Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2022-03-04 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-633446)
142 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu’il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.
Résumé produit par un modèle de langage à partir du seul texte du laboratoire, selon une méthode arrêtée par l’OXA. Publié sans relecture individuelle préalable, sous la responsabilité de l’association, et corrigé au fil des relectures.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet, selon le laboratoire
Réponses rédigées par le laboratoire demandeur, à des fins de communication. Elles ne sont ni sourcées ni relues par des pairs.
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Dans quel but fait-on ça ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Est-ce « inutile » ou « nécessaire » ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.
Nuisances prévues, selon le laboratoire
Réponses rédigées par le laboratoire demandeur, à des fins de communication. Elles ne sont ni sourcées ni relues par des pairs.
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Un examen publié en 2018 a établi que les résumés allemands et britanniques décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Le droit d'accès aux documents · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l’animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l’animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l’animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l’animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Un nouvel examen, publié en 2024, a mesuré que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces mesures portent sur l'Allemagne et le Royaume-Uni. L'examen de 2018 classait la France parmi les pays les moins bons pour l'identification, l'accessibilité et la qualité de ses résumés, sans les noter rubrique par rubrique (Taylor et al., 2018). Les résumés français suivent aujourd'hui le modèle européen commun.
Les animaux souffrent-ils ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d’assurer une qualité optimale d’acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l’animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l’animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Peut-on parler d'éthique en expérimentation animale ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
L’euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s’appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Application de la règle des "3R", selon le laboratoire
Réponses rédigées par le laboratoire demandeur, à des fins de communication. Elles ne sont ni sourcées ni relues par des pairs.
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Comment avancer vers la fin de l'expérimentation animale ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D’après une revue des publications d’études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l’expérience d’études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l’écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
La réglementation est-elle « très stricte » ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L’application de critères d’arrêts nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d’une euthanasie
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Spécisme et expérimentation animale · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L’augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l’âge de 3 mois et augmente avec l’âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l’âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.