Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 28/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-323610)
Cinq minutes séparent l’incision de la paroi abdominale de la mise à mort. 120 rats vont être utilisés dans ce protocole, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, pour prélever leur foie et en isoler des hépatocytes. Ces cellules alimenteront une biobanque et serviront à cribler des molécules, lipides, médicaments mitotoxiques ou pesticides, au sein des autres projets du laboratoire. Le porteur indique que les échantillons de foie humain disponibles sont rares et de qualité variable, et retient le rat parce qu’une perfusion en fournit environ 500 millions de cellules contre 50 millions chez la souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Nous souhaitons isoler de manière routinière des hépatocytes et cellules non parenchymateuses de rat pour servir de modèles d’études au sein des projets du laboratoire. Notamment les cellules isolées pourront servir à des fins de screening in vitro de molécules (lipides, médicaments mitotoxiques, pesticides…) ou de modèles pour la culture 2D et 3D. Les cellules seront isolées puis distribuées fraichement isolées en fonction des besoins des chercheurs et doctorants ; l’excédant produit sera congelé pour réaliser une biobanque de cellules qui seront caractérisées avant chaque mise à disposition.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet permettra aux chercheurs de l’unité d’avancer sur leurs études en l’absence de cellules humaines en optimisant le nombre d’animaux et en réduisant la variabilité due à l’opérateur ou aux réactifs. Cela permettra aussi de sélectionner des milieux de congélation qui pourront servir pour l’établissement d’une biobanque de cellules congelées de rat, humaines ou éventuellement issues d’autres espèces.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux (120) sont soumis à une anesthésie générale de courte durée pour permettre d’inciser la paroi abdominale et accéder au foie. Une injection d’anticoagulant (héparine) par voie intraveineuse en début de chirurgie permettra de limiter le risque d’échec de la perfusion dû aux caillots sanguins formés pendant la mobilisation du foie ; elle sera réalisée sous anesthésie pour ne pas générer de stress à l’animal. La mort est induite pendant l’anesthésie dans les 5 minutes suivant l’incision, juste avant l’isolement des cellules par perfusion.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Un protocole d’anesthésie générale adapté est mis en place pour supprimer la douleur associée à l’incision de la paroi abdominale pour accéder au foie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’isolement des cellules implique le prélèvement du foie après mise à mort de l’animal sous anesthésie générale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le foie isolé et les cellules du foie de rat et humain sont des modèles alternatifs très utilisés en recherche fondamentale et pour l’évaluation réglementaire des médicaments en phase préclinique. Ces modèles permettent de remplacer le test des molécules sur les animaux vivants tout en permettant d’augmenter grandement le nombre de tests par échantillon. Les échantillons de foie humain disponibles pour la recherche sont rares et de qualité variable ce qui limite leur utilisation à des fins de criblage ; de plus l’ischémie imposée aux tissus humains génère des altérations supplémentaires qui limitent les rendements cellulaires. Le recours à l’utilisation des rats est donc nécessaire et permettra d’identifier les réactifs permettant d’augmenter le rendement et la qualité des cellules isolées chez le rat pour une application future sur des échantillons de foie humain.
2. Réduction
La technique de perfusion de référence est maîtrisée par l’équipe et permet d’obtenir un grand nombre de cellules par animal pour réaliser des tests in vitro. Les animaux utilisés pour la sélection des réactifs et formation aux gestes techniques (n=20) permettront d’optimiser les isolements de routine. 50 lots de 2 animaux (n=100) seront utilisés pour réaliser environ 1 session d’isolement par mois pendant 5 ans ; ce nombre a été déterminé comme minimal pour permettre l’utilisation des cellules dans les projets, tout en prenant en compte le risque d’échec de la perfusion.
3. Raffinement
L’environnement des rats est enrichi (cage avec couvercle surélevé permettant aux animaux de se mettre debout ; bâtonnets de bois et carré de coton sont ajoutés dans la cage) et l’étude est organisée de manière à maintenir le contact social des rats au cours de leur hébergement. Si toutefois un animal présente des signes de maladie ou d’anxiété (absence de prise de poids au cours de l’hébergement, troubles du comportement, signes d’agressions), il est retiré de l’étude et mis à mort pour limiter sa souffrance. Le maintien d’une anesthésie générale tout au long de la procédure permet de supprimer la douleur causée par l’incision de la paroi abdominale. En cas de signes de douleur au cours de l’anesthésie (mouvement de la peau), la procédure est suspendue et l’anesthésie est réadaptée. Si le rat présente toujours des signes de douleur 5 min après l’adaptation de l’anesthésie, la procédure s’arrête et le rat est mis à mort pour limiter sa souffrance. Une injection intraveineuse d’anticoagulant (héparine) permettra d’améliorer le taux de réussite des perfusions en évitant la formation de caillots sanguins au cours de la chirurgie. Le choix de cette voie d’injection permettra une action immédiate de l’anticoagulant, ce qui permettra de réaliser l’administration sous anesthésie sans générer de stress à l’animal. Tous les prélèvements et la perfusion du foie sont réalisés post-mortem pour n’occasionner aucune douleur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’optimisation des conditions d’isolement des hépatocytes est historiquement faite chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats avec la littérature. Les hépatocytes primaires de rat sont un modèle d’étude répandu en pharmacologie préclinique, les perfusions de foie de rat permettent d’obtenir une quantité suffisante de cellules afin de réaliser des tests (environ 500 millions/rat) contrairement à la souris (environ 50 millions/souris). Les rats Sprague Dawley sont commandés à 5 semaine (110-200g) et utilisés à 6 semaines (180-230g), poids standard d’utilisation pour l’isolement des hépatocytes.