Procédures légères

Injectés dans l'œil sous anesthésie, soumis à des angiographies, des tomographies et des électrorétinographies répétées jusqu'à trois fois, 2 020 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 180 d'entre eux et modéré pour 1 840. Une partie reçoit des corticoïdes pendant huit jours, une autre est soumise à un modèle de séparation postnatale. Le porteur écrit attendre de cette séparation des comportements de stress et de dépression chronique qu'il qualifie de nécessaires au bon déroulement de la procédure. Il présente par ailleurs les examens du fond de l'œil comme non invasifs, tout en indiquant que les injections intraoculaires peuvent laisser une gêne ou une douleur et, rarement, une infection de la surface oculaire.

Objectifs

La choriorétinopathie séreuse centrale (CRSC) est la 4ème cause de cécité rétinienne en France. C’est une maladie multifactorielle, mais la prise de glucocorticoïdes est reconnue comme l’un des principaux facteurs déclenchants de la maladie, par des mécanismes encore mal connus. La CRSC se manifeste par des décollements répétés de la rétine, secondaires à une atteinte de la choroïde. La choroïde est située en dessous de la rétine, c’est une couche richement vascularisée qui assure l’apport de l’oxygène et des nutriments aux cellules visuelles. Lors d’une CRSC, on observe notamment une forte dilatation des vaisseaux de la choroïde, dont la cause est inconnue. Alors que les glucocorticoïdes signalent soit via le récepteur glucocorticoïde ou le récepteur minéralocorticoïde, il a été montré que l’antagonisme de ce dernier était bénéfique dans la CRSC, démontrant l’implication de ce récepteur dans la physiopathologie de la maladie. Plus récemment, le laboratoire a montré que la surexpression du récepteur minéralocorticoïde chez la souris s’accompagnait d’une neuropathie du système nerveux choroïdien, qui est essentielle à la régulation vasculaire et immun de la choroïde. Cette neuropathie choroïdienne induite par les corticoïdes via le récepteur minéralocorticoïde pourrait constituer un mécanisme clé dans l’étiologie de la maladie et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’étudier en profondeur les mécanismes et la physiopathologie qui lient corticoïde et système nerveux choroïdien chez des modèles murins afin de mieux appréhender la maladie humaine.

Bénéfices attendus

La choriorétinopathie séreuse centrale est une maladie multifactorielle dont l’étiologie et les traitements sont encore débattus. Alors que la majorité de la recherche se concentre sur les anomalies vasculaires/inflammatoires, personne n’a encore l’implication du système nerveux choroïdien et l’impact des corticoïdes sur sa pathophysiologie. Ce projet apportera non seulement des connaissances fondamentales et cliniques essentielles en ophtalmologie, à la compréhension de la choriorétinopathie séreuse centrale et d’autre pathologie impliquant la choroïde, mais pourrait rapidement ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Procédures

Dans l’ensemble des parties de l’étude, y compris dans la première partie, l’anatomie du fond de l’œil sera évaluée par des examens cliniques sous anesthésie incluant l’angiographie, la tomographie par cohérence optique (OCT) et l’électrorétinographie. Ces trois examens sont couramment utilisés chez l’Homme en ophtalmologie pour évaluer le bon fonctionnement des vaisseaux sanguin (angiographie), l’anatomie de la rétine (OCT) et la réponse visuelle (électrorétinographie). Ces interventions sont courtes et non-invasives (généralement inférieures à 10min). Selon les parties, ces analyses seront répétées au maximum 3 fois et dans ce cas, elles seront espacées d’au moins 1 semaine pour éviter d’éventuelle complication. Dans une seconde partie de l’étude, les animaux recevront une injection intraoculaire de substance régulant l’activité des nerfs. Elles seront réalisées sous anesthésies générales et locales. Elles seront réalisées avec une durée très courtes, moins de 2 minutes par injection. Dans une troisième partie et une quatrième partie, les animaux recevront des injections de corticoïdes systémique, locales (au niveau de la conjonctive) ou de substance altérant l’épithélium pigmentaire de la rétine de façon systémique. Ces injections sont réalisées sur des animaux vigiles ou anesthésié selon si l’injection est systémique (vigile) ou conjonctive (anesthésié). Ces injections sont uniques excepté pour les corticoïdes systémiques, qui seront répétées sur 8 jours. Dans tous les cas, ces injections sont très courtes (inférieures à 1 minute) et n’entraineront qu’un léger stress par la manipulation des animaux. Dans une dernière partie, les animaux recevront sous-anesthésie une injection intra-oculaire unique de traceur pour visualiser les nerfs de l’œil in vivo. Cette injection est unique et courte, d’une durée inférieure à 1 minute. Le traceur sera naturellement éliminé dans la durée et n’est pas connu pour induire des complications.

Impact sur les animaux

La préhension des animaux vigiles ainsi que les contentions pour permettre les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress. Ces injections peuvent également entraîner une douleur lors de la piqure et l’anesthésie peut induire des problèmes respiratoires, des comportements similaires à la dépression ou encore provoquer une hypothermie latente (malgré l’usage de tapis chauffants). Après les procédures impliquant des injections intraoculaires ou d’imagerie in vivo, les animaux sont également susceptibles de ressentir une légère gêne ou douleur au niveau de l’œil. Une infection de la surface oculaire est également possible bien que très rare. Dans le modèle de séparation postnatale, des comportements indiquant du stress et de dépression chronique sont attendus et nécessaires au bon déroulement de la procédure. Dans de rares cas, il est possible que ces comportements puissent induire une détresse physique/psychique qui mène l’animal aux points limites fixés préalablement (perte de poids, signes de souffrance prolongée). Enfin, concernant l’injection des traceurs, ces molécules sont connues pour être éliminer rapidement et n’entrainent aucune complication ou gêne dans la vision.

Devenir

Les animaux seront systématiquement euthanasiés à la fin de chaque procédure pour garantir la récupération des différents tissus et liquides biologique nécessaire à la poursuite de la procédure. Les analyses histologiques, moléculaires et l’analyse des sérums sont essentiels pour étudier et comprendre la dérégulation des processus physiologiques. Cette approche longitudinale permet non seulement une forte corrélation entre les études in vivo et ex vivo garantissant la fiabilité des données, mais participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés lors des procédures.

Remplacement

En parallèle des procédures expérimentales chez l’animal, nous réalisons de nombreuses études in vitro impliquant la culture cellulaire de cellules de Schwann, afin de tester les effets des corticoïdes sur la physiologie de ces cellules présentent dans le système nerveux choroïdiens des rongeurs et de l’Humain. De plus, nous travaillons avec de nombreux tissus oculaires humains provenant de donneurs, permettant d’étudier in vitro l’organisation du système nerveux choroïdien en condition normale et pathologique. Ces études nous permettent de remplacer l’utilisation des animaux pour répondre à un grand nombre de question sur le rôle des corticoïdes sur les cellules nerveuses ainsi que la caractérisation anatomique des structures choroïdiennes.

Réduction

Le nombre des animaux total (effectif de 2020) a été calculé au plus juste afin de non seulement valider l’efficacité de la procédure, mais également afin de permettre la réalisation de test statistique pertinents permettant de garantir la validité et la publication des résultats. De plus, nous privilégions dès que cela est possible les études longitudinales lors de nos procédures, permettant de réduire significativement le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément à la réglementation en rigueur. Ils seront maintenus dans un cycle lumière obscurité 12/12 avec boisson et nourriture ad libitum, en groupe de 2 animaux minimum par cages. Les animaux sont systématiquement habitués aux locaux de stabulation et à la manipulation afin de réduire le stress durant les procédures expérimentales. L’ensemble des interventions durant les procédures se font sous anesthésie et avec antalgique locale avant, pendant et après l’intervention. Un contrôle systématique des animaux est réalisé le jour même et le jour suivant les procédures afin de prévenir tous les signes de douleur, de dégradation éventuelle de la santé physique, perte de poids ou comportement anormale. Des points limites adaptés ont été définit pour chaque procédure, incluant notamment une perte de poids anormale, des signes de complication inflammatoire post-examen ou des signes de stress/souffrance prolongés. Les animaux seront contrôlés et monitorés sur toute la période de l’étude soit par les expérimentateurs ou les zootechniciens. Tout signe de souffrance ou de stress sera pallié par la mise en place immédiate d’un traitement adapté lorsque cela est possible. Par ailleurs, l’atteinte d’un des points limites correspondant résultera en l’euthanasie immédiate du ou des animaux concernés.

Choix des espèces

L'espèce Rattus norvegicus a été choisi car il s'agit d'un modèle établi pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines du segment postérieur. De plus lors de nos précédents travaux, nous avons démontré que l’organisation du système nerveux choroïdien du rat est assez similaire à l’Humain tout comme leur réponse métabolique à la prise de corticoïdes exogènes. La taille des yeux de rats est également optimale pour permettre d’étudier convenablement l’œil et ses structures en ERG, OCT et angiographie. Enfin, la proximité génétique est satisfaisante pour permettre la transposition des résultats obtenues lors d’étude transcriptomique et protéomique à la clinique.Les animaux utilisés seront tous adultes, avec un âge minimum fixé à 3 mois, garantissant que l’œil et la rétine sont totalement développés.

Lever un doute pour un client industriel : la baisse de prise alimentaire provoquée par son candidat médicament anti-obésité vient-elle d'un effet nauséeux ? 80 souris rendues obèses par un régime apportant 60 % de l'énergie sous forme de graisses vont être utilisées pour y répondre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 30 d'entre elles et modéré pour 50, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Chacune passe jusqu'à 49 jours en cage individuelle, reçoit jusqu'à 36 injections, subit 37 pesées, deux mises à jeun de quatre heures et jusqu'à sept prélèvements sanguins à la queue. Seuls des mâles sont utilisés, le porteur écartant les femelles au motif que les étudier doublerait les effectifs de chaque groupe, et renvoyant leur cas à une seconde étude conditionnée à un résultat favorable chez le mâle.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet fait suite à une étude précédente préliminaire qui a permis de démontrer que le composé X est capable d'induire une diminution de prise alimentaire associée à une diminution de poids corporel chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie apportée sous forme de graisses). Cet effet était observable lorsque le composé était administré seul ou en combinaison avec un autre composé anti-obésité. Fort de ces résultats encourageants, et avant de poursuivre plus en avant le développement du composé X, nous souhaitons répondre à deux questions afin de tester la spécificité des effets observés : 1) La réduction de poids corporel résulte-t-elle uniquement de la réduction de prise alimentaire ? 2) La diminution de la prise alimentaire ne résulterait-elle pas d'un effet nauséeux ? Nous avons conçu une étude en deux procédures afin de répondre à ces questions. La première procédure consiste à administrer le composé (seul ou en combinaison avec un autre composé anti-obésité) afin d’observer la diminution de prise alimentaire induite par le traitement, et d'utiliser des groupes d'animaux traités au placébo mais dont la ration calorique journalière est limitée à celle des animaux traités. Si la perte de poids s'avère identique dans les deux groupes, il sera alors possible de conclure que le composé X diminue la poids corporel par son seul impact sur la prise alimentaire. La seconde procédure consiste à vérifier si le traitement à l'aide du composé X induit ou non un état nauséeux chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - un hébergement individuel (maximum 49 jours) - des injections quotidiennes de placébo ou de traitements (maximum 35+1 administrations, durée: 1 minute) - des pesées de poids corporel (maximum 37 mesures, durée : 1 minute) - des mesures de composition corporelle (2 mesures maximum, durée de la mesure : 2 minutes) - une mise à jeun de 4h (en présence d'eau) - un test oral de tolérance au glucose (Mise à jeun pendant 4h) - des prélèvement sanguin à la queue (maximum 7 prélèvements, durée du prélèvement : 1 minute)

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun de 4h préalable au test de tolérance au glucose, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Par ailleurs les prélèvements sanguins réalisés seront source de douleurs légères et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

Des prélèvements d'organes sont prévus en fin d'études pour analyses biochimiques ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape réglementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les animaux seront randomisés pour l'attribution de leur groupe. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l'étude mais les animaux conserveront des contacts visuels et olfactifs entre eux. Une attention particulière sera apportée à l'enrichissement des cages qui sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus pour le test de tolérance au glucose seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée (2 visites par jour) et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Des chirurgies stéréotaxiques d'une heure trente, des implants crâniens, des canules dans le cerveau, des puces télémétriques dans l'abdomen et un hébergement individuel prolongé attendent une partie des 10 525 souris de ce projet sur la vascularisation du cerveau pendant la gestation. Le niveau de souffrance déclaré reste léger pour 8 681 d'entre elles, modéré pour 1 844. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel génère un stress social et affirme développer des méthodes pour l'éviter, tout en indiquant que l'étude de la dynamique individuelle doit précéder celle du groupe. Les souris sont tuées pour examen histologique de leur cerveau, celles qui ne portent pas le patrimoine génétique recherché le sont faute de pouvoir être replacées, et une partie des porteuses est gardée en vie pour entretenir les lignées.

Objectifs

Le réseau de vaisseaux sanguins dans le cerveau adulte dans des conditions saines est considéré comme un réseau très stable. Lorsque l’activité du cerveau augmente ou diminue, on pensait que le diamètre des vaisseaux sanguins simplement augmentait ou diminuait pour apporter plus ou moins d’oxygène, de glucose, de nutriments aux cellules du cerveau. Cependant, de manière inédite, en utilisant des outils de reconstruction en 3D du réseau vasculaire du cerveau entier (qui permet de visualiser toutes les veines et artères du cerveau), nous avons découvert que la gestation induisait aussi la formation de nouveaux vaisseaux. En fin de gestation, nous avons observé une augmentation du nombre des vaisseaux dans certaines régions du cerveau importantes pour le comportement maternel. Dans ce projet, nous proposons d’étudier les mécanismes qui permettent la formation de ces nouveaux vaisseaux, et d’explorer les conséquences de ces changements sur la fonction du cerveau et sur le comportement maternel en utilisant des souris de différentes lignées génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet est pionnier dans l’étude de la plasticité vasculaire cérébrale à l’âge adulte. Il permettra de démontrer que le système vasculaire peut s’adapter à des changements physiologiques, et de comprendre comment ces adaptations influencent l’activité/fonction du cerveau, ainsi que le comportement de l’animal. Certaines pathologies neuropsychiatriques présentent par ailleurs des défauts d’activité neuronale dans certaines régions du cerveau, associés à des anomalies de la vascularisation cérébrale. Identifier et comprendre ainsi les mécanismes qui sous-tendent la plasticité vasculaire permettra peut-être dans le futur de rectifier ces anomalies et/ou de moduler l’activité cérébrale en ciblant le système vasculaire dans un but thérapeutique.

Procédures

Une partie des souris aura un prélèvement d’un petit fragment de queue pour connaitre leur patrimoine génétique (Durée inférieure à 1minute par animal, une fois). Une partie des souris aura une procédure chirurgicale, sous anesthésie et analgésie adaptées, pour implanter un implant hormonal (durée 20minutes par animal, une fois), puis recevra soit une injection intraveineuse immédiatement toujours sous anesthésie (10 minutes par souris, une fois) ; soit une injection intraveineuse 1 à 2 semaine après sur animal vigile (10 minutes par souris, 1 fois).Une partie de ces animaux recevra également des injections en intrapéritonéale pour la mise en place du modèle (moins d’1 minute, 1fois par jour, pendant 5 jours). Une partie des souris sera soumise à des injections dans le cerveau au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale qui durera jusqu’à 1h30 par souris (stéréotaxies). En plus des stéréotaxies, une partie des souris recevra des injections en intrapéritonéale pour la mise en place du modèle (1 injection par jour par souris pendant 15 jours). En plus des stéréotaxies, une autre partie des souris recevra des puces télémétriques en intrapéritonéale pour mesure de la température (en même temps que stéréotaxie, anesthésie générale, 1h30 en tout maximum), sera hébergée seule pour étudier le comportement de nidification et aura 2 prélèvements de sang (5 minutes maximum) avec 9 jours d’écart en vigile. En plus des stéréotaxies, une autre partie des souris sera hébergée seule suite à l’installation d’un implant sur leur tête (en même temps que stéréotaxie, anesthésie générale, 1h30 en tout maximum) pour manipuler l’activité neuronale. Trois à cinq sessions d’enregistrement de 5 minutes seront effectuées chaque jour pendant 3 jours. En plus des stéréotaxies, une autre partie des souris sera hébergée seule suite à l’installation d’une canule dans le cerveau (en même temps que stéréotaxie, anesthésie générale, 1h30 en tout maximum) pour enregistrer l’activité des neurones sur souris vigiles (1 enregistrement de 30 minutes par souris par jour, 4 fois). Quelques souris seront opérées pour faire de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore. La pause d’un cathéter, et l’enregistrement se feront sous anesthésie générale. Cette opération durera environ 1h en tout, et l’enregistrement sera réalisée 2 fois. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les contentions et manipulations pourront générer un stress chez les animaux. Lors du prélèvement du fragment de queue pour connaitre leur patrimoine génétique, les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur. Lors des procédures chirurgicales, ils pourront ressentir un inconfort et des douleurs post-opératoires. L’anesthésie générale associée aux chirurgies impliquera une hypothermie et des risques rares de problèmes cardiorespiratoires. L’implantation de dispositifs dans l’animal pourra générer une gêne et de rares risques d’inflammation ou infection. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors des prélèvements de sang et lors des injections. L’hébergement individuel nécessaire pour certaines procédures génèrera un stress social pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour examen histologique de leur cerveau. Les animaux non porteurs du patrimoine génétique d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés du fait de leur modification génétique spécifique. Une partie des animaux porteurs du patrimoine génétique d’intérêt sera maintenu en vie pour le maintien de nos lignées.

Remplacement

L'utilisation d’organismes vivants, plus précisément de souris ne peut être remplacée pour ce projet, car nous étudions l'impact de la gestation (nécessité d’une espèce vivipare) sur la plasticité vasculaire dans le cerveau, ainsi que les conséquences de cette plasticité sur l’organisme entier (comportement, température corporelle, activité des neurones…). De plus, la souris reste le modèle de mammifère le plus pratique pour la manipulation génétique qui nous permet de cibler certains types cellulaires et certains mécanismes moléculaires précis. Cependant, si le projet permet de découvrir des voies de signalisation importantes pour la néo-angiogenèse, en réponse aux hormones, de futures études pourraient être menées en utilisant des cellules en culture.

Réduction

Nous avons réduit dans ce projet le nombre d'animaux au minimum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes afin de n‘utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Cet effectif a été déterminé d'après notre expérience passée sur l’étude des changements de densité des vaisseaux sanguins. Ceci a été rendu possible par le développement de logiciels d'analyse bio- informatique de la vascularisation cérébrale à haute précision, permettant la réduction du nombre d'animaux nécessaires par groupe. Pour ce projet de 5 ans, nous utiliserons 10525 souris au total. Le nombre de souris nécessaires a été établi par un calcul de puissance.

Raffinement

Les souris seront hébergées de manière conforme à la réglementation et seront observées quotidiennement. La biopsie de l’extrémité de la queue sera réalisée sur des animaux jeunes (cicatrisation rapide) et limité à la plus petite taille possible. Ce geste rapide et parfaitement maitrisé sera réalisé au calme dans une pièce dédiée. Nous utilisons une grille de lecture standardisée du comportement de nidification afin de limiter les variations inter expérimentateurs et inter cohortes. Pour chaque procédure, des points limites sont respectés et établis, sur 1) le suivi du poids de l’animal et 2) l’étude d’expressions corporelles de la souffrance (posture, expression faciale, position des oreilles, du nez). Dans les procédures concernées, nous mettons en place l’utilisation d’analgésiques adaptés, ainsi qu’un suivi rigoureux des animaux opérés. Les expérimentateurs sont formés aux techniques de chirurgie. Suite aux chirurgies, les souris seront placées dans des cages de réveil à 37degrés pour récupérer avec un suivi de réveil, puis dans des cages enrichies (maisonnette, batônnets en bois, différente sorte de matériel de nidification) où elles recevront des analgésiques adéquats selon les bonnes pratiques, ainsi qu’un suivi post-opératoire renforcé (examen et pesée) sur une durée qui peut aller jusqu’à une semaine ou plus selon les chirurgies. Nous développons actuellement de nouvelles méthodologies pour suivre le comportement en groupes afin d’éviter l’hébergement individuel, mais l'étude de la dynamique individuelle est nécessaire avant de passer à la dynamique de groupe. Afin de mieux surveiller les animaux hébergés seuls, les cages présenteront des étiquettes spécifiques, avec la date de début d’isolement. Nous développons aussi dans ce projet une technologie de stimulation optogénétique non filaire (par induction magnétique), qui permet l'étude du comportement sur des animaux non-attachés, et donc complètement libres de leurs mouvements, via un implant crânien permettant l'optogénétique non fibrée. De plus, l’utilisation de puces télémétriques nous permet d’éviter de manipuler les souris tous les jours à plusieurs reprises pour mesurer leur température.

Choix des espèces

Ce projet étudie l'impact de la gestation sur la physiologie neurovasculaire. Il est donc nécessaire de travailler chez des mammifères. Au sein des mammifères, la souris représente le modèle idéal pour étudier la plasticité neurovasculaire pendant la gestation, du fait de l'existence d'outils génétiques, et d'outils bio-informatiques pour la cartographie du réseau vasculaire cérébral de cette espèce. Étant donné que nous étudierons les effets de la gestation sur la plasticité vasculaire, nous utiliserons des femelles sexuellement matures adultes de 8 à 15 semaines pour ce projet. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera fait à l’âge de 7 à 10 jours.

Tuées à l'issue pour prélever leurs organes et mesurer la réponse immunitaire, 510 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 450 d'entre elles et modéré pour 60. Chacune reçoit une ou deux injections sous la peau alors qu'elle est éveillée, puis deux prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur affirme qu'une réponse immunitaire antitumorale mobilise trop de types cellulaires et d'organes pour être étudiée in vitro. L'apport annoncé se limite à disposer de formulations vaccinales de rechange, en complément de celles qui existent déjà.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer les formulations optimales de vaccins thérapeutiques antitumoraux à base d’ARNm capables d’induire une réponse immunitaire détruisant spécifiquement la tumeur. Les vaccins à ARNm actuels sont basés sur des formulations lipidiques contre lesquelles une réponse immunitaire parasite peut se développer. Nous avons mis au point de nouvelles façons d’encapsuler efficacement l’ARNm pour la vaccination tumorale. Ces nouvelles formulations pourront être utilisées en complément de celles déjà existantes.

Bénéfices attendus

La vaccination thérapeutique constitue une immunothérapie anti-tumorale spécifique de la tumeur qui réduit donc grandement les effets indésirables observés lors des traitements de chimio et radiothérapies. Les immunothérapies existantes peuvent également entraîner des effets indésirables graves tels que l'auto-immunité. Le développement d’une vaccination anti-tumorale est donc d’un grand intérêt. L’ARNm, quant à lui, représente une plateforme de vaccination très puissante qui peut être adapté à chaque patient. Bien que les formulations utilisées dans les vaccins contre la covid-19 aient démontré leur efficacité, une réponse immunitaire parasite peut voir le jour si la même particule est utilisée plusieurs fois. Le développement de nouvelles formulations vaccinales permettrait d’éviter cet inconvénient. Ainsi, le bénéfice principal de notre projet est de trouver des formulations vaccinales différentes que l’on pourrait utiliser en complément de formulations déjà existantes.

Procédures

Une ou deux injections seront réalisées sur animal vigile sous la peau. Cette procédure ne dure que quelques secondes. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et cela ne durera que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les injections causeront une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude pouvant induire un inconfort (démangeaisons ou rougeur cutanée) pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue de récupérer différents organes. Leur analyse permettra de conclure quant aux effets sur la réponse immunitaire innée et adaptative des formulations vaccinales.

Remplacement

L’induction d’une réponse immunitaire anti-tumorale efficace nécessite l’implication de plusieurs familles de globules blancs, chacune specialisée dans un type d'actions, qui vont intervenir de façon concertée. Au vu de ce processus complexe et coordonné entre plusieurs types différents de cellules immunitaires et plusieurs organes situés à des endroits distincts dans l'organisme, il n’est pas possible de réaliser l’étude in vitro ou ex vivo. Pour cette raison, l’évaluation du potentiel thérapeutique de nos formulations vaccinales ainsi que l’étude de leur potentiel à induire une réponse immunitaire doit se faire in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus dans ce projet a été calculé à l’aide d’un logiciel spécifique pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles avec un nombre minimum d’animaux. Chaque procédure sera réalisée avec un effectif de 15 souris par condition expérimentale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des cages enrichies avec des materiaux de nidifications (frisure de carton, coton), des elements à ronger (bâtons ou boule en bois...) et des abris pour limiter le stress des animaux (tunnel...) . Après 4 à 8 jours d’acclimatation et une petite semaine d'habituation, les animaux pourront entrer en expérimentation. Leur état général sera surveillé régulièrement et des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance ont été établis.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car son système immunitaire est bien étudié et il existe de nombreux modèles de cancer chez la souris. les animaux arriveront à l'âge de 6 semaines lorsque leur systeme immunitaire est mature. Après 4 à 8 jours d’acclimatation et une petite semaine d'habituation, les animaux pourront entrer en expérimentation.

Soumises à une chirurgie d'une heure, parfois précédée d'une seconde intervention, 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 80 d'entre elles et modéré pour les 780 autres. Elles passent ensuite des tests d'anxiété en quatre sessions de cinq minutes, de mémoire en trois sessions de dix minutes et de sociabilité dix minutes par jour pendant trois jours. Le projet observe la mitophagie pendant la formation de nouveaux neurones, chez des souris saines et chez des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. Les retombées avancées pour les personnes atteintes de troubles de la mémoire sont renvoyées au "plus long terme", le porteur reconnaissant que le sujet n'a "jamais été étudié jusqu'à présent".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) se caractérise par une dégénérescence neuronale et des troubles de la mémoire. La mémoire repose sur la plasticité neuronale et notamment sur l'ajout de nouveaux neurones qui naissent dans le cerveau adulte au sein de l'hippocampe. Dans les modèles murins de la maladie d'Alzheimer, comme chez les patients, la production de ces nouveaux neurones, qu’on appelle neurogenèse hippocampique adulte, est altérée, ce qui contribuerait aux déficits de mémoire observés. De plus en plus d’évidences montrent que les mitochondries jouent un rôle clé dans la neurogenèse adulte et la plasticité neuronale qui sous-tendent la mémoire. Contrôler leur nombre et maintenir leur fonctionnalité, sont donc deux enjeux cruciaux. La mitophagie est un processus cellulaire qui permet l’élimination ciblée, par autophagie sélective, des mitochondries endommagées ou surnuméraires. Suite à des travaux récents suggérant que l'autophagie joue un rôle dans la neurogenèse adulte, nous souhaitons explorer la mitophagie au cours de la neurogène adulte dans le cerveau sain et pathologique, en utilisant souris saines et modèles de la MA.

Bénéfices attendus

Notre projet ouvre une nouvelle voie pour comprendre le rôle de la mitophagie dans la formation et l'intégration de nouveaux neurones dans l'hippocampe, un sujet jamais étudié jusqu'à présent. D’un point de vue fondamental, ces recherches pourraient considérablement élargir notre compréhension de la plasticité et des fonctions cérébrales. A plus long terme, nos résultats pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles moléculaires pour des traitements pharmacologiques innovants ou des modifications du mode de vie susceptibles d'améliorer la plasticité neuronale et la flexibilité cognitive. Ces travaux seront une étape essentielle dans l'amélioration des conditions de vie des personnes souffrant de troubles de la mémoire liés à des affections neurologiques, en particulier celles qui sont atteintes de la MA.

Procédures

Certaines souris seront soumises à une chirurgie d’une durée totale de 1h. Certaines souris seront soumises à une première chirurgie d’une durée de 2 secondes avant d’être soumises à une deuxième chirurgie d’une durée totale de 1h. Certaines souris seront soumises à des tests comportementaux pour mesurer leur niveau d'anxiété (4 sessions de 5 minutes espacées d'1 heure), et leur mémoire (2 sessions de 10 minutes suivie 24h après d'une session de 10 minutes) et leur socialibiité (10 minutes par jour pendant 3 jours).

Impact sur les animaux

Pour la chirurgie, l'incision de la peau peut induire une douleur modérée dans la phase postopératoire pendant 24 heures. Les injections d'agents pharmacologiques peuvent induire une douleur modérée pendant une dizaine de minutes.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour réaliser des analyses.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la mitophagie pendant la croissance et l'intégration des nouveaux neurones du cerveau adulte en lien avec la mémoire et sa restauration dans la maladie d’Alzheimer. Il est donc indispensable de travailler sur un modèle animal. Autant que possible, en première intention, nous utiliserons un modèle de culture de nouveaux neurones adultes hippocampiques pour guider les travaux que nous mènerons ensuite in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études précédentes et a été réduit au minimum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les comparaisons entre les groupes. Pour les études histologiques, 5 animaux par groupe dans nos études pilotes et 10 animaux pour les études finales. 20 animaux par groupe seront nécessaires pour effectuer les tests comportementaux en longitudinal. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous étudierons seulement 3 moments clés dans les étapes de la neurogenèse adulte. Grâce aux études pilotes nous pourrions être en mesure de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront habitués à l'expérimentateur au cours de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Si une altération de leur état est observée, une grille de notation sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les critères évalués sont l'aspect général de l'animal, les fonctions corporelles, le comportement et le poids. Avant la chirugie deux analgésies, une générale par injection et une locale par application, seront réalisées.

Choix des espèces

L'utilisation d'un système in vivo qui reproduit fidèlement la physiologie humaine est essentielle dans notre projet de recherche pour élucider le processus complexe et dynamique de mitophagie impliqué dans la génération et l'intégration fonctionnelle des nouveaux neurones dans l'hippocampe, en conditions saines et de la maladie d’Alzheimer (MA). Pour ce faire, nous utiliserons des souris de type sauvage et des souris transgéniques modèles de la MA, et envisageons aussi d’utiliser si nécessaire des souris sauvages ou MA exprimant de façon intrinsèque un marqueur de mitophagie. Les souris, en tant que mammifères ayant des structures cérébrales bien caractérisées et similaires à celles des humains, sont un modèle de choix pour explorer les processus neuronaux complexes et les troubles de la mémoire. En outre, les technologies disponibles chez la souris, comme leur manipulation génétique ou l’utilisation de fluorochromes pour visualiser la morphologie et le fonctionnement des neurones, chez un individu dont on peut évaluer les performances cognitives, permettent d’aborder des questions fonctionnelles en lien avec la pathologie humaine. La variété des modèles murins disponibles, y compris ceux qui imitent la MA et expriment un marqueur de mitophagie, offre une opportunité unique de comparer les états sains et malades, offrant ainsi des pistes pour de nouvelles découvertes thérapeutiques. Les animaux seront utilisés lorsqu'ils auront atteint l'âge adulte (au moins deux mois). Certaines souris modèles de la maladie d’Alzheimer seront utilisées à 3, 6 et 9 mois -, âges qui correspondent à différents stades de la pathologie allant de léger à avéré.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant une injection de tamoxifène dans le ventre cinq jours de suite. Quarante d'entre elles subissent en plus une injection dans le sinus situé derrière l'œil, puis, deux mois plus tard, une chirurgie sous anesthésie sans réveil avec perfusion du cœur pour prélever le cerveau. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 480 animaux et modéré pour 40, l'objet étant de caractériser le rôle d'une protéine dans les astrocytes. Le porteur indique que cinq animaux suffisent à obtenir des observations exploitables, sans relier ce chiffre aux 520 souris déclarées.

Objectifs

Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une une morphologie très ramifiée et complexe. Ils forment en particulier des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de cette polarité des astrocytes et les régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. Dans une étude récente, nous avons identifié la spectrine comme un marqueur important de la polarité des pieds astrocytaires périvasculaires. Le but de notre projet est de caractériser la fonction de la spectrine dans les astrocytes du cerveau.

Bénéfices attendus

Les astrocytes sont des cellules gliales indispensables au fonctionnement du cerveau qui ont une morphologie très ramifiée et complexe et qui contactent en particulier les vaisseaux sanguins cérébraux. Les astrocytes régulent les fonctions cérébrovasculaires mais les modalités de ces régulations sont encore mal caractérisées. Notre projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de la spectrine dans les astrocytes qui est une molécule que nous pensons être indispensable pour la polarité et la morphologie des astrocytes à l’interface vasculaire cérébrale. Ces connaissances sont indispensables car la polarité astrocytaire à l'interface vasulaire est modifiée dans de nombreuses pathologies du cerveau et que cette interace est indispensable au fonctionnement de cet organe.

Procédures

Les interventions sous anesthésie générale (injection intraveineuse rétro_orbitale et chirurgie terminale sousanesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau) sont rapides (environ 30 secondes pour l’injection rétro_orbilate et environ 30 minpour la chirurgie terminale sousanesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau) et ne sont réalisées qu’une seule fois par animal. L'injection de tamoxifène est réalisée1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Bilan: injection intrapéritonéale de tamoxifene : 1 injection fois par jour pendant 5 jours consécutifs ; 520/520 animaux; injection unique intraveineuse rétro-orbitale d' AAV puis 2 mois après, injection sous cutanée de buprénorphine, injection intrapéritonéale d’anesthésique, perfusion intracardiaque : 40/520 animaux

Impact sur les animaux

Tous animaux subiront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pendant 5 jours consécutifs ce qui peut engendrer un stress lié à la contention de l’animal et une douleur locale liée à l’injection (nuisance légère). Pour l’étude histologique, tous les animaux recevront une injection intraveineuse dans le sinus rétroorbitale. Ce geste peut entrainer une gêne auniveau de l’œil injecté (nuisance modérée).

Devenir

L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entre les différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués . En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 5 animaux indépendant. Ce chiffre a été fixé grâce à nos études précédentes utilisant le même type d’approche pour étudier la morphologie de l'unité gliovasculaire et des astrocytes et l’expression de différentes protéines ou ARN dans les astrocytes. Il s’agit du chiffre minimum pour intégrer la possible variabilité entre les animaux et est donc requis pour l'obtention de données interprétables et publiables.

Raffinement

Les souris subissant une expérimentation feront l'objet d'une surveillance accrue pendant les procédures et les jours suivants. Les injections intrapéritonéale et rétroorbitale pouvant générer de l'inconfort, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, les points limites intermédiaires permettant la mise en place de soins des animaux sera mise en place évitant l'euthanasie des animaux.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Cette espèce est aussi choisie en raison de l’existence d’un modèle génétique déjà établi permettant d'étudier le role de la spectrine astrocytaire. Les injections de tamixifène sont réalisées sur des animaux agées de 1 à 2 mois. Un délai de 2 mois après l’injection de tamoxifène est prévu afin de s’assurer la bonne inactivation du gène et de la protéine. Nous avons prévu d’analyser les animaux à 4 mois et à 6 mois car l’effet sur la morphologie des astrocytes et l’unité gliovasculaire peut être progressif.

Les souris utilisées sont invalidées pour des gènes du foie et du tissu adipeux, construites pour accumuler de la graisse hépatique. 4 248 d'entre elles vont être utilisées, 3 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 728 un niveau léger. Après une biopsie de la queue pour génotypage, elles sont soumises seize semaines durant à un régime gras ou gras et sucré, à des jeûnes de vingt-quatre heures, à des gavages, et à sept prélèvements de sang effectués par la même entaille au bout de la queue. Toutes sont tuées pour analyse biochimique. Le porteur justifie dix animaux par groupe, chiffre qui laisse le total de 4 248 sans explication détaillée.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndrômes qui vont d' une accumulation importante de lipides dans le foie vers des complications plus importantes allant jusqu'au cancer de foie. Cette pathologie du foie est très fortement associée à l’obésité, la glucotoxicité, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les voies métaboliques, qui peuvent conduire au stockage excessif de lipides dans le foie (principalement des triglycérides), sont multiples et font interveir différents organes comme le foie ou le tissu adipeux. Dans ce projet, nous caractériserons des modèles de souris génétiquement modifiés dans le but d’obtenir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de la stéatose hépatique, et des syndrômes qui lui sont associés comme la glucotoxicité et la résistance à l’insuline.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence du rôle des protéines d'intérêt dans le développement de maladies métaboliques telles que l'obésité, l'accumulation importante de lipides dans le foie ou encore l'insulinorésistance. Nous pourrons ainsi identifier les différents facteurs et les voies de signalisation impliqués mais aussi le rôle des différents organes, notamment le foie et le tissu adipeux dans le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux auront une biospie de la queue pour le génotypage (durée 15 secondes). Les animaux auront des injections par voie intrapéritonéale (durée 15 secondes) pendant 3 jours de suite. Ils seront soumis à des changements de régime alimentaire. Ainsi ils pourront être soumis soit à des régimes gras ou gras et sucrés pendant 16 semaines soit à des mises à jeun de 24h qui peut être suivi d'une réalimentation avec un apport de glucose supplémentaire. Ils suivront des tests physiologiques impliquant soit un gavage, cet acte dure 1 minute/souris soit une injection en intrapéritonéale. Ces tests physiologiques impliquent un prélèvement de sang qui s'effectuera après une légère entaille à l'extrémité de la queue, cet acte prendra 15 secondes par souris. Le prélèvement de sang se fera à partir de la même entaille à 7 reprises. Enfin ils auront une injection par voie sous cutanée d’un analgésique puis une injection par voie intrapéritonéale d'un mélange anésthésique. Chacune des injections se fait en 15 secondes.

Impact sur les animaux

La contention, le gavage, le prélèvement sanguin et les injections sont des sources de stress pour les animaux et peuvent induire une douleur modérée. Le prélèvement caudal d’un millimètre pour le génotypage peut être source de stress et de douleur légère de courte durée pour les animaux. Les animaux seront soumis à des changements des changements de régime alimentaire (régimes gras ou gras et sucrés) pendant 16 semaines pouvant induire un stress léger par une prise de poids avec possiblement une activité réduite . La mise à jeun peut entraîner un stress modéré aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'analyser des paramètres biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée ainsi que le développement de maladies qui font intervenir différents organes. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine (diabète de type 2 et accumulation de lipides dans le foie). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Notre expertise des études métaboliques chez la souris, et nos résultats antérieurs indiquent qu’un nombre minimum de 10 animaux par groupe est requis pour avoir des données statistiquement analysables. Les analyses statistiques seront réalisées avec GraphPad Prism. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par un test non paramétrique, le test U de Mann-Whitney, permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Une analyse avec le test de Kruskal-Wallis sera réalisée pour comparer plus de 2 groupes.

Raffinement

La durée sous régime riche en graisse supplémenté ou non en sucres et les traitements relatifs aux tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et lors de la mise à jeun l'accès à l'eau est conservé. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés entraînant la mise à mort anticipée si nécessaire. En effet, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectuée.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, l'utilisation de modèles de souris transgéniques (knock-out) permet une étude approfondie des maladies hépatiques et de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons de souris adultes âgées de 8 à 24 semaines. A ce stade de développement, toutes les voies métaboliques hépatiques sont mises en place.

Trois mois de restriction alimentaire, ramenant les rats à dix pour cent en dessous de leur poids pour les motiver à travailler contre une récompense : 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 70 d'entre eux et modéré pour 130, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent une chirurgie d'implantation d'électrodes crâniennes, trois séances d'imagerie cérébrale, des enregistrements de vingt-quatre heures et des injections de kétamine destinées à reproduire des symptômes psychotiques. Le projet cherche à modéliser la prise de décision et à tester l'hypothèse d'un déséquilibre entre excitation et inhibition dans la schizophrénie. Le porteur retient le rat Long Evans pour ses capacités cognitives et visuelles, et prévoit d'écarter quinze pour cent des animaux qui n'atteindront pas les critères d'apprentissage.

Objectifs

Les troubles neuropsychiatriques sont aujourd'hui la principale cause d'invalidité et de coûts de santé dans les pays développés. L’objectif de ce projet est de développer une tâche comportementale permettant d’étudier chez l’animal les processus inférentiels et d’explorer l’hypothèse clinique mettant en cause un déséquilibre excitation/inhibition

Bénéfices attendus

Le projet produira de nombreux résultats aux niveaux fondamental, clinique et pratique. Au niveau fondamental, il dévoilera le rôle des systèmes glutamatergique (excitateur) et GABAergique (interneurones parvalbumine inhibiteurs) dans les processus de prise de décision et remettra en question la théorie de l'inférence circulaire, en mettant en lumière la manière dont les croyances/priorités peuvent être créées et propagées au niveau des microcircuits. Sur le plan clinique, cela ouvrira la voie à des traitements pharmacologiques dans le domaine des troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie, visant à rétablir l'équilibre de l'excitation cérébrale.

Procédures

Concernant l’analyse comportementale 200 rats seront soumis à un apprentissage cognitif et une série d’évaluation d’une durée allant de 1 à 3 mois à raison de 30 min à 1h de test quotidien. Pendant ces tests, les animaux seront soumis a une restriction alimentaire de 10% de leur poids sur une période de 3 mois, afin des les motiver à la récompense. Des imageries cérébrales in vivo (imagerie par résonnance magnétique et tomographie par émission de positrons) seront réalisées à 3 temps sans dépasser 1h15 par rat. Afin de mener les enregistrements cérébraux sur une partie des animaux, une chirurgie sera réalisée permettant l’implantation d’électrodes. Celle-ci ne dépassera pas 45min durant 4 sessions d'enregistrement. Les enregistrements seront réalisés sur animaux vigiles au repos (acquisition de 24h) ou en cours de tâche comportementale. Sur certains animaux, des injections (au nombre de 5) seront réalisées pour moduler la balance excitation/inhibition et observer les impacts sur le comportement des rongeurs. Enfin sur l’ensemble des animaux, trois prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie, d’une durée maximale de 10min par rat.

Impact sur les animaux

La kétamine est un agent pharmacologique couramment utilisé pour modéliser les symptômes psychotiques et présente une bonne tolérance à la dose qui sera utilisée dans ce projet. Aucun effet indésirable n’est attendu. Lors des chirurgies (implantation des électrodes) ou durant les acquisitions en imagerie, l’induction et le maintien de l’anesthésie peuvent provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie pouvant conduire à la mort soudaine des animaux. Concernant l’évaluation comportementale, une habituation à la manipulation sera réalisée à l’arrivée des rats pour réduire le stress. La principale nuisance est la restriction alimentaire qui sera maintenue sur une période relativement longue (3 mois maximum) afin de motiver les animaux dans les tâches de conditionnement opérant.

Devenir

L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportemental et d'imagerie du vivant ou Eléctroencéphalographie avant leur mise à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire. Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés au cours de ce protocole, nous avons intégré dans la mesure du possible, les animaux a toutes les procédures mises en oeuvre dans ce projet.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle assurant le lien entre la recherche fondamentale et la recherche clinique et permettant le transfert des connaissances vers des applications thérapeutiques au bénéfice du patient. Cherchant à évaluer le bénéfice comportemental et fonctionnel de stratégies thérapeutiques pro-cognitives, il est indispensable de se reposer sur un modèle intégré et le remplacement des rats par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce contexte. Toutefois l’ensemble des molécules pharmacologiques utilisées dans ce travail ont fait l’objet d’études préalables permettant de valider les propriétés recherchées pour cette étude.

Réduction

Le projet a été conçu avec un nombre minimal d’animaux nécessaire à sa validité scientifique et statistique. Les animaux qui seront utilisés pour effectuer l'évaluation comportementale seront également utilisés pour étudier les marqueurs fonctionnels d’imagerie. En termes de comportement des groupes de 20 animaux par groupe sont nécessaires pour garantir la fiabilité des résultats. Un taux d’exclusion de 15% de l’effectif initial doit toutefois être considéré. Ce chiffre a été défini sur la base de notre expérience dans l’utilisation de la tâche de discrimination visuelle et correspond au pourcentage de rats qui ne parviennent pas à atteindre les critères de validation de l’étape de conditionnement/apprentissage.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la réglementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée.

Choix des espèces

L’espère de rat Long Evans est choisie pour ses capacités cognitives et visuelles adaptées. Les animaux seront utilisés dès 2 mois et suivis jusqu’à 6-7 mois, car il a été montré que c'est pendant cette période du dévelopement que les animaux présentent les meilleures facultés d'apprentissage, nécessaire pour les procédures comportementales.

Pour tester trois médicaments contre les angiomes caverneux cérébraux, 1 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 048 d'entre elles et modéré pour 168. Elles subissent des injections quotidiennes pendant trois jours, une séance d'imagerie d'une heure sous anesthésie, puis une chirurgie de quinze minutes destinée à récupérer les tissus. 144 souris de "mauvais génotype" sont réutilisées comme animaux témoins dans d'autres projets, les autres sont tuées. Le porteur annonce une échelle de cotation de la douleur et des points limites adaptés, sans préciser les signes retenus ni les seuils qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) et a pour objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs capacités à arrêter la formation des lésions vasculaires dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement médicamenteux disponible pour les angiomes caverneux et la suppression par chirurgie n'est pas toujours possible. De plus, le risque de nouveaux saignements dans les années suivant la chirurgie est élevé. Ce projet vise à tester des traitements afin de savoir si ces derniers bloquent la formation des lésions vasculaires dans nos modèles atteints de la maladie. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à la découverte d’un traitement thérapeutique efficace sans effet secondaire.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, seule l’élevage et la reproduction des animaux sera réalisée. Dans le second établissement utilisateur, la distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Puis, l’étude impliquera une injection du traitement de 30 secondes, une fois par jour pendant trois jours suivie d’une imagerie d’une durée de 1h maximum, réalisée sous anesthésie, suite, ou non à l’induction d’une inflammation. Et enfin, une chirurgie d’une durée de 15 minutes sera réalisée afin de récupérer les tissus à analyser.

Impact sur les animaux

La distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Ces résultats permettront d’adapter le protocole d’administration sur les animaux présentant la pathologie. Ces derniers recevront un traitement administré pendant 3 jours consécutifs, pouvant induire une légère douleur, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. L’évolution des lésions et la réponse au traitement sont suivies par imagerie, d’une durée de 1h maximum et peuvent engendrer un léger stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés. Les 144 animaux réutilisés correspondent aux souris de mauvais génotype, qui pourront être réutilisées pour des prélèvements ou d'autres projets comme animaux sauvages.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé ou une espèce autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidat pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animaux est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront exportés de L’EU1 à l’EU2 pour les expérimentations. Les animaux seront placés dans des caisses de transport spécialement conçues pour les rongeurs, assurant un espace adéquat, une aération optimale, une sécurité appropriée pour éviter toute blessure ou fuite ainsi qu’une non-rupture de la barrière sanitaire. L’itinéraire le plus court sera choisi afin de minimiser le temps de transport, qui n’excèdera pas 15 minutes. Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Tous les croisements réalisés viseront à obtenir exclusivement des animaux viables ayant les mêmes symptômes que les patients avant déclaration de la pathologie.

Choix des espèces

Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Les animaux auront entre 6 et 12 semaines lors des expérimentations afin d’être en conditions semblables à la pathologie humaine étudiée.