Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 07/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-401477)
54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées de gravité légère. Elles reçoivent par voie orale des bactéries intestinales, subissent des prélèvements de selles quotidiens et une prise de sang terminale, pour étudier la mémoire immunitaire des macrophages face à différentes bactéries. Le porteur précise que les souris sans germes ont un système immunitaire incomplet et utilise cette particularité pour isoler l’effet de ses bactéries. Il conclut au « besoin » d’utiliser des animaux, aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la communication entre organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le microbiote joue un rôle fondamental dans la santé, y compris la modulation de la réponse immunitaire. Les cellules du système immunitaire inné telles que les macrophages, cellules sentinelles du système immunitaire, sont capables de reconnaître et de répondre à une grande variété de stimulations. Récemment, la capacité des macrophages à développer une réponse mémoire après un premier stimulus a été décrite : ce stimulus initial détermine la réponse inflammatoire et anti-microbienne aux stimuli ultérieurs. Cependant, les mécanismes de génération de la mémoire des macrophages contre les bactéries restent mal compris. Ce projet propose d’étudier l’effet de l’inoculation intestinale de 2 bactéries modèles différentes sur les cellules précurseurs des macrophages. Pour cela, nous avons sélectionné une bactérie bénéfique, largement caractérisée, et une autre bactérie, sans effet apparent. Nous avons précédemment analysé la réponse mémoire contre ces deux bactéries in vitro, dans des macrophages de souris. In vivo, leur passage transitoire dans l’intestin des souris conventionnelles conduit à des différences phénotypiques dans les macrophages. Nous approfondirons cette caractérisation à l’aide de souris libres de germes. La génération de souris colonisées avec chaque bactérie permettra d’analyser in vivo la réponse mémoire des macrophages contre une bactérie spécifique et d’identifier les réponses qui dépendent exclusivement de notre stimulus. De même, cela nous aidera à comprendre les mécanismes par lesquels le système immunitaire inné est entraîné lors d’un premier contact avec une bactérie bénéfique ou sans effet apparent. Ce modèle nous donnera également l’opportunité d’étudier les macrophages de souris non colonisés, chez lesquelles le développement de la réponse immunitaire innée n’a pas été préalablement conditionné par une interaction avec des microorganismes intestinaux. De plus, en raison de leur manque de microbiote, les souris sans germes ont un système immunitaire incomplètement développé, nous inclurons une bactérie incapable de coloniser les souris. La colonisation transitoire de souris libres de germes permet une maturation partielle du système immunitaire. Cette approche de cinétique de colonisation en deux temps, avec une colonisation transitoire en premier avant l’inoculation de nos bactéries d’intérêt, nous permettra donc d’analyser en parallèle l’effet isolé de nos bactéries d’intérêt dans un environnement immunitaire plus développé.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le bénéfice essentiel de ce projet est la génération de nouvelles connaissances concernant la maturation du système immunitaire en réaction à la présence de bactéries intestinales. Notamment, ces éléments pourraient permettre de mieux comprendre la manière dont une bactérie bénéfique peut avoir un effet positif sur la santé de l´ l’hôte. Par quelle(s) voie(s) les microorganismes utilisés peuvent-ils stimuler la maturation des macrophages de l’hôte ? A terme, ces connaissances pourraient servir éventuellement à la sélection de nouvelles souches bénéfiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Administrations par voie orale (- de 5 minutes par admninistration, sur animal vigile) : entre 2 et 6 administrations selon les groupes Prélèvements de fèces quotidiens (environ 5 minutes par prélèvement, sur animal vigile) : Entre 14 et 24 prélèvements selon les groupes Prélèvement de sang en fin d’essai (2 minutes), sur animal vigile: 1 seule fois pour chacun des 54 animaux Pesées des animaux (environ 30 secondes par pesée), sur animal vigile, 3 fois par semaine du début à la fin de l’essai
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Il y aura besoin de contention pour effectuer les administrations par voie orale qui peuvent générer un bref inconfort et un peu de stress pour les animaux. Par ailleurs, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang. Enfin, nous aurons également besoin d’isoler les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des feces indivuellement. Cet isolement dure quelques minutes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La survie des animaux est incompatible avec les différents prélèvements effectués en fin d’essai.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
De telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. La complexité de la réponse immunitaire n’est pour le moment pas accessible au travers de modèles in vitro. Dans notre cas particulier, cette réponse est induite suite à l’administration des bactéries qui passent par un tractus digestif complet et peuvent déclencher une réponse immunitaire que nous mesurons au niveau de la moelle osseuse. Il n’existe pas à ce jour de modèle permettant d’appréhender cette complexité et nous avons donc besoin d’utiliser des animaux.
2. Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données acquises dans des essais avec des souris conventionnelles nous ont permis de calculer les tailles de groupes suivants avec des paramètres classiques Nous effectuerons des tests statistiques pour les comparaisons directes entre deux groupes.
3. Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés quotidiennement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (5 minutes environ, pour chaque gavage et/ou récupération de fécès). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger. Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Le besoin de travailler en environnement axénique (complètement stérile), principalement en isolateurs, compatibles avec la petite taille des animaux, constituent de plus des facteurs imposant le choix de cette espèce animale. La lignée de souris choisie est une lignée de référence dans l’étude de l’inflammation et elle a été utilisée pour les premières étapes de ce projet en souris conventionnelles. Afin de comparer les résultats avec ceux générés en souris conventionnelles disposant d’un système immunitaire mature entre 6 et 8 semaines, les animaux seront utilisés au même âge.