Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/01/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-193347)
4 864 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères et leur descendance subissent un puçage, une séparation maternelle de trois heures par jour, des gavages de contaminants alimentaires et des administrations intranasales, pour étudier l’effet de stress chimiques et psychologiques périnataux sur le développement d’allergies. Le porteur décrit la séparation néonatale comme un stress « nécessaire » à ses hypothèses. Il euthanasie les femelles exposées et leur descendance pour prélever des tissus, les mâles reproducteurs étant réutilisés, et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut reproduire le passage transplacentaire et l’allaitement.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les maladies allergiques, notamment alimentaires et pulmonaires, sont un problème majeur de santé publique. Elles résultent d’une réponse immunitaire inappropriée et excessive contre certaines protéines environnementales (aliments, pollens, acariens…), alors appelées des allergènes. Ces allergènes devraient être tolérés, car ils sont inoffensifs et peuvent même être essentiels au fonctionnement et à la croissance de l’organisme. L’allergie résulte ainsi de l’absence d’une « tolérance immunitaire », que l’on cherche à rétablir au cours des protocoles de « désensibilisation ». Une augmentation constante de la prévalence et de la sévérité des allergies est observée dans les pays industrialisés depuis plus de 30 ans, démontrant le rôle de facteurs non génétiques dans cette pathologie. Ainsi, différents facteurs environnementaux peuvent agir, dès le plus jeune âge voire pendant la grossesse, et favoriser le développement ultérieur de ces pathologies. Ces facteurs peuvent notamment interférer avec la maturation de la muqueuse intestinale, du système immunitaire, et du microbiote intestinal, les trois étant étroitement liés. Un défaut de l’un de ces paramètres peut être déterminant dans la propension du nouveau-né à développer, plus tard dans la vie, une allergie. Le but de ce projet est donc d’étudier l’effet de certains facteurs environnementaux périnataux sur le développement de ces différents paramètres dans la descendance, et d’analyser leur lien avec la propension à développer une allergie (alimentaire ou pulmonaire), ou au contraire une tolérance immunitaire. Nous réaliserons une évaluation du risque sanitaire liée à l’exposition à deux stress, seuls et combinés: un stress chimique, résultant d’une exposition réaliste à un mélange de contaminants alimentaires (« effet cocktail »), et un stress psychologique. Ces travaux sont basés sur la littérature et sur l’utilisation de données issues de l’analyse de cohortes mère-enfant pour l’identification de facteurs pertinents, mais ils ne cherchent pas à reproduire des travaux déjà réalisés. Ils permettront d’établir le lien de causalité entre les expositions et la pathologie observée dans les cohortes, et d’éclairer les mécanismes sous-jacents. Ils permettront ainsi d’enrichir la connaissance scientifique sur les facteurs environnementaux périnataux favorisant le développement des maladies allergiques, aidant ainsi à établir des politiques publiques de prévention efficaces.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ces travaux permettront d’enrichir la connaissance scientifique sur les facteurs environnementaux périnataux favorisant le développement des maladies allergiques, aidant ainsi à établir des politiques publiques de prévention efficace. Ils fourniront également des modèles intéressants pour l’analyse d’autres facteurs périnataux pouvant favoriser, ou au contraire protéger, des allergies. Les résultats « négatifs » (résultats qui ne confirment pas l’hypothèse de l’étude) seront valorisés, notamment par des communications et des publications.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Les mères et la descendance seront identifiées individuellement par puçage : puces adaptées à l’âge des souris, injectées sous anesthésie légère. Le puçage est réalisé en 1-2 minutes. – Induction d’un stress psychique en séparant les portées des mères pendant 3 heures/jour, entre les 17e et 21e jours post-naissance – Des gavages intra-gastriques seront réalisés pour les expositions aux contaminants (uniquement si ces derniers ne peuvent être inclus dans les croquettes pour des raisons techniques) : 3 fois/semaine, pendant 8 semaines pour les mères, 3 fois/semaine pendant au maximum 8 semaines dans la descendance – Des gavages intra-gastriques sur animaux vigiles seront réalisés dans les animaux soumis au protocole d’induction de l’allergie alimentaire (1 gavage/semaine, pendant 7 semaines) – Des administrations intranasales sous anesthésie légère seront réalisées chez les animaux soumis au protocole d’induction de l’asthme (5 administrations, réparties sur 16 jours) – Deux à trois prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie légère, selon les groupes. Les prélèvements sont réalisés en 1-2 minutes maximum – Des prélèvements des fèces seront réalisés sur animaux vigiles : les fèces sont collectés au fond des cages, après mise des animaux en cage propre individuelle pendant quelques minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Toutes les interventions sur animaux seront réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant au maximum le stress des animaux. On ne peut cependant exclure le stress lié aux manutentions répétées lors des administrations intra-gastriques, des anesthésies, des changes et des pesées. Le puçage est réalisé par voie sous-cutanée, à l’aide de matériel spécifique adapté à la taille des souris et sous anesthésie gazeuse. La douleur et le stress sont limités, restreints au temps de la manipulation. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie légère. Au maximum, 3 prélèvements sanguins/animal sont prévus, avec des intervalles et des volumes adaptés et conformes à la règlementation. Le stress est limité, lié à la contention. Un isolement des mâles en cage individuelle est réalisé pendant 7 jours, juste en amont des mises en accouplement, ce qui peut générer un stress modéré pour ces mâles. Le stress induit par la séparation néonatale est un stress nécessaire pour répondre à nos hypothèses de recherche, mais reste d’une durée modérée par rapport à d’autres modèles publiés. Les méthodes expérimentales sont donc modérées, voire légères pour les males reproducteurs.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les femelles exposées et leurs descendances seront euthanasiées, pour prélèvementsprélever des tissus d’intérêt pour évaluer l’effet des expositions sur les différents paramètres de l’homéostasie (barrière intestinale, immunité, microbiote, métabolisme global) et de l’inflammation allergique..
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucun modèle in vitro n’est disponible pour tester l’impact des facteurs périnataux (stress chimiques, stress psychique) sur la descendance : ces effets résultent en effet du passage transplacentaire et dans le lait maternel d’une information (stress chimique appliqué, molécules ou cellules inflammatoires en résultant…), et/ou d’un comportement impactant la mise en place in utero puis en période néonatale de l’homéostasie intestinale et systémique. L’impact de ces maturations altérées ne se révèleront que plusieurs semaines plus tard, sur la capacité à développer une maladie allergique. Cette étude, nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal permettant d’analyser de façon intégrative ces différents facteurs. Un modèle mère-enfant et un modèle expérimental d’allergie alimentaire/de tolérance orale induite chez le rongeur seront ainsi mis en œuvre. Afin de limiter le nombre d’animaux en expérimentation : – En amont, la sélection des stress chimiques les plus pertinents sera réalisée grâce à l’analyse de données épidémiologiques obtenues dans des cohortes mère-enfant, combinée à des tests in vitro. – En aval, et selon les résultats obtenus, des analyses in vitro sur des modèles cellulaires humains et murins plus complexes seront réalisés, afin de compléter et de conforter les données (effet doses, études mécanistiques,…),
2. Réduction
La taille des lots est fixée à 8-12 animaux/lot, selon les taux de reproduction et la descendance obtenue. Ce nombre d’animaux à inclure est déterminé par notre expérience, et permet de prendre en compte la forte variabilité interindividuelle observée sur les paramètres mesurés, tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Des analyses statistiques seront dans un premier temps réalisées sur l’ensemble des paramètres mesurés pour chaque animal, permettant d’identifier tout individu ou toute variable aberrante. Des analyses statistiques seront ensuite menées, visant à construire un modèle discriminant nos groupes de traitement à l’aide de tous les paramètres analysés, et permettant d’identifier les groupes de variables permettant de discriminer les lots. Des analyses sur chaque paramètre mesuré pris individuellement seront réalisées en parallèle, afin de confirmer nos observations. La combinaison de ces approches statistiques permettra une analyse objective et maximisée de l’ensemble des paramètres analysés.
3. Raffinement
Toutes les interventions sur animaux sont réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant le stress des animaux. Les cages sont enrichies par des sopalins et des coques type boite à œuf, permettant la fabrication d’un habitat et des nids. Les animaux sont hébergés par groupe, avec une taille de cage règlementaire adaptée au nombre d’animaux, permettant un comportement grégaire et sociable. Les cages sont placées en armoire ventilée, permettant une isolation phonique vis-à-vis de l’extérieur. Les animaux sont surveillés visuellement quotidiennement pour identifier rapidement tout animal en souffrance. Des points limites sont établis pour identifier ces animaux. Si un tel animal est identifié, une fiche de suivi individuel est initiée et l’animal sera isolé et surveillé spécifiquement plusieurs fois par jour, par les zootechniciens et les responsables de la procédure. En cas de non amélioration, il sera sorti de la procédure expérimentale et euthanasié. Par ailleurs, chaque animal est suivi par mesure hebdomadaire de son poids.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle souris présente de nombreux avantages, notamment la disponibilité de lignées caractérisées, un système immunitaire bien décrit, de nombreuses données sur la réponse allergique. De plus, de nombreux réactifs permettant l’étude du système immunitaire sont disponibles chez cet animal. La souche de souris utilisée est particulièrement utilisée dans nos protocoles du fait d’un phénotype biaisé vers une réponse immune de type Th2, mimant ainsi le sujet atopique (c’est-à-dire la prédisposition génétique à développer une allergie). Ce modèle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire, ainsi que le modèle mère-enfant. La mère en devenir, gestante et/ou allaitante, sera exposée aux facteurs environnementaux via son régime alimentaire, à des doses réalistes, afin d’étudier l’impact de ces expositions en période critique sur la santé de la descendance, qui sera évaluée après le sevrage