Procédures légères

Gardées vivantes après l'unique procédure, les souris de ce projet voient leur sort dépendre du résultat du génotypage et de leur sexe : utilisation dans un autre projet autorisé, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement. 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Sur chacune, entre 13 et 28 jours de vie, deux millimètres de l'extrémité de la queue sont coupés sur animal vigile sous contention, geste que le porteur situe à un âge où la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, avec un risque de saignement et, rarement, de rejet par la mère. Le bénéfice avancé se limite à la gestion de l'élevage, en sélectionnant les animaux porteurs du gène recherché, et le chiffre de 2 500 individus est annoncé sans être ventilé entre les lignées concernées.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les projets et pour le maintien des lignées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasive. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée pour le génotypage des lignées utilisées.

Bénéfices attendus

Ce projet permets de selectionner les animaux ayant un gène d'intéret afin d'optimiser la gestion de l'élevage.

Procédures

Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage et/ou de leur sexe parmi les cas suivants : a) Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé, b) Utilisé pour le maintien de la lignée, c) Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.

Réduction

L’enjeux et l’objectif majeur de la réduction consiste ici à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au stricte nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, si phénotype non dommageable) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir.

Raffinement

La méthodes utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (tels que l'épilepsie, l'autisme, ...). Les prélèvements seront réalisés entre 13 et 28 jours après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémoragiques extrêmement réduits.

Chaque rat reçoit une injection dans le muscle sous anesthésie, puis deux jours d'analgésie, avant d'être tué pour des prélèvements histologiques et moléculaires. 480 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. L'objectif est de tester des séquences d'ADN censées limiter l'expression d'un gène thérapeutique aux seules cellules souches du muscle, en vue de thérapies géniques contre les myopathies. Le porteur indique utiliser à la fois des rats sauvages et des rats porteurs d'une mutation du gène Dmd, qui reproduit la dystrophie de Duchenne, sans dire combien d'individus relèvent de chaque groupe, et précise que ces rats seront tués vers l'âge de deux mois, avant l'apparition des atteintes les plus marquées.

Objectifs

Les cellules souches du muscle squelettique (aussi appelées cellules satellites) sont essentielles dans le processus de la régénération musculaire, et pourraient être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies. Par contre, ces cellules sont entourées par plusieurs autres types de cellules. Les thérapies géniques pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en utilisant des vecteurs de gènes ciblant spécifiquement ces cellules souches, et en évitant ainsi l’expression des gènes apportés (transgènes) dans d’autres populations cellulaires, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Nous allons utiliser des virus adéno-associé (AAV) pour tester des séquences régulatrices de gènes seulement exprimés dans les cellules satellites, afin de créer des vecteurs qui peuvent cibler les cellules souches du muscle squelettique. Des rats sauvages ou avec une dystrophie musculaire provoquée par mutation du gène Dmd, responsable de la production de la dystrophine, seront injectés par voie intramusculaire avec les AAVs. Le ciblage des cellules souches sera examiné par analyse en immunofluorescence sur coupe histologique et cytométrie en flux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier des séquences d’ADN qui permettent une expression spécifique des transgènes dans les cellules souches du muscle squelettique. De telles séquences ne sont pas connues à ce jour, donc cette identification représentera une avancée importante dans notre connaissance du ciblage et de la régulation génique dans les cellules souches. Du point de vue clinique, ces séquences seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets non-ciblés et des réponses immunitaires.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront une injection intramusculaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous attendons une douleur légère liée avec l’injection intramusculaire, qui sera traitée avec des analgésiques pendant deux jours suivant l’injection. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seraient mises à mort à l’âge de 1,5-2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Nous réalisons des cultures de myoblastes en première intention pour tester nos séquences d’intérêt. Malheureusement, ces cultures restent loin de la situation in vivo puisque les vraies cellules souches du muscle sont quiescentes chez l’adulte, se divisant rarement, ce qui rend impossible la mise au point d'un système d'étude représentatif in vitro. De plus, nos expériences antérieures ont montré que certaines séquences prometteuses en culture n’avaient pas toujours une activité spécifique in vivo. Compte tenu de ces contraintes, il reste nécessaire de valider les séquences selectionnées dans un modèle animal.

Réduction

Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par AAV et point de temps. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure de façon significative.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à l’âge d’un mois. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. D’abord, nous utilisons un modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne dans le rat, qui récapitule le phénotype humain. Le rat est aussi un mammifère, et beaucoup des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les AAVs sont conservées chez l’humain. Donc si une séquence a une activité forte dans des cellules de rat, il est probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les rats utilisés en procédure 1, les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules souches du muscle sont plus accessibles au virus à ce stade.

Des tirs de laser sur la rétine sous anesthésie, ou une injection sous la rétine, provoquent une dégénérescence maculaire chez des souris et des rats, qui reçoivent ensuite jusqu'à huit gouttes oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine. 9 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme que le développement de cette maladie n'est pas douloureux, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité. 8 390 animaux sont tués pour les évaluations histologiques, et 810 réutilisés dans d'autres procédures, ceux-là étant les individus écartés du protocole après la détection d'une anomalie de l'œil avant le début de l'étude.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle expérimental de DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge) chez les rongeurs, dans le but de tester des traitements potentiels. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés. Cette pathologie touche l'œil dans une zone particulière de la rétine : la macula, impliquée dans la vision fine et la vision centrale. La maladie est silencieuse pendant plusieurs années, puis la vision et la perception des détails baissent, des tâches sombres apparaissent au centre du champ de la vision. Elle existe sous plusieurs formes : la forme « humide » ou exsudative et la forme sèche (ou atrophie géographique). Dans la forme humide de la DMLA, plus grave qui évolue rapidement vers une perte importante de la vision centrale, de nouveaux vaisseaux sanguins poussent de façon anormale et endommagent la rétine. Les nouveaux vaisseaux sanguins poussent anormalement à partir de la choroïde (tissu situé sous la rétine), on utilise les termes de néovascularisation choroïdienne. La stratégie des traitements est de stopper la progression anarchique de ces vaisseaux délétères. La forme dite «sèche», ou atrophie géographique de la DMLA est la plus fréquente, elle évolue plus lentement que la forme humide mais il n’existe pas de traitement. Nous estimons pouvoir réaliser 7 études par an de test d’efficacité de molécules luttant contre la DMLA, comportant au maximum 6 groupes de 15 animaux (90 animaux maximum) en fonction des produits à tester, par an pendant 5 ans, chez le rat et la souris, il s’agit d’une prévision maximumselon nos capacités. Le nombre de groupe varie en fonction des produits à tester : soit 1 ou plusieurs doses d’une même molécule à comparer à l’effet d’un placébo, soit plusieurs traitements différents à comparer entre eux.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement de médicaments luttant contre la DMLA et améliorant la vue des patients. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés et la troisième cause dans le monde (1,5 millions de personnes en France, 196 millions dans le monde). Sa fréquence augmente avec l’âge et le nombre de patient augmentera compte tenu de l’allongement de l’espérance de vie.

Procédures

L’induction de la DMLA chez les rats et les souris se fait par des tirs de laser ophtalmiques sur la rétine sous anesthésie, ou par une injection sous la rétine. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens en lampe à fente) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil (injection intravitréenne, sous conjonctivale), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Le développement de la DMLA chez l’homme, et par transposition chez l’animal, n’est pas douloureux. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, ce stress sera minimisé par l'utilisation de tapis, de lampe ou d'enceinte de réveil chauffants.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif grâce à un test, sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de minimum 5 semaines, conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Porteuses d'une mutation qui provoque une cardiomyopathie dilatée, ces souris développent une atteinte cardiaque vers neuf mois, avec une mobilité réduite, une douleur et une mort prématurée autour d'un an. 534 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'acte déclaré se limitant à une biopsie de queue prélevée en quelques secondes sur des souriceaux de 7 à 14 jours. Le porteur indique limiter volontairement leur utilisation à six mois, soit avant l'apparition du phénotype pour lequel la lignée est entretenue. La grande majorité des hétérozygotes partira vers d'autres projets d'expérimentation, certains encore en cours d'écriture, et les animaux sans le génotype recherché comme les anciens reproducteurs seront tués.

Objectifs

Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement d'une famille de maladies rares présentant une atteinte cardiaque (cardiomyopathie dilatée) associée ou non à des atteintes musculaires (prévalence estimée à environ 9 sur 100.000). Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche. Chez ces souris, à l'état hétérozygote, la mutation du gène impliqué dans la pathologie entraine une cardiomyopathie dilatée ; tandis qu'à l'état homozygote, les souris développent une cardiomyopathie dilatée précoce associée à une atteinte musculaire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du bon génotype indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie (cardiomyopathie associée ou non à une atteinte musculaire) et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques dans les dystrophies musculaires et cardiomyopathies liées aux mutations d'un gène impliqué dans une famille de maladies rares affectant le coeur et les muscles, et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La cardiomyopathie liée à ce gène est la plus agressive des cardiomyopathies pour laquelle il n'existe aucune alternative thérapeutique à l'heure actuelle en dehors de la transplantation cardiaque.

Procédures

Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigil. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourront induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Les souris hétérozygotes développent un phénotype cardique vers l'âge de 9 mois, pouvant induire une mobilité réduite et une douleur conduisant à une mort prématurée autour de l'âge de 1 an. Dans ce cadre, notre utilisation de ces souris est limitée à 6 mois afin de se placer avant la survenue du phénotype dommageable.

Devenir

La grande majorité des animaux hétérozygotes sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasiés.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires participant au développement d'une atteinte cardiaque, musculaire et adipeux, organes qui communiquent entre eux. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.

Réduction

534 animaux seront utilisés dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés (si nos besoins sont en baisse, nous pourrions être amené à réduire le nombre d'accouplements, à procéder à de la cryopréservation). Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La technique utilisée pour la réalisation des biopsies est la biopsie caudale, technique recommandée par les différents comités nationaux. Les biopsies sont réalisées avec du matériel propre et désinfecté, une compression avec de l'essuie tout propre est effectué pour stopper le micro-saignement. Les souriceaux sont sur surveillance jusqu'à ce que leur mère les reprenne en charge dans le nid. Un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire et cardiaque est la souris. Des animaux modèles de la maladie sont indispensables pour étudier le muscle/coeur in vivo dans un système pathologique. Les animaux sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 6 mois de vie pour les reproducteurs. Afin de limiter au maximum la manipulation des animaux, le prélèvement pour génotypage est réalisée en même temps que l'identification individuelle, soit sur des souriceaux âgés de 7 à 14 jours de vie. Nous limitons volontairement l'utilisation des animaux jusqu'à 6 mois de vie, nous plaçant ainsi plusieurs mois avant le développement du phénotype dommageable survenant vers 9 mois de vie.

Cinq prises de sang de six gouttes, une par heure, puis six autres prélèvements et une injection intraveineuse tous les quatre jours pendant deux semaines : 368 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous tués pour prélever leur sang, leur aorte et leur cœur. La question posée porte sur les vésicules extracellulaires libérées après un repas et sur la capacité d'un polyphénol, l'hespéridine, à en modifier la quantité et le contenu. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées de la queue peuvent laisser des bleus et une irritation, et qu'une manipulation excessive de cette queue perturbe la régulation de la température de l'animal. Le choix de rats de 8 à 12 semaines est présenté comme un geste éthique, l'argument étant que des individus physiologiquement stables réduisent la variabilité et donc le nombre d'animaux non-humains à utiliser.

Objectifs

Le stress nutritionnel après le repas est connu pour être à l’origine d’altérations transitoires dans le fonctionnement normal du métabolisme, mais que répétées dans le temps, sont associées au développement des maladies métaboliques et cardiovasculaires. D’autre part, il est connu que des petites vésicules libérées par toutes les cellules de l’organisme peuvent se retrouver dans le sang et sont impliquées dans le bon fonctionnement du corps. De plus, une augmentation du taux circulant de ces vésicules est associée avec l’apparition de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Cependant, l’effet des vésicules produites après un repas sur les fonctions cardiovasculaires est peu connu. Des approches nutritionnelles à base d’aliments végétaux riches en composés naturels appelés polyphénols, connus pour leurs bienfaits sur la santé, se sont avérées capables de réduire l’élévation du taux de ces vésicules extracellulaires lors de désordres cardio-métaboliques. Toutefois, l’impact quotidien de notre alimentation et de ces constituants végétaux sur la libération des vésicules extracellulaires après un repas et leurs activités biologiques n’est pas connu. Ce projet fait l’hypothèse selon laquelle les polyphénols apportés par la composante végétale de notre alimentation peuvent impacter favorablement la biologie des vésicules extracellulaires après un repas notamment en réponse à un stress nutritionnel. Pour répondre à cela, le premier objectif est de caractériser de façon fine les vésicules extracellulaires libérées (origine cellulaire et contenu) à la suite d’un stress après un repas et de déterminer les constituants permettant d’identifier spécifiquement les vésicules extracellulaires post-repas. Le projet a également pour but de déterminer le rôle biologique des vésicules extracellulaires post-repas, notamment sur certaines fonctions cardio-métaboliques. À partir des connaissances ainsi générées, nous pourrons évaluer la capacité de certains polyphénols à moduler la libération, le contenu et les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires produites après un repas.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet est un prérequis à la compréhension du rôle des vésicules extracellulaires post-repas dans les effets de notre alimentation, et tout particulièrement de la composante en polyphénols des produits végétaux, sur notre physiologie et notre santé. Dans son ensemble, le projet permettra d’apporter un éclairage nouveau sur la réponse post-repas et son rôle primordial dans la mise en place des désordres cardiométaboliques.

Procédures

- Gavage (1 fois/animal, < 1 minute), - Prélèvement de sang pour doser les vésicules extracellulaires (5 prélèvements de 6 gouttes de sang par animal, 1 prélèvement/heure, durée de chaque prélèvement < 1 minute). - Supplémentation de la nourriture avec de l’hespéridine (durée acte : 4 semaines), - Injection intraveineuse (1 injection tous les 4 jours pendant 2 semaines, durée de chaque injection < 5 minutes), - Prélèvement de sang pour étude métabolique (6 prélèvements d’une goutte de sang par animal, durée de chaque prélèvement < 1 minute).

Impact sur les animaux

1. Gavage : Les animaux peuvent ressentir une gêne passagère lorsqu’un petit tube est introduit dans leur gorge pour administrer une substance. Cette procédure peut être un peu stressante, car elle nécessite de tenir l’animal immobile pendant un court moment. Si elle n’est pas faite correctement, elle pourrait provoquer de petites irritations internes. 2. Injections dans la queue : Les injections dans une veine de la queue peuvent provoquer une légère douleur au moment de la piqûre. Si plusieurs tentatives sont nécessaires, cela peut être un peu plus désagréable pour l’animal et entraîner une légère irritation ou un petit bleu. Dans certains cas, l’animal peut lécher ou mordiller la zone concernée. 3. Prises de sang dans la queue : Comme pour les injections, cette procédure nécessite de maintenir l’animal immobile, ce qui peut être stressant. La piqûre peut provoquer un léger inconfort, et des bleus ou une irritation peuvent apparaître si les prélèvements sont répétés trop souvent. Une manipulation excessive de la queue peut aussi perturber la régulation naturelle de la température chez l’animal.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus (sang, aorte, cœur) seront effectués sur les animaux euthanasiés afin d’analyser les effets cardiovasculaires et métaboliques de l’étude.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement d’autres méthodes permettant d’obtenir les mêmes informations sans utiliser d’animaux vivants. Pour comprendre comment le stress après un repas agit sur l’organisme, et comment certains composés comme les polyphénols peuvent influencer la circulation de petites particules appelées vésicules extracellulaires, il est nécessaire d’observer ces réactions directement dans un organisme vivant. Cela permet d’étudier des phénomènes complexes qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire autrement.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de gavage chez le rat. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistique pour déterminer le minimum numéro d’animaux nécessaire pour assurer la validité des résultats obtenues.

Raffinement

Pour favoriser la socialisation des animaux, nous placerons au maximum trois animaux par cage. Nous avons raffiné nos approches afin de minimiser la détresse imposée aux animaux, qui seront hébergés dans un environnement enrichi répondant à leurs besoins physiques et comportementaux. Dans la cage, les animaux auront à leur disposition des tubes en plastique opaque pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. L’état de santé des animaux sera évalué régulièrement par l’expérimentateur (au moins une fois par semaine) pendant toute la durée du protocole, en observant leur comportement. Si une douleur est anticipée ou si les animaux présentent des signes pouvant suggérer du stress ou de la douleur après une manipulation, une grille de scoring spécifique avec des seuils prédéfinis sera appliquée. Le cas échéant, des médicaments appropriés (anesthésiques ou analgésiques) seront administrés, conformément aux recommandations vétérinaires et aux bonnes pratiques en expérimentation animale. Le suivi de ces animaux sera alors effectué quotidiennement dès l’apparition de ces signes. Si l’animal se rétablit, le suivi régulier sera repris jusqu’à la fin de la procédure. En revanche, si son état se détériore, le seuil limite sera appliqué et une euthanasie sera réalisée.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce est basé sur notre connaissance de ce modèle, ainsi que sur la disponibilité de données dans la littérature associées à un stress après un repas de courte durée. Les rats âgés de 8 à 12 semaines sont dans une phase de développement adulte jeune, ce qui les rend physiologiquement plus stables et donc plus fiables pour les expériences. À cet âge, ils ont dépassé les changements hormonaux liés à la puberté et ne sont pas encore affectés par les effets du vieillissement, ce qui permet d'obtenir des résultats plus cohérents et précis. D'un point de vue éthique, cette tranche d'âge respecte les principes de la science responsable. En effet, les rats à ce stade sont plus stables physiologiquement, ce qui permet de réduire les variations entre les individus et de mieux contrôler les expériences. Cela permet aussi de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Choisir des rats à ce stade évite l'utilisation d'animaux trop jeunes, plus vulnérables, ou trop âgés, susceptibles de présenter davantage de risques. En résumé, l'utilisation de rats adultes jeunes garantit des résultats plus fiables tout en assurant leur bien-être et en réduisant le nombre d'animaux utilisés pour l'expérience.

Maintenues en vie et versées au fil de l'eau à d'autres projets d'expérimentation de l'établissement, 1 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en quelques secondes : au sevrage, à quatre semaines, deux millimètres de l'extrémité de la queue sont coupés sur l'animal éveillé, ce qui peut saigner, le saignement étant arrêté par compression au coton. Le porteur écarte toute analgésie, jugeant qu'elle ajouterait un geste invasif et que les animaux biopsiés ne présentent pas une douleur qui la justifie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les plaques d'athérosclérose et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux génétiquement altérés.

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer des biopses de queues sur les souris génétiquement modifiées qui ont intégrées dans tous nos projets scientifiques en cours et à venir (ayant déjà des autorisations de projet ou en cours) dans le but de génotyper nos lignées. La nouvelle réglementation exige désormais une autorisation pour ces prélèvements invasifs en vue de génotypage. Nos projets en cours concernant la compréhension du rôle d'une molécule d'adhésion dans les maladies cardiovasculaires. Cette molécule est exprimée par différents types cellulaires et nous souhaitons préciser son rôle lorsqu'elle n'est exprimé que par les cellules endothéliales. Nous utilisersons donc des modèles expérimentaux délétés pour cette molécule uniquement au niveau de l'endothélium.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour nos projets scientifiques ainsi que leur génotypage et le contrôle qualité de nos lignées murines.Les animaux utilisés dans ce projet permettront d'apporter de nouvelles données dans la compréhension du rôle d'une molécule d'adhéson dans les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Cette intervention se fera sur animal vigile et ne durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue au moment du sevrage à 4 semaines, donc éventuellement un saignement. Le fait de manipuler l'animal par contention engendre également un stress chez ce dernier.

Devenir

Animaux maintenus en vie, utilisation continue dans des DAP d'expérimentation.

Remplacement

Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro mimant les plaques d'athérosclérose et suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur le rôle d'une molécule d'adhésion dans la progression des maladies cardiovasculaires. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme. Ici, il s'agit de produire des animaux avec un phénotype d'intérêt pour nos projets en cours.

Réduction

Nous appliquerons la stratégie de réduction, à savoir 1/ l'utilisation dès que possible de schémas d'accouplements ne nécessitant pas ou peu de génotypage, 2/ des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques), 4/ le développement en parallèle des méthodes de génotypage sous le seuil telles que la biopsie de poils . Au total, dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux nécessaires aux expérimentations, à savoir un nombre de 1000 souris qui résulte du nombre de souris nécessaire en lien avec nos besoins expérimentaux pour atteindre la puisance statistique nécessaire minimale.

Raffinement

Concernant le prélèvement invasif, il s'agit d'une méthode éprouvée, précise, rapide et standarisée, ce qui limite les effets indésirables liés au stress et à la douleur,cela peut éventuellement entraîner un saignement et une douleur, saignement qui sera arrêté par compression à l'aide d'un coton. Egalement, l'analgésie systématique n'est pas pertinente (elle se ferait par injection, ce qui ajoute un geste invasif alors que les animaux biopsiés ne presentent pas une douleur justifiant cette dernière).

Choix des espèces

Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Ici, il s'agit de produire des animaux avec un phénotype d'intérêt pour nos projets en cours. Afin de pouvoir définir le phénotype des souris, un génotypage est nécessaire. Les animaux seront prélevés à l’âges de 20 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.

Tuées pour que leur tissu adipeux soit prélevé et mis en commun, une seule souris n'en fournissant pas assez, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent neuf gavages hebdomadaires d'une huile contenant un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose, une partie d'entre elles suivant en plus un régime riche en graisses pendant toute l'étude. Une partie des souris est obèse par mutation génétique, ce que le porteur relie à des troubles de mobilité, une résistance à l'insuline et une inflammation chronique, en précisant que ces effets "ne provoquent pas de douleur directe". Les vésicules extraites de leur graisse seront ensuite testées sur des cellules en culture et injectées à des larves de poissons zèbres, toute application humaine restant hors du projet.

Objectifs

Les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse (appelées MASLD, anciennement NAFLD) sont de plus en plus fréquentes et représentent un véritable problème de santé. Elles commencent par une infiltration excessive de graisse dans les cellules du foie (stéatose), ce qui peut entraîner des complications plus graves comme l’inflammation du foie (MASH), puis évoluer vers de la fibrose, une atteinte sévère du foie (cirrhose) et, dans certains cas, un cancer du foie. Parmi les facteurs qui pourraient aggraver ces maladies, l’exposition prolongée à certaines substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs) est particulièrement inquiétante. Ces substances, présentes dans l’environnement et certains produits du quotidien, pourraient perturber le fonctionnement normal du foie et favoriser la progression de ces maladies. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment certaines substances chimiques de l’environnement, appelées perturbateurs endocriniens (PEs), pourraient influencer les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse. Pour cela, nous allons produire en laboratoire des particules appelées vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), issues de la graisse de souris ayant été exposées à différents niveaux de PEs. Ces particules pourraient jouer un rôle clé dans l’évolution de ces maladies. Pour cela, nous exposerons des souris de différentes souches (normales, obèses et nourries avec un régime riche en graisses) à des perturbateurs endocriniens. Après leur mise à mort, nous collecterons le tissu adipeux pour produire in vitro les AdVEs. Grâce à ces différents modèles expérimentaux, nous pourrons étudier comment le sexe et l’état métabolique des souris (obésité d’origine génétique ou liée à l’alimentation) influencent la production et la composition des vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhensions des interactions entre exposition environnementale, adiposité et dysfonctionnements métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets d’une exposition prolongée à un mélange de substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs), à deux niveaux d’exposition différents, dans des situations métaboliques variées. L’objectif est de mieux comprendre l’impact combiné de ces substances, en particulier lorsqu’elles sont associées à de l’obésité. Des études précédentes ont montré que certains de ces polluants, pris individuellement, ont peu d’effet, mais qu’en cocktail, ils peuvent perturber davantage le métabolisme en agissant ensemble. Cette approche aidera à mieux comprendre comment l’environnement influence notre organisme. Enfin, les vésicules extracellulaires issues de la graisse des souris seront utilisées pour étudier leurs effets soit sur des cellules en laboratoire, soit après injection dans des larves de poissons-zèbres. Ces modèles complémentaires permettront d’avoir une vision plus large des conséquences de ces substances dans un contexte pathologique particulier.

Procédures

Une partie des souris sera soumise à un régime riche en graisses HFD pendant toute la durée de l’étude. Et toutes les souris recevront, par gavage oral (5 secondes) et à neuf reprises, soit une huile servant de contrôle, soit une huile contenant un mélange de 4 perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose.

Impact sur les animaux

Le gavage hebdomadaire est la principale source de nuisance dans cette étude. Bien qu’indispensable pour une administration contrôlée des substances, cette méthode peut entraîner du stress pour les animaux. Pour réduire cet impact, les manipulations seront effectuées par du personnel qualifié, en utilisant une contention appropriée et en limitant la durée des manipulations. L’exposition aux substances étudiées vise à simuler une exposition environnementale chronique, comparable à celle à laquelle les humains peuvent être confrontés. Toutefois, l’administration répétée peut provoquer un stress physique, notamment à cause des manipulations fréquentes. L'obésité, qu'elle soit causée par un régime alimentaire spécifique ou une mutation génétique, peut entraîner des problèmes de mobilité, des troubles métaboliques tels que la résistance à l'insuline et une inflammation chronique. Toutefois, ces effets ne provoquent pas de douleur directe chez l'animal, bien qu'ils nuisent à son bien-être en réduisant sa capacité à se déplacer et en générant un stress physiologique.

Devenir

À la fin de la procédure toutes les souris seront mises à mort, afin de permettre le prélèvement du tissu adipeux nécessaire à l’isolement des vésicules extracellulaires.

Remplacement

Le développement des maladies hépatiques liées à l’accumulation de graisse est souvent associé à l’obésité et résulte d’interactions complexes entre plusieurs organes, notamment le foie, le tissu adipeux et le pancréas. Ces échanges impliquent également divers types cellulaires au sein du foie. Les perturbateurs endocriniens (PEs) agissent en perturbant les hormones, ce qui peut influencer ces mécanismes. En l’absence de modèle alternatif fiable pour reproduire l’obésité à l’échelle de l’organisme, nous utiliserons un modèle murin de souris déjà bien caractérisé. De plus, ces interactions complexes entre les organes, qui jouent un rôle clé dans les troubles métaboliques, ne peuvent être correctement reproduites qu’avec un modèle vivant.

Réduction

L’expérimentation sera réalisée avec un nombre d'animaux suffisant pour garantir des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le nombre total d'animaux est déterminé en fonction du nombre de groupes nécessaires et du nombre d'animaux par groupe pour obtenir des données fiables. Pour extraire les vésicules extracellulaires provenant du tissu graisseux, une certaine quantité de matière est indispensable. Comme une seule souris ne fournit pas assez de tissu, il est nécessaire de regrouper celui de plusieurs animaux. Le nombre varie selon le type de souris utilisé : il en faut davantage pour les souris de poids normal, et un peu moins pour les souris obèses. Des tests statistiques ont montré qu’il fallait au minimum huit échantillons indépendants pour chaque condition afin de pouvoir comparer les résultats de façon fiable. Ces échantillons seront préparés séparément pour les mâles et les femelles, car les effets étudiés peuvent différer selon le sexe. Au total, ces besoins justifient l’utilisation de 720 souris pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce, avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tubes en carton, morceaux de bois). Le protocole expérimental prévoit un suivi quotidien des animaux, basé sur l’observation de signes physiques et comportementaux prédéfinis, qui permettront de repérer tout signe de mal-être. Leur poids sera contrôlé deux fois par semaine. En cas de douleur ou de souffrance, des antalgiques pourront être administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, une euthanasie pourra être pratiquée pour éviter toute souffrance prolongée, selon une grille d’évaluation spécifique. Les souris obèses, mâles ou femelles, seront placées par groupes de 2 ou 3 par cage, en tenant compte de leur poids et de la taille des cages, et des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise. Étant moins mobiles, une attention particulière sera portée lors de leurs transferts.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris, c’est un modèle bien établi d’étude préclinique et facilement accessible, permettant d’étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte physiologique complexe. Leur exposition à un gavage hebdomadaire est facile à réaliser, ce qui simplifie l’administration contrôlée des substances. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées, car les maladies liées à l'accumulation de graisses dans le foie touchent principalement les adultes.

Nés dans l'élevage de l'établissement avec un génotype inutilisable pour ses projets de recherche, 350 souris et 10 rats étaient de toute façon promis à la mise à mort. Ils vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour entraîner du personnel aux gestes techniques, et tués à l'issue. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trois types de gestes différents sur des jours distincts pendant trois semaines, administration orale, injections sur animal vigile ou anesthésié, deux prélèvements sanguins au maximum, et jusqu'à trente minutes d'anesthésie pour l'apprentissage de l'échographie. Le porteur indique qu'un apprentissage préalable sur mannequins sera proposé aux apprenants pour fixer la technique, sans le rendre obligatoire avant le passage sur les animaux.

Objectifs

Ce projet est consacré à l’entrainement du personnel sur les gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales, sur les espèces déclarées dans les projets de recherche de l’établissement. En complément de la formation, initiale le programme du tutorat permet d’assurer le niveau de compétence requis pour la qualification au poste de travail. Ce programme inclut la formation aux aspects pratiques et aux gestes techniques sur les espèces concernées par le poste de travail. Un entrainement régulier et une bonne compétence du personnel sont indispensables à une réalisation efficace des études, augmentant la fiabilité des résultats, et respectant le bien-être animal par la pratique de gestes maitrisés. La formation aux différents gestes techniques peu invasifs sera mise en place dans ce tutorat. Les tutorés seront supervisés dans l’accomplissement de leurs tâches par un tuteur présentant les qualifications et l’expérience adéquates, jusqu’à ce qu’ils aient démontré qu’ils possèdent les compétences requises. Ce programme de tutorat sur différents gestes techniques permettra de 1-donner les éléments théoriques sur la bonne réalisation du geste en respectant le bien-être des animaux, 2-réaliser des démonstrations par le tuteur, 3-mettre en pratique sous surveillance rapprochée, 4-valider la compétence et l’autonomie du tutoré.

Bénéfices attendus

Ces sessions de formation sur l’animal permettront une amélioration de l’apprentissage des concepteurs et applicateurs concernant les gestes de base et puis secondairement plus complexes sur le vivant. Les enseignants seront présents pour parfaire les gestes des apprenants, discuter et faire un « debriefing » à chaque fin de séance. Ces sessions viendront compléter les formations reçues au préalable par l’apprenant. L’avantage de la formation par tutorat est de pouvoir acquérir des gestes plus assurés et efficaces pour améliorer le confort des animaux avec une diminution du temps d’exécution des gestes, une contention ou anesthésie d’une plus courte durée et une meilleure récupération des animaux qui seront utilisés dans les futurs projets. Un entrainement régulier et une bonne compétence du personnel, sont indispensables à une réalisation efficace des études, augmentant la fiabilité des résultats, et respectant le bien-être animal par la pratique de gestes maitrisés.

Procédures

Les gestes concernés par ce tutorat seront des techniques d'administrations avec le geste d'administration orale, les techniques d'injections sur animaux vigiles ou anesthésiés et l'apprentissage du suivi des animaux en echographie. Trois types de gestes techniques peu invasifs pourront être réalisés au maximum sur un même animal sur des jours différents. Un interval de minimum 3 jours sera à respecter entre les séances de formation. Les prélèvements de sang seront limités à un prélèvement par semaine pour un maximum de 2 prélèvements par animal. Les animaux entrant en procédure pourront être utilisés pendant 3 semaines. Ils seront pesés avant de commencer la procédure et chaque geste technique. Les gestes d'administration et injection peuvent occasionner un stress ou douleur de faible intensité de trés courte durée (quelques secondes). Pour l'acquisition en echographie, il n'y a aura pas de douleur car aucune injection mais les animaux peuvent rester sous anesthésie 30 minutes.

Impact sur les animaux

L'ensemble des procédures seront légères, les gestes qui le nécessitent seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Lors des contentions les animaux même habitués peuvent avoir un léger stress. L’introduction d’une aiguille lors des gestes d’injection et prélèvements peut occasionner une très légère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette procédure de formation sont des animaux surnuméraires d'élevage ayant un génotype non adéquat pour les projets de recherche de l'établissement et sont donc destinés à l'euthanasie. Ils ne pourraient pas être réutilisés pour d'autres études ni être replacés.

Remplacement

Ce projet consiste à former les personnels aux gestes techniques sur animaux vigiles, il ne sera donc pas possible de remplacer completement le modèle animal dans ce projet. Mais il sera proposé aux apprenants de débuter par un apprentissage théorique sur des mannequins pour fixer la technique avant de passer à la réalisation des gestes sur animaux. Ainsi des entrainements sur supports inertes pourront être réalisés afin que les apprenants puissent se concentrer ensuite sur les gestes techniques

Réduction

Un nombre minimal d'animaux est prévu pour assurer un bon enseignement à chacun des participants et la possibilité de renouveler les phases de tutorat. En effet, l’acquisition des compétences nécessite de pouvoir répéter les gestes techniques pour que la personne atteigne le niveau de compétence requis. Ce niveau de compétence est évalué par le formateur, lors des séances de tutorat. Le nombre d’apprenants choisi sera fait avec soin et limité pour un meilleur apprentissage, suivi et maintien des compétences. Des essais sur mannequins pourront être faits avant de passer sur l'animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures pourront être réalisées sur le même animal pour limiter le nombre d’animaux. Les animaux utilisés pour ce projet ne seront pas générés pour ces études car nous réutiliserons des animaux de nos élevages destinés à l’euthanasie.

Raffinement

Les animaux de ce projet seront acclimatés à leur salle d’expérimentation et hébergement et habitués à la présence des apprenants au minimum 5 jours avant le début des procédures pour limiter le stress généré lors de leur préparation. Une étape cruciale avant de réaliser les gestes techniques peu invasifs sera d'apprendre et de maitriser la préhension et la contention des animaux. En effet la contention correcte des animaux est déterminante pour la qualité des administrations à réaliser ensuite chez les animaux. Une première partie du tutorat pourra être réalisée sur modèles inertes pour fixer la technique des apprenants avant de passer sur l'animal. L’apprentissage du maintien de l’anesthésie, de l’analgésie et du monitoring sera également enseignée et à maîtriser avant de passer à une procédure complète d’acquisition sur animaux vivants anesthésiés ou vigiles. Une attention particulière sera également faite sur le suivi des animaux et leur observation (reconnaissance des signes de douleurs, pesée à l'aide d'une grille de score). En effet le suivi des animaux en expérimentation repose sur la capacité à savoir reconnaitre des signes de souffrance et remplir correctement une grille de score. Cette étape sera donc vérifiée en tutorat.

Choix des espèces

Les apprenants seront formés sur les rats ou souris en fonction du modèle d’étude choisi dans leurs procédures expérimentales. Les animaux utilisés pour ce tutorat seront des adultes à partir de 8 semaines. Ce seront des animaux surnuméraires d'élevage sevrés et ayant effectués une période d'habituation avant de débuter les formations. Attendre un âge de 8 semaines permettra d'avoir des animaux aldultes suffisamment habitués et manipulés avec un poids correct pour débuter les formations.