Production de routine

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".

Objectifs

Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.

Bénéfices attendus

De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.

Procédures

- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Un millilitre de liquide abdominal par souris, prélevé entre 67 et 72 heures après l'injection, avant que le parasite ne tue l'animal au-delà de 80 heures : 50 000 souris femelles de réforme vont être utilisées sur trois ans, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent à produire les toxoplasmes entiers qui composent des kits de dépistage de la toxoplasmose, dont le porteur revendique 10 millions de tests fournis dans le monde. À partir de la soixantième heure, les parasites libérés dans la cavité abdominale provoquent une douleur et un inconfort que le porteur dit prendre en charge par un analgésique injecté dès la quarante-huitième heure. Un premier projet de remplacement a été arrêté en 2019 faute d'atteindre les performances visées, un autre est annoncé pour 2027, et l'entreprise indique avoir divisé par deux en dix ans le nombre de souris utilisées à volume de tests constant.

Objectifs

La production de suspension de toxoplasmes est utilisée dans la production de kits d’immunoessais pour le diagnostic de la toxoplasmose humaine. Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire dont les hôtes définitifs sont les félidés. Il est capable d’infecter l’Homme, en tant qu’hôtes intermédiaires sans symptômes apparents dans 50% des cas. On estime entre 200 000 et 300 000 nouvelles infections chaque année en France le plus souvent bénignes. Par contre cette affection transmissible de la mère au fœtus peut entrainer des séquelles très invalidantes pour l’enfant (150 cas par an), et peut être la cause de mortalité chez l’immunodéprimé (environ 200 cas par an en France). La séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes baisse régulièrement depuis une cinquantaine d’années. Elle varie selon les régions et est liée à des facteurs géo-climatiques et des habitudes de consommations alimentaires différentes. La baisse régulière de la séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes a pour corollaire une augmentation de la population des femmes séronégatives amenées à être suivies mensuellement (Santé Publique France). La France a instauré un programme de prévention unique au monde : le diagnostic de la toxoplasmose est obligatoire dans le cadre de suivi prénatal avec une sérologie en début de grossesse, qui entraine un contrôle mensuel sérologique des femmes non immunisées et la fourniture de conseils nécessaires pour prévenir la maladie et ainsi en éviter la transmission au fœtus. L’entreprise fabriquant les kits est pionnière de ce secteur et y occupe un positionnement unique. Ces trousses de diagnostic sont des matériels de référence, et donc utilisés en confirmation, en deuxième intention, pour éviter un diagnostic erroné. Les réactifs concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite. Les performances de ces tests sont basées sur l’utilisation d’un lysat parasitaire natif permettant d’assurer à la fois de très bonnes sensibilité (très peu de résultats faux négatifs) et spécificité (très peu de résultats faux positifs). Les laboratoires (notamment les laboratoires de référence, type CHU) ont souvent besoin de disposer de méthodes de diagnostic utilisant différentes compositions/natures d’antigènes pour asseoir leur diagnostic. Dans ce contexte fin 2022, 72 % des laboratoires CHU français utilisaient ces tests.

Bénéfices attendus

Les réactifs de diagnostic concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, dans le sérum des patients les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite. Ces kits de diagnostics concernés par le projet sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Les performances de ces tests sont basées sur l’utilisation d’un lysat parasitaire natif permettant d’assurer à la fois: une très bonne sensibilité (très peu de résultats faux négatifs) et une très bonne spécificité pour les immunoglobulines (très peu de résultats faux positifs). Les laboratoires (notamment les laboratoires de référence comme les C.H.U.) ont souvent besoin de disposer de méthodes de diagnostic utilisant différentes compositions/natures d’antigènes pour asseoir leur diagnostic. Dans ce contexte: fin 2022, 72 % des laboratoires hospitalo-universitaires français utilisaient ces tests.

Procédures

- injection en moins 5 secondes/animal - A 48 heures injection d’analgésique en moins 5 secondes/animal. - De 67 à 72 heures après inoculation initiale : euthanasie rapide. - aucun prélèvement sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les souris sont injectées avec une suspension contenant des parasites et des cellules. Ces dernières sont colonisées par les parasites intracellulaires stricts. Ils ne sont pas agressifs pour la souris car tant qu’ils sont hébergés dans les cellules, ils n'ont pas de conséquence sur l’état sanitaire de l’animal. Il est important de noter que la faible quantité de la suspension en cellules ne provoque pas de douleur à l’animal. A partir de 60 heures après l’injection, les parasites s’étant multiplier dans la cellule, se retrouvent libérés dans la cavité abdominale ce qui entrainera une douleur au niveau de l’abdomen et un inconfort pris en charge de façon prédictive et jusqu’à la fin du protocole, avec l’ajout d’un analgésique dès la 48ème heure.

Devenir

La nature du parasite inoculé ne peut conduire à une autre issue que l’euthanasie de l’animal à la fin du protocole. Au-delà de 80 heures le parasite provoquerait la mort de l’animal. De ce fait le liquide d’intérêt doit être prélevé avant la mort de l’animal.

Remplacement

Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits actuels sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Ce protocole est le seul mode de production aujourd’hui validé pour garantir les performances requises des kits de diagnostic concernés : sensibilité et spécificité des kits. Un premier projet de remplacement a été stoppé en 2019 car les objectifs de performance de cette nouvelle génération de tests n’ont pas été atteints. A ce jour un développement de nouvelles générations de kits est en cours afin de remplacer l’origine des antigènes en les produisant par culture. La durée du développement a été fixée à 8 ans à minima. La stratégie est de définir les bonnes conditions de culture garantissant un antigène présentant tous les épitopes d’un lysat parasitaire et ce, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Le lancement des premières commercialisations en Europe est prévu au premier semestre 2027.

Réduction

L’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet d’amplifier la production de toxoplasmes et donc de réduire le nombre d’animaux (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Cette méthode optimisée entraine la production d’un volume moyen de 1mL de liquide d’intérêt très concentré en toxoplasmes par souris de 30g. Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. La quantité produite par animal est constante et le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Plusieurs projets ont été menés pour réduire le nombre d’animaux utilisés : l’amélioration des conditions de vie des souris : enrichissement, adaptation du nombre d’animaux par cage, la rationalisation et l’optimisation des processus, l’ajout d’un analgésique. Ces projets ont permis de diviser par 2 l’utilisation annuelle des souris en 10 ans, alors que les volumes de tests vendus sont restés constants. Le développement de nouvelles générations de kits va permettre de réduire de façon conséquente le nombre d’animaux utilisés pour la production de ces toxoplasmes. 50 000 souris sont nécessaires sur les 3 années à venir. Ce nombre de souris permettra de produire et de mettre à disposition 10 millions de tests de diagnostic à travers le monde, au service de la santé publique.

Raffinement

Les animaux entrent en production après une période d'acclimatation, de manière à ce qu'ils s'habituent aux conditions d'élevage, limitant ainsi le stress lors des différentes manipulations. Ils sont hébergés sur litière (sciure/lanières de carton) assurant l'enrichissement du milieu et permettant aux souris de faire leur nid. Un tunnel PVC est introduit dans la cage permettant aux souris de répondre à un besoin physiologique de bien-être animal. Un suivi quotidien par cage permet de contrôler l’état sanitaire des souris. Les animaux continuent de se mouvoir dans la cage et de s’alimenter. Toutefois si un animal présente des signes de dégradation de son état sanitaire il est immédiatement euthanasié. Ces signes sont : isolement, apathie, dos voussé, yeux plissés, poil piqué. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet de limiter la colonisation des cellules de la souris de la 1ère heure à la 60ème heures et donc d’en diminuer l’impact : le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict, il n'est pas agressif pour la souris tant qu'il est dans la cellule et n'a pas de conséquence sur son état sanitaire. Les cellules ne peuvent pas se multiplier et donc ne sont pas toxique pour l’animal et provoquer les nuisances qu’elles pourraient causer si elles étaient inoculées seules, à savoir la production d’une quantité importante d’ascite après une dizaine de jours d’incubation. De plus le protocole ne dure que trois jours, il n’y a pas de début de production d’ascite. Au-delà de la 60ème heure le toxoplasme a lysé la totalité des cellules et se retrouve libéré dans le péritoine. Il colonise alors les cellules de la souris et devient agressif et des signes d’inconfort apparaissent. Pour diminuer ceux-ci, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type Kétoprofène. Cette molécule est dotée d’une puissante activité anti-inflammatoire, antalgique et antipyrétique. La concentration maximale est atteinte en une heure et reste constante et élevée au niveau des sites inflammatoires pendant 30 à 36 heures, ce qui couvre la totalité du protocole. Les animaux sont alors euthanasiés puis le liquide d’intérêt est récolté.

Choix des espèces

A l’origine la culture de toxoplasmes a été validée sur souris pour assurer la performance des tests de diagnostic in vitro. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits actuels sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. De plus ces trousses de diagnostic sont considérées comme matériel de référence et sont utilisés en confirmation, c’est-à-dire en deuxième intention (pour éviter un diagnostic erroné). Ils permettent la prise de décision en cas de résultats sur des sera à résultats douteux. Les animaux utilisés sont des souris femelles de réformes d’un poids de 20-39g de souches robustes, calmes et permettent une manipulation aisée. L’utilisation de souris de cette tranche de poids permet d’avoir un liquide d’intérêt de bonne qualité. Des essais menés sur des animaux plus jeunes et d’un poids inférieur ont montré que le liquide d’intérêt était de moins bonne qualité car souvent hémolytique et bien moins concentré . Après une période d'acclimatation les animaux entrent en production.