Étude de la réponse immunitaire innée induite par des bactéries pathogènes chez le vertébré Danio rerio (zebrafish).

Les maladies infectieuses affectent les personnes et les animaux avec un impact considérable sur les économies mondiales et la santé publique. La résistance aux antimicrobiens est responsable des échecs de traitement entraînant une estimation de 700.000 décès humains chaque année dans le monde (OMS, 2018). Il donc est urgent de résoudre ce problème croissant en développant des thérapies alternatives. Comprendre comment les infections affectent les organismes vivants est une étape importante pour le développement de ces thérapies . Cependant, elle nécessite de travailler avec des modèles animaux. Afin d’adopter la stratégie 3R (Remplacement, Raffinement et Réduction) pour ses travaux, ce projet implique l’utilisation du zebrafish (Danio rerio) (Remplacement). Le zebrafish a été choisi car l’étude de son embryon offre de nombreux avantages pour l’étude de certaines maladies infectieuses. En effet, du fait de sa transparence, nous pouvons l’observer directement sous un microscope pour suivre sa réponse immunitaire aux infections à différents temps sans avoir à l’euthanasier. Ceci permet de Réduire de façon substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour mener convenablement les études. De surcroit, de très nombreux outils expérimentaux sont disponibles, comme par exemple, des lignées de zebrafish où l’on peut observer directement les cellules qui luttent contre les infections avec un microscope. Ces outils permettent de Raffiner les expériences et donc d’obtenir des résultats beaucoup plus robustes et statistiquement plus significatifs. Le but du présent projet est de : -comprendre le developpement d’une infection induites par des microbes impliqués dans des maladies humaines – étudier et comparer la nocivité des différentes bactéries, c’est-à-dire comprendre comment ces bactéries infectent les organismes vivants (animaux), survivent et se développent dans ces organismes, -identifier les facteurs microbiens impliqués dans ces processus -identifier les gènes de l’hôtes impliqués dans la défense contre les bactéries -identifier des médicaments ou therapies permettant lutter contre les infections bactériennes.

Le but ultime de ce projet est d’apporter des solutions thérapeutiques à des problèmes clefs du domaine des infections bactériennes. A couts terme, le projet fournira des connaissances fondamentales sur le développement des maladies infectieuses. Ces connaissances seront plubliées dans des revues scientifiques spécialisées permettant la diffusion de la science. Les différents microbes que nous étudierons ont en commun la capacité de survivre dans l’organisme qu’ils infectent, leur permettant ainsi de persister à long terme, conduisant à des infections chroniques. Ce projet permettra de comprendre comment les microbes échappent aux défenses immunitaires de de l’organisme hôte et nous identifierons les molécules produites par l’agent infectieux qui sont importantes pour la persistance du microbe dans l’organisme hôte. Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet permettront à moyen terme d’identifier des molécules pouvant être ciblée par de futurs traitements anti-microbiens. A plus long terme de nouveaux medicaments anti-bactériens seront developpés pour traiter des patients atteints d’ infections chroniques.

Les gestes techniques réalisés sur animaux de plus de 5 jours de développement sont les suivants : – Immobilisation sous anesthésie générale dans de l’eau à 28°C dans une boite avec un fond en verre pour l’observation avec un microscope, au stade 6 à 17 jours de développement sur une durée courte inferieur à 1h ou sur une longue durée (entre 1 et 15 heures au cours de la nuit). Cette intervention lorsqu’elle est courte (inférieur à 1 h) pourra être répétée une fois chaque jour jusqu’à 17 jours (n total= 46 800 embryons et larves).

Les principales nuisances attendues sont les suivantes : -Pour les embryons ayant subies une infection, les microbes présents dans l’organisme peuvent induire une infection aigue ou chronique. Du fait de l’infection, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement. – Pour les embryons traités avec des médicaments, si la dose n’est pas adaptée, elle peut induire des effets secondaires sur l’organisme. Si tel est le cas, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement La surveillance régulière des embryons par simple observation permettra de détecter ces changements dès leur apparition, la prise de nourriture et les mouvements de nage seront surveillés.

Pour chaque procédure, les animaux seront mis à mort, soit en fin d’expérience, soit en cours d’expérimentation pour tout animal qui, présente un état prédictif d’une grande douleur ou d’une mort prochaine. Pour la mise à mort, les animaux seront traités tout d’abord avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée pour atteindre une dose léthale et induire la mort. Les animaux morts seront ensuite traités avec de l’eau de javel (lorsque l’animale est infecté par un microbe), puis ils seront ensuite congelés à -20°C et éliminés comme des déchets biologiques et incinérés. Pour l’étude des gènes importants dans la défense contre les bactéries, seuls les animaux porteurs des modifications génétiques permettant l’inactivation du gène d’intérêt, seront maintenus dans notre animalerie pour constituer le stock d’animaux reproducteurs, c’est-à-dire qui seront uniquement utilisés pour des accouplements afin d’obtenir des embryons. Ces animaux seront gardés sous observation quotidienne jusqu’au stade adulte et pendant les deux premières années afin de déceler toute anomalie et détecter tout signe de maladie afin de prévenir une soufrance ou une mort éventuelle par une mise à mort.

L’espèce choisie est le zebrafish (Danio rerio). Les nouvelles techniques rendent le zebrafish pertinent pour le Remplacement des mammifères pour l’étude de l’inflammation et des maladies infectieuses notamment grâce à sa transparence et à l’utilisation d’imagerie en temps réel qui permettent de Réduire le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement bons. De plus, l’existance de nombreux outils expérimentaux permettant de suivre facilement les cellules immunitaires marquées par transparence permettent de Raffiner les études. Par rapport au modèle souris, le zebrafish répond donc parfaitement aux besoins de Remplacer, de Réduire et de Raffiner. Par sa taille, le zebrafish se révèle attractif pour la découverte de nouveaux médicaments . Pour les expériences de test de médicaments et d’infections, nous utilisons des embryons et des larves de zebrafish. Tous les gestes techniques sont effectués avant le stade 5 jours. Une partie des analyses se font sur des embryons et larves dont les stades ne dépassent pas 5 dpf et qui ne nécessitent donc pas de répondre à un protocole soumis au comité d’éthique. Seules certaines larves font l’objet d’un suivi plus long, notamment pour l’étude des infections persistentes au-delà de 5 jours. Aucune infection n’ est réalisée sur le stade adulte. Donc en fonction de l’analyse realisée, nous utiliserons des larves de différents stades de developement : du stade 1-cellule (0 jour de développement) à 17 jours de développement. Seules certaines larves etudiées en microscopie seront maintenues en vie jusqu’à 1 mois. Pour l’obtention d’animaux portant une modification génétique permettant l’étude des gènes importants pour la réponse immunitaires, les animaux sont elevés jusqu’à l’age adulte mais ne subissent aucune infection. S’ils portent la modification génétique d’intérêt, ils seront maintenus dans l’animalerie pour assurer la reproduction et pour produire des œufs.