Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 28/05/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-729619)
Réutilisées d’une ponte à l’autre après stimulation hormonale, 100 femelles xénopes sont maintenues en vie, tandis que 500 autres xénopes sont tués pour prélever ovaires et testicules. Les animaux relèvent d’un niveau de souffrance sans réveil ou léger, dans un projet de recherche fondamentale sur la reprogrammation épigénétique du destin cellulaire. Chaque semaine, un mâle est tué pour la purification de cellules germinales et une femelle pour ses ovaires. Les autres femelles servent de façon répétée à la ponte, induites tous les six mois, avant d’être à leur tour utilisées.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le projet vise à décrire les mécanismes épigénétiques permettant la programmation et la reprogrammation du destin cellulaire. Nous abordons trois questions en relation avec cette thématique. 1-Dans quelle mesure les modifications associées aux histones retenues dans le spermatozoïde contribuent a la régulation du développement embryonnaire précoce ? Pour cela nous décrivons le paysage épigénétique du spermatozoïde par des techniques de ChIP-seq quantitative puis évaluons l’effet de perturbation de ces instructions épigénétiques paternelles sur le développement de l’embryon. 2-Quels sont les mécanismes épigénétiques qui stabilisent le destin des cellules somatiques ? Nous réalisons des expériences de clonage au cours desquels un embryon est généré par transplantation du noyau d’une cellule différenciée dans un œuf énucléé. Le développement d’un tel clone est limité par des verrous épigénétiques présent au sein de la chromatine de la cellule donneuse. Pour identifier ces mécanismes de stabilisation du destin cellulaire, nous désactivons des voies épigénétiques de la cellule différenciée et évaluons si cela réduit la résistance a la reprogrammation par les composantes de l’œuf (ce traduisant par une amélioration du clonage). 3-Quels sont les mécanismes moléculaires et cellulaires qui gouvernent les processus de régénération ? Nous tirons bénéfice du fait que les têtards de Xenopus Laevis présentent des capacités de régénération (queue, pattes) qui varient au cours du développement pour réaliser des études comparatives permettant d’identifier les processus moléculaires et cellulaire associées a un bon déroulement de la régénération. Nous focalisons nos études sur l’influence du système immunitaire dans la réponse régénérative. MODIFICATIONS Pour tester la fonction de voies épigénétiques d’intérêt a des stades précoces du développement, les stratégies reposant sur des injections d’ARNm dans des zygotes sont les approches déployées. Cependant les ARNm ne persistent pas suffisamment longtemps pour exercer des effets aux stades tardifs. D’autre part les stratégies reposant sur des injections d’ARNm ne permettent pas de réaliser des interférences spécifiquement dans certains tissus. En conséquence, pour permettre des tests fonctionnels a des stades développementaux tardifs et de façon tissue spécifique nous employons dans ce cas des animaux transgeniques qui nous permettent ce niveau de contrôle spatiaux-temporel.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre recherche fondamentale a pour objectif de mieux comprendre des mécanismes moléculaires et cellulaires dont la compréhension a un fort potentiel pour la santé humaine : 1- Compréhension des mécanismes de transmission d’information épigénétiques entre générations. Une meilleure description/compréhension de ces mécanismes, en particulier de la possibilité que la lignée germinale male puisse transmettre à la descendance l’effet de l’exposition paternelle a l’environnement peut aider à orienter les politiques de santé publique. 2-Compréhension des mécanismes stabilisant le destin cellulaire. Un déséquilibre de ces mécanismes peut contribuer a des pathologies chez l’homme (déstabilisation dans le cas de cancer par Example). 3- Le déchiffrage des processus permettant la régénération, très efficace chez le Xenope, peut identifier des voies moléculaires et cellulaires a cibler pour améliorer les processus régénératifs chez l’homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subissent uniquement des injections d’homones. Pour les femelles il sagit de deux injections en sous-cutannee espacees de 2 a 7 jours , repetees tous les 6 mois. Les animaux sont manipulés pour moins de une minute: prelevement du bac d’elevage pour immobilisation sur paillasse humide suivie d’injection (quelques secondes) puis retour en bac de ponte.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures decrites ont des effets modérés sur les animaux. Il s’agit uniquement d’injection sous cutanées d’hormones pour stimuler la ponte. L’injection sous-cutanée ne provoque pas de saignement et n’induit pas de douleurs pour l’animal. Le produit injecté n’est pas toxique pour les animaux. Par précaution les animaux soumis à injection ne sont pas nourris le jour précédant, car les injections provoquent quelques fois des phénomènes de regurgitations
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Apres stimulation de la ponte les femelles sont mise au repos puis reutilisees ulterieurement pour de nouvelles pontes. Ceci permet d’obtenir regulierement des oeufs de bonne qualite tout en lilitant le nombre d’animaux utilises. Dans le cas des prelevements d’organes, les animaux sont mis a mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’y pas d’alternative actuelle a l’utilisation d’animaux pour l’obtention de cellules germinales fonctionnelles. Les efforts actuels, chez la souris en particulier, de production de cellules germinales in vitro à partir de cellules souches ne permettent pas d’atteindre des cellules pleinement différentiées. L’utilisation de dérivés de cellules souches mimant le développement embryonnaire précoce n’est également pas une option car nous nous intéressons a l’influence de l’épigénome de la lignée germinale sur le déroulement du développement embryonnaire précoce. Cependant, les études de la spermatogenèse en cours dans notre laboratoire nous amène a développer un modèle de spermatogenèse Ex-vivo qui pourrait conduire á la mise en place d’un protocole de spermatogenèse in vitro, réduisant ainsi l’utilisation de males.1
2. Réduction
Les pratiques pour réduire l’utilisation des animaux dans notre laboratoire sont les suivantes : 1-Mutualisation des animaux utilisés : Étant donne l’abondance des œuf/ovocytes produits par une femelle, le matériel produit permet dans la majeure partie des cas la réalisation d’une multitude d’expériences. En conséquence, la planification de l’utilisation des animaux est optimisée pour accommoder les besoins du plus grand nombre possible d’expérimentateurs. 2-Reutilisation des animaux : Les femelles utilisées pour la ponte sont réutilisées suite à une période de repos. 3-Optimisation de l’utilisation des testicules pour les fécondations in vitro. Les testicules issus d’un males peuvent être utilisées pour réaliser plus de 10 fécondations in vitro. La durée de stockage de ces testicules est de 15 jours. En conséquence les expériences impliquant les FIVs sont regroupées dans le temps afin de maximiser l’utilisation des testicules et limiter le nombre de males sacrifiés. 4-De la même façon nous avons optimisé l’utilisation des ovaires en améliorant les conditions de d’utilisation des organes prélevés. Les ovocytes sont dissociés par une solution enzymatique, tries manuellement, puis stockes a 14 degré dans une solution contenant des antibiotiques. Chaque jours, une élimination des ovocytes défectueux et un renouvellement du milieux de culture permet d’étendre la survie de ces cellules au-delà d’une semaine. La détermination du nombre d’animaux utilisés est basée sur les calculs suivants : Nous envisageons l’utilisation de ~350 femelles et de ~ 250 males Xenopus Laevis. L’utilisation se décompose en 3 modes : 1/Animaux réutilisés au cours du projet : Les femelles sont utilisées par lot de 2 pour la ponte. Deux pontes par semaine en moyenne >soit environ 200 pontes par an> 100 femelles (les femelles sont induites pour ponte tous les 6 mois). 2/ Prélèvement d’ovaires. Sacrifice d’une femelle par semaine pour prélèvement d’ovaires > ~ 250 femelles 3/ Prélèvement de testicules. Sacrifice d’un male par semaine pour prélèvement de testicules et purification de cellules germinales > ~250 males
3. Raffinement
Un nouveau protocole de stimulation de ponte a été testé permettant l’utilisation d’une même femelle pour deux pontes successives espacées de 1 a deux semaines, l’animal étant ensuite mis au repos pour ~3mois. Ce protocole permet d’obtenir deux fois plus d’œufs, de qualité comparable, a partir d’une même femelle, réduisant ainsi le pool d’animaux utilse2 pour la ponte. Pour les expériences de régénération nous avons mis au point une protocole de régénération ex-vivo qui permet de recapituler certaines étapes de la régénération d’un membre. Ce protocole permet d’étudier la régénération après euthanasie, réduisant ainsi la souffrance de l’animal. En outre il permet d’amputer les deux membres d’un animal plutôt qu’un seul lorsque les études sont réalisées in vivo.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les espèces ont été choisie en raison de l’abondance, de l’accessibilité du matériel biologique étudié (ovocytes, spermatozoïdes, embryons). Ce modèle permet la réalisation a grande échelle d’expériences de clonage, d’• Injection Intracytoplasmic de spermatozoide (ICSI), et de production d’embryons haploïdes. Enfin il présente des caractéristiques uniques de la spermatogenèse (remodelage partiel des nucléosomes) permettant des analyses épigénétiques qui ne sont pas possibles dans d’autres modelés animaux tel que souris, zebrafish, drosophille, ou le nématode Caenorhabditis Elegans. Une autre caractéristique cruciale de ce tétrapode est l’existence d’une période étendue (8 division cellulaire) entre la fécondation et l’initiation de la transcription du génome zygotique. Cette caractéristique est cruciale pour l’étude de la transmission des caractères epigenetiques dérivés de la lignées germinales. En effet cette fenêtre temporelle de 8 cycle cellulaires permet par example de perturber la transmission des marques epigenetiques derivées du spermatozoide et d’en etudier l’impact sur l’activation des genes zygotiques. Enfin l’abondance des œufs permets la production d’extrait qui peuvent etre utiliser pour identifier les facteurs maternelles impliques dans la reconaissance/propagation des signaux epigenetiques issus du spermtozoide. Les animaux sont sexuellement matures, soit >= 1 an chez Xenopus Laevis