Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 09/04/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-502005)
Une partie des souris est génétiquement prédisposée à développer des tumeurs du côlon, l’autre privée du gène de la tétraspanine 8. 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont marquées par section d’une phalange, gavées avec des bactéries choisies pour leur rôle pro-cancéreux, puis saignées par ponction derrière l’œil sous anesthésie, la progression tumorale étant suivie deux fois par semaine par l’aspect du pelage, celui de l’anus et la présence de sang dans les selles. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure pour prélèvements, sauf celles retenues pour entretenir la lignée.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet a pour but d’étudier le rôle de la tétraspanine 8 (Tspan8) dans le côlon en termes physiologique et physiopathologique. Cette protéine est majoritairement localisée dans la membrane des épithéliums notamment dans le tube digestif et est connue pour être associée à des processus métastatiques dans le cancer colorectal. Pour ce projet, nous utiliserons des souris invalidées pour Tspan8 et des souris prédisposées à dévolopper un cancer colorectal. L’objectif principal sera de générer un modèle d’étude prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8 afin d’établir l’implication éventuelle de cette protéine sur la carcinogénèse colique. Le second objectif consistera à définir l’importance de cette dernière dans la perméabilité intestinale et son rôle sur le microbiote intestinal dans les deux contextes. En effet, ce dernier est un acteur majeur des (dis-) fonctions intestinales et il a été montré que les tétraspanines peuvent interagir avec des souches bactériennes. De ce fait, nous évaluerons également si TSPAN8 peut être partenaire pour des bactéries commensales ayant acquis des facteurs de virulence et connues pour jouer un rôle procarcinogène dans le cancer du côlon (Escherichia coli productrice de colibactine). Enfin, nous testerons la même hypothèse avec une entérobactérie murine Citrobacter Rodentium mimant une infection par entérobactérie chez homme.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude est partie intégrante d’un projet plus large visant à caractériser l’effet du microbiote intestinal sur la survenue de cancers colorectaux. En effet, l’étude des modifications de la structure de la barrière intestinale et de la colonisation bactérienne, en contexte sain ou pathologique sur des souris invalidées pour le gène de la TSPAN8, nous permettra de définir le rôle pro tumoral de cette protéine et de débuter les études mécanistiques visant à établir le lien entre cette protéine et les bactéries intestinales. A terme, ces études permettraient de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer colorectal.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à un gavage intragastrique (douleur légère, faible durée quelques secondes) et des prélèvements de sang par technique rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse en pré-mortem (douleur légère, faible durée quelques secondes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour les souris ne produisant pas la protéine d’intérêt TSPAN8, il n’est pas attendu de phénotype dommageable au vu des précédentes observations. Pour les souris prédisposées à développer un cancer colorectal, la croissance tumorale sera appréhendée par une observation bi-hebdomadaire des souris. Une fiche de score sera réalisée pour chaque souris et permettra de déterminer si l’animal est en souffrance. Les animaux seront génotypés/marqués par phallangectomie. Cette technique entraîne une douleur légère et de faible durée. Plusieurs paramètres généraux, comportementaux et d’autres liés au modèle seront observés : suivi du poids, aspect du pelage et de l’orifice anal, consistance et présence de sang dans les selles, locomotion, comportement innée et induit. Un suivi renforcé (quotidien) sera également mis en place dès l’apparition des premiers signes de douleur (noté sur la fiche de score) afin d’intervenir la plus rapidement. Les animaux pourront également subir un gavage intragastrique (douleur légère, très courte durée) ou un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital en prémortum sous anesthésie gazeuse (douleur légère, très courte durée).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour des prélèvements post-mortem sauf ceux nécessaires à l’entretient de la lignée.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La caractérisation des propriétés de la Tspan8 sur l’architecture de l’épithélium intestinal en contexte sain sera complétée par des études in vitro sur cellules coliques polarisées. Cependant, l’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il est impossible d’étudier le rôle de la Tspan8 lors d’une infection chronique en modèle in vitro. De même, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’étudier la perméabilité intestinale à l’échelle systémique en présence de microbiote intestinal sain ou pathologique. Enfin, l’étude du rôle de la TSPAN8 sur la modulation du microbiote intestinal en contexte sain ou pathologique doit obligatoirement être réalisé sur modèle animal.
2. Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire sur modèle sain (Tspan-/-) ou pathologique (APCmin/+) ont mis en évidence une forte variabilité des modèles (variabilité inter individuel), de la colonisation bactérienne post gavage, de son maintien au cours du temps, de la progression tumorale en fonction du temps et de l’étude de le perméabilité intestinale. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance des modèles et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Lors de la création de la lignée le nombre d’animaux est également réduit à son minimum afin d’obtenir à terme un minimum de 7 souris femelles et mâles présentant le génotype d’intérêt pour l’étude du bien être animal.
3. Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un suivi qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal-être quel que soit le modèle (sain ou pathologique). Le cas échéant, l’animal sera isolé et traité à l’aide d’antidouleurs de manière graduelle à la souffrance observée. Les animaux seront hébergés avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’eau et l’alimentation seront fournis à volonté et disposé dans le fond de cage pour faciliter son accès. La litière sera changée en fonction des besoins de chaque cage. Durant la phase de création de la lignée, les animaux bénéficieront du même raffinement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’étude des processus de progression tumorale ne peut s’effectuer que dans un organisme vivant proche de l’homme, en l’occurrence, le modèle souris. Celui-ci est aussi particulièrement adapté aux expériences d’infection bactérienne et d’étude de la perméabilité intestinale. Dans le modèle prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8, nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois correspondant respectivement à la période d’apparition des premières lésions et d’un stade avancé de développement tumoral. Pour le modèle uniquement invalidé pour la synthèse de la Tspan8, nous regarderons aux temps 2,3 et 4 mois les modifications de perméabilité de l’épithélium intestinal. La colonisation bactérienne sera suivi en temps réel 1fois/semaine.