Procédures légères

182 prélèvements sanguins en cinq jours par deux cathéters posés dans les veines jugulaires, plus douze piqûres à l'oreille à la lancette : 22 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont attachées à une chaîne d'un mètre pendant cinq semaines, privées de la moitié de leur eau pendant deux jours, puis exposées à 36 °C six heures par jour pendant une semaine. Elles rejoignent ensuite un troupeau laitier en production, le projet visant à mettre au point des capteurs qui détecteraient tôt le stress thermique et la déshydratation dans les élevages. Le porteur décrit la privation d'eau comme une déshydratation "temporaire et légère" et l'exposition à la chaleur comme une "légère hyperthermie réversible", deux états qu'il provoque délibérément pour les mesurer.

Objectifs

Le changement climatique se traduit par une fréquence accrue d’épisodes de stress thermique pour les vaches laitières. Le risque pour leur bien-être et leur santé est d’autant plus fort que les fermes laitières n’y sont pas complètement préparées. En particulier, les équipements d’abreuvement peuvent être insuffisants. Les nouvelles technologies numériques sont une opportunité pour mesurer en temps réel certains constantes physiologiques des animaux (température corporelle, teneurs en sodium et en glucose plasmatiques, conductivité du liquide interstitielle) et peut-être permettre d’identifier des signaux d'alerte précoces de dégradation du bien-être et de la santé des animaux en réponses à des variations environnementales. Notamment, l’augmentation de la température ambiante ou la déshydratation entrainent les perturbations immédiates ces constantes physiologiques sur les vaches laitières. Cependant, ces constantes dépendent aussi de l’heure du jour du fait de l’horloge biologique, et du rythme des activités quotidiennes. Ainsi, les modalités de mesures des constantes physiologiques (heure de la journée, fréquence) par des capteurs, dans l’objectif d’identifier des défauts d’adaptation de certains individus dans les troupeaux, nécessitent d’être précisées. Les objectifs de ce projet seront de 1) tester et valider des capteurs intradermiques de glycémie, ainsi que de capteurs de conductivité du liquide interstitiel lors d’une vague de chaleur simulée ou lors d’une courte restriction hydrique, 2) suivre en dynamique d’autres paramètres sanguins permettant de décrire l’adaptation à court terme (échelle minute/heure/jour) des vaches aux conditions expérimentales testées et au cours de la traite, 3) mesurer les effets de la restriction hydrique et du stress thermique sur la santé mammaire et la qualité du lait. Les capteurs testés dans ce projet sont développés pour devenir des outils de recherche peu invasifs, utilisables en fermes si leur robustesse s’avère suffisante.

Bénéfices attendus

Les connaissances acquises vont nous permettre de mieux comprendre la dynamique des évènements métaboliques (concentrations circulantes des molécules) et physiologiques (température interne, intégrité de l’épithélium mammaire) constituant la réponse adaptative des vaches laitières à la chaleur ou à la déshydratation. Ceci permettra de raffiner les méthodes de détection précoces de défaut d’adaptation des vaches et d’améliorer les pratiques en amont pour minimiser les conséquences des épisodes de forte chaleur. L'adaptation physiologique de l’animal est difficile à évaluer à des échelles de temps rapprochées sans procédures invasives et contraignantes pour l'animal. Valider la pertinence des mesures obtenues avec des capteurs comme ceux testés ici constitue une étape prometteuse pour analyser les états physiologiques en réponse aux modifications de conditions environnementales, tout en fournissant une alternative aux prélèvements sanguins.

Procédures

Selon la réussite des mesures, 6 à 12 vaches seront soumis à une restriction hydrique partielle (50% de leur volume d’eau bu à volonté) et courte (2 jours). Après 5 jours de récupération, elles seront soumises à une période de forte chaleur (36°C) pendant 6 heures dans la journée avec une période de récupération à 18°C de 14 h par jour pendant 7 jours. Elles subiront une opération de quelques minutes sous anesthésie locale pour la pose de 2 cathéters jugulaires, puis seront soumises à des prélèvements de sang sériées au cours de 5 jours (182 prélèvements sanguins). Une petite quantité de sang (500 µl) sera également prélevée par piqure de la veine de l'oreille grâce à une lancette (stylet pédiatrique) avec 3 prélèvements de ce type pendant 4 jours espacés dans le temps. Pour ces prélèvements, les animaux seront maintenus à l’attache pendant 5 semaines, ce qui correspond pour cette espèce à une pratique adoptée l’hiver dans les élevages de montagne.

Impact sur les animaux

Les vaches seront maintenues à l’attache pendant 5 semaines, ce qui constitue une contrainte pour des animaux qui sont habituellement en stabulation libre ou au pâturage (nuisance modérée). La pose de cathéters jugulaires se fera sous anesthésie locale mais ils seront fixés grâce à deux points chirurgicaux sur la peau de l’animal, ce qui pourra entrainer une légère gêne (nuisance légère). La présence de microaiguilles sur les capteurs de conductivité et de glycémie intradermique pourra entraîner une légère gêne (démangeaison) pour l’animal du fait d’une bande adhésive sur l’oreille (nuisance légère). Les vaches seront soumises à 12 prises de sang au niveau des capillaires de l’oreille par lancettes (dispositif de prélèvement utilisés sur les nourrissons en pédiatrie), ce qui induira une douleur fugace et un effet de surprise (nuisance légère). L’exposition des vaches à la chaleur (36°C dans la journée pendant 7 jours) constituera aussi une légère hyperthermie réversible, qui restera néanmoins contrôlée par la définition de points limites associés (nuisance modérée). De même, la restriction hydrique de 2 jours à 50% des volumes d’eau bue à volonté (non concomitante au stress thermique) entrainera une déshydratation temporaire et légère (nuisance légère).

Devenir

A la fin des procédures 1 et 2, les animaux seront replacés dans un troupeau de vaches laitières ayant vocation à produire du lait. Aucun effet durable du projet n'est attendu sur les animaux.

Remplacement

Le bovin est l'espèce cible de ce projet dont nous cherchons à décrire les mécanismes de régulation des constantes physiologiques face à une vague de chaleur ou à une déshydratation courte. Une particularité importante de la vache en lactation, qui constitue le stade physiologique le plus fréquent dans les élevages laitiers, est sa forte intensité métabolique qui induit une nécessité de régulation physiologique accrue par rapport à des vaches ne produisant pas de lait L'utilisation de vaches laitières vivantes est nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques et sujets à une large variabilité entre individus, face aux variations de la température ambiante ou des conditions d’accès aux abreuvoirs.

Réduction

Le nombre de vaches destinées strictement à la mesure des dynamiques infra-journalières et inter-journalières de paramètres physiologiques en réponses à une restriction hydrique ou un stress thermique court a été réduit au nombre minimum d’individus (à savoir 6), nous permettant de différencier les dynamiques des constantes physiologiques mesurées en situation de stress (restriction hydrique ou forte chaleur) par rapport aux périodes de pré-stress/récupération. Chaque vache sera son propre témoin durant les deux périodes de stress qui se succèderont, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Des études de même type ont déjà été conduites et ont donné lieu à des publications conclusives. Du fait de la courte durée de la procédure mise en œuvre dans ce projet, obtenir des résultats conclusifs avec ce nombre d’individus suppose qu’aucun aléa ne conduise à la perte des données, même de quelques heures ou sur un seul individu. Pour cette raison, en cas d’aléas indépendants de notre volonté (défaillance matérielle par exemple), la procédure sera reconduite sur 6 autres vaches. Elles ne seront pas impliquées dans le projet si tout se passe bien. Ces animaux seront aussi utilisés pour répondre à des problématiques connexes relatives à la qualité du lait et à l’adaptation du tissu mammaire à ces stress grâce des analyses sur le lait prélevé de façon non invasive lors de la chaque traite. Avant les mesures des dynamiques en situation de stress, les tests préalables nécessaires pour définir un protocole de pose de capteurs intradermiques sur bovin seront réalisés de façon séquentielle sur des binômes de vaches jusqu’à ce que les capteurs soient opérationnels et restent en place au moins 48 h, avec un maximum de 10 vaches impliquées. Les tests séquentiels devraient nous permettre d’utiliser moins de vaches.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi très proche par les techniciens en expérimentation animale formés à l'éthique. Pour la mesure des dynamiques infra-journalière et inter-journalière de paramètres physiologiques en situation de stress, les 6 vaches d’une même répétition, seront logées dans 2 salles avec 3 vaches par salle. Elles seront équipées d’un licol et attachées grâce à une chaine de 1 m de long, leur permettant de se coucher sans entrave. Leur stalle sera équipée d’un tapis en caoutchouc. Les 3 vaches d’une même salle pourront s’entendre et se sentir. L’alimentation leur sera offerte à volonté, de même que l’abreuvement sauf pendant les deux jours de restriction hydrique. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera réalisée par du personnel habilité, formé et expérimenté. Dans le cadre de prélèvements répétés de sang, le recours à un cathéter veineux permet de réduire significativement le niveau de stress de l’animal. Il permettra aussi de ne pas induire d’hématome du fait de prises de sang répétées. Chaque intervention rapprochée sur l’animal sera accompagnée de gestes rassurants, et notamment de caresses sur la croupe et l’encolure associées au son de la voix. Les poses de cathéters jugulaires s’accompagneront d’une anesthésie adaptée au niveau de douleur engendré et d’un suivi rapproché des animaux tant que ces dispositifs seront en place. La période pendant laquelle les vaches seront attachées sera minimale pour mener à bien toutes les mesures (5 semaines) grâce à un ajustement des périodes de récupération selon les données déjà publiées. Les suivis rapprochés de la température corporelle, des gaz et des teneurs en électrolytes du sang, de l’ingestion et de la production laitière nous permettront de réagir très rapidement si un animal avait des difficultés à s’adapter aux épreuves avant de déclencher des malaises. Lors des tests préalables de protocoles de pose de capteurs intradermiques, les animaux ne seront attachés que sur des périodes limitées de la journée d’un maximum de 2 à 3 h après le repas du matin.

Choix des espèces

Le bovin est l’espèce la plus utilisée pour produire les volumes de lait consommés en France et c’est sur cette espèce cible que se pose la question de la recherche de leviers en élevage pour limiter les effets néfastes du stress thermique sur le bien-être et la santé de ces animaux. Les ruminants présentent des spécificités propres en terme de régulation thermique car la chaleur produite par la masse microbienne ruminale constitue une source de chaleur qui contribue fortement au bilan thermique de l’animal. Au sein des ruminants, les bovins sont plus disposés que les caprins et les ovins au stress thermique. Pour ces raisons, il est important de disposer de méthodes de détection précoce de stress thermique spécifiquement pour cette espèce. Les bovins seront des femelles en lactation et en gestation. C’est le stade physiologique le plus présent dans les fermes laitières pour la production de lait. C’est aussi à ce stade que les bovins sont les plus sensibles au stress thermique et à la restriction hydrique du fait de la forte demande métabolique provenant de la lactation et des flux importants d’eau à l’échelle de l’animal.

Tester si huit aliments fermentés africains protègent contre l'inflammation intestinale suppose d'abord de provoquer cette inflammation. 200 souris reçoivent du DSS pendant sept jours pour déclencher une colite, la souffrance attendue étant déclarée légère pour la moitié d'entre elles et modérée pour l'autre. Chacune est gavée tous les jours pendant vingt-quatre jours, subit un prélèvement de fèces quotidien, une mise à jeun de quatre heures et deux prises de sang, avant d'être tuée pour prélèvement du côlon. Le porteur rappelle que l'effet de ces aliments a déjà été testé in vitro sur des protéases humaines et fécales, et conclut malgré tout que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) constituent l’un des désordres les plus courants du tube digestif et représentent un véritable problème de santé publique. Les MICI se caractérisent par une inflammation chronique du système digestif altérant la qualité de vie des patients. Malgré une incidence croissante et un impact socio-économique majeur, il n’existe actuellement aucun traitement curatif. De plus, les options thérapeutiques actuelles présentent des limites incluant intolérances, pertes de réponse, et effets secondaires souvent graves. D’où l’intérêt de la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les MICI sont des maladies complexes et multifactorielles dont la physiopathologie n’est que partiellement élucidée. Elles affectent des sujets génétiquement prédisposés chez lesquels le dialogue entre le microbiote intestinal et le système immunitaire est déséquilibré. En plus de la dysbiose du microbiote intestinal, de nombreux arguments plaident en faveur du rôle clé des protéases exprimées par l’hôte et le microbiote dans la survenue des MICI. L’augmentation de l’activité de ces enzymes induit des altérations de l’épithélium intestinal et favorise le maintien de l’inflammation. Malgré l’implication démontrée du déséquilibre du microbiote et de l’activité de ces enzymes dans l’inflammation digestive, leur potentiel en tant que cible thérapeutique est peu étudié. Or l’activité de ces protéases peut être régulée par le microbiote intestinal, lui-même étant directement modulé par l’alimentation. L’analyse des données bibliographiques montre que les aliments fermentés permettent de ré-équilibrer la composition du microbiote intestinal. D’autre part, nos études préliminaires in vitro ont montré que 8 aliments fermentés africains (Mabisi, Omashikua, Omaere, M'bannick, Pendidam, Kétoungol, Itutu, Cheka Mwaka) contiennent naturellement des antiprotéases inhibant significativement des protéases surexprimées chez les patients atteints de MICI. Cela suggère un fort potentiel des produits de lait fermenté africains pour lutter contre l’inflammation intestinale.Dans le cadre de ce projet, notre intérêt s'est porté sur le potentiel protecteur des produits fermentés africains contre l’inflammation intestinale induite chez un modèle de souris. Ce projet vise à étudier l’impact des aliments fermentés africains sur i) la composition du microbiote intestinal, ii) les activités protéolytiques et iii) par conséquent sur l’inflammation digestive

Bénéfices attendus

Les données acquises permettront de confirmer l’impact de chaque aliment fermenté sur les maladies inflammatoires de l’intestin. En fonction des résultats, de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur les aliments fermentés et ciblant les protéases, dont les activités sont augmentées lors de l’inflammation chronique de l’intestin, pourraient être adoptées pour gérer ces maladies.

Procédures

- Gavage des animaux vigiles (200 souris) tous les jours pendant 24 jours (J1 à J24). Les souris seront gavées le J14 matin après une mise à jeun de 4 heures. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Prélèvements fécaux (2 ou 3 fèces) pour les 200 souris, tous les jours pendant 24 jours (J1 à J24) Les fèces seront émis naturellement à l’occasion de la pesée des animaux et de l’examen clinique. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Mise à jeun des 200 souris une fois pendant 4 heures. Deux prélèvements de sang sur les souris vigiles sera effectué à J24. La durée du geste pour les prises de sang est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Comme une colite expérimentale sera induite, de la douleur est attendue. La souffrance liée à la manipulation sera essentiellement lors du gavage (fausse route) et de la prise de sang (douleurs). Notons que le prélèvement des fèces et la pesée des souris sont caractérisés par une faible nuisance associée à un léger stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes tels que le colon et étudier les effets des aliments fermentés sur l'inflammation.

Remplacement

Préalablement aux essais sur les animaux, l’effet des aliments fermentés a été testé in vitro aussi bien sur des protéases humaines impliquées dans l’inflammation intestinale que sur des protéases fécales issues de sujets sains et malades. Ces tests in vitro constituent un premier argument qui suggère que les produits de lait fermenté africains pourraient réguler les activités protéolytiques et en conséquence diminuer l’inflammation digestive. Comme le régime alimentaire peut moduler la composition du microbiote intestinal, lui-même étant impliqué dans la balance protéolytique et la pathogenèse des MICI, il est alors nécessaire d’étudier à la fois la réponse de l’hôte et du microbiote lors de l’exploration de l’effet des aliments. Cependant, le développement des MICI met en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait ainsi les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. Le recours aux animaux est alors indispensable pour tester l’impact des aliments fermentés sur l’équilibre protéolytique, leur impact sur la composition du microbiote et pour valider en conséquence leur effet sur la maladie.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été défini en se basant sur des études précédentes publiées dans la littérature scientifique ainsi que sur des essais préliminaires réalisés par des collègues, mais aussi grâce à un test de puissance afin d’incorporer un nombre minimum d’animaux tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques significatifs. Comme il sera en pratique impossible d'étudier simultanément les 8 aliments fermentés sélectionnés, car cela représenterait un trop grand nombre de souris à la fois, nous conduirons ainsi l'étude en 2 séries permettant de tester chacune l’effet de 4 aliments fermentés différents. Le nombre d’animaux pour chaque série est alors de 10 groupes * 10 souris = 100 souris, soit au totale 2 séries * 100 = 200 souris pour l’ensemble de ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 5 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée d'administration du produit chimique qui induit l’inflammation sera courte (7 jours) afin de révéler l’effet des produits de lait fermenté sur l’inflammation tout en limitant au strict nécessaire le développement des lésions. Au cours de l’étude, les souris seront examinées individuellement de façon quotidienne ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’inflammation trop invalidante. Notons que des points limites seront mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les rongeurs, en particulier la souris, sont des animaux couramment utilisés pour l’étude de la physiologie intestinale ainsi que ses maladies. Le modèle de colite induite par le produit chimique utilisé dans le projet chez la souris est l’un des modèles les plus couramment utilisés et les mieux documentés. Il reproduit un grand nombre de caractéristiques de la colite chez l'être humain (augmentation de la perméabilité de l’intestin, diarrhée et présence de sang fécal, …). Ceci explique l’utilisation de ce modèle lors des études antérieures sur ces maladies et également pour ce projet. Au commencement de l’expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-7 semaines), ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’être humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies inflammatoires de l'intestin.

1 836 souris vont être utilisées et toutes tuées, chacune pouvant recevoir jusqu'à 84 administrations de composés et subir jusqu'à douze prélèvements sanguins sur animal éveillé. Une colite leur est provoquée par du DSS, que le porteur décrit comme une substance corrosive et irritante, ou par du TNBS, une solution acide qui brise la barrière intestinale, avec ulcérations et diarrhées hémorragiques à la clé. Pour 204 d'entre elles la souffrance attendue est déclarée légère, pour 1 632 elle est modérée. La rubrique consacrée à la réduction annonce un effectif "réduit au minimum nécessaire (N=12 maximum)", sans expliquer comment ce maximum se concilie avec les 1 836 animaux du projet.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouveaux agents pharmacologiques à caractère anti-inflammatoire dans un modèle de colite aiguë ou chronique induite par l’administration de DSS (Dextran Sodium Sulfate) ou par l’administration d’un produit chimique : le TNBS (2.4.6-trinitrobenzene sulfonic acid). 250000 personnes sont atteintes en France d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Ces maladies digestives sont des maladies dont on ne guérit pas aujourd'hui. Le DSS est une substance corrosive et irritante qui va créer des lésions au niveau de la barrière intestinale. Administré quotidiennement aux animaux, le DSS provoque une très forte inflammation intestinale accompagnée d’ulcérations et de diarrhées hémorragiques. Ce modèle d’inflammation est particulièrement utilisé pour cibler les mécanismes inflammatoires au niveau de l’intestin. Le TNBS est une solution acide qui induit une inflammation du colon très reproductible. Administré aux souris, le TNBS brise la barrière intestinale et pénètre dans la paroi de l’intestin. Il va provoquer une inflammation significative caractérisée par une perte de poids et des diarrhées hémorragiques. La pathologie induite par le TNBS mime la maladie de Crohn chez l’Homme. Cette pathologie, aux causes inconnues, ne bénéficie pas encore de traitement. Un modèle murin d’inflammation intestinale est donc un bon modèle pour avancer sur la compréhension et le traitement de cette maladie. La phase préclinique qui consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur est une étape essentielle dans le développement de médicaments à visée anti-inflammatoire.

Bénéfices attendus

A l'heure actuelle il n'existe aucun traitement curatif des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). En cas de rectocolite hémorragique, des 5‑aminosalicylés (5‑ASA) sont le plus souvent prescrits dans les formes débutantes et de sévérité faible à moyenne. Ces derniers ne sont pas efficaces dans la maladie de Crohn, pour laquelle les corticoïdes sont privilégiés. Mais leur utilisation doit être limitée en raison de leurs effets secondaires à moyen et long terme. En cas de maladie évolutive, les médecins instaurent rapidement un traitement immunomodulateur ou immunosuppresseur, pour stopper les crises et éviter l’apparition de nouvelles lésions. Ces médicaments permettent de réguler l’immunité des patients et réduire l’inflammation à long terme. La moitié des patients répondent bien aux biothérapies à leur démarrage. Mais le traitement finit par ne plus être efficace chez la moitié d’entre eux, le plus souvent après deux ans d’utilisation : il faut alors changer de molécule. C’est pourquoi le but de ce projet est de tester de nouvelles molécules thérapeutiques anti-inflammatoires dans ces pathologies.

Procédures

Anesthésie générale : une injection (30 secondes/souris, induction modèle TNBS). Prélèvements de sang : maximum 12 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 84 administrations (30 secondes/souris)

Impact sur les animaux

Le developpement de la maladie va entrainer une douleur liée à l'inflammation intestinale ainsi qu'une déshydratation liée aux diarrhées (durée des diarrhées = 1 à 3 jours). L’administration de traitement par injection répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraîne une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires intestinales).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de la procédure afin de prélever des tissus biologiques permettant de réaliser des analyses pour vérifier l'efficacité des candidats médicament sur la maladie

Remplacement

Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation du colon chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Les souris sont les plus petits animaux chez qui la réponse inflammatoire peut être étudiée. Les tests précliniques permettent de caractériser les réponses immunitaires au niveau cellulaire et moléculaire qui sont les plus développés. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. A l’heure actuelle, des organoïdes de différents systèmes biologiques (notamment le système respiratoire) sont en cours de développement dans le monde entier. Cependant, le microbiote est un constituant majeur de l’environnement intestinal. Il est cependant absent des organoïdes produits in vitro. Par conséquent, à ce jour aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (N=12 maximum), dû à la variabilité individuelle observée pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et détecter toute douleur au moment de l’expérimentation. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 au nombre de 6 maximum en portoir ventilé enrichies avec : des cylindres de coton, des frisures kraft, des cercles en carton, ainsi que des dômes et des tunnels carton. Les animaux auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. En prévention d’une éventuelle déshydratation liée à l’apparition des diarrhées, des croquettes humides ou du gel hydratant seront déposés dans les cages à partir de J0. Des points limites prédictifs sont mis en place ainsi qu'une prise en charge de la douleur avec l'utilisation d'un analgésique.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris seront utilisées de l’âge de 8 semaines à 18 mois. A ce stade de développement, les organes sont à maturité et cela nous permet d’étudier des animaux du stade jeune adulte au stade âgé. - Génétique est bien connue - Animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques - Modèle établi et maîtrisé dans notre laboratoire depuis plusieurs années Les animaux sont utilisés au stade adulte et âgés de 8 semaines à 18 mois afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature, et cela nous permet d’étudier des animaux du stade jeune adulte au stade âgé. Les paramètres étudiés étant l’évaluation du degré de l’inflammation après administration de DSS ou TNBS, une souris juvénile induira un biais dans l’expérimentation. Les âges seront homogènes au sein d'une même étude.

Les deux yeux de chaque lapin sont infectés par une bactérie après scarification de la conjonctive sous anesthésie, puis reçoivent jusqu'à soixante-dix administrations de collyre en deux semaines, avec des prélèvements par coton-tige et un examen oculaire chaque jour. 210 lapins subissent ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec conjonctivite attendue, œdème des paupières et inflammation de l'iris, et sont hébergés seuls dès l'infection. Le projet teste cinq à dix candidats médicaments pour un donneur d'ordre, en vue d'une mise sur le marché. 195 lapins sont tués, leur infection rendant selon le porteur toute réutilisation impossible, tandis que dix lapins de réserve non infectés seront réutilisés pour la formation du personnel et cinq proposés à l'adoption.

Objectifs

Les infections oculaires (conjonctivites, kératites et uvéites) sont un motif fréquent de consultation en ophtalmologie. Elles peuvent entrainer une gêne et des douleurs significatives mais également des complications sévères, jusqu’à la perte de la vision, si elles ne sont pas traitées correctement. Il est donc primordial de traiter rapidement et efficacement ces infections afin d’éviter des complications pouvant conduire à des interventions médicales ou chirurgicales. La multiplication des résistances aux antibiotiques nécessite constamment le développement de nouveaux médicaments offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés. L’objectif du projet est d’évaluer l’innocuité, la tolérance locale et l’efficacité de différents candidats médicaments (tel que des collyres) dans un modèle d’infection bactérienne oculaire chez le lapin. Entre 5 et 10 traitements à des posologies différentes pourront être testés au cours de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera aux développements et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits ophtalmiques offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés contre les infections bactériennes oculaires.

Procédures

Les animaux subiront une intervention afin de réaliser l’infection des 2 yeux sous anesthésie et analgésie. La procédure d’infection durera en moyenne 30 minutes (anesthésie comprise). Les animaux vigiles recevront dans les 2 yeux les produits tests, références ou contrôles. Ces produits seront administrés entre 1 et 5 fois par jour. L’administration des traitements commencera le lendemain de l’infection et se poursuivra jusqu’à 7 ou 14 jours post-infection (en fonction de la durée de l’étude). Les animaux recevront donc au maximum 70 administrations oculaires. Ces administrations dureront environ 5 minutes. Des examens spécifiques oculaires des 2 yeux seront réalisés quotidiennement de l’infection jusqu’à la fin de l’étude (soit 8 ou 15 examens en fonction de la durée de l’étude post-infection). Ces examens dureront environ 10 minutes. Des prélèvements oculaires à l’aide d’un coton-tige seront réalisés sous anesthésie locale au niveau des 2 yeux avant l’infection (baseline), environ 12h après l’infection puis à 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11 et 14 jours après l’infection (soit 8 ou 11 prélèvements en fonction de la durée de l’étude post-infection : 7 ou 14 jours). Ces prélèvements dureront environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle d’infection oculaire, une conjonctivite est attendue chez les animaux ce qui entrainera l’apparition de différents signes cliniques tels qu’une hyperémie palpébrale et bulbaire (accumulation de sang au niveau des paupières ou du bulbe oculaire), exsudation, chémosis (gonflement de la conjonctive), œdème des paupières, blépharite (inflammation de la paupière), iritis (inflammation de l’iris). La sévérité et la durée de ces signes pourront varier entre les animaux traités et non traités. Les animaux seront manipulés régulièrement (jusqu’à 5 fois / jour) pour différents actes susceptibles d’induire un stress : examen oculaire, examen clinique, pesée, administration des traitements, réalisation des prélèvements oculaires.

Devenir

Les animaux inclus dans les études seront euthanasiés à la fin du protocole car ils seront entrés dans une procédure infectieuse rendant leur réutilisation impossible. De plus, des prélèvements des yeux pourront être réalisés pour analyse histologique. Dans la mesure du possible, les animaux réserves qui n’auront finalement pas été inclus dans les études pourront être réutilisés pour de la formation continue du personnel ou adoptés selon la procédure d’adoption de l’EU.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu'à des exigences réglementaires, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser la réponse d’un organisme entier vivant à une infection bactérienne locale (modélisation d’une situation clinique). En effet, cette réponse dépend d’un très grand nombre de facteurs impliquant notamment l’ensemble du système immunitaire. Une sélection in vitro des candidats les plus prometteurs pourra être réalisée en amont des études précliniques par le donneur d'ordre.

Réduction

Dans un premier temps, des études sur un nombre restreint d’animaux (3 animaux par conditions expérimentales) pourront être réalisées afin de valider l’établissement d’un modèle de conjonctivite et/ou d'ajuster différents paramètres tels que la concentration et la fréquence d’administration des traitements. Une fois les conditions optimales définies et afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur l’innocuité, la tolérance locale et l’efficacité des produits testés, des études avec des groupes d’au moins 6 animaux seront réalisées. Un groupe contrôle traité avec le placebo/véhicule sera systématiquement inclus dans les études.

Raffinement

Une période d’acclimatation de minimum 8 jours sera respectée pour les lapins. Les animaux seront hébergés avec les enrichissements appropriés (plateforme et cachette, bâtonnet de bois à ronger, balles (jeux) et galet de foin, autant que possible en groupe sociaux en parcs ou en cages durant la période d’acclimatation puis en individuel après l’infection afin d’éviter tout risque de bagarre pouvant engendrer des blessures au niveau des yeux ne permettant plus de répondre à l’objectif de l’étude (innocuité et tolérance locale). Les animaux seront observés quotidiennement, à l’aide d’une grille de scoring permettant d’observer à la fois leur état général et leur mobilité, afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. ou bien mise à mort en cas d'état de santé considérablement dégradé et irréversible). Des pesées seront réalisées quotidiennement. De plus, un vétérinaire ophtalmologue spécialisé réalisera quotidiennement un suivi clinique oculaire. Lors de l’anesthésie, une attention particulière sera portée pour éviter l'hypothermie : mise en place de tapis chauffant et/ou réveil des animaux sous lampe chauffante. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux de l’animal pendant l’anesthésie pour éviter le dessèchement cornéen. Un protocole analgésique sera mis en place avant et aprés la scarification de la conjonctive et un anesthésique local sera appliqué avant la scarification de la conjonctive et avant chaque prélèvement oculaire permettant la quantification de la charge bactérienne. Les lapins seront habitués à entrer dans la boite à contention. Pour cela, il seront placés plusieurs fois dans la boite en amont de l’étude sans réalisation de geste technique. Une récompense alimentaire (boulette croquante au fruit) leur sera alors donnée à ce moment-là.

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce privilégiée dans les modèles d’infection oculaire. Sa taille permet une observation confortable des signes cliniques oculaires. De plus, cette espèce est très bien caractérisée et présente des similarités anatomiques avec l’homme permettant une transposition des résultats. Les lapins seront utilisés entre 10 et 12 semaines afin d’avoir des animaux d’environ 2-3 kg au moment de l’infection. Les animaux seront donc réceptionnés à partir de 8/9 semaines (pour prendre en compte la période d’acclimatation de minimum 8 jours). Il n’y a pas de contraintes spécifiques liés à l’âge pour ce type d’étude, cependant des animaux de 2-3 kg permettent une manipulation facile et le système immunitaire du lapin aura atteint une maturité fonctionnelle complète à partir de 8 semaines.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une instillation de virus modifié dans le nez, puis huit injections en un mois d'un composé qui déclenche la mort des cellules vieillissantes de leurs poumons. Le projet sert d'abord à vérifier qu'une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées fonctionne, avant de l'employer dans de futurs travaux. Le porteur indique avoir testé ce modèle en culture cellulaire, et affirme que la validation dans un "organisme complexe, proche de l'Homme" reste nécessaire.

Objectifs

En vieillissant, les cellules de nos tissus accumulent de multiples défauts conduisant à un déclin progressif de la fonction tissulaire. Le vieillissement augmente donc les risques de nombreuses maladies, dont le cancer. En 2013, la sénescence cellulaire a été décrite comme l'une des principales caractéristiques du vieillissement. Ce processus est provoqué par un stress ou des dommages intracellulaires et/ou extracellulaires excessifs, et entraîne un arrêt de la division cellulaire à long terme. La sénescence cellulaire a été décrite comme un mécanisme suppresseur de tumeur limitant la capacité des cellules endommagées à proliférer. Cependant, la sénescence cellulaire peut également avoir divers effets favorisant le développement tumoral, en fonction du contexte cellulaire et de la composition de son phénotype sécrétoire pro-inflammatoire. Enfin, l’élimination de cellules sénescentes chez des souris a permis de retarder l’apparition de caractéristiques liés à l’âge et le dysfonctionnement tissulaire, ainsi que d’augmenter la longévité. Pour pouvoir étudier le rôle de la sénescence cellulaire dans divers contextes pathologiques, nous allons mettre au point un nouveau modèle murin afin de (1) pouvoir tracer et quantifier la sénescence des cellules à quatre âges différents et de (2) permettre l’élimination spécifique de ces cellules sénescentes. Nous serons alors à même de mieux comprendre leur implication dans divers contextes pathologiques.

Bénéfices attendus

La mise en place et la validation de ce nouveau modèle murin nous permettra d’étudier par la suite le rôle des cellules sénescentes dans divers contextes pathologiques. Ainsi, cela permettra potentiellement le développement de diverses stratégies thérapeutiques où la sénescence cellulaire joue un rôle prépondérant.

Procédures

Au cours de ce protocole, les animaux seront soumis à l'instillation intranasale de virus ainsi qu'à de multiples injections. Les cellules sénescentes n'étant pas forcément très nombreuses, nous souhaitons tester notre nouveau modèle murin par activation des systèmes de traçage et d'élimination de toutes cellules sénescentes au niveau pulmonaire. Pour se faire, nous aurons recours à l'instillation intranasale de virus modifié permettant l'activation de ces systèmes dans n'importe quel type de cellules présentes au niveau des poumons. Les animaux seront anesthésiés au préalable et recevront une seule instillation. Puis, nous injecterons un composé synthétique venant induire spécifiquement la mort des cellules sénescentes. Les animaux recevront deux injections du composé synthétique par semaine pendant un mois, soit un total de huit injections.

Impact sur les animaux

Au cours de ce protocole, les animaux pourront ressentir une douleur légère et du stress lors des multiples injections.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'être analysés et de déterminer si notre nouveau modèle murin est fonctionnel et peut être utilisé pour de futurs projets de recherche scientifique pour lesquels nous souhaitons étudier le rôle de la sénescence dans divers contextes pathologiques.

Remplacement

Notre nouveau modèle murin étant un modèle génétiquement modifié, nous avons testé sa validité dans un premier temps par culture et traitement de cellules dérivées de divers organes de ces souris. Néanmoins, il est nécessaire de valider nos résultats dans un organisme complexe, proche de l’Homme, où de nombreux facteurs externes difficiles à reproduire en culture cellulaire entrent en jeu.

Réduction

Ce protocole contient deux procédures qui ont pour but de mettre au point notre modèle d’étude. Nous utiliserons tous les contrôles nécessaires tout en prenant le nombre minimum de souris par groupe, incluant à la fois des mâles et des femelles. Les animaux d’une même portée ne comportant pas la modification génétique seront utilisés comme contrôles pour les procédures expérimentales. Puisque nous cherchons à valider le modèle murin, nous nous basons sur des données de la littérature quant à la mise au point de l'instillation intranasale de virus ainsi que des injections du composé synthétique induisant la mort cellulaire. De plus, les procédures de validation se feront en deux temps: si nous ne visualisons pas les cellules sénescentes pulmonaires après instillation de virus, nous ne procèderons pas à l'élimination des cellules.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours avant toutes manipulations. Une période d’habituation aux expérimentateurs et à la manipulation sera par la suite mise en place. Les souris seront pesées et observées au moins une fois par semaine dès la mise en place du protocole expérimental. Cette pesée entre dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Les animaux seront observés lors du change par le personnel animalier. Une liste de scoring sera mise en place afin de déterminer l’éventuel degré de souffrance/l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe dans chaque cage. Ces dernières comporteront des enrichissements comme du coton de nidation, des batônnets de bois et des maisons.

Choix des espèces

Une fois mis en place, notre laboratoire prévoit d'utiliser ce modèle murin pour des recherches comportant des analyses d’expression de gènes. Ainsi, la souris apparaît comme un modèle pertinent pour effectuer des études vivo du fait de sa forte homologie avec le génome humain. Les divers contextes pathologiques que nous étudierons par la suite n’étant pas toujours évident à mettre en place de façon représentative in vitro, le modèle murin apparaît alors approprié en termes de complexité et de pertinence par rapports aux questions scientifiques de notre équipe. Par ailleurs, nous travaillerons avec des animaux adultes, de différents âges, puisque la sénescence des cellules est plus fréquente au cours du vieillissement physiologique.