Procédures légères

Mesurer comment le vieillissement et le sexe altèrent la mémoire des odeurs : 750 souris âgées de deux à dix-huit mois vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les tests comportementaux sont détaillés, exposition répétée à un odorant puis évaluation du souvenir à différents délais, étalés sur deux mois. Une partie subit une chirurgie d'injection de vecteurs viraux dans le cerveau et l'implantation de fibres optiques, avec un risque que les congénères dégradent le matériel et la zone cérébrale correspondante, ou que les animaux se blessent entre eux. Toutes sont tuées pour prélèvement du cerveau, notamment afin de contrôler que les injections et les implantations ont bien atteint leur cible.

Objectifs

Les odeurs guident le comportement animal (alimentation, prédateurs et reproduction) et sont sources de plaisir et de lien social chez l’humain, contribuant à notre santé mentale et physique. Les odeurs sont également une voie d’entrée pour moduler le fonctionnement cérébral, mais les mécanismes sous-jacents restent méconnus. Nous faisons l’hypothèse que cette action des odeurs soit médiée par l’induction d’une libération généralisée de noradrénaline. Le vieillissement modifie progressivement l’organisation et le fonctionnement cérébral, de manière similaire chez la souris et l’humain : notamment ceux du système olfactif permettant la perception et la mémorisation des odeurs. Ainsi, la durée de la mémoire olfactive est réduite dès l’âge moyen (12 mois) chez les souris mâles, avant une détérioration complète à 18 mois. Le système neuromodulateur noradrénergique régulant la mémoire olfactive chez le jeune adulte, nous faisons l’hypothèse qu’un déficit noradrénergique contribue à l’altération de la mémoire olfactive à l’âge moyen. Des stratégies de promotion du bien-vieillir visant à stimuler le système noradrénergique ont été développées. Par exemple, un enrichissement olfactif tout au long de la vie, améliore l’olfaction des souris âgées mais également la cognition de manière globale, avec un remaniement de l’innervation noradrénergique et de l’activation cérébrale. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-tendant la capacité des odeurs à mobiliser le système noradrénergique restent à explorer. Enfin, alors que des différences anatomo-fonctionnelles liées au sexe sont maintenant identifiées dans de nombreux processus physiologiques, l’influence du sexe sur les mécanismes du fonctionnement et du vieillissement cérébral n’est que très rarement étudiée. Combinant des approches anatomiques et fonctionnelles chez la souris, ce projet de recherche fondamentale étudie les spécificités liées au sexe et les altérations liées au vieillissement de : 1) la mémoire olfactive, 2) l’effet des odeurs sur le fonctionnement cérébral, et 3) l’action de la noradrénaline. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes du vieillissement cérébral en incluant la dimension du sexe et contribuera ainsi au développement de stratégies de remédiation du vieillissement, dans une perspective de médecine personnalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’action des odeurs sur le fonctionnement cérébral global, le mode d’action de la noradrénaline et les mécanismes cellulaires sous-tendant le vieillissement cérébral en interaction avec l’effet du sexe, pour pouvoir proposer des stratégies de remédiation/promotion du bien-vieillir, qui soient les plus efficaces possibles et qui prennent en compte les différences liées au genre dans une perspective de médecine personnalisée. Il s’agira de produire la 1ere démonstration sans ambiguité de la capacité des odeurs à induire la libération de noradrénaline dans différentes régions cérébrales et à moduler leur fonctionnement, hypothèse pour laquelle il n’existe actuellement que des preuves indirectes. A l’issue de ce projet, il pourra être envisagé de proposer la mise en place de stratégies de promotion du bien vieillir chez l’humain, basées sur l’utilisation des odeurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des test comportementaux visant à étudier leur capacité d’apprentissage et de mémorisation des odeurs. Pour cela, ils seront entrainés (cet entrainement se fait par simple exposition répétée à un odorant) puis évalués à différents délais après l’apprentissage pour évaluer pendant combien de temps ils se souviennent des odorants appris. L’ensemble de ces tests comportementaux s’étalera sur 2 mois et sera effectué sur des groupes d’animaux différents à différents âges pour étudier l’effet du vieillissement. Afin d’analyser la libération de noradrénaline chez l’animal vigile en comportement, une approche en photométrie par fibre optique sera utilisée. Elle nécessite des injections intracérébrales de vecteurs viraux et à l’implantation de fibres optiques lors d’une chirurgie. L’ensemble de cette intervention comprend la chirurgie (d’une durée de 30 min), la phase de récupération et les enregistrements pendant le comportement et s’étend sur 2 mois maximum. Afin de caractériser les contacts établis par les fibres noradrénergiques sur différents neurones, nous utiliserons la technologie GRASP permettant de révéler les contacts entre deux populations neuronales spécifiques. Elle nécessite des injections intracérébrales de vecteurs viraux lors d’une chirurgie. L’ensemble de cette intervention comprend la chirurgie (d’une durée maximale de 45 min) et la phase de récupération et s’étend sur 6 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux implantés avec une fibre optique (procédure chirurgicale) étant remis entre congénères (pour éviter l'isolement des animaux), ils peuvent être susceptibles de se blesser. Des dégradations du matériel d’implantation et donc de la zone cérébrale correspondante peuvent aussi être engendrées. Les chirurgies peuvent également induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Enfin, la manipulation des animaux ainsi que les injections intrapéritonéales peuvent induire chez les animaux un stress léger. Une surveillance sera mise en place à l’aide d’une grille de score évaluant l’état physiologique et comportemental de l’animal, définissant des points limites connus et maitrisés.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour 1) contrôler les injections et implantations chirurgicales et 2) analyser post-mortem l’activité neuronale ou les connexions entre les neurones.

Remplacement

L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neurales du comportement (ici apprentissage et mémoire olfactifs et l’impact du sexe et du vieillissement) nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur des modèles strictement in vitro. Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux (10 à 15 souris par groupe selon les méthodologies), pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats. Lorsque cela était possible sans compromettre le résultat des expériences et sans altérer le bien-être des animaux, nous avons prévu d’effectuer plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Ces prévisions sont basées sur les précédentes études de l’équipe et les données de la littérature. De plus, pour assurer la fiabilité statistique nous randomiserons les animaux et les groupes, et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous corrélerons (grâce à des statistiques adaptées) le comportement et les paramètres cellulaires sur les mêmes animaux.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée pour détecter les points limites de souffrance. Le poids et l’apparence physique seront vérifiés pendant toute la durée du protocole. Pour réduire le risque d’un impact physique et psychique, une semaine de repos sera effectuée à l’arrivée des animaux avant début des expérimentations. Une sciure avec copeaux longs sera utilisée. Les animaux seront maintenus en groupe (de 5 maximum), avec nourriture et eau à volonté. Les cages sont transparentes pour favoriser la communication. Lors de la procédure chirurgicale, les souris seront placées sous anesthésie générale à l’aide d’un analgésique approprié. Une injection d’antalgique sera pratiquée avant et après chirurgie, réitérée ensuite en fonction de l’état de l’animal. En attendant un réveil partiel, les animaux seront placés sous une lampe chauffante. Le test de pli de peau sera pratiqué pour vérifier le niveau d’hydratation (une injection de NaCl sera faite si besoin). Le poids sera contrôlé pendant les jours suivants. L'état général sera évalué régulièrement pendant la phase de récupération.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse, c’est-à-dire l’effet du vieillissement sur le fonctionnement cérébral. De plus, le cerveau et le système olfactif humain et murin présentent de grandes similarités anatomiques et fonctionnelles, y compris des altérations similaires liées au vieillissement, faisant de cette espèce un très bon modèle pour étudier le vieillissement cérébral et le système olfactif. Le modèle murin permet l’accès à une analyse à l’échelle cellulaire du fonctionnement cérébral, inaccessible chez l’humain. Enfin, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce ; elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude, et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. Afin d’étudier l’effet du vieillissement sur la mémoire olfactive et les mécanismes cellulaires sous-jacents, les expériences seront réalisées aux stades jeune adulte (2 mois) et à différents stades de vieillissement (9, 12 et 18 mois), afin de définir la chronologie de l’altération de ces processus. La maturité sexuelle, qui se situe à 8 semaines chez les femelles et 10 chez les mâles, est atteinte. Les âges (jeune adulte 2 mois, âge moyen 9-12 mois, âge avancé 18 mois) ont été choisis sur la base de la littérature existante sur le vieillissement.

Nourries au régime riche en graisses pendant huit ou dix-sept semaines, mises à jeun jusqu'à seize heures, injectées au glucose ou à l'insuline dans l'abdomen, saignées cinq fois à la queue en quatre-vingt-dix minutes, 180 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit en plus des virus porteurs de gènes dans une veine de la queue, une autre voit son rythme jour-nuit dérégulé. Toutes sont tuées pour que leur foie soit analysé. Le porteur décrit une alimentation choisie pour reproduire la maladie "sans trop affecter la santé générale des souris", tout en énumérant les signes attendus en cas de cirrhose décompensée : fatigue, perte d'appétit, amaigrissement, crampes musculaires et vomissements.

Objectifs

Comprendre le "foie gras humain" et ses causes. Le "foie gras humain", ou stéatose hépatique métabolique, est une maladie où de la graisse s'accumule dans les cellules du foie. Elle concerne environ un Français sur quatre. Dans un cas sur cinq, cette accumulation provoque une inflammation du foie. Avec le temps, cela peut causer des cicatrices sur le foie (fibrose), pouvant évoluer en cirrhose (grave atteinte du foie) ou même en cancer. Pourquoi cette maladie est-elle de plus en plus courante ? Plusieurs facteurs liés à notre mode de vie moderne en sont responsables : 1) Sédentarité : on bouge moins; 2) Surconsommation alimentaire : trop de nourriture, surtout grasse et sucrée; 3) Dérèglement des rythmes biologiques : travail de nuit ou alimentation décalée perturbent l'horloge interne de notre corps. Que cherchent les chercheurs ? Pour mieux comprendre cette maladie, des scientifiques étudient des souris nourries avec un régime riche en graisses pendant 4 mois. Ce régime reproduit chez ces souris des symptômes proches de ceux des humains lorsqu'ils se nourissent mal et de manière excessive : accumulation de graisse dans le foie, inflammation, et cicatrices. Ils s'intéressent à un phénomène de modifications chimiques liées aux gènes appelé "changements épigénétiques". Ces modifications chimiques n'altèrent pas l’ADN lui-même mais influencent le fonctionnement des gènes, notamment ceux liés à la gestion des graisses par le foie. Les objectifs de leur recherche est d'étudier comment l’expression des gènes du foie est altérée par un régime riche en graisses. Comprendre les modifications épigénétiques provoquées par ce régime. Découvrir comment ces changements épigénétiques contribuent à l’apparition du "foie gras" et de ses complications. Identifier les protéines impliquées dans le dérèglement de l’horloge biologique (travailleurs de nuits, les gens souffrant de décalage horaire) qui favorise cette maladie. En résumé, cette étude vise à démêler les mécanismes cachés derrière le "foie gras" et à mieux comprendre comment notre alimentation et notre mode de vie influencent la santé du foie. Ces découvertes pourraient un jour aider à prévenir ou traiter cette maladie.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre le "foie gras humain" pour mieux le traiter Pour mieux prévenir et traiter le "foie gras humain" et son évolution vers des formes graves comme l'inflammation sévère, la cirrhose ou le cancer du foie, les chercheurs s'intéressent à ce qui se passe au niveau des molécules dans notre corps. Ils cherchent à comprendre comment certains changements chimiques liés aux gènes mais qui n'induisent pas de mutations influencent le fonctionnement des gènes du foie. Ces changements, déclenchés par des facteurs comme l'alimentation malsaine (graisses animales et sucres contenus dans les boissons comme les jus et sodas), peuvent aggraver l'inflammation et provoquer des cicatrices dans le foie (fibrose). Les bénéfices découlant de ce projet sont de développer de nouveaux traitements capables : 1) D'empêcher la maladie de se développer dès ses débuts; 2) de stopper son évolution avant qu'elle n’atteigne des stades graves nécessitant une greffe de foie. En décryptant ces mécanismes biologiques, on pourrait créer des médicaments innovants qui aideraient à protéger le foie et à éviter des complications graves liées aux maladies métaboliques du foie.

Procédures

Suivi des souris et protocoles expérimentaux Dans cette étude, nous utilisons des souris âgées de 7 semaines pour comprendre l'impact d'un régime riche en graisses sur le foie. Ce régime est suivi pendant 8 semaines pour observer une accumulation modérée de graisse dans le foie (stéatose bénigne) et pendant 17 semaines pour étudier une atteinte plus sévère, avec inflammation et formation de tissu cicatriciel (stéatohépatite). Les souris du groupe témoin suivent, pendant la même durée, un régime alimentaire standard. Avant certaines analyses, les souris sont mises à jeun : • Pendant 4 heures avant de mesurer leur glycémie • Pendant 14 à 16 heures avant les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline. Ces tests impliquent une injection unique de glucose ou d’insuline dans l’abdomen de l’animal (la durée de l’injection est de 30 secondes). Ensuite, plusieurs échantillons de sang sont prélevés sur la queue pour mesurer la glycémie à l’aide d’un appareil spécifique (glucomètre). Ces analyses se font à des intervalles précis (15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection). Chaque souris ne subit ce test qu’une seule fois au cours de l’étude. D’autre part, nous utilisons une technique de modification génétique où des virus transportant des gènes spécifiques sont injectés dans une veine située au niveau de la queue des souris (la durée de l’injection est d’une minute). Une crème anesthésiante est appliquée avant cette injection pour limiter l’inconfort. Cette procédure, réalisée à l’âge de 8 semaines, permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques en jeu.

Impact sur les animaux

Les souris qui suivent ce régime prennent du poids et peuvent avoir plus de mal à se déplacer dans leur cage. Lorsque la maladie métabolique du foie progresse, certaines peuvent ressentir un inconfort, voire des douleurs, notamment en cas d’inflammation ou de fibrose. Le dérèglement du rythme biologique (rythme circadien) peut aussi provoquer du stress chez ces souris par rapport à celles qui conservent un rythme naturel. Les injections nécessaires aux tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline peuvent être inconfortables. De plus, l’injection d’insuline peut, dans certains cas, provoquer une baisse excessive du taux de sucre dans le sang (hypoglycémie). Si cela se produit, une injection de glucose est immédiatement administrée pour stabiliser la souris. Dans les cas les plus graves, lorsque la maladie du foie évolue vers une cirrhose décompensée (insuffisance hépatique), les souris peuvent montrer des signes de fatigue, une perte d’appétit, un amaigrissement, des crampes musculaires ou des vomissements. Si leur état devient trop critique, elles sont euthanasiées pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur foie sera prélevé pour des études histologiques et épigénétiques (séquençage de l'ADN et de l'ARN).

Remplacement

Pourquoi utiliser des souris pour cette étude ? L’objectif de cette étude est de comprendre les mécanismes des maladies du foie causées par une mauvaise alimentation. Les souris sont le modèle idéal pour cette recherche car leur organisme fonctionne de manière similaire à celui des humains en ce qui concerne le métabolisme. Elles permettent d’étudier les interactions entre plusieurs organes clés comme le foie, le pancréas, le cerveau, les muscles et les tissus adipeux, ce qui est impossible avec des cellules en laboratoire. Grâce à ce modèle, nous pouvons observer comment la maladie évolue progressivement, de l’accumulation bénigne de graisse (stéatose) à une inflammation sévère (stéatohépatite), puis à la cirrhose et, potentiellement, au cancer du foie. Ce type d’étude est indispensable pour comprendre les maladies du foie et tester de futurs traitements.

Réduction

Minimiser le nombre d’animaux utilisés Nous avons conçu cette étude pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en garantissant des résultats fiables. Au total, 180 souris sont impliquées dans différentes expériences : • 10 souris sous régime standard (groupe témoin) • 10 souris sous régime riche en graisses pendant 8 semaines (stéatose) • 10 souris sous régime riche en graisses pendant 17 semaines (stéatohépatite) • 10 souris sous régime standard, mais avec un dérèglement du rythme biologique • 60 souris recevant des injections de virus modifiés pour étudier les effets génétiques • 40 souris d’une souche différente, qui développent une inflammation plus modérée, pour observer d’autres variations de la maladie. Enfin, chaque souris permet d’analyser à la fois le foie et les tissus adipeux, ce qui réduit encore le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Garantir le bien-être des souris Nous mettons en place plusieurs mesures pour limiter le stress et la souffrance des souris tout en garantissant des résultats fiables : • Respect du rythme biologique : Nous contrôlons précisément les cycles de lumière et d’obscurité pour éviter de perturber leur horloge interne. • Habituation progressive : Les souris sont manipulées régulièrement avant les expériences pour réduire leur stress. • Techniques de contention adaptées : Pour éviter les montées de stress et les variations hormonales. • Alimentation ajustée : Plutôt qu’un régime trop extrême, nous utilisons une alimentation qui reproduit les effets de la maladie sans trop affecter la santé générale des souris. • Surveillance accrue : Nous suivons attentivement chaque souris, en observant leur poids, leur activité et leur apparence générale. Si une souris montre des signes de souffrance, nous adaptons son suivi. • Réduction des interventions invasives : Plutôt que de faire des biopsies, nous utilisons des méthodes comme l’échographie ou l’imagerie par résonnance magnétique (IRM) pour surveiller l’évolution de la maladie. • Prélèvements sanguins optimisés : Nous utilisons des micro-prélèvements pour limiter le volume de sang prélevé et éviter des procédures inutiles.

Choix des espèces

Pourquoi ne pas utiliser d’autres modèles comme la mouche ? Certaines études sur le métabolisme peuvent être réalisées sur d’autres animaux comme la drosophile (mouche), mais pas celle-ci. En effet, la mouche ne possède pas de foie comme les mammifères. Son organe métabolique principal combine plusieurs fonctions (foie, tissu adipeux, système immunitaire), mais ne reproduit pas fidèlement l’organisation et le fonctionnement du foie humain. Chez la souris, le régime riche en graisses est initié à l’âge adulte (7 semaines) et dure : • 8 semaines pour observer une accumulation de graisse sans inflammation. • 17 semaines pour étudier les formes plus avancées avec inflammation et fibrose. C’est pourquoi l’utilisation de la souris est essentielle pour cette recherche.

Les souris de cette lignée cessent de grandir vers quatre semaines, pèsent la moitié du poids de leurs congénères, présentent des mouvements anormaux et une démarche altérée qui évolue vers une scoliose. 404 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, l'acte déclaré se limitant à une biopsie de la queue prélevée sur des juvéniles éveillés pour le génotypage. La finalité est de faire naître et d'entretenir cette lignée dystrophique, dont les descendants alimenteront d'autres travaux sur la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss. Les reproducteurs sont tués quand leur fertilité baisse, les autres pour prélèvement d'organes, et le porteur affirme que des animaux dystrophiques sont "indispensables" pour étudier le muscle.

Objectifs

Des souris à phénotype dommageable sont nécessaire pour réaliser des projets de recherche : ces souris sont dystrophiques. Les recherches ciblent le muscule squelettique et en particulier la régénération musculaire. La lignée de souris dystrophique est essentielle pour pouvoir étudier la régénération musculaire dans sa globalité en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point de stratégies thérapeutiques. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc de générer et de maintenir une lignée de souris capable de produire des lots de souris avec un génotype dystrophique, destinées à être directement utilisées pour la caractérisation tissulaire ex vivo.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les dystrophies musculaire chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. En particulier, ce projet produira des animaux qui seront utilisés pour caractériser la dystrophie d'Emery-Dreifuss, ce qui permettra d'identifier de nouveaux mécanismes de signalisation moléculaire impliqués dans cette maladie. On estime que la prévalence du syndrome d'Emery-Dreifuss est d'environ 1 à 2 cas pour 100 000 dans la population générale, et les traitements futurs pourraient apporter des bénéfices à de nombreuses personnes.

Procédures

Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile en vigil. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourront induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également y avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. La lignée murine a un phénotype dommageable: la croissance s’arrête vers 4 semaines, bien que le développement dentaire soit normal et qu'elles conservent la capacité de se nourrir. À ce stade, leur poids corporel moyen correspond à environ la moitié de celui de leurs congénères. Cette lignée manifeste également des mouvements anormaux et une démarche altérée, évoluant vers une scoliose.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Les reproducteurs le seront lorsqu'ils seront moins fertiles et les autres animaux pour prélèvements et analyses d'organes.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant à la régénération musculaire et à la mise en place des pathologies musculaires. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.

Réduction

404 animaux seront utilisés dans ce projet d'élevage et pour analyse post mortem. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux dans cet élevage, nous ajustons le nombre de couples reproducteurs en fonction des besoins expérimentaux. Les souris seront élevées de manière à conserver une copie du gène fonctionnel, car cela suffit à prévenir les symptômes de la maladie.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. De la nourriture humidifée sera déposée au fond de la cage pour facilier la prise alimentaire. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris. Des animaux dystrophiques sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. La ligne choisie représente l'un des modèles de souris les plus utilisés dans l'étude de la dystrophie d'Emery Dreifuss. Les animaux seront génotypés entre 7 et 14 jours de vie, étudiés entre 2 et 4 semaines de vie et en reproduction de 2 à 8 mois de vie.

Gardées le plus longtemps possible, jusqu'à leur mort naturelle ou jusqu'à l'atteinte d'un point limite, 240 souris vieillissantes accompagnent 128 autres qui sont tuées à vingt mois pour analyse des tissus, soit 368 animaux au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent dans leur nourriture un produit destiné à éliminer les cellules sénescentes et dans leur eau de boisson un antibiotique censé relancer la régénération cellulaire, avec une mesure mensuelle de la glycémie par incision de l'extrémité de la queue. Les tests de motricité, de force et de mémoire se répètent tous les mois ou tous les deux mois jusqu'à la fin de leur vie. Le porteur qualifie ces procédures de non invasives et écarte de ce fait tout recours aux analgésiques, l'objectif annoncé étant de vieillir en meilleure santé.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'explorer une nouvelle approche pour ralentir le vieillissement et améliorer la santé en agissant directement sur nos cellules. Des recherches ont montré qu'il est possible de "réinitialiser" certaines cellules adultes et de les rendre plus jeunes (reprogrammation). Ce phénomène a été observé chez les souris et les humains, où ces cellules reprogrammées peuvent même contribuer à reconstruire des tissus et des organes. D’autres études ont révélé que lorsqu’on applique ce processus de manière temporaire chez des souris atteintes d'une maladie provoquant un vieillissement accéléré, leur état de santé s’améliore et leur espérance de vie s’allonge. Cependant, nous avons constaté qu’une seule intervention tardive n’a pas d'effet significatif sur la longévité et les organes. Nous pensons que l'accumulation de cellules trop âgées, qui ne fonctionnent plus correctement, pourrait empêcher ce processus de rajeunissement d’être pleinement efficace. C’est pourquoi notre projet vise à associer deux stratégies : Éliminer les cellules trop usées, qui pourraient gêner la régénération. Stimuler le renouvellement des cellules restantes, pour leur redonner une "seconde jeunesse". En testant cette combinaison chez la souris, nous espérons mieux comprendre comment ralentir le vieillissement et, à terme, trouver des pistes pour améliorer la santé au fil des années.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le processus de rajeunissement des cellules pourrait être encore plus efficace s'il était associé à un traitement capable d’éliminer les cellules trop vieilles et dégradées. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons observer de près les effets de cette approche chez des souris âgées. Nous examinerons leurs tissus au microscope, analyserons les différentes cellules présentes et étudierons certains marqueurs biologiques du vieillissement. Nous espérons ainsi constater non seulement une amélioration de la santé des tissus, mais aussi une augmentation de leur espérance de vie chez les souris recevant ces deux traitements combinés. Ce projet nous aidera à mieux comprendre les transformations qui accompagnent le vieillissement et à explorer une nouvelle approche pour limiter les maladies liées à l’âge. À terme, ces découvertes pourraient ouvrir la voie à des applications pour l’être humain. Si les résultats sont concluants, il pourrait être possible d’activer ce processus de rajeunissement grâce à des méthodes similaires à celles utilisées pour certains vaccins récents, ou encore via des traitements ciblés directement sur les organes ou tissus concernés (comme la peau, les muscles ou les articulations). Ce projet pourrait ainsi poser les bases d’une nouvelle approche pour vieillir en meilleure santé.

Procédures

Les interventions prévues pour les animaux seront les suivantes : - Suivi du poids et de la composition corporelle : Pesée hebdomadaire et mesure de la composition corporelle (méthode non invasive, 2 minutes de contention) tous les mois jusqu’à 18 mois, puis tous les 15 jours jusqu’à la fin de vie. - Surveillance de la glycémie : Une mesure mensuelle jusqu’à 20 mois sur 128 animaux, nécessitant une petite incision à l’extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang (3 secondes). - Traitements pharmacologiques : Administrés via l’alimentation pour limiter les interventions – l’un dans les croquettes pour éliminer les cellules vieillissantes (pour 48 animaux, de 18 à 20 mois / pour 90 animaux de 18 mois jusqu'en fin de vie), l’autre dans l’eau de boisson pour stimuler la régénération cellulaire (pour 48 animaux de 2 à 20 mois / pour 32 animaux de 18 à 20 mois / pour 90 animaux de 2 mois jusqu'en fin de vie / pour 60 animaux de 18 mois jusqu'en fin de vie). - Évaluations fonctionnelles et comportementales : Tests de motricité (5 tests de 3 fois 5 minutes pour 128 animaux / 5 tests de 3 fois 5min puis 1 test tous les mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux), force physique (5 tests de 1 min pour 128 animaux / 5 tests de 1 min puis 1 test tous les 2 mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux) et mémoire (4 tests de 2 fois 10 minutes pour 128 animaux / 4 tests de 10 minutes puis 1 test tous les 2 mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux) réalisés à différentes étapes de l’étude.

Impact sur les animaux

Effets indésirables prévus sur les animaux : Vieillisement naturel et effets associé; Stress ponctuel lié aux tests de forces, motricité, comportement et suivi ; Douleurs Légères et ponctuelles (Biopsies, tatouage, mesure de la glycémie, injection d'anesthésique lors de la fin de procédure. Désagréments digestifs mineurs liés à l'utilisation d'un antibiotique dans l'eau de boisson pour stimuler la régénération cellulaire, mais rien de significatif n'a pu être observé dans les expériences passées avec les mêmes concentrations.

Devenir

Au terme des 20 premiers mois, un groupe de 128 animaux sera euthanasié afin de réaliser un large panel d’analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires. Les animaux restants seront gardés aussi longtemps que possible, jusqu'à leur mort naturelle, ou jusqu’à l’atteinte des points limites préalablement définis et enregistrés sur une grille de score.

Remplacement

Bien que la reprogrammation cellulaire ait déjà montré des effets positifs sur la santé et la longévité des souris, nos recherches indiquent qu’elle fonctionne moins bien chez les souris âgées. Cela semble être dû à l’accumulation de cellules usées qui perturbent le bon fonctionnement des tissus et empêchent le processus de rajeunissement d’agir efficacement. Ce projet vise à améliorer cette approche en éliminant ces cellules vieillissantes dans différents organes pour lever cet obstacle. Il permettra aussi d’étudier en détail l’impact de ces traitements sur les cellules et les molécules des organes, notamment sur les cellules responsables de la régénération des tissus. L’utilisation d’animaux est essentielle pour comprendre comment ces traitements influencent le vieillissement et évaluer leur potentiel pour améliorer la santé au fil du temps.

Réduction

Des travaux réalisé au sein de l’équipe ont démontré pour la première fois qu’il existait une différence de la réponse à la reprogrammation cellulaire entre les mâles et les femelles. Afin d’optimiser au mieux l’utilisation de tous les animaux produits, nous allons réaliser nos tests à la fois sur les mâles et les femelles. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques. Plusieurs tests statistiques seront envisagés afin d'analyser les données.

Raffinement

Afin des limiter au maximum les interventions et les nuisances dues aux différents traitements ces derniers ne seront administrés que par l’alimentation. Les procédures expérimentales étant non invasives, l’utilisation d’analgésiques ne sera pas nécessaire. L’ajout d’éléments d’enrichissement dans les cages sera systématiquement effectué. Un tunnel en plexi rouge permet à la fois de déplacer les animaux sans stress, et de les habituer à la contention pour la mesure de composition corporelle. Les animaux seront préalablement habitués aux tests de motricité. L’examen, hebdomadaire jusqu’à l’âge de vingt mois puis bi-hebdomadaire ensuite, (sauf incident avec un individu nécessitant plus d’attention ou de soins), de l’ensemble des souris sera effectué pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies. L’état de santé des animaux sera évalué et l’atteinte d’un point limite entrainera la mise à mort de l’animal. Les animaux seront pesés tous les 15 jours jusqu’à 18 mois puis chaque semaine. Dès les premiers signes de difficultés de déplacement ou de nutrition, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages. Enfin, nous avons fixé des points limites qui, lorsqu'ils seront atteints déclencheront l'arrêt du test ou l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

La reprogrammation permet de faire revenir des cellules adultes à un état plus jeune et moins spécialisé. Afin d’étudier l’impact de la sénescence sur la reprogrammation, les expérimentations et analyses seront réalisées sur des souris adultes. Le modèle souris permet d’étudier des animaux génétiquement modifiés et capables d’être reprogrammés lors de l’administration d’un traitement. Ainsi, les traitements (dans la nourriture ou l’eau de boisson) seront réalisés sur des animaux dont les signes de vieillissement commencent à se manifester (à partir 18 mois, équivalent à environ 60 ans en âge humain). La reprogrammation sera faite dès l’âge de 2 mois, ou bien sur des animaux déjà âgés de 18 mois.

Porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance cardiaque vers neuf mois chez les hétérozygotes et tue les homozygotes vers dix-neuf jours, les souris de cette lignée servent à tester trois approches de thérapie génique. 309 animaux au maximum sont concernés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 237 d'entre eux et modéré pour 72. Les souriceaux sont anesthésiés sur la glace à deux jours de vie, ce qui peut abaisser leur température corporelle, puis reçoivent une injection intraveineuse unique, la veine n'étant plus visible dès le troisième jour. Les souris reproductrices sont tuées à six mois avant l'apparition des symptômes cardiaques, et les souriceaux injectés à seize jours pour prélever leur cœur, leur foie et trois muscles des pattes.

Objectifs

Le projet a pour but d'évaluer et de comparer l'efficacité de 3 approches de thérapie génique dans des souris porteuses d'une mutation conduisant à une cardiomyopathie dilatée chez les souris hétérozygotes, et à une dystrophie congénitale associée à des problèmes cardiaques chez les souris homozygotes. Chez l'homme, les mutations de ce gène entrainent différentes pathologies, les plus nombreuses conduisant à une cardiomyopathie dilatée, associée ou non à une dystrophie musculaire (prévalence estimée à environ 9 individus sur 100.000). Le présent projet vient compléter un autre projet dans lequel les mêmes approches de thérapie génique ont été évaluées dans ces mêmes souris pour leur capacité à prolonger la survie des animaux et à corriger le phénotype. Suite aux résultats obtenus, de nouveaux prélèvements sont nécessaires afin de réaliser des études moléculaires et permettre de finaliser notre étude.

Bénéfices attendus

Les résultats de cet essai de thérapie génique permettront de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques dans cette maladie grave. D'autre part, si les résultats sont positifs, ils permettront d'avancer vers le développement d'une thérapie pour les patients pour lequels aucun traitement n'existe à l'heure actuelle.

Procédures

Des accouplements seront réalisés afin de générer les lots expérimentaux. En tout 8 accouplements en trio (1 mâle hétérozygote et 2 femelles hétérozygotes) seront réalisés. Afin de limiter l'appartition du phénotype cardiaque, les accouplements seront réalisés avec des animaux qui ont entre 2 et 6 mois (4 portées maximum par femelle). L'anesthésie des souriceaux (réalisée 1 fois à 2 jours de vie, avec une durée de 1 min) est susceptible d'induire une baisse de la thermorégulation. Suite à l'anesthésie, les souriceaux seront soumis à une injection intraveineuse (1 seule injection par souris, durée inférieiur à 1 min) est susceptible d'induire une douleur légère de courte durée.

Impact sur les animaux

A l'état hétérozygote, les souris développent une cardiomyopathie dilatée autour de 9 mois, entrainant une insuffisance cardiaque et à leur mort prématurée autour de l'âge de 1 an. Les souris homozygotes développent un retard de croissance généralisé, associée à une atteinte sévère des muscles squelettiques et cardiaque, conduisant à la mort prématurée des souriceaux autour de 19 jours. L'anesthésie des souriceaux sur la glace est susceptible d'induire une baisse de la thermorégulation. L'injection est susceptible d'induire une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les souris hétérozygotes en croisement seront euthanasiées à 6 mois, avant l'appartition des symptômes cardiaques afin d'éviter la survenue de souffrances non nécessaires. Les souriceaux injectés seront euthanasiées à l'âge de 16 jours afin de récupérer les différents organes nécessaire à tester l'efficacité des différentes approches thérapeutiques (coeur, foie, tibialis anterior, gastrocnemius, quadriceps).

Remplacement

Les outils thérapeutiques ont déjà été validés par des approches in vitro. Le recours à un organisme vivant est nécessaire pour étudier la bonne diffusion des virus thérapeutiques dans l'organisme entier et vérifier si l'expression des molécules thérapeutiques atteint le niveau nécessaire dans les différents organes d'intérêt afin d'empêcher le développement de la maladie. D'autre part, le recours à un organisme vivant est également nécessaire afin d'identifier d'éventuels effets indésirables tels qu'une réponse immunitaire.

Réduction

Ce projet nécessite l'utilisation de 309 animaux maximum. 1) Une partie du projet inclus des croisements afin de générer les souris nouveau-nées modèles de la maladie génétique chez lesquelles les approches thérapeutiques seront évaluées. Les accouplements contrôlés comprendront 21 souris. A l'issue de ces croisements, nous obtenons environ un quart de souris modèles de la maladie génétique. 2) Les 4 groupes de souris seront générés afin d'obtenir au moins 15 souris modèle de la maladie par groupe. Il nous faudra donc environ 60 souris par groupe, soit 240 souriceaux en tout. Etant donné que le nombre de souriceaux par portée et le nombre de souriceaux modèle de la maladie dans ces portées peuvent légèrement dévier des chiffres théroriques (obtenus pour un grand nombre de portée), nous demandons une autorisation pour un plus grand nombre d'animaux que le chiffre théorique, soit 288 souriceaux (au lieu de 240). Les croisements seront arrêtés dès que le nombre de 15 souris modèles de la maladie par groupe aura été atteint.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements de nidification et un bâton à ronger. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La procédure est réalisée précocement afin d'éviter le développement du phénotype dommageable des animaux, de plus les injections sont réalisées sous anesthésie. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, croquette humidifiée et hydrogel etc.).

Choix des espèces

D'un point de vue génétique, les souris sont extrêmement proches de l'homme, permettant de reproduire les mutations du gène dans ce modèle animal, conduisant à des sympômes très similaires. Le modèle murin utilisé ici, généré par recombinaison homologue, a prouvé sa validité pour étudier le développement de la pathologie par de multiples publications. Les injections sont réalisées à 2 jours de vie car la veine n'est plus visible à 3 jours de vie (pigmentation) et l'injection n'est pas possible à un stade adulte due à la sévérité du phénotype conduisant au décès des souris homozygotes à 19 jours de vie. La procédure sera arrêtée à 16 jours de vie. Les souris hétérozygotes utilisées pour les accouplements permettent de générer les souris homozygotes nécessaire à ce projet. Ces accouplements sont limités dans le temps (entre 2 et 6 mois de vie), afin de limiter l'apparition du phénotype dommageable de ces souris (développement d'une insuffisance cardiaque autour de l'âge de 9 mois).

Une biopsie du bout de la queue, des injections, une chirurgie de quarante-cinq minutes et des séances d'imagerie de trente minutes attendent 160 souris, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié relève de la souffrance légère, l'autre de la souffrance modérée. L'étude, qualifiée de pilote, porte sur des étapes de maturation des protéines de surface des neurones et prépare des expériences ultérieures sur des modèles de maladies neurologiques. Ni la nature de la chirurgie, ni le nombre de séances d'imagerie, ni le contenu des injections ne sont précisés, et sur les effectifs le porteur écrit seulement qu'ils sont déterminés et analysés avec des tests statistiques adaptés.

Objectifs

Le développement et la fonction des neurones requiert la biogenèse de nombreuses protéines de surface qui permettent aux neurones de percevoir et d’interagir avec leur environnement. Des travaux précédents montrent que des étapes spécifiques de la maturation des protéines ne sont pas nécessaires pour la production de protéines de surface fonctionnelles par les neurones, contrastant avec d’autres types cellulaires où ces étapes sont requises. Ces étapes de maturation régulent la transmission neuronale et la plasticité fonctionnelle du cerveau et sont altérées dans plusieurs maladies neurologiques ou psychiatriques. Les mécanismes cellulaires sous-jaccents sont cependant encore mal caractérisés. Des études entendues de ces processus ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire à l’aide d’agents pharmacologiques. Nous souhaitons maintenant étudier ces processus dans des modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet de recherche fondamentale permettra de mieux comprendre les bases cellulaires de ces variations, contribuant ainsi in fine à l’identification de nouveaux biomarqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les expériences réalisées nous permettront de préciser le rôle d’étapes importantes de la synthèse des protéines de surface des neurones, un mécanisme cellulaire fondamental, apportant des informations manquantes sur les causes responsables des dérégulations de ce processus qui sont observées dans de nombreuses maladies humaines sévères et actuellement non ou difficilement traitables.

Procédures

Biopsie du bout de la queue (quelques secondes), injections (quelques secondes). Chirurgie sous analgésie et anesthésie (45min). Séances d'imagerie (30 min).

Impact sur les animaux

Douleurs de quelques secondes lors des injections IP et SC et de la biopsie de la queue. Douleur post-opératoire modérée minorée par des antalgiques. Stress léger lié au bruit modéré lors des séances d'imagerie ultrasonore minoré par habituation des animaux au dispositif.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et préservation de leur cerveau pour analyse post-mortem.

Remplacement

Les études qui seront réalisées font suite à des études étendues de ces processus dans des systèmes de culture cellulaire. Il est maintenant essentiel d’étudier ces mécanismes in vivo dans des neurones intégrés dans leur environnement tissulaire complexe pour étudier plus avant leur rôle physiopathologique.

Réduction

Nous réalisons ici une étude pilote sur un nombre relativement restreint d’animaux qui nous permetterons de tester la faisabilité d’expériences projetées dans des modèles de neuropathologies. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’optimiser nos procédures pour des analyses futures plus étendues. Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification (enrichissement). Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie et la poursuite des expériences déterminées en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est un modèle de référence dans notre champs d'étude. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler des types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Les animaux seront utilisés entre 10 jours et 6 mois de vie, stades les plus appropriés pour l'identification des animaux et l'étude de la plasticité cérébrale.

Pour quantifier des déficits de mémoire et de motivation sociale dans quatre lignées porteuses de mutations liées à l'autisme, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent neuf semaines de tests portant sur la mémoire de travail, la mémoire à court et long terme et l'apprentissage, l'insertion sous-cutanée d'une puce à radiofréquence sous anesthésie, un prélèvement vaginal pour certaines, une nuit sans nourriture et une eau de boisson acidifiée destinée à les motiver. Le porteur indique que deux des lignées peuvent présenter des crises d'épilepsie, et qu'un score de suivi supérieur à 8 déclenche la mise à mort au CO2. 284 souris sont tuées pour prélever leurs organes, les 100 autres, utilisées comme "nouveaux arrivants" dans le test d'interaction sociale, étant conservées pour être réutilisées.

Objectifs

Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles et des troubles du spectre autistique associées à des mutations génétiques. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la caractérisation de déficits cognitifs et sociaux dans quatre modèles animaux portant des mutations génétiques associées aux troubles du spectre autistique. Les tests comportementaux proposés permettront d’identifier et de quantifier les déficits cognitifs et sociaux des modèles de souris. Nous nous intéresserons à la mémoire de travail, à la mémoire à court et long terme, aux capacités d’apprentissage ainsi qu’à la motivation pour les interactions sociales. Cette caractérisation constitue donc la base d’un projet général qui vise à comprendre les mécanismes soujacents aux troubles du spectre autistique. Elle va permettre de sélectionner les tests les plus pertinents pour évaluer les effets de traitements potentiels dans une étude ultérieure. Elle est donc primordiale pour bien identifier les niveaux de référence dans les études futures.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux caractériser les défauts comportementaux de quatre modèles animaux de troubles du spectre autistique. Les défauts cognitifs et sociaux seront en particulier étudiés. Elle permettra de sélectionner les tests comportementaux les plus pertinents afin de tester des molécules à effets thérapeutiques visant à réduire ces défauts dans des études futures. Cette étude constitue donc la base pour des études ultérieures pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.

Procédures

Tous les animaux vont être évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 9 semaines. Une semaine avant le test d'interactions sociales, les souris subiront une injection d'antidouleur (quelques secondes) avant la micro chirurgie déstinée à l’insertion sous cutanée d’une puce à radiofréquence (RFID) servant à l'analyse automatique des données. Cette intervention sous anesthésie gazeuse est très rapide (3 min). Les souris "nouveaux arrivants" du test d'interaction sociales seront également soumises à un prélèvement vaginal (quelques minutes). Les animaux destinés à des analyses immunohistochimiques seront anesthésiés par une injection (quelques secondes). Ils subiront ensuite une chirurgie terminale.

Impact sur les animaux

Il a été rapporté que deux lignées peuvent présenter des crises d'épilépsie de type cloniques et/ou toniques (PE3). Une partie des souris subira une légère douleur très ponctuelle lors d'une micro-chirurgie déstinée à l’injection sous cutanée d’une puce à radiofréquence (RFID) servant à l'analyse automatique des données. Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétent le lait sucré lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. Les souris seront privées de nourriture pendant une nuit afin de les motiver à réaliser le test de motricité fine. Les souris "nouveaux arrivants" seront soumises à un stress léger de courte durée lors du prélèvement vaginal.

Devenir

Tous les animaux des lignées transgéniques étudiées seront mis à mort pour faire des prélévements (organes, tissus…) permettant une étude approfondie des tissus et des processus moléculaires. Les animaux utilisés comme nouvel arrivant dans l’interaction sociale ne subissent que l’insertion de puce radiofréquence et l’interaction sociale. Ils seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des déficits intellectuels requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus cognitifs et sociaux. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.

Réduction

Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes avec une puissance statistique suffisante en prenant en compte les variations inter-individuelles d'une population. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Pour l’insertion de la puce, la douleur lors de l’injection sous-cutanée de la puce est gérée par une injection sous-cutanée préalable d’un anti-douleur local. Lors du test d’apprentissage, les animaux auront une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par du lait mélangée à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. Le lait sucré présenté dans le test devient d’autant plus appétent que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne et que cette acidification n'impacte pas le système gastrique des souris. Cette procédure représente un raffinement car elle permet d'éviter une privation hydrique et/ou alimentaire mais reste nécessaire pour que les souris aient une motivation suffisante pour effectuer la tâche. Pour évaluer l’état des souris, nous observerons le poids, l’apparence, la modification du comportement avant et près manipulation et la douleur. Chacun de ces points pourra être scoré entre 0 (Normal) et 3 (Alteration sévère). Si la somme des scores des 5 catégories est inférieure à 5, aucune mesure n’est prévue. Un score entre 5 et 8 entrainera un suivi quotidien individuel de l’animal. Un score supérieur à 8 entrainera la mise à mort de l’animal par gradient de CO2 avec augmentation progressive.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des animaux transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (Syndrome DYRK1A). Les souris seront testées une fois adultes (à partir de 8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients atteints du Syndrome DYRK1A montrent des défauts dans un large panel de processus cognitifs comparés à la population contrôle à l’âge adulte.