Procédures légères
Formation à l’imagerie par échographie ultrason chez la souris.
- Formation professionnelle
Des points limites fondés sur la température corporelle et les fréquences cardiaque et respiratoire encadrent les séances, chaque souris pouvant rester anesthésiée jusqu'à une heure d'affilée. 90 souris vont être utilisées, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin. Elles passent sous anesthésie gazeuse deux ou trois jours par semaine pendant une semaine pour des examens échographiques, certaines recevant une injection guidée par l'image avant d'être tuées aussitôt après. La finalité est de former jusqu'à neuf personnes par an à l'échographie, au nom de la réduction des effectifs dans leurs futures expériences, sans qu'aucun calcul statistique n'ait été fait pour fixer l'effectif de ce projet.
Objectifs
L’objectif de ce projet et de former et de familiariser les utilisateurs internes et externes à notre établissement à l’imagerie échographique afin qu’ils puissent appliquer cette méthode d’acquisition de données dans un but de réduction des effectifs et de raffinement des procédures expérimentales. Les applications de ces techniques vont de la biologie du développement, à la cardiologie, en passant par la cancérologie, les maladies métaboliques et les effets hémodynamiques. Le but de ce projet, aussi bien théorique que pratique est donc de familiariser les utilisateurs au concept et aux notions d’imagerie par ultrasons, et de les former à l’identification des différents organes/différentes structures internes, à l’utilisation du doppler pour l’analyse les flux sanguins et l’identification de vaisseaux, à l’élastographie permettant de mesurer l’élasticité des tissus, à l’injection guidée par image échographique, et à la reconstruction 3D.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de former jusqu’à 9 personnes par an à l’utilisation des différentes modalités d’un échographe pour rongeur et ainsi de les rendre autonomes. La pratique de cette méthode d’acquisition de données devrait leur permettre de réduire leurs effectifs et de raffiner leurs méthodes dans leurs futures expérimentations.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à une anesthésie gazeuse de 1 heure maximum, 2 ou 3 jours par semaine, pendant une seule semaine, afin de réaliser des analyses par échographie. Certains animaux recevront une injection guidée par l’image (durée de l’acte environ 1-2 minutes) et seront mis à mort tout de suite après cette injection.
Impact sur les animaux
Un stress dû à la préhension et à l’anesthésie gazeuse, et une baisse de la température corporelle au cours de l’examen échographique sont attendus au cours de ce projet.
Devenir
Tous les animaux sont utilisés pour la formation à l’utilisation de l’échographie, ils ne seront pas réutilisés dans d’autres projet et donc mis à mort à la fin de chaque procédure. Il semble difficile de pouvoir allouer les animaux utilisés dans ce projet, pour d’autres projets qui devraient démarrer à peu près au même moment que la fin de formation. Il n’est pas possible de les garder trop longtemps après la formation auquel cas les animaux n’aurait pas l’âge requis pour d’autres projets.
Remplacement
L’échographie est une méthode non invasive d’acquisition d’images et de données qui prend en compte plusieurs paramètres vitaux (circulation sanguine, respiration, rythme cardiaque) et qui ne peut être apprise et réalisée que sur animal vivant. Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal pour se familiariser avec cette technique, notamment pour l’identification d’organes/de structures anatomiques et l’acquisition de données complexes.
Réduction
Nous n’avons pas réalisé d’analyse statistique à priori pour la détermination des effectifs pour ce projet. Chaque stagiaire travaillera avec 2 souris soit un maximum de 6 souris par session de formation. Ceci permet de limiter le temps que passera chaque animal sous anesthésie gazeuse. En effet, la réduction du nombre d’animaux impliquerait que l’animal reste anesthésié plus longtemps afin que chaque stagiaire puisse manipuler l’échographe.
Raffinement
Pour ce projet les animaux seront hébergés en groupes sociaux en cages ventilées. Une période d’acclimatation de 14 jours sera observées avant toute manipulation. Toutes les cages sont enrichies avec des briques de tremble à ronger, des cylindres de coton pour la nidification et des tubes en papier kraft pour permettre aux animaux de se cacher. Les animaux sont manipulés avec des tubes de manipulation afin d’éviter la préhension par la queue. Pour chaque examen échographique, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane, maintenus sur une platine chauffante à 37°C, et sous lampe chauffante le cas échéant, au maximum 1h. Une goutte de gel ophtalmique sera appliquée sur chaque œil pour éviter l’assèchement des yeux. Ce gel sera remis en cours d’examen si besoin. Des points limites basés sur l’observation de paramètres vitaux (température corporelle, fréquence cardiaque et respiratoire) ont été mis en place afin de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont des petits mammifères proches de l’homme et les phénomènes biologiques mis en jeu chez ces 2 espèces sont très comparables, ainsi que les structures anatomiques. De plus l’échographe à disposition dans notre EU est un échographe spécifiquement développé pour les rongeurs et la sonde échographique dont nous disposons est adaptée à l’examen des souris. Nous utiliserons des animaux adultes de plus de 8 semaines. Les projets réalisés dans notre EU, qui s’intéressent essentiellement aux maladies hépatiques et aux cancers, impliquent des animaux adultes, notamment mâles.. L’utilisation de femelles et de mâles permettra aux stagiaires de réaliser des études échographiques sur les 2 sexes. La taille des animaux adultes facilite également l’apprentissage de l’échographie.
Infection des moustiques par des Plasmodia murins
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées par dislocation cervicale avant l'apparition des symptômes du paludisme, 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par injection intrapéritonéale ou intraveineuse à l'état vigile, subissent jusqu'à cinq prélèvements sanguins par piqûre de la veine caudale, puis sont exposées sous anesthésie à des moustiques qui prennent leur repas de sang pendant quinze à trente minutes, à raison de deux repas au maximum par animal. Une même souris peut nourrir 400 à 500 femelles de moustiques, et celles réutilisées le lendemain reçoivent une injection de solution saline pour compenser la perte de sang. Au-delà de l'étude des interactions entre moustiques et parasites, le laboratoire indique fournir aussi des moustiques infectés à des établissements extérieurs.
Objectifs
Le paludisme est une affection causée par des parasites du genre Plasmodium et transmise par des moustiques du genre Anopheles. Cette maladie provoque chaque année dans le monde la mort de plus de 600 000 personnes, principalement des jeunes enfants et des femmes enceintes. Les inconvénients liés à l’utilisation d’insecticides (apparition de moustiques résistants, destruction de nombreuses autres espèces animales), la difficulté technique que représente la création d’un vaccin efficace, et l’apparition de parasites résistants aux médicaments antipaludiques existants, ont conduit la communauté scientifique, et notamment notre laboratoire, à étudier les bases de l’interaction moustique/Plasmodium et à rechercher de nouvelles stratégies de lutte contre ce fléau. Les animaux de ce projet seront utilisés pour des infections de moustiques avec des parasites, et pour des tests de transmission du parasite de moustiques infectés vers des souris. L’objectif de ces expériences est de comprendre les interactions entre les moustiques et les parasites, et d’utiliser ces connaissances pour mettre au point de nouvelles stratégies de lutte contre le paludisme. Notre laboratoire fournit également des moustiques infectés à des établissements extérieurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus dans ce projet sont de mieux comprendre les interactions moustique/parasite afin de mettre en place et tester de nouvelles stratégies permettant de lutter efficacement contre cette maladie.
Procédures
Les animaux sont infectés par injection péritonéale ou intra veineuse sur animal vigile. Ces deux procédures sont rapides (1-2 min maximum depuis la préhension de l’animal jusqu’à sa remise en cage). Les souris sont infectées sur une courte période de temps et mises à mort avant l’apparition des symptômes de la maladie. Les animaux sont soumis à un prélèvement sanguin par piqûre de la veine caudale sur animal vigile, avec un maximum de 5 prélèvements. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Un maximum de deux repas sanguins de moustiques (15-30 min) est fait sur un animal donné, et sous anesthésie. Les ponctions cardiaques sont réalisées rapidement (1-2 min maximum) sur animal anesthésié (procédure terminale). Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et expérimenté.
Impact sur les animaux
Après infection d’une souris par un parasite du paludisme, sa parasitémie augmente, sans symptôme dans les premiers jours. Dans ce projet, toutes les souris sont mises à mort avant l’apparition des premiers symptômes à une parasitémie
Devenir
Toutes les souris infectées sont mises à mort par dislocation cervicale avant l’apparition des symptômes du paludisme. A terme, cette maladie conduit à une anémie importante et à la mort de l’animal.
Remplacement
L’utilisation comme modèles d’étude de parasites murins P. berghei et P. yoelii nécessite l’utilisation des rongeurs comme hôtes. En effet, outre l’importance du système in vivo pour certaines des expériences que nous menons (cycle complet du parasite avec infection de souris à partir de moustiques infectés pour « recycler » le parasite, ou bien pour tester la capacité vectorielle de nos moustiques), il n’est pas possible de maintenir ces deux parasites en culture cellulaire (ce qui nécessiterait dans tous les cas du sang de rongeur).
Réduction
La réalisation des passages par injection intra-veineuse nous permet d’infecter le nombre exact de souris nécessaires à nos expériences et donc de réduire au minimum le nombre de souris à infecter. Le calcul du nombre de souris nécessaires à une infection repose sur les critères suivants : (1) une souris peut nourrir jusqu’à 400-500 femelles (dans le cas d’une procédure terminale), (2) si les moustiques sont répartis en plusieurs cups, 4 cups peuvent être nourries l’une après l’autre sur la même souris sans que cette dernière ne perde en attractivité ou en infectivité pour les moustiques. Dans ce cas, les tests statistiques que nous faisons portent sur les moustiques (prévalence, charge parasitaire), pas sur les souris. Dans le cas où nous testons la capacité vectorielle des moustiques, nous utilisons le test exact de Fisher pour comparer le nombre de souris ayant été infectées dans les différents groupes, après un repas sanguin pris par des moustiques infectés. Un minimum de 20 souris est alors nécessaire (10 pour les moustiques contrôles et 10 pour les moustiques tests) pour détecter une réduction d’au moins 50% de leur capacité à transmettre le parasite.
Raffinement
Les souris utilisées pour les repas sanguin infectieux sont hébergées par groupes sociaux et bénéficient de frisure de carton ainsi que de tunnels. Elles sont anesthésiées avant d’être placées sur la cage de moustiques. Durant le repas, les yeux des souris sont protégés avec un gel pour éviter qu’ils ne se dessèchent et une couverture chauffante leur permet de conserver leur chaleur. Lorsque les souris infectées sont réutilisées le lendemain, elles reçoivent une injection de solution saline physiologique après le repas infectieux pour compenser la perte en volume sanguin. Pendant la phase de réveil, les souris sont placées sous lampe chauffante pour limiter les déperditions en chaleur. Les souris infectées sont mises à mort à un stade asymptomatique du paludisme. Elles sont sacrifiées sous anesthésie après un repas sanguin ou une ponction cardiaque.
Choix des espèces
Parmi les espèces de rongeurs possibles, Mus. musculus s’avère le choix le plus pertinent pour nos expériences. En effet cette espèce est sensible aux parasites P. berghei et P. yoelii. De plus, elle est utilisée pour ce type d’expériences depuis plusieurs décennies par de nombreux laboratoires dans le monde et les protocoles d’infection sont donc bien établis. Nous utilisons des souris adultes âgées de plus de 8 semaines et d’un poids suffisant pour permettre d’infecter l’ensemble des moustiques d’un groupe expérimental.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement des méningiomes : évaluation thérapeutique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles de xénogreffes orthotopiques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
Tester si des particules alpha traitent mieux les méningiomes que les particules bêta déjà employées conduit à utiliser 509 souris, toutes tuées pour prélèvement d'organes. 240 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 140 d'un niveau modéré, 120 d'un niveau léger et 9 sont opérées sans réveil. Les procédures comprennent une greffe de méningiome dans le crâne sous anesthésie pendant 45 minutes, des injections intraveineuses de radiopharmaceutiques sur animal vigile, des prélèvements de sang répétés et une imagerie TEP-IRM hebdomadaire, l'escalade de doses pouvant provoquer perte de poids, chute des cellules sanguines et apathie. L'imagerie sert aussi à fixer le jour de la mise à mort, en complément de l'observation du comportement.
Objectifs
Un méningiome est une tumeur bénigne qui se développe à partir des méninges, qui sont les enveloppes protégeant notre cerveau et notre moelle épinière. Ces tumeurs présentent souvent un grand nombre de récepteurs pour une hormone qui régule certaines sécrétions dans notre corps. Pour diagnostiquer et suivre ces tumeurs, les médecins utilisent une technique d'imagerie particulière, plus informative que l’IRM ou le scanner. Cette méthode consiste à injecter une substance par les veines (un analogue de l'hormone, c’est-à-dire, une molécule qui y ressemble beaucoup) marquée avec un élément radioactif, qui permet de visualiser les méningiomes. En effet, la particule radioactive va rejoindre la tumeur grâce à la molécule qui ressemble à l’hormone en se fixant sur son récepteur. En ce qui concerne le traitement des méningiomes, de nouvelles méthodes, comme la radiothérapie interne, ont été développées (cela revient à faire venir directement dans la lésion la particule radioactive contrairement à la radiothérapie classique, externe qui envoie la particule radioactive au travers de la peau et du cerveau avant d’atteindre la lésion). Cette approche utilise aussi un traceur radioactif, d’un autre type, cette fois-ci pour délivrer des particules radioactives qui vont permettre de traiter la lésion. Certaines particules radioactives (que l’on appelle alpha) pourraient être encore plus efficaces que celles qui sont actuellement utilisées (que l’on appelle Beta). Elles ont un trajet radioactif plus court et donc délivrent toute leur énergie de manière plus concentrée, ce qui pourrait détruire davantage de cellules tumorales tout en préservant les tissus sains autour. Des recherches préliminaires ont montré que cette méthode fonctionnait bien pour d'autres types de tumeurs. Le but de ce projet est donc de vérifier si ces alphas peuvent également améliorer le traitement des méningiomes, qui malheureusement, évolue dans certains cas, sans que les techniques chirurgicales, médicamenteuses (chimiothérapie) et de radiothérapie classique ne fonctionnent.
Bénéfices attendus
La radiothérapie interne est un traitement qui utilise principalement des particules radioactives de type bêta pour cibler et détruire les cellules tumorales. Cependant, une nouvelle méthode prometteuse consiste à utiliser des particules radioactives de type alpha. La différence entre ces deux types est que les alphas parcourent une distance plus courte dans le corps, mais avec une énergie beaucoup plus élevée. Cela signifie qu'ils peuvent libérer plus d'énergie directement dans la tumeur, ce qui peut endommager davantage les cellules cancéreuses tout en protégeant mieux les tissus sains autour qui ne sont pas traversés par la matière radioactive. Ce projet vise donc à développer de nouveaux médicaments radioactifs qui seront plus efficaces dans le traitement des tumeurs et qui entraîneront moins d'effets secondaires pour les patients.
Procédures
Procédure 1 (9 souris) : Validation du geste : Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (45minutes/souris), procédure sans réveil . Procédure 2 (80 souris) : Mise en place des 4 modèles de méningiome: Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (durée 45 minutes/ souris). Imagerie TEP/IRM 1fois par semaine sur souris anesthésiées (11minutes/souris). Le développement tumoral s'étale sur 4 à 10 semaines en fonction des modèles . Procédure 3 (60 souris) : Escalade de doses: Injection intraveineuse sur souris vigile (1 minute)_ Prélèvement de sang (1 minute) sur souris anesthésiées sous isofurane/air après application d'une goutte de tétracaïne à J-7, J 7, J14, J 21, J28 puis une fois par mois et en terminal sur 3 mois. Procédure 4 (120 souris): Biodistribution : Injection sous cutanée sur le flanc de cellules de méningiome (1 Minute),_ Injection intraveineuse du radiopharmaceutique sur souris vigiles (1 minute). Procédure 5 (240 souris) : Thérapie : Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (durée 45 minutes/ souris)_Injection intraveineuse du radiopharmaceutique sur souris vigiles (1 minute)_ Prélèvement de sang (1 minute) sur souris anesthésiées sous isofurane/air après application d'une goutte de tétracaïne à J-7, J 7, J14, J 21, J28 puis une fois par mois et en terminal_ Imagerie TEP/IRM 1fois par semaine sur souris anesthésiées (11minutes/souris). Le développement tumoral s'étale sur 4 à 10 semaines en fonction des modèles pour les souris où le traitement n'aurait pas d'effet. Les souris ayant bénéficié d'un effet thérapeutique sont suivies jusqu'à 150 jours.
Impact sur les animaux
La procédure d'escalade de doses pour déterminer la dose maximum tolérée peut entrainer une exposition toxique pour les hautes doses. A savoir: perte de poids cytopénie, apathie. Nous limiterons au maximum cette exposition en se référant à la litterature et à nos précédents projets. Pour chaque procédure concernée, c'est l' étape de greffe orthotopique puis l'évolution tumorale qui peuvent induire des nuisances aux souris. A savoir : -1 Les greffes orthotopiques se font par chirurgie ce qui induit de la douleur. 2- L'évolution tumorale peut également engendrer de la douleur notamment dans les groupes contrôle.
Devenir
Pour toutes les procédures les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées avec des frisottis pour pouvoir faire un nid , avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine.L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne ce qui permet de déterminer le palier de douleur. L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Par ailleurs, l’imagerie permet de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc de pouvoir, en parallèle de l’observation comportementale, d’adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à la mise à mort. Dans la procédure de thérapie, l'étape d’injection du radiopharmaceutique en intraveineuse n’est pas douloureuse et les doses sont choisies pour être non toxiques. Après l’injection du traceur, l’animal est remis dans sa cage où il a libre accès à l’eau et à la nourriture pendant le temps nécessaire à la biodistribution du traceur (1h à 2h). Pendant l’acquisition d’imagerie, les souris sont anesthésiées durant les 11 minutes de l’examen. Elles sont placées dans une cellule d’imagerie chauffante et une goutte de gel est déposée sur leurs yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Elles sont replacées dans leur cage dès le réveil avec libre accès à la nourriture et à l’eau.
Choix des espèces
De nombreux modèles de tumeurs ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les méningiomes touchent les adultes chez l'homme, les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, et le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe.
Détermination et quantification in vivo des produits de dégradation de polymères injectables utilisés en clinique.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
45 rats vont être utilisés, chacun subissant jusqu'à cinq prélèvements sanguins en trois jours, sans anesthésie, et des séjours en cage à métabolisme au fond grillagé, isolé de ses congénères et sans enrichissement. Vingt-cinq relèvent d'un niveau de souffrance léger, vingt d'un niveau modéré, et tous sont tués pour le prélèvement des organes. Une injection sous-cutanée de polymère précède la série de prélèvements, l'objet étant de suivre la dégradation de matériaux utilisés dans les médicaments et les dispositifs médicaux. Les retombées annoncées vont d'un nouveau standard international d'analyse au suivi des microplastiques, renvoyé au long terme, quand le recours aux animaux est justifié par des exigences réglementaires portant sur un "organisme entier".
Objectifs
La médecine moderne s’appuie fortement sur l’utilisation de polymères (matériaux de type silicone, cellulose, polyéthylène, polypropylène, néoprène, chlorure de polyvinyle, nylon…) pour développer de nouvelles solutions thérapeutiques, que ce soit dans la formulation de médicaments ou l’implantologie (dispositifs médicaux). C’est dans ce cadre que s’inscrit ce projet, qui a pour but de faciliter le suivi et le devenir des polymères dégradables dans l’organisme. L’objectif de l’étude est d’étudier le devenir des polymères et d'identifier leurs produits de dégradation dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues sont à la fois au niveau de la santé des patients en contact avec les polymères, et à la fois au niveau de l’environnement. Il faut dans un premier temps répondre aux exigences réglementaires qui régissent les médicaments et les dispositifs médicaux en développant des méthodes de marquage et d’analyse qui permettront un suivi simple, non toxique et non biaisé du devenir de ces produits dans l’organisme. Sur le moyen terme, le projet doit permettre d’établir un nouveau standard international d’analyse des polymères dégradables en santé et pour les applications environnementales. A plus long terme il est envisagé d’élargir cette méthode de suivi de dégradation par à d’autres polymères et d’autres champs d’application comme par exemple le devenir des microplastiques dans des milieux biologiques complexes.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous-cutanée du produit à tester (quelques secondes). Afin de suivre la distribution dans l'organisme, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps, sans anesthésie, et 5 fois maximum par animal sur 3 jours (2 min par prélèvement).
Impact sur les animaux
La réalisation d’une étude de biodistribution nécessite des prélèvements sanguins répétés, avec une contention de courte durée mais pouvant induire un stress. De plus, pour les prélèvements urinaires, les animaux devront être hébergés en cages à métabolisme, entraînant un isolement sans contact avec leurs congénères et un confort altéré par la surface réduite et le fond grillagé de la cage.
Devenir
Afin d'évaluer la biodistribution des produits dans l'organisme, il sera nécessaire de prélever les organes. C'est pourquoi tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Les exigences réglementaires imposent une documentation précise du devenir in vivo des composants d’un système de libération prolongée. Ces études nécessitent un organisme entier pour évaluer en pré-clinique les biodistributions des polymères utilisés, d’où le recours à des animaux.
Réduction
Une sélection des polymères à tester sera préalablement réalisée in vitro, pour limiter le nombre d'animaux utilisés. L’effectif de chaque groupe expérimental a été évalué de façon à obtenir un panel de données de 5 individus par temps permettant d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents, mais en limitant le nombre global d'animaux à 10 par polymère testé. En effet, le prélèvement tissulaire n'étant pas prévu à chaque temps, et la volémie du rat permettant de réaliser des prélèvements sanguins répétés sur un même animal, cela a contribué à réduire les effectifs.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les injections sous-cutanées et les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des bonnes pratiques sur animal vigil. Les animaux seront surveillés après l'injection des produits à tester. Tout signe clinique inhabituel ou inquiétant sera noté sur une fiche de suivi reprenant les observations générales de comportement et d'apparence. Cependant les polymères étant déjà connus, aucun signe de toxicité n'est attendu. Une vigilance particulière sera mise en oeuvre pour les animaux qui nécessiteront un hébergement en cages à métabolisme, entraînant l’hébergement individuel, l’absence d’enrichissement, et un confort altéré par la surface réduite et le fond grillagé de la cage. Avant de commencer les tests, les animaux seront acclimatés à la cage à raison de 2 heures par jour pendant 3 jours. Les points de vigilance seront l'alimentation (les animaux ne mangent pas ou moins), l'hydratation (les animaux ne boivent pas ou moins), les signes de stress (comportement ou apparence).
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix pour les études de biodistribution et de pharmacocinétique. Les animaux choisis seront à un stade jeune adulte, à un poids autour de 300 g car leur taille et leur volume sanguin permettent la répétition de prélèvements, nécessaires pour le suivi régulier des produits testés au cours du temps. C'est une souche non-consanguine qui a été choisie, ce qui permet de conserver les différences inter-individus, plus représentative de la population humaine.
Evaluation d’une thérapie par transfert de gène sur les fonctions motrices d’un modèle murin de dysferlinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Nées dans l'établissement à partir d'une lignée porteuse d'une mutation du gène de la dysferline, 237 souris vont être utilisées, dont 111 pour le seul entretien de l'élevage. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 96 d'entre elles et modéré pour 141. Elles reçoivent une injection unique dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse, puis deux tests de force musculaire tous les trois mois jusqu'à l'âge de douze mois, l'expérimentation s'arrêtant avant l'âge où la myopathie devient cliniquement visible. Le porteur écrit que la récupération fonctionnelle ne peut s'explorer que sur des modèles vivants et qu'un essai in vivo ne peut être évité.
Objectifs
Les dysferlinopathies sont un groupe de maladies musculaires rares et héréditaires caractérisées par des mutations dans le gène de la dysferline, ce qui entraîne une altération de la fonction de cette protéine. Les atteintes cliniques dans les dysferlinopathies incluent généralement : - une faiblesse musculaire progressive. Cette faiblesse affecte principalement les muscles des membres, en particulier les épaules, les hanches et les cuisses. - une perte de la force et de la fonction musculaire : Avec la progression de la maladie, les patients peuvent éprouver une diminution de la force musculaire, ce qui entraîne des difficultés à effectuer des activités quotidiennes telles que monter les escaliers, se lever d'une chaise, ou porter des objets lourds. - une dystrophie musculaire : La dégénérescence progressive des muscles peut conduire à une dystrophie musculaire, caractérisée par une perte de masse musculaire et une détérioration de la structure des fibres musculaires. Ces atteintes cliniques peuvent varier en gravité d'un individu à l'autre. Les souris présentant une mutation dans le gène de la dysferline présentent une atteinte musculaire très progressive avec un impact clinique pour l'animal au-delà de 13 mois. Au cours d'un projet antérieur, nous avons testé une approche thérapeutique par injection intramusculaire d'un AAV (adeno associated virus) codant pour une mini dysferline fonctionnelle (protéine plus courte que la forme normale mais ayant conservée sa fonction). Ces traitements ont permis d'améliorer le phénotype histologique du modèle murin. Ce nouveau projet, a pour objectif de tester l'efficacité de cette thérapie génique par administration par voie systémique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide la thérapie génique va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires observée chez les patients et offrir une thérapie potentielle
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection dans la veine caudale latérale sous anesthésie générale gazeuse (une seule injection/ une seule anesthésie). Ils seront également soumis tous les 3 mois à 2 tests de force musculaire (moins de 30 minutes par test))
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au-delà de l'âge auquel la myopathie clinique se déclare. Les injections intra veineuses peuvent générer une douleur locale, de courte durée. Les animaux vont également participer à des tests fonctionnels qui sont des sources de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse d'organes.
Remplacement
Les techniques in vitro ne peuvent être utilisées qu’afin de voir un effet à l’échelle cellulaire de l’administration de la mini-dysferline. La récupération fonctionnelle permise par l’administration systémique ne peut être explorée que sur des modèles vivants. Les premières étapes de notre projet ont démontré que cette approche était fonctionnelle ; nous devons maintenant étendre cette étude à des injections intraveineuses. Malheureusement, l’approche thérapeutique envisagée ne peut pas éviter un essai sur un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous avons utilisé des tests statistiques appropriés qui nous a permis de définir que nous aurons besoin d'au moins 9 souris par groupe expérimental. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 10 souris par groupe maximum, pour les souris traitées sur un an ce nombre est légèrement augmenté pour pallier les pertes, nous aurons donc 12 souris soit au total 126 souris. En prenant en compte les souris pour l’élevage ce nombre atteint 237 souris.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 avant d’entrer en procédure. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft et de dômes en carton. Les animaux en procédure seront hébergés à plusieurs, sauf pour les mâles reproducteurs (procédure 1) qui auront alors un triple enrichissement (buchettes en bois). La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelles ou tunnels). Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d'un point de vue clinique et nous connaissons l’âge d’apparition de signe de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Nous allons étudier les animaux avant l’apparition des signes impactant le bien-être des animaux ; le suivi des points limites nous permettra de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance éventuelle.Ce suivi se fera à l’aide d’une grille de scoring chaque semaine ou plus fréquemment si des anomalies sont observées. Les critères se basent notamment sur le poids, l’aspect de l’animal, son comportement ainsi que sa posture.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Afin d'étudier l'évolution naturelle de la pathologie, les animaux seront étudiés de l'âge de 1 mois jusqu'à l'âge de 12 mois dans les procédures 2 et 3.
Rôle de l’habenula latérale dans l’intégration des signaux olfactifs sociaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Une souris dont la fréquence respiratoire chute de moitié pendant la neurochirurgie voit la procédure interrompue, et se retrouve tuée si son état ne permet pas une seconde tentative sept jours plus tard. 835 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement du cerveau, dont 20 opérées sous anesthésie sans réveil et 715 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie de trente minutes, des injections intrapéritonéales d'endotoxine ou de modulateurs neuronaux, jusqu'à huit frottis vaginaux pour les femelles, un isolement de sept jours et des tests olfactifs de dix minutes. L'enjeu déclaré tient à la compréhension du rôle d'une région du cerveau, l'habenula latérale, dans l'évitement des congénères malades et l'attirance sexuelle.
Objectifs
Chez la plupart des animaux, les signaux chimiques olfactifs sont cruciaux pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont intégrées via les neurones sensoriels du système olfactif et sont ensuite codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Récemment, l'habenula latérale (LHb), une région cérébrale épithalamique qui participe à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions habénulaires chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs, provoquent une diminution de la réactivité sexuelle (lordose) et un évitement des contacts sexuels. En outre, l'Hb reçoit les projections neuronales exprimant des hormones contrôlant la reproduction : la gonadolibérine (GnRH) et la kisspeptine (KP)). Il a été montré que l’LHb exprime les récepteurs de ces deux hormones. Cependant, le rôle de LHb comme centre de traitement olfactif régulant les comportements sociaux ainsi que la modulation de la fonction de l'Hb par les hormones GnRH et KP restent peu compris à ce jour. Nos résultats préliminaires montrent que LHb est activée par des stimuli olfactifs contenus dans l’urine de congénères malades. Ces mêmes stimuli olfactifs provoquent aussi l’évitement du congénère malade par la souris saine. Par conséquent, ce projet a pour objectif de : (i) caractériser le rôle de la LHb dans le traitement des odeurs sociales lié à l'évitement des congénères malades et à l'attirance sexuelle ; (ii) déterminer le rôle de la GnRH et de la KP dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par LHb.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus avec ce projet seront de deux ordres à moyen terme : (i) la mise en évidence que l’LHb relaie des informations externes, telles que les odeurs sociales, permettant une régulation fine des comportements sociaux adaptatifs ; (ii) que les hormones KP et GnRH ne sont pas seulement des régulateurs clés de l'axe de reproduction hypothalamo-hypophyso-ovarien mais qu’ils peuvent aussi agir en amont dès la transmission des stimuli olfactifs.
Procédures
Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 30 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectué par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevé entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Pour les urines de souris mimiquant un état infectieux aigüe, une seule injection de l'endotoxine en intrapéritonéale (IP) sera effectuée et l'urine sera prélevée qu'une seule fois par animal. Chaque souris injectée avec l'inhibiteur de l'excitation neuronale, recevra au total 4 injections de l'activateur de l'inhibition en IP (1 fois/semaine) et 4 injections du tampon contrôle en IP (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections IP ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des virus, analogues et antagonistes peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne. L'injection de la molécule provoquant la mort neuronale peut entrainer des petites convulsions jusqu'à 1 heure post-injection. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines est possible. Il s’agira d’un stress aigu de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'endotoxine pourront développer des effets secondaires transitoires tels que fatigue, réduction de l'appétit et diminution de l'intérêt social. Ces effets, qui peuvent être observées 2 à 3 h après l'injection de l'endotoxine, disparaissent rapidement et n’entraînent pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'activateur d'inhibition pourront développer des effets secondaires transitoires tels qu'une diminution de la locomotion et de l'anxiété. L'injection intrapérotonéale peut parfois générer une douleurs et hématome au point d'injection. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests olfactifs pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.
Devenir
Tous les animaux seront tous euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine qui seront euthanasiés par le personnel animalier.
Remplacement
A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité́ de neurones de résidants dans plusieurs structures qui sont à la fois olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulations interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères. Néanmoins nos expériences s’appuient sur des données fortes de la littérature ce qui nous permettra de limiter le nombre de tests et d’acquérir des résultats pertinents.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. La taille de nos échantillons a été calculée grâce à un logiciel spécialisé. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. La significavité des résultats sera évaluée grace à des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe sociaux en présence d’enrichissements (abri cartonné complémenté de matériel de nidification)] avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies avec une première sédation analgésique suivie d’une anesthésie gazeuse. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflamatoire non stéroidien permettant une couverture analgésique de 24h. L’administration sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoire si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra une dose de molécule contrant les effets de l'analgésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation en se conformanat aux points limites post-opératoires connus chez cette espèce.
Choix des espèces
Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. En outre, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelles (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux mâles ou femelles seront des adultes qui seront âgés de 8 semaines au début des expériences.
Etude du tropisme et des paramètres d’excrétion des virus influenza aviaires hautement pathogènes chez le canard domestique.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Infectés par un virus influenza aviaire hautement pathogène, par aérosol ou par dépôt dans l'arrière-gorge, des canards subissent ensuite des prélèvements répétés de sang, de plumes en croissance, de gorge et de cloaque. 1 580 canards vont être utilisés, dont 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des signes possibles de paralysie, de torticolis, de saignements ou de mort soudaine. Parmi les bénéfices annoncés figurent l'amélioration du "bien-être" des volailles d'élevage et la limitation des pertes économiques liées aux abattages. Tous les canards sont tués, 3, 5, 7 ou 14 jours après l'infection selon la procédure, pour prélever organes et plumes, et parce que leur infection interdit toute réutilisation.
Objectifs
Les virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP) ont eu un impact considérable dans les élevage de volailles et chez les oiseaux sauvages ces dernières années. Cela a conduit dans le monde entier à l'abattage à grande échelle d'animaux infectés, à la mort d'espèces en danger et à un risque de transmission plus élevé à d'autres animaux (notamment mammifères), y compris l'humain. Les canards et oies jouent un rôle crucial dans la transmission des VIAHP parce qu'ils peuvent produire une quantité importante de virus et le transmettre avant de montrer des signes de maladie. Le virus se propage dans l'environnement principalement par les excréments et l'air expiré par les animaux infectés. Des recherches récentes montrent que les plumes en croissance des canards peuvent aussi diffuser le virus. Les plumes infectées peuvent contenir le virus pendant très longtemps, jusqu'à 160 jours. Pour développer des mesures de contrôle efficaces et lutter contre ces virus, il est important de comprendre comment ils se multiplient et se propagent. Ce projet vise à comprendre comment ces virus pénètrent et diffusent dans les plumes, et à déterminer quels sont les facteurs influençant l'infection des plumes (par exemple : les différentes espèces de canards et les types de virus). Ces recherches aideront à mieux comprendre la dynamique de l'infection que l'on peut observer sur le terrain. Elles permettront également de comprendre comment les virus diffusent et survivent dans l'environnement, et au final à évaluer l'impact de la vaccination sur la propagation des virus contemporains et futurs.
Bénéfices attendus
Le projet vise à : 1) étudier la libération du virus par les plumes, en mesurant l'intensité, la durée et la quantité de virus libérés, pour comprendre le rôle des plumes dans la contamination de l'environnement. 2) Comprendre par quels mécanismes les virus arrivent à infecter les plumes et s'y développent pour déterminer l'impact des différents types de virus, des espèces animales et de la vaccination. Les plumes pourraient en effet être un site où le virus se développe facilement même chez des animaux vaccinés. Ces recherches pourront aussi étudier de nouveaux virus influenza aviaires qui pourraient apparaître pendant la réalisation du projet. Cela permettra d’évaluer le rôle des plumes dans leur diffusion dans l'environnement et de déterminer si les vaccins restent efficaces dans le contrôle de la maladie. Ces résultats aideront à décider s'il faut ajuster le vaccin et/ou les programmes vaccinaux, et s'il faut renforcer les mesures de biosécurité dans les élevages. Cela permettra potentiellement de limiter les pertes économiques dues à l'abattage de milliers de volailles en cas de foyers, tout en améliorant le bien-être de ces dernières, et d'estimer les risques de transmission des virus par les plumes à l'humain.
Procédures
Avant de commencer l'étude, une prise de sang sera effectuée pour vérifier si les animaux ont déjà été en contact avec le virus ou si eux ou leurs parents ont été vaccinés. En effet, si des animaux ont déjà rencontré le virus, les résultats de l'étude seront faussés. Pour étudier la multiplication du virus dans les plumes, les animaux seront infectés soit par inhalation d'un aérosol contenant le virus, soit en déposant une solution contenant le virus dans le passage reliant le nez et la gorge (voie intra-choanale). Ensuite, les animaux infectés seront euthanasiés à différents moments : 3 jours après l'infection afin d'étudier les premiers stades de l'infection, et 5 ou 7 jours après l'infection (selon le virus utilisé) pour étudier les stades plus avancés de la maladie. Les animaux seront anesthésiés par injection d'anesthésiques par voie intra-musculaire avant de procéder à l'euthanasie. Une deuxième procédure permettra quant à elle de suivre la diffusion du virus au cours du temps. Après avoir infecté les animaux par la même méthode que dans la première procédure, des prélèvements seront réalisés à plusieurs moments (0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 jours après l'infection) : prises de sang, plumes en croissance de la région de la poitrine, écouvillons de la gorge et du cloaque. A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
(1) Les virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP) peuvent provoquer des symptômes graves, parfois mortels. Les signes cliniques peuvent dépendre du type de virus et de l’espèce animale touchée. Les effets indésirables peuvent inclure : une fatigue générale (abattement), des problèmes nerveux (comme torticolis, tremblements, paralysie), des difficultés à respirer, des saignements, ou une mort soudaine. Ces signes, lorsqu’ils surviennent, peuvent apparaître dès 24 à 48 heures après infection et s’intensifier jusqu’à la mort des animaux. (2) Prélever des plumes en croissance peut entrainer un léger risque de saignement ou de douleur, surtout pour les grandes et grosses plumes comme celles de l'aile. Ces risques sont beaucoup plus faibles sur des plumes plus petites, comme celles de la poitrine.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Dans la première, certains animaux seront euthanasiés 3 jours après infection pour prélever différents organes et des plumes. Les analyses de ces prélèvements sont importantes pour étudier les premiers stades de l'infection et voir comment le virus envahit dans les différents tissus/organes, dont les plumes. Les autres animaux seront euthanasiés 5 ou 7 jours après infection (selon le virus étudié) et les mêmes prélèvements seront faits pour étudier les mêmes points à un stade plus avancé de la maladie, où la quantité de virus est très importante. Dans la deuxième procédure, les animaux seront tous euthanasiés 14 jours après l'infection, car c'est le dernier moment utile pour étudier la diffusion du virus dans l'environnement au cours du temps. Après euthanasie, les mêmes prélèvements que dans la première procédure seront réalisés (organes et plumes). Ils permettront notamment d'analyser par exemple : les lésions causées par le virus, sa localisation dans les cellules, sa quantité dans les différents tissu au fil du temps. L'euthanasie des animaux est donc indispensable pour répondre aux différentes questions scientifiques de l'étude. De plus, les animaux infectés par un virus influenza hautement pathogène ne peuvent donc malheureusement pas être réutilisés, replacés ou adoptés car ils représentent un risque de diffusion virale.
Remplacement
Pour remplacer les tests sur animaux, des plumes peuvent être prélevées et mises en culture en laboratoire (explants de plumes) afin d'étudier l'infection par le virus. Un seul canard peut permettre d'obtenir des dizaines d'explants, permettant de tester de nombreuses conditions d'infection. Cependant, ce modèle ne prend pas en compte le fonctionnement complet de l'organisme, où le virus circule dans le sang et se propage dans les organes. Néanmoins, le projet vise aussi à étudier les paramètres cliniques, la propagation du virus, les lésions, l'excrétion, la transmission et l'impact de la vaccination. Ces études nécessitent des expériences sur animaux, car aucun modèle alternatif ne peut reproduire entièrement la diffusion du virus dans un organisme vivant. En parallèle de la présente saisine, le développement d'un modèle d’infection sur œufs embryonnés de canards et de poulets (modèle d'infection in ovo) a été initié car il permettrait de réduire les infections sur des jeunes animaux. Il représente pour le moment un modèle alternatif complémentaire à l'expérimentation animale, car il a des limites : l'infection est plus courte et ne reflète pas complètement celle des animaux présents dans les élevages.
Réduction
Une approche statistique a permis de calculer le nombre minimal d'animaux infectés permettant d'atteindre les objectifs scientifiques du projet (détection d'une différence dans la quantité de virus entre les groupes). Le nombre d'animaux témoins non infectés sera réduit au minimum permettant de valider l'expérience.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : 1. Une période d’acclimatation de 72h en isolateur. 2. Un enrichissement du milieu de vie avec des jouets suspendus, la possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement, des miroirs avec clochette, et des friandises (comme de la salade ou des vers de farine). 3. Un suivi clinique rapproché, deux fois par jour, avec une grille de suivi et de notation clinique par le vétérinaire responsable de l’essai. Si un animal présente un signe grave ou atteint un point limite, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance supplémentaire. Avant l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés pour réduire leur douleur et leur stress.
Choix des espèces
Les canards sont une espèce soumise à la vaccination déployée depuis septembre 2023 et jouent un rôle fort dans l’écologie des VIAHP en produisant beaucoup de virus sans forcément être visiblement malades. Les canards Pekin (Anas Platyrhinchos), canards de barbarie (Cairina moschata), leurs hybrides (canards mulards) juvéniles (d’un âge maximum de 6 semaines), mâles et femelles, seront hébergés durant la période de croissance post-natale permettant d’exploiter le duvet, et les plumes adultes se développant par la suite jusqu’à 6 semaines d’âge. A ces âges les canards ne peuvent pas encore voler. Ils pèseront au maximum 3 kg à 6 semaines d’age.
Elevage et maintien de la lignée de souris DMSXL utilisée comme modèle de la dystrophie myotonique de type 1 à des fins de recherche scientifique et visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris homozygotes de cette lignée transgénique présentent dès leurs premières semaines un retard de croissance et une faiblesse musculaire, ce qui vaut à 1 250 d'entre elles un classement en niveau de souffrance sévère. 5 000 souris au total sont concernées par cet élevage destiné à fournir un modèle de la maladie de Steinert, avec pour seules interventions déclarées une biopsie de queue à sept jours, un microtatouage des phalanges au même âge et la coupe des incisives quand la mâchoire se déforme, ce qui survient dans 40 % des cas. Le porteur dimensionne la colonie sur l'historique des performances de reproduction, afin de "ne produire que le juste nécessaire d'animaux d'étude". Les souris au génotype recherché partent vers les laboratoires utilisateurs au sevrage, à trois ou quatre semaines, les surnuméraires sont tuées au même moment, et quelques porteurs sains sont gardés pour renouveler les reproducteurs.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de maintenir une colonie d'élevage de variant transgénique de la souris utilisé comme modèle de la maladie de Steinert afin de disposer de modèles d'étude pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dystrophie myotonique de type 1 (DM1 ou maladie de Steinert) ainsi que développer et tester de nouvelles approches thérapeutiques. La DM1 chez l'Homme se manifeste notamment par une faiblesse musculaire, une myotonie, une cataracte précoce, des troubles cardiorespiratoires, un hyperinsulinimisme ainsi que par des anomalies cognitives et comportementales très handicapantes. La forme la plus sévère se manifeste dès la naissance par une hypotonie, des troubles respiratoires graves, des difficultés de succion et de déglutition ainsi que par un retard psychomoteur et une déficience intelectuelle.
Bénéfices attendus
Pour étudier la DM1 au cours du développement ainsi que dans divers types cellulaires et tissulaires affectés par la maladie, nous avons développé un modèle de souris transgénique porteuse du gène muté responsable de la maladie. Ces souris reproduisent plusieurs caractéristiques moléculaires, cellulaires et physiologiques de la maladie notamment dans les mucles et le système nerveux. Ce modèle sera utilisé pour étudier les mécanismes spécifiques liés à la mutation et leurs conséquences physiopathologiques ainsi que pour identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer la progression de la maladie et les réponses thérapeutiques développées dans notre laboratoire et des équipes de collaborateur travaillant sur la même pathologie.
Procédures
Les seules interventions auxquelles les animaux d'élevage seront soumis sont une biopsie caudale à partir d'un prélèvement d'un petit bout de queue (moins de 0,5 mm) à des fins d'identification génétique des animaux à 7 jours postnatal, un microtatouage à l'encre à l'extrêmité distale des phalanges au même âge et le cas échéant, une taille des incisives lorsqu'un risque de mal-occlusion des mâchoires apparaît.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont pour partie liées au prélèvement pour typage et pour autre partie au phénotype des individus homozygotes. Concernant le génotypage des animaux, cette identification nécessite la biopsie d'un petit fragment de queue (inférier à 0,5 mm) à 7 jours postnatal s'accompagnant d'une légère douleur passagère. Concernant les nuisances liées au phénotype, les animaux homozygotes présentent un retard de croissance et une faiblesse musculaire dès leur plus jeune âge, assimilables à un phénotype prospectif sévère. Cependant, les symptômes phénoypiques caractéristiques de la maladie ne sont pas exprimés avant 3-4 semaines, âge à partir duquel les animaux sont expédiés vers le(s) Laboratoire(s) utilisateurs ce qui permet de faire correspondre l'effet délétaire (retard de croissance et myotonie) à un degré de gravité sévère.
Devenir
Les animaux modèles (homozygotes) et leur contrôle sont envoyés au Laboratoire utilisateur après sevrage au plus tard à 3-4 semaines d'âge. Les animaux surnuméraires ne présentant pas le génotype d'intérêt sont éliminés au sevrage. Quelques animaux porteurs (sains) du gène responsable de la maladie (hétérozygotes récessifs) sont conservés pour le renouvellement des reproducteurs placés en accouplement suivant un processus dit d'utilisation continue pour fourniture aux utilisateurs.
Remplacement
Dans une optique de remplacement, des études sur des modèles cellulaires de la maladie ont été largement menées avant toute utilisation de modèles animaux. Ces travaux ont permis d’approfondir nos connaissances et d’établir un rationnel solide pour ce projet. Cependant, les modèles in vitro de cellules (notamment des cellules musculaires et neuronales) présentent des limites importantes car ils ne reproduisent pas la complexité du contexte tissulaire (muscle et cerveau) ni les interactions intercellulaires hautement spécialisées. La compréhension des mécanismes à l’origine de la maladie de Steinert et le développement de solutions thérapeutiques pour les patients nécessitent donc l’utilisation de modèles animaux pertinents de cette pathologie, tels que nos modèles murins qui expriment la mutation associée à la maladie et reproduisent des anomalies moléculaires et physiologiques similaires avec la maladie humaine.
Réduction
Afin d'adapter la production aux besoins de l'expérimentation et ne produire que le juste nécessaire d'animaux d'étude, la colonie d'élevage est dimensionnée à l'issue d'un historique de plusieurs années permettant de rationaliser la production sur la base d'une stratégie d'accouplement en couple bigame et des performances parentales connues.
Raffinement
Les animaux sont examinés individuellement attentivement une fois par semaine et contrôlés une fois par jour pour le relevé des naissances et la détection d'un changement brutal du poids corporel ou la survenue d'anomalies du comportement. De plus, compte tenu que les individus homozygotes présentent dans 40 % des cas une anomalie au niveau des incisives se manifestant par une mal-occlusion dentaire due à un allongement des incisives, les incisives sont coupées à l'aide d'une paire de ciseaux fins spécialement prévus pour cet acte. Le cas échéant, le mileu d'élevage est alors supplémenté avec des pellets d'aliment humidifiés. Le programme d'élevage prévoit par ailleurs des points limites pré-établis étant entendu que les animaux destinés à rejoindre les projets applicatifs ne sont jamais conservés au delà de 3 à 4 semaines post-natales dans l'élevage.
Choix des espèces
La nécessaire modélisation vivo de la maladie de Steinert a porté le choix de notre Laboratoire vers l'espèce souris compte tenu des possibilités offertes par la transgénèse qui nous a permis d'insérer le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie dans son génome et de mimer certaines caractéristiques moléculaires et physiologiques de la maladie chez le patient. Le phénotype des animaux se manifeste dès la naissance mais les animaux seront utilisés à l'état adulte entre 1 et 4 mois.
Etude des polyphénols alimentaires sur l’hémostase et le risque hémorragique sous anti-coagulants chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Gavés quotidiennement d'anticoagulant pendant cinq semaines sous contention, 80 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués sans réveil pour la collecte du plasma et des tissus vasculaires. Ils sont hébergés seuls pendant tout le protocole, ce que le porteur justifie par le risque de blessures entre congénères sous anticoagulant et par le recueil des urines sur 24 heures. Une seule prise de sang est prévue en cours de traitement. Le projet évalue le risque hémorragique associé à une supplémentation en polyphénols, et le porteur écrit dans le même temps qu'aucun effet indésirable n'est suspecté.
Objectifs
Le saignement sous anti-coagulants représente une des premières causes iatrogènes d’hospitalisation d’urgence en France. Une marge thérapeutique étroite et des effets indésirables potentiellement graves des anti-coagulants conduisent les praticiens à prendre en considération les interactions possibles entre anti-coagulants et alimentation du patient. L’objectif du projet est l’évaluation des effets d’une supplémentation nutritionnelle en polyphénols sur les paramètres de l’hémostase et le risque d’hémorragie chez le rat sous anti-coagulant. En effet, de nombreuses études montrent que les polyphénols agiraient favorablement sur certains facteurs de risque cardiovasculaires dont l’amélioration de la fonction endothéliale . Bien qu’encore peu documenté au niveau clinique, les flavonoïdes, une famille de polyphénols, auraient également un impact direct sur l’hémostase (ensemble des phénomènes qui permettent l’arrêt d’une hémorragie). Elle est divisée en deux temps successifs : l’hémostase primaire correspondant à la formation du « clou plaquettaire » et l’hémostase secondaire, dite « cascade de coagulation ». Murphy et al. ont mis en évidence un impact des flavonoïdes sur l’hémostase primaire en exerçant une action antiplaquettaire. Plus récemment, des études ont mis en évidence une réduction de la coagulation plasmatique par les flavonoïdes qui exercent des activités anti-facteur IIa ou anti- facteur Xa. De plus, notre équipe a montré un impact des flavonoïdes sur la structure du caillot de fibrine formé lors de l’hémostase secondaire, résultant en un caillot moins dense et plus perméable. L’ensemble de ces résultats sont en faveur d’une diminution des évènements thrombotiques et d’un allongement de l’hémostase primaire , qui pourrait constituer un facteur de risque de saignement, notamment chez les sujets sous anti-coagulants. Ainsi, il apparaît pertinent de porter une attention particulière au risque hémorragique en cas de supplémentation nutritionnelle riche en polyphénols.
Bénéfices attendus
Les bénéfices qui découleront de ce projet sont la contribution à la compréhension de l’impact des polyphénols de notre alimentation sur l’hémostase, le risque hémorragique, et la réactivité vasculaire. Le projet contribuera également à la mise en place d’un modèle animal permettant de tester d’autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant un bénéfice ou un risque hémorragique (anticoagulants ou anti-agrégants plaquettaires…).
Procédures
Les animaux, sous contention (d'une durée d'environ 30s) recevront une administration quotidienne d'anticoagulant par voie orale pendant 5 semaines. Une prise de sang unique sera réalisée pour s'assurer du taux plasmatique d'anticoagulant au cours du traitement (durée du geste = moins de 2 minutes). En fin d'études, les animaux seront anesthésiés (5 minutes) pour la réalisation de prélèvements et des mesures d'hémostase avant sacrifice sans réveil préalable pour la collecte des tissus.
Impact sur les animaux
La mise sous anti-coagulants ainsi que la supplémentation nutritionnelle en polyphénols (à des doses équivalentes à celles des aliments sources) ne sont pas suspectées d’induire d’effets indésirables. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés lors de l’administration par voie oral des traitements anti-coagulants afin de s’assurer de l’absence d’effet secondaire (hémorragie spontanée, …). Par ailleurs, l''hébergement en cage individuelle transparente n'est connu pour induire de baisse de l'ingéré. Par précaution, la masse corporelle ainsi que leur consommation alimentaire seront contrôlées de façon bi-hebdomadaire dans le cadre de se projet.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de collecter le plasma et les tissus vasculaires nécessaires à l'exploration des fonctions tissulaires impliquées dans l'hémostase et la réactivité vasculaire.
Remplacement
Les méthodes d’étude de l’hémostase in vitro, sur des restes de tubes de plasma humain par exemple, ne permettent pas la prise en compte du métabolisme des flavonoïdes. En effet, les flavonoïdes de notre alimentation sont soumis à différentes modifications de structure par les enzymes digestives et métaboliques, résultant en la génération de formes nommées métabolites dans la circulation sanguine. De plus, les approches in vitro ne prennent pas en compte les effets des métabolites des flavonoïdes sur les paramètres cellulaires régulant l’hémostase (ex : facteurs endothéliaux …). De plus ces méthodes permettent d’estimer de façon indirecte le risque d’hémorragie. Par conséquent, à ce jour, aucune méthode de remplacement n’est envisageable pour répondre aux objectifs scientifiques de notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux dans l’étude proposée a été déterminé sur la base des données de la littérature ayant mis en évidence une modification significative du temps de saignement chez le rat anti-coagulé à l’aide d’une procédure similaire. Par ailleurs, des critères secondaires d’analyses tels que l’évaluation de l’hémostase primaire et secondaire ainsi que l’évaluation de la réactivité vasculaire ont été inclus dans l’étude afin de ne pas répéter cette expérimentation à ces fins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés individuellement afin d’éviter tout comportement agressif pouvant engendrer des blessures et saignement notamment lors des traitements sous anti-coagulants. De plus, l’individualisation des animaux est nécessaire pour le suivi de la prise alimentaire et le recueil des urines 24h. Cet hébergement se fera dans les conditions standards et réglementaires. Toutefois, ces animaux bénéficieront d’attention particulière notamment en termes d’offre d’objets d’enrichissement (tunnel et balles en acier) avec des alternances hebdomadaires. Un suivi quotidien des animaux, imposé par ailleurs par le déroulé du protocole, permettra de compléter la surveillance de leur bien-être.
Choix des espèces
Les rats « Sprague-Dawley » ont été largement étudiés avec des similitudes physiologiques avec l’homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Ces animaux sont également utilisés dans les études publiées sur le temps de saignement ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux agés de 8 semaines (poids < 200gr) de façon similaire aux études précédentes publiées.
Étude des défauts de connectivité cérébrale par Imagerie par Résonance Magnétique chez des souris modèles de maladies neurologiques et psychiatriques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
516 souris porteuses de mutations liées à une faiblesse musculaire progressive ou à des troubles psychiatriques passent des séries d'examens IRM de deux heures, sous anesthésie gazeuse et avec un cathéter posé dans une veine de la queue. Les examens se répètent tous les mois ou tous les deux mois jusqu'à leurs 18 mois, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour analyse des tissus. Le porteur qualifie l'IRM de "totalement indolore" tout en reconnaissant un stress léger. Sur la réduction, il annonce vouloir minimiser le nombre de souris sans donner aucun calcul, aucun effectif par groupe, ni le nombre d'examens que chaque animal subira.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les anomalies cérébrales dans deux modèles murins de maladies neurologiques et psychiatriques, en utilisant des outils d'imagerie par résonance magnétique (IRM). L'objectif est de mieux comprendre la perturbation de la connectivité cérébrale, qui est souvent altérée dans ces pathologies. Le premier modèle concerne des souris avec une mutation affectant une protéine liée au squelette de la cellule, entraînant une faiblesse musculaire progressive dans les membres inférieurs. Le second modèle implique des souris présentant une mutation dans un gène responsable de troubles psychiatriques associés à des lésions cérébrales visibles sur IRM. L’étude utilisera plusieurs techniques d’IRM afin de détecter les anomalies physiques du cerveau, examiner la connectivité structurale et fonctionnelle mais aussi la vascularisation cérébrale des souris. Le projet comprendra des expériences pour observer les évolutions cérébrales des souris sur une période de 1 à 18 mois.
Bénéfices attendus
A terme, ces recherches auront pour but d'évaluer l'impact de traitements pharmacologiques sur les anomalies cérébrales et de développer de nouvelles approches cellulaires et moléculaires pour mieux comprendre les effets des mutations génétiques dans ces modèles.
Procédures
Les souris passeront une série d'examens par IRM, avec une durée maximale de 2 heures. En fonction de l'évolution des anomalies observées dans leur cerveau, les examens par IRM seront réalisés une fois par mois ou tous les deux mois jusqu’à leur 18 mois.
Impact sur les animaux
Passer une IRM peut causer un léger stress à l'animal, mais la procédure est totalement indolore. L'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pour éviter qu'il bouge pendant l'examen. De plus, un petit cathéter est posé dans une veine de la queue de l'animal, et cela se fait aussi sous anesthésie générale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des examens sur les tissus prélevés.
Remplacement
Actuellement, il n'existe aucune méthode expérimentale (qui ne nécessite pas l'utilisation d'animaux) capable de réaliser ce que notre projet demande. En effet, notre objectif est d'étudier le cerveau dans son ensemble, avec toute sa complexité. Il n'y a pas de préparation en laboratoire qui puisse reproduire l'ensemble des connexions entre les neurones, ni permettre d'observer les différentes parties du cerveau et les faisceaux de neurones qui relient ces parties entre elles. En résumé, pour atteindre les objectifs du projet, il est nécessaire de travailler directement sur le cerveau dans sa totalité, ce qui n'est pas possible à ce jour avec des méthodes alternatives sans animaux.
Réduction
Notre objectif dans ce projet est de minimiser le nombre de souris tout en tenant compte des facteurs pouvant influencer l'expérimentation comme la mortalité et problèmes techniques, et d'appliquer des analyses statistiques appropriées pour tirer des conclusions fiables.
Raffinement
À l'arrivée des souris à l'animalerie, une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant les expérimentations. Lors des procédures, comme l’IRM, un léger stress peut survenir, mais l’anesthésie est utilisée pour éviter la douleur. La durée des acquisitions est limitée à 2h. La profondeur de l’anesthésie est surveillée, et les souris sont maintenues à une température stable et protégées avec un gel pour les yeux. Après l’IRM, elles sont placées dans une cage de réveil chauffée. Le poids, la motricité et l'état général des animaux seront suivis de leur naissance à leur mort.
Choix des espèces
La souris est l'animal le mieux adapté pour ces études car son cerveau est très similaire à celui de l'humain, tant sur le plan de sa structure que de son fonctionnement, en particulier pour les circuits neuronaux. Il est courant de modifier des gènes ou d'introduire des gènes mutants chez la souris pour étudier des maladies ou des fonctions spécifiques. Nous utiliserons des souris jeunes et adultes âgées entre 2 et 18 mois.
Étude globale sur les populations de brochet dans les lacs alpins et efficacité de repeuplement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés à la ligne puis anesthésiés, 100 brochets sauvages des lacs alpins se voient prélever un fragment de nageoire dorsale de la taille d'un grain de riz. 60 autres, élevés en pisciculture et transportés jusqu'à 1 h 45 en cuves oxygénées, reçoivent sous anesthésie une marque souple de 5 cm implantée dans le muscle du dos, qu'ils porteront à vie. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance léger pour les premiers et modéré pour les seconds, et les 160 individus sont remis à l'eau après contrôle de leur état et réveil complet. Le suivi des recaptures repose sur les prises des pêcheurs de loisir, dans une étude qui juge de l'efficacité des repeuplements organisés par les associations de pêche sur une espèce classée vulnérable.
Objectifs
Le brochet est l’une des espèces emblématiques de poissons de lacs alpins. Principal prédateur autochtone de eaux douces métropolitaines, cette espèce très recherchée par les pêcheurs est également soumise à de nombreuses pressions, principalement en lien avec la dégradation de l'habitat naturel (zones de frai, pollution, etc.). C'est une espèce indicatrice des grands milieux d'eau douce tempérés (lacs et grandes rivières), dont la présence indique le bon fonctionnement. Elle est considérée comme « Vulnérable », premier échelon des espèces menacées, par la Liste Rouge Régionale de 2023. Les suivis réalisés par l’Office Français de la Biodiversité (OFB) ainsi que par les pêcheurs confirment le déclin progressif de ces populations sur les lacs alpins. Le but de cette étude est de comprendre le fonctionnement des populations de brochet commun sur les lacs où l'espèce apparaît sur le déclin. Pour se faire, elle comprendra 2 volets : - Une estimation de la diversité génétique de la population, basée des analyses de fragments de nageoires dorsales, prélevés sur des individus « sauvages » ; - Une estimation de l'efficacité des repeuplements effectués par les associations de pêche locales, par l’intermédiaire du suivi des recaptures de brochets issus de pisciculture (faites par les pêcheurs amateurs de loisir), via l’emploi de marques passives dites « spaghettis » implantées à la base de la nageoire dorsale.
Bénéfices attendus
Cette étude rentre dans le cadre d’un objectif de compréhension de l’état de la population de brochets actuelle au travers de la diversité génétique qu’elle présente, et de l’efficacité des opérations de repeuplement sur les lacs afin de juger de leur pertinence. Au final ces informations permettront d’orienter les politiques de gestion et de protection de l’espèce sur ces lacs.
Procédures
Pour le volet « analyse de la diversité génétique » de la procédure n°1, capture de poissons à la ligne puis prélèvement sous anesthésie d’un fragment de tissu de la nageoire dorsale (de la taille d’un grain de riz, soit 2mm X 3mm au maximum). Pour le volet « repeuplement » de la procédure n°2, insertion sous anesthésie d’une marque « spaghetti » dans le muscle dorsal. Les poissons concernés sont issus d’une pisciculture, située à 1h45 de route maximum, et arrivant par cuves oxygénées.
Impact sur les animaux
En accord avec le classement proposé, les effets indésirables des interventions, après raffinement peuvent être les suivants : Pour la procédure n°1 (classement proposé : légère) visant à analyser la diversité génétique, l’intervention entrainera une ablation infime et momentanée (régénération rapide en quelques semaines) du tissu membraneux de la nageoire dorsale, représentant moins de 1% de sa surface. Elle ne vise à entraver aucune des 5 libertés individuelles de l’animal. Les individus seront potentiellement soumis au stress lié à la manipulation et à la stabulation avant ou après l’anesthésie. Le prélèvement de tissu membraneux se déroulant sous anesthésie générale, il n’est pas attendu de stimulus nociceptif ni de malaise associé. Pour la procédure n°2 (classement proposé : modérée) visant à implanter une marque passive sur le dos à la base de la nageoire dorsale, l’intervention entrainera le port définitif d’une marque souple, de taille et poids réduits (tube de 3mm de diamètre pour 5 cm de long, poids 1 gr) visant l’identification des individus. Elle vise également à n’entraver aucune des 5 libertés individuelles de l’animal, notamment le déplacement des individus, en raison de sa taille réduite. Les individus seront potentiellement soumis au stress lié à la manipulation et à la stabulation près ou post-intervention. Les individus seront potentiellement soumis au stress lié à la manipulation et à la stabulation avant ou après l’anesthésie. L’implantation de la marque en intramusculaire se déroulant sous anesthésie générale, il n’est pas attendu de stimulus nociceptif ni de malaise associé. A l’issue des interventions, tous les individus sont relâchés dans le milieu naturel pour accomplissement de leur cycle de vie.
Devenir
Pour le volet caractérisation « génétique » des poissons sauvages, les prélèvements ne nécessitent pas la mise à mort des individus, la remise à l’eau sur le lieu de capture sera donc réalisée. Pour le volet « repeuplement », le but est ici de connaître le devenir des poissons relâchés dans les lacs, d’où leur remise à l’eau.
Remplacement
Le volet « génétique » s’intéresse aux poissons vivants actuellement dans les lacs, il est donc nécessaire d’accéder directement à des individus pour estimer la diversité génétique des populations (les méthodes recourant à l’analyse de l’eau ne permettent d’étudier cette échelle fine, pas plus que la simple observation de la morphologie des individus). Le volet « marquage » pour le suivi du repeuplement s’intéresse au devenir des poissons relâchés, issu de pisciculture, lors des campagnes de repeuplement des lacs. L’objectif visant l’étude globale des brochets dans leur milieu naturel, toute étude réalisée en milieu contrôlé n’est pas envisageable. Il n’existe pas de modèle statistique permettant de répondre aux besoins de l’étude.
Réduction
En ce qui concerne le volet génétique, la taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables, et garantit une bonne vision de la diversité génétique des population étudiées. Aussi, nous visons 50 individus pour chacun des 2 lacs ; soit 100 poissons au total. Pour les individus marqués, il apparaît donc nécessaire de recourir au même nombre d’individus habituellement introduits pour le repeuplement annuel, soit un objectif de 60 individus.
Raffinement
Toutes les manipulations visant à procéder au prélèvement de fragment de nageoire, ou de pose de la marque « spaghetti », se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. Pour les poissons venant de pisciculture, un temps d’habituation de 30 min sera pris pour acclimater les poissons aux conditions du milieu. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie (nage et respiration normales). Pendant l’anesthésie générale, obtenue par balnéation, les poissons seront sous surveillance, toute modification dans le comportement lors de cette dernière (réveil prématuré) sera ainsi prévenue. La manipulation des poissons sera réalisée de manière à prévenir toute infection : Le port des EPI (gants et lunettes) sera obligatoire lors de la préparation du bain de balnéation pour l'anesthésie et lors du marquage ; le matériel de prélèvement et/ou de marquage sera nettoyé, désinfecté et rincé à l’eau distillée avant chaque utilisation et la zone d’implantation de la marque spaghetti, pour le suivi du repeuplement sera désinfectée. Le bain d’anesthésiant sera renouvelé autant de fois que nécessaire (lorsque le temps d’endormissement dépassera 2 min). Après anesthésie, un soin sera apporté au réveil des individus, par la surveillance des paramètres du milieu (oxygène et température) et le retour pour les individus à l’état de nage (maintien) et de respiration normale.
Choix des espèces
Le brochet commun est l'espèce cible de l'étude. La présence de cette espèce, à la fois patrimoniale et très recherchée par les pêcheurs, est un indicateur du bon fonctionnement des écosystèmes lacustres de leurs annexes (zones humides, roselières en bordure). S’agissant d’une espèce « vulnérable » d’après le classement des espèces menacées (en raison du réchauffement climatique et de la dégradation des habitats), l’objectif final de cette étude est de comprendre et d’enrailler le déclin observé de l’espèce sur les lacs alpins. Les brochets marqués et relâchés, issus de pisciculture seront au stade mature, 2 ans pour les mâles et 3 ans pour les femelles, ce qui correspond à une taille comprise entre 40 et 60 cm. En ce qui concerne l’étude génétique, nous visons la caractérisation des potentiels géniteurs, une taille minimale de 30 cm sera considérée pour procéder au prélèvement du fragment de nageoire.
Étude de la réponse immunitaire pendant l’inflammation et pendant la vaccination à l’aide de la microscopie intra-vitale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une première procédure produit les souris transgéniques qui alimentent ensuite toutes les autres du projet, où elles ne peuvent plus être réutilisées. 3 441 souris vont être utilisées au total, dont 3 306 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes finissent tuées pour l'analyse de leur réponse immunitaire hors de l'organisme. Elles reçoivent un agent infectieux ou un agent inflammatoire par injection intramusculaire ou sous-cutanée, puis passent une chirurgie sans réveil pouvant durer six heures pour l'observation de leurs cellules au microscope. Le porteur compare la douleur au site d'injection à celle d'une vaccination chez l'humain, et indique que cultures cellulaires et organoïdes servent à caler les doses avant le passage à l'animal, sans pouvoir "récapituler la complexité des réponses immunitaires".
Objectifs
La réponse immunitaire contre un agent infectieux consiste à mobiliser, de manière ciblée et séquentielle, les cellules capables de lutter contre cette agression, limitant ainsi sa propagation. La vaccination, de son côté, "éduque" le système immunitaire pour qu'il puisse réagir efficacement à une future infection. Ces deux mécanismes sont complexes et impliquent le recrutement coordonné de différents types cellulaires à travers divers sites anatomiques. L’objectif de ce projet est de décortiquer ces différentes étapes du mécanisme immunitaire au niveau des tissus et des organes lymphoïdes drainants lors de la présence de microorganismes invasifs ou pendant la vaccination par une technologie émergente qui permet le développement d’un vaccin rapidement. Nous souhaiterions nous appuyer sur des modèles murins génétiquement modifiés, et des techniques d’imagerie afin d’améliorer notre connaissance de la mise en place de la réponse immunitaire précoce et plus tardive. Ce projet se décompose en 3 étapes: o Étape 1 : identification des souris transgéniques nécessaires afin d’étudier différents types cellulaires, acteurs de « l’immunité », ainsi que certaines voies de signalisation. o Étape 2 : A. Inoculation « du microbe invasif » ou de l’« agent inflammatoire » induisant des processus inflammatoires aïgus » afin de réaliser une étude de quantitative et qualitative des cellules immunitaires recrutées pendant la réponse immunitaire. B. Vaccination par une nouvelle technologie et étude de la réponse immunitaire induite. La réponse immunitaire sera comparée à une vaccination plus classique. o Étape 3 : Visualisation par imagerie des tissus hôtes « du microbe invasif » et des ganglions drainants ces tissus afin d’analyser les interactions ou la communication entre les cellules du système immunitaire. Ce projet de recherche devrait permettre d’identifier les acteurs cellulaires participant à une réponse inflammatoires précise dans le cas d’un agent infectieux, d’un agoniste ou d’une vaccination. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait d’optimiser les stratégies thérapeutiques en clinique.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette recherche est cruciale pour mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de la réponse immunitaire face aux infections et aux vaccins. En combinant des approches génétiques et de microscopie intra-vitale, nous avons la possibilité d’étudier en temps réel les interactions cellulaires au sein d’un organisme vivant, offrant ainsi une vision dynamique et globale des processus immunitaires. Ces recherches permettront non seulement d’identifier les gènes et cellules clés impliquées dans la défense contre les agents pathogènes, mais aussi de déchiffrer les étapes critiques de la coordination spatio-temporelle de la réponse immune. Ce savoir pourra par la suite être utilisé afin de mettre au point de nouvelles thérapies ciblées, capables de moduler la réponse immunitaire de manière plus précise et efficace, comme la vaccination. En effet, la vaccination est un pilier essentiel de la santé publique, car elle permet de prévenir la propagation de maladies infectieuses potentiellement graves, voire mortelles. En "éduquant" le système immunitaire à reconnaître et à combattre des agents pathogènes spécifiques, les vaccins protègent non seulement les individus vaccinés, mais aussi la collectivité dans son ensemble. Nos résultats pourront donc ouvrir de nouvelles pistes dans le domaine de l’élaboration de vaccins.
Procédures
Les animaux seront soumis : - Pour le génotypage : un prélèvement sanguin au niveau de la queue d’une courte durée (quelques secondes) par prélèvement. - Une injection intramusculaire ou en sous-cutanée en début de procédure d’une durée de quelques secondes ou une injection intramusculaire ou en sous cutanée en début de procédure (quelques secondes) puis une chirurgie sous anesthésie d’une durée maximale de 6 heures. - La chirurgie pour la microscopie est sans réveil.
Impact sur les animaux
Ce projet sera attentif aux cinq libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines des procédures pourraient avoir un effet indésirable sur l’animal. Certains animaux seront prélevés au niveau de la veine caudale ce qui pourrait entrainer une légère douleur au site de prélèvement. Certains animaux pourraient ressentir une douleur modérée au site d’injection, qui ne devrait pas dépasser celle ressentie chez l’homme lors d’une vaccination. Le site d’injection pourrait devenir inflammatoire pendant les 3 premiers jours et inconfortable pour l’animal. Dans ce cas, l’environnement de sa cage pourra être adapté (changement de litière pour de la cellulose, alimentation humide) Certains animaux recevront une injection qui pourra entrainer une légère douleur avant d’être anesthésiés.
Devenir
Les animaux générés par la procédure 1 seront utilisés pour toutes les procédures décrites dans ce projet. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour l’étude de la réponse immunitaire ex-vivo et ne pourront donc pas être réutilisés.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires ou des organoïdes (Structures 3 dimensions mimant certaines des communications inter cellulaires in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier la réponse immunitaire dans le cas d’une infection ou d’une vaccination. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer la complexité de la réponse immunitaire.
Réduction
Ce projet de recherche propose de réduire le nombre d’animaux utilisé si les différences à différent temps ou entre les sexes n’est pas importante. Par ailleurs, l'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, différents tests seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. Les effectifs par groupe (3-4) sont cohérentes avec les tailles d'effet très fortes attendues, correspondant à des différences très marquées entre les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils auront reçus un agent infectieux ou une vaccination et seront mis à mort à la fin de la procédure. Enfin, si les premiers tests ne donnent pas les résultats attendus, les autres expériences ne seront pas réalisées. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet seront réduits.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour les prélèvements sanguins, la queue sera désinfectée avant et après afin de minimiser les risques d’infections. Concernant l’injection d’agent inflammatoire, l’animal pourrait ressentir une gêne au site d’injection. Des analgésiques lui seront immédiatement administrés dans son eau de boisson. Concernant l’intervention chirurgicale, un analgésiant sera administré à l’animal en amont de l’anesthésie et de la chirurgie. Une plaque thermo contrôlée sera utilisée pendant l’imagerie pour limiter la perte de chaleur corporelle.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Toutes les souris utilisées seront d’âge adulte entre 6 et 16 semaines afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine.