédures d’analgésie et d’anesthésie ont été mises en place pour minimiser la douleur et le stress des animaux lors des injections et des prélèvements ainsi que les douleurs éventuelles post-procédures. Lors des anesthésies les animaux sont isolés dans une salle thermorégulée ou la température est augmentée afin d’éviter l’hypothermie. Les protocoles de collecte de sang ont été optimisés pour minimiser les interventions répétées. L’optimisation du protocole de vaccination permettra également d’améliorer les conditions d’injections chez les porcs (diminution du nombre et du volume d’injection). Pendant les procédures d'immunisation et prélèvement les animaux sont surveillés quotidiennement et individuellement selon une grille d’évaluation qui définit des points limites selon un score (voir en annexe). Selon le score obtenu et l’arbre décisionnel (voir en annexe), les animaux sont maintenus ou sortis du programme et/ou traités avec des analgésiques si besoin.

Choix des espèces

Le choix du modèle porcin pour la production d'anticorps polyclonaux se révèle pertinent sur plusieurs plans scientifiques et éthiques. Les porcs, avec leur système immunitaire relativement similaire à celui des humains, offrent une source efficace pour la génération d'anticorps spécifiques et en quantités significatives. Leur taille et leur physiologie facilitent les procédures de collecte et le traitement du sang, rendant leur utilisation optimale pour la production à grande échelle. Le porc est un bon compromis pour obtenir des anticorps de haute qualité tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires et en optimisant les conditions de leur traitement. Les porcs seront utilisés à plusieurs stades de développement pour assurer l'efficacité et la sécurité de la procédure d'immunisation. Tout d'abord, les porcelets sont élevés jusqu'à ce qu'ils atteignent un poids minimum de 80 kg, ce qui correspond généralement à un âge d'au moins 5 mois. Cette période de croissance permet de s'assurer qu'ils ont atteint une maturité physique suffisante pour supporter les procédures d'immunisation sans risque accru de complications. Ensuite, les animaux sont immunisés à partir de cet âge, garantissant que leur système immunitaire est suffisamment développé pour répondre efficacement à la vaccination. Enfin, des sérums hyper-immuns sont prélevés sur les porcs 35 jours après la première vaccination par prises de sang répétées, conformément aux normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement. Cette approche permet de recueillir des échantillons de manière sûre et éthique tout en maximisant l'efficacité de la réponse immunitaire induite.

La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".

Objectifs

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.

Bénéfices attendus

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Le protocole s'achève par un prélèvement de sang poursuivi jusqu'à la mort de l'animal, dix à douze minutes sous anesthésie. Il concerne 120 790 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit d'abord deux injections d'une suspension cellulaire à quatorze jours d'intervalle, puis subit deux saignées de cinq à huit minutes à l'artère médiane de l'oreille, maintenu vigile dans une boîte de contention et refermé à la colle chirurgicale, avec une anémie de deux à six jours que le porteur reconnaît. Le sérum obtenu entre dans la fabrication d'un immunosuppresseur commercialisé dans plus de quatre-vingts pays, et le porteur décrit au titre de la réduction une sélection génétique menée sur les reproducteurs de l'élevage pour augmenter la quantité de sérum tirée de chaque lapin.

Objectifs

Le projet a pour objectif la production de sérum de lapin entrant dans la fabrication d'un médicament à usage humain, immunosuppresseur visant à lutter contre le risque de rejet de greffe chez l'Homme et également utilisé dans le traitement de l'aplasie médullaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la production d'un médicament humain, commercialisé dans plus de 80 pays à travers le monde et considéré comme un "life saving drug", c'est-à-dire un médicament vital pour de nombreux patients. Il est utilisé en milieu hospitalier. Ce médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé pour lutter contre les rejets de greffe chez l'Homme en période pré et post-opératoire. Le médicament est également utilisé dans le cadre de la prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques ainsi que pour le traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë corticorésistante. Enfin, le médicament sert au traitement de l'aplasie médullaire. Il est inclus sur la liste des médicaments critiques de l’Union Européenne (Union list of critical medicines), pour lesquels un stock minimal de 4 mois est requis afin d’éviter toute rupture d’approvisionnement des pays.

Procédures

Les animaux sont changés de cage au moment de la mise en place en salle de protocole et pesés individuellement. Puis le protocole comprend différentes étapes pouvant impacter les animaux : - une phase d'immunisation : l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu (durée : 1 minute) et l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu 14 jours plus tard (durée : 1 à 2 minutes) - un premier prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - un second prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille controlatérale sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - l’anesthésie de l’animal par injection intraveineuse d’un mélange d’anesthésiques sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : 1 minute), puis un prélèvement de sang terminal, jusqu'à la mort de l’animal (durée : environ 10 à 12 minutes).

Impact sur les animaux

Le protocole comprend différentes étapes sur les animaux inclus dans le projet : - une phase d'immunisation avec deux injections d'une suspension cellulaire sur animal vigile réalisées à 14 jours d’intervalle entrainant une douleur légère de courte durée ; - une phase de prélèvements avec deux prélèvements successifs à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile entrainant une douleur légère de courte durée ; - un prélèvement terminal sous anesthésie générale, entrainant une douleur légère de courte durée lors de l’anesthésie. Les prélèvements peuvent entrainer une anémie de courte durée (entre 2 et 6 jours) et celle-ci reste légère à modérée (selon une étude interne réalisée en 2023 sur le suivi de l’anémie des animaux par le biais de la mesure du taux d’hématocrite).

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure sont mis à mort, puisque le protocole prend fin à la mort des animaux lors du prélèvement de sang sous anesthésie générale.

Remplacement

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production d'anticorps polyclonaux tels qu'inclus dans la composition du médicament final. La diversité et la quantité d'anticorps produits par l'animal permettent une compatibilité sans équivalent avec un nombre très élevé de patients receveurs de greffes dans les différents pays du monde. Cette diversité n’est pas reproductible via la production d’anticorps in vitro. En effet, plus de 80 épitopes différents de cellules de l’immunité sont ciblés par le médicament, ce qui provoque chez le patient une immunosuppression majeure et durable.

Réduction

La procédure expérimentale appliquée a été définie afin d'obtenir la plus grande quantité possible de sérum par animal utilisé (sérum contenant la concentration requise en anticorps polyclonaux). De plus, un travail de sélection génétique mené sur les animaux reproducteurs de l'élevage a permis d'optimiser la quantité de sérum prélevée sur chaque lapin lors du prélèvement terminal, et d'améliorer la concentration en immunoglobulines du sérum produit. De plus, la répétition des prélèvements de sang, réalisée sous surveillance du bien-être des animaux, augmente la quantité moyenne de sérum prélevée par animal. Il est donc possible de fabriquer une plus grande quantité de médicament avec un nombre équivalent d'animaux utilisés. Enfin, les lapins mâles et femelles sont utilisés dans le cadre du protocole, ce qui permet d'inclure dans la procédure tous les lapins élevés au sein de l'établissement.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences de la règlementation et de respect du Bien-Etre Animal, ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger, de tunnels pour se cacher). Les animaux élevés ensemble depuis leur naissance sont de préférence hébergés dans la même cage, afin de limiter le risque d’agression entre lapins. Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement ; des fiches de suivi permettent d’enregistrer les soins adaptés prodigués aux animaux et de suivre l’évolution de l’état de santé des animaux. Un suivi renforcé est effectué sur les animaux durant les phases de prélèvements du protocole expérimental. Une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance excessive. Une prise en charge spécifique de la douleur par l'application d'un protocole d'anesthésie générale validé est appliquée lors du dernier prélèvement de sang. Enfin, l'utilisation de colle chirurgicale lors de chaque injection intraveineuse ou prélèvement de sang assure un meilleur confort à l'animal.

Choix des espèces

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe aucune méthode alternative permettant de produire le sérum entrant dans la composition du médicament humain in vitro. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin, espèce qui fait référence dans la production d'anticorps polyclonaux pour l'usage pharmaceutique. L’AMM du médicament fixe également l’âge et le poids requis pour utiliser les animaux dans le cadre du protocole expérimental. Les lapins ne sont inclus dans la procédure d'expérimentation animale qu'à partir de l'âge de 14 semaines et pour un poids minimum de 2,8 Kg. C'est en effet à partir de cet âge que leur système immunitaire est capable de produire les anticorps nécessaires à la fabrication du médicament humain, en quantité et concentration suffisantes. Les animaux sont également aptes à supporter les différentes phases de la procédure (prélèvements de sang répétés notamment).