Procédures légères

6 516 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur induite par un carcinogène, greffée sous la peau ou appliquée sur une peau abrasée, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un quatrième groupe est irradié pour détruire son système immunitaire avant de recevoir une greffe de moelle osseuse, avec des diarrhées, de la prostration et une altération de l'état général possibles pendant trois semaines. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem. Le porteur revendique de suivre vingt peptides chez la même souris pour réduire les effectifs, affirme qu'il reste "nécessaire" de valider ses observations dans un "organisme entier", et annonce comme retombée d'accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.

Objectifs

L’essor récent des approches d’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de cancers préalablement incurables. Cependant, ces approches ne sont pas efficaces pour les patients et ne s’appliquent pas à tous les cancers. Pour élargir leur champ d’application, il est essentiel d’identifier des stratégies visant à combiner les médicaments d’immunothérapie déjà utilisés avec d’autres molécules ou approches qui augmenteront l’efficacité des traitements. Une piste privilégiée est le développement de vaccins anti-tumoraux. L’objectif de tels vaccins seraient d’induire le développement de cellules immunitaires capables de reconnaître les cellules tumorales. Une étape essentielle est d’identifier les molécules exprimées par les cellules cancéreuses (antigènes) et pas par les cellules saines. Cela est possible car pendant la tumorigénèse, les cellules cancéreuses divergent petit à petit des cellules normales par l’accumulation d’anomalies génétiques ou épigénétiques. On sait depuis longtemps que le système immunitaire peut détecter les anomalies génétiques associées aux cancers. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont montré qu’il peut détecter la plupart des anomalies épigénétiques acquises pendant la tumorigénèse. Cependant, il est nécessaire de tester si les cibles dérivant de ces anomalies épigénétiques sont adéquates pour une vaccination anti-tumorale, en déterminant notamment la stabilité de leur expression au cours du temps, leur capacité à induire une réponse immunitaire robuste, etc… L’objectif de ce projet est de fournir une description approfondie des réponses immunitaires contre les anomalies épigénétiques associées aux cancers, pour accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.

Bénéfices attendus

Le développement de l’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de nombreux cancers. Cependant, ces protocoles ne sont pas efficaces pour tous les patients et ne s’appliquent pas à toutes les pathologies. Améliorer leur efficacité est un enjeu central en cancérologie. Le développement de vaccins anti-tumoraux thérapeutiques est une piste prometteuse pour améliorer le champ d’application de l’immunothérapie. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont identifié de nouvelles sources de molécules exprimées par les cellules tumorales qui peuvent être détectées pour le système immunitaire. Cependant, il est nécessaire de mieux décrire les réponses immunitaires contre ces nouvelles molécules si on veut s’appuyer sur cette découverte pour améliorer la prise en charge clinique des patients. Le projet proposé ici apportera une compréhension approfondie des réponses immunitaires contre les cancers et consolidera les approches visant au développement de vaccins anti-tumoraux.

Procédures

Dans un premier lot d’animaux, une molécule carcinogène (induisant la formation des tumeurs) sera injectée à des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie inf à 5 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un deuxième lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse et les animaux seront traités 2 fois par semaine par injection pendant toute la durée de la procédure. La mesure de la tumeur et l’injection pour le traitement sont réalisées en même temps (une seule contention inf à 2 min). Dans un troisième lot d’animaux, des cellules tumorales seront appliquées aux animaux anesthésiés après abrasion douce de la peau (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie env 20 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un quatrième lot d’animaux, les animaux seront irradiés pour éliminer les cellules immunitaires. 4h après irradiation, des cellules de moelle osseuse d’intérêt seront injectées par voie intraveineuse sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour reconstituer le système immunitaire. 6-8 semaines après injection, un prélèvement de sang sera réalisé sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour évaluer la reconstitution.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou soumis à une procédure de carcinogenèse chimique développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de carcinogènes, de cellules ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est également attendu une douleur légère liée à la piqûre elle-même (gène de courte durée ). Suite aux irradiations, certains animaux peuvent présenter des problèmes de diarrhée, prostration, altération de l’état général pendant les 3 premières semaines suivant l’irradiation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro ainsi que de nombreuses analyses bioinformatiques qui nous ont permis d’identifier des peptides dérivant de gènes, de mutations ou du génome silencieux exprimés par plusieurs lignées tumorales. Cependant, pour analyser si leur expression peut être affectée lors d’une réponse immunitaire efficace, il nous est essentiel de réaliser certaines expériences en utilisant des modèles de souris. En effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de système d’activation in vitro permettant de récapituler la complexité des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire lors du développement d’un cancer. Par conséquent, pour décrire les propriétés immunologiques des antigènes dérivés du génome non-codant, il nous est essentiel d’avoir recours à un modèle animal. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait de la proximité des systèmes immunitaires entre hommes et souris.

Réduction

Nous avons réalisé des approches expérimentales et bioinformatiques en profondeur pour caractériser au mieux l’expression de différents types d’antigènes par nos cellules tumorales d’intérêt et ajuster les expériences à faire in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme entier où les interactions complexes entre cellules tumorales et système immunitaire seront reproduites. D’autre part, nous utiliserons systématiquement des approches dites de « multiplexage », qui permettront de suivre dans la même souris le comportement d’au moins 20 peptides différents. Ces approches complexes ont déjà été mises en place au laboratoire, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux utilisés dans ce projet . Les nombres d’animaux dans les différentes procédures ont été déterminés sur la base d’expériences similaires au laboratoire et sur la base des données de la littérature

Raffinement

Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer la souffrance, et des points limites ont été définis. Les animaux seront mis à mort à l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans la grille de score. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Il y a également de nombreux modèles de tumeurs transplantables disponibles, bien décrits et reproductibles, qui permettront de répondre rapidement aux questions posées dans ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

Injectées avec des vecteurs viraux dans les jours suivant leur naissance ou à quatre semaines, puis soumises à un régime spécifique et à deux gavages, 136 souris subissent la destruction chimique d'un muscle de la patte par injection de chlorure de baryum sous anesthésie. La régénération dure trente jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur indique que la lésion peut être douloureuse pendant cette phase. L'objectif déclaré est de valider une méthode qui permettrait ensuite de cibler n'importe quel gène sans créer une nouvelle lignée de souris, et toutes sont tuées pour prélever leurs cellules souches musculaires.

Objectifs

Le muscle possède une remarquable capacité de régénération, due en grande partie à la fonction des cellules souches musculaires, également connues sous le nom de cellules satellites. En réponse à une lésion musculaire ou à une maladie affectant le tissu musculaire, les cellules satellites s'activent et génèrent de nouvelles cellules musculaires pour réparer les dommages. Pour maintenir leur capacité de régénération, les cellules satellites doivent rester dans leur niche appropriée, qui leur fournit des éléments optimaux tels que des nutriments, des signaux chimiques et un soutien physique. Lorsqu'elles sont retirées de cette niche spécialisée, les cellules satellites perdent leur capacité de régénération. L'un des principaux défis de la recherche biomédicale est d'identifier les facteurs qui composent cette niche spécialisée, car cette connaissance pourrait aider à préserver les propriétés régénératrices des cellules satellites et éventuellement à les exploiter à des fins thérapeutiques. La matrice extracellulaire, un réseau complexe de protéines comme les collagènes, joue un rôle crucial dans la niche des cellules satellites. Nous avons identifié plusieurs facteurs candidats de la matrice extracellulaire et nous souhaitons étudier leurs fonctions à l'aide de modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet devrait nous permettre de développer une nouvelle méthode pour générer rapidement des souris génétiquement modifiées afin d'étudier le rôle de différents facteurs de la niche dans la fonction des cellules satellites.

Bénéfices attendus

Bénéfice à court terme (scientifique) : La matrice extracellulaire est un environnement riche et dense composé de nombreuses protéines différentes spécialisées en fonction du tissu. Ce projet nous permettra de cribler l'importance des différents composants de la matrice extracellulaire exprimés par les cellules souches musculaires pour leur activité lors de lésions musculaires. Bénéfice à long terme (scientifique + réduction du nombre d'animaux) : Ce projet nous permettra de confirmer la stratégie de ciblage de differentes gènes d’intérêt en utilisant une seul model. Par conséquent, dans une perspective à long terme, la validation de cette stratégie nous permettra, ainsi qu'à d'autres chercheurs-euses, d'utiliser ce protocole comme un modèle rapide et robuste pour cibler n'importe quel gène d'intérêt dans les cellules souches musculaires directement in vivo sans avoir besoin de développer de nouvelles model de souris pour chaque gène d'intérêt. Cela réduira considérablement le nombre de souris utilisées par projet.

Procédures

Les souris incluses dans ce projet recevront en une injection des vecteurs viraux, en un seul geste (rapide (moins d'une minute)) soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. Une fois adultes, les souris seront soumises à un régime alimentaire spécifique en granules pendant deux semaines suivi par deux gavages (pendant deux jours consictifs, un par jour, en un seul geste, ce qui prend moins d'une minute). Deux semaines après, un seul muscle d'une seule jambe sera blessé par injection intramusculaire (rapide (moins d'une minute)) sous anesthésie générale. Le processus de régénération musculaire dure 30 jours chez la souris.

Impact sur les animaux

Concernant l'injection des vecteurs viraux chez les souriceaux après la naissance ou chez les souris adultes, ils seront realisées rapidement et à l'aide d'une aiguille adaptée et fine afin de minimiser la douleur chez l'animal. La douleur est donc considérée comme faible. Le gavage est effectué par des chercheurs formés et expérimentés en un seul geste, rapidement, à l'aide de sondes adaptées. La douleur est minimale et l'inconfort pour l'animal est très faible. Enfin, concernant l'induction de lésions musculaires par injection de BaCl2 dans le muscle tibialis antérieur (TA), l'injection est réalisée rapidement, sous anesthésie, en un seul geste et à l'aide d'aiguilles fines adaptées pour minimiser la douleur. Cependant, étant donné que l'induction de la lésion elle-même peut être douloureuse pour les souris pendant la régénération musculaire, des analgésiques ainsi que des adaptations de l'environnement et de la nourriture des animaux dans la cage ont été envisagés et décrites dans les sections adaptées.

Devenir

Toutes les animaux inclut dans ce projet seront utilisées pour effectuer des prélèvements musculaire afin d'avoir accès aux cellules souches musculaire.

Remplacement

Dans ce projet, nous nous intéressons aux cellules souches musculaires et à la structure de leur matrix extra cellulaire in vivo. Bien que plusieurs systèmes de culture cellulaire se soient développés, le comportement de ces cellules change lors de leur mise en culture. Par conséquent, la simulation complète de la matrice extra cellulaire physiologique des cellules souches musculaire n’est pas encore possible in vitro, ce qui nous oblige à passer par des modèles in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, tous les tests in vitro possibles ont été réalisés. Cependant, pour confirmer notre stratégie de travail nous aurions besoin de 36 souris avant de commencer les expériences principales. Ensuite, pour la phase expérimentale, nous avons décidé de réduire le nombre d'animaux en induisant une lésion musculaire dans un seul muscle d'une seule patte par souris, ce qui nous permettra de comparer le comportement des cellules souches musculaires au repos (muscle controlatéral non lésé = témoin) ou après régénération musculaire. Ainsi, 100 animaux (10 lots de 10 souris, pour avoir par lot, 5 souris controles et 5 souris expérimentales) sont prévus pour la phase expérimentale. Ces groupes représentent le minimum nécessaire pour pouvoir effectuer une analyse statistique et conclure les résultats expérimentaux.

Raffinement

Tout au long du projet, le comportement et le poids des souris seront surveillés par le même manipulateur afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort chez les souris. Toutefois, l'induction de la blessure musculaire provoque des lésions musculaires et une régénération. De la nourriture et de l’hydrogel seront mis à disposition dans la cage les trois premiers jours au cas où les animaux ne parviendraient pas à atteindre la grille pour se nourrir. Également, des anti-douleurs sont prévus pour réduire la douleur des souris. Un tableau d'évaluation des animaux et des points limites a été préparé, adapté à chaque intervention, et sera consulté tout au long du projet pour évaluer l'état de chaque souris incluse dans chaque procédure

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1. La souris est un mammifère et la structure de son muscle squelettique est très similaire à celle du muscle squelettique humain. 2. La courte durée de gestation et la maturité post natale chez la souris sont compatibles avec la durée de nos expériences. 3. La petite taille des souriceaux nous permet de cibler toutes les cellules avec une petite quantité des vecteurs viraux. 4. Des études similaires sur la délivrance de gènes par des vecteurs viraux chez la souris ont servi de base à la conception de l'expérience. 5. Notre laboratoire possède une expertise dans la manipulation des souris. pour l'injection des vecteurs viraux, les souris seront injectées soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. L'objectif est de cibler le plus grand nombre de cellules souches musculaire par l'intermédiaire des vecteurs viraux. Par la suite, les tests de régénération musculaire seront effectués chez des souris adultes, soit à 11-15 semaines d'âge, pour étudier le comportement et la capacité des cellules souches musculaires pendant la régénération des muscles squelettiques.

Une biopsie de la queue, trois injections rétro-orbitaires quotidiennes et des séjours de six heures en cage métabolique deux fois par semaine : 2 000 souris vont être utilisées, 1 940 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 60 un niveau modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, les reins au premier chef. Le projet consiste à mettre au point un système d'explants rénaux ex vivo et à le comparer à une maladie rénale provoquée chez l'animal par injection d'une substance. Le porteur présente ce système comme destiné à "remplacer l'utilisation de modèles animaux" et affirme qu'une seule souris permettra de tester de nombreuses molécules, tout en déclarant 2 000 souris pour y parvenir.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont un enjeu majeur de santé publique. Nous développons un système d'explants rénaux ex vivo permettant l'étude de le physiopathologie rénale de façon dynamique. Ce modèle ex vivo sera comparé à un modèle in vivo de maladie rénale obtenu par injection d'une substance. dans ce modèle, la fonction rénale sera analysée grâce aux urines des animaux prélevés dans des cages à métabolisme.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra le développement d'un modèle ex vivo de maladies rénales rares et sévères et la création d'une plateforme de criblage pour des candidats-médicaments. L'utilisation de modèle ex vivo permettra de réduire l'utilisation des animaux à des fins de recherches car une seule souris permettra de tester de nombreuses molécules.

Procédures

Biopsie à la queue (1 fois 10 secondes). Une injection rétro-orbitaire quotidienne pendant 3 jours (1 min/ jour). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement 2 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension, douleur légère de courte durée au point d’injection et stress lié aux cages métaboliques.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

L'objectif du projet est de développer un système ex vivo permettant de remplacer l'utilisation de modèles animaux par un modèle ex vivo.

Réduction

Les accouplments sont optimisés pour réduire le nombre d'animaux générés à leur minimum. Le nombre d'animaux a été optimisé pour pouvoir avoir la puissance statistique nécessaire à l'analyse des résultats.

Raffinement

Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites stricts et spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance, grâce à l'utilisation d'une analgésie. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De la naissance à l'age adulte car nous avons un élevage. Les animaux adultes sont utilisés pour isoler les glomérules et pour le modèle pathologique.

Tous tués à l'issue pour prélever sang, organes et tissus, 360 rats et 64 souris vont être utilisés pour mesurer ce que fait l'exposition aux fréquences de la 5G à leur régulation thermique. Les rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les souris un niveau léger. Chaque rat reçoit un capteur télémétrique implanté dans la cavité abdominale au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis passe deux heures par jour, pendant une ou quatre semaines, dans une cage d'exposition chauffée à 31 °C, avec un test de préférence thermique de quinze minutes. Le porteur reconnaît qu'aux plus fortes intensités la température interne des rats peut monter de 0,5 à 1 °C, et rattache le projet à un programme européen destiné à revoir les valeurs limites réglementaires d'exposition.

Objectifs

Actuellement, la 5G est diffusée par l’intermédiaire d’une bande de fréquence de 3,5 GHz et pourra par la suite être accompagnée d’une nouvelle bande dite millimétrique à 26 GHz. L’éventuel impact sanitaire des champs électromagnétiques (CEM) à ces fréquences, est peu étudié. De précédents travaux avaient montré une modification de la régulation thermique à une température d’air de 31°C après une exposition de 5 semaines à 900 MHz chez des rats. Des souris exposées une semaine à 900 MHz semblaient avoir une expression plus importante de certaines protéines dans différents tissus. Ainsi, les rongeurs exposés aux CEM de 900 MHz activent des réponses observées lors d’exposition au froid. Dans ce projet, nous étudierons si une exposition aux fréquences de 3,5 GHz et 26 GHz à différentes intensités couplée à une température d’air élevée (31°C) modifie les paramètres physiologiques impliqués dans la régulation thermique (mesure in vivo de la température interne, du poids corporel et de la préférence thermique) chez des rats. Le second objectif du projet est de vérifier si la fréquence de 3,5 GHz influe sur un récepteur sensible au froid chez des souris après une exposition subaiguë. Pour cela, des rats seront exposés deux heures par jour à une température d’air de 31°C et à différents débits d’absorption spécifique (DAS) pour la fréquence de 3,5 GHz et différentes densités surfaciques de puissance (DSP) pour la fréquence de 26 GHz. Les paramètres physiologiques seront analysés lors ou après une exposition à des DAS de 0,08 W/kg, 0,4 W/kg et 4 W/kg pour la fréquence de 3,5 GHz, et des DSP de 10W/ m2, 50W/ m2 et 100W/ m2. Ces différents groupes d'exposition seront comparés aux groupes non exposés aux CEM (antenne éteintes) mais exposés à 31°C, en fonction du temps d’exposition (1 ou 4 semaine(s)) et en fonction du sexe (mâle et femelle). Deux autres groupes (contrôles négatifs) seront maintenus dans les cages d’hébergement sans être exposés ni aux CEM ni à 31°C. Cette procédure sera composée de 360 rats répartis en 30 groupes de 12 animaux chacun. Pour étudier l’implication des récepteurs au froid lors d’une exposition, des souris seront exposés deux heures par jour à des DAS de 0,08 W/kg, 0,4 W/kg et 4 W/kg à la fréquence de 3,5 GHz à 24°C pendant 4 semaines. Ces groupes seront comparés à un groupe non exposé. Cette procédure sera composée de 64 souris réparties en 4 groupes de 16 animaux chacun. Au total, le projet sera effectué sur 424 rongeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet européen qui a pour objectif d’évaluer les niveaux d’exposition de la population à la technologie 5G et les éventuels effets sanitaires (études expérimentales et clinique chez l’homme ou l’animal). Ainsi, ce projet permettra d’évaluer les risques d’une exposition 5G pour donner d’éventuelles recommandations ou revoir les valeurs limites d’exposition réglementaires concernant les fréquences liées à la 5G.

Procédures

Des animaux seront exposés à des champs électromagnétiques et à une température ambiante de 31°C deux heures par jour durant une ou quatre semaines. Une chirurgie sera effectuée afin d'implanter un capteur télémétrique pour enregistrer la température interne dans la cavité abdominale. Celle-ci durera maximum 30 minutes par animal. Les animaux seront transportés et manipulés pour les déplacer de leur cage d'hébergement à leur cage d'exposition. Un test comportemental sera réalisé pour mesurer la préférence thermique. Celui-ci durera 15 minutes avec une habituation de 5 minutes tous les jours 3 jours avant le test.

Impact sur les animaux

Les groupes d’animaux exposés à 3,5 GHz à un DAS de 4 W/kg peuvent avoir une augmentation de leur température interne, comprise entre 0,5 et 1°C. Cette augmentation est liée à une absorption trop importante de l’énergie émise qui n’est pas assez dissipée par le système thermorégulateur des organismes (effet qui est à l’origine des valeurs limites d’exposition aux CEM chez l’homme). Cette augmentation, si elle est présente, durera le temps de l’exposition soit maximum 2 heures par jour. Pour les intensités inférieures, aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu. Pour la fréquence de 26 GHz, aucune nuisance ou effet indésirable n’est connu actuellement. Un potentiel effet stress peut être observé lors de la manipulation des animaux pour les déplacer de leur cage d’hébergement aux cages d’exposition.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter le sang, des organes et des tissus pour effectuer des analyses post-mortem.

Remplacement

Le modèle in vivo est indispensable pour étudier les effets des CEM. En effet, l'énergie émise par les CEM est absorbée par l'organisme. Cette énergie peut induire une élévation de température qui est généralement dissipée par la thermorégulation. Les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reproduire cette thermorégulation ce qui entraîne très souvent une élévation de température des cultures cellulaires. Ainsi, les résultats observés sont forcément liés à cette élévation de température. De plus, il n’existe pas de modèle in silico et in vitro reproduisant la régulation thermique qui implique des variations hormonales et comportementales ce qui nécessite le recours aux études in vivo. Le modèle rongeur (souris et rat) a été choisi car son système thermorégulateur est relativement similaire à celui de l’homme au niveau génétique, hormonal, comportemental et tissulaire. Les effets observés chez le rongeur peuvent contribuer à définir des valeurs limites d’exposition aux CEM.

Réduction

Plusieurs paramètres physiologiques seront analysés sur chaque rat. Afin de s’assurer d’avoir des résultats exploitables pour la température et le comportement et d’une puissance statistique forte pour réaliser des tests robustes combinant plusieurs facteurs, le nombre de 12 animaux par groupe a été choisi. En effet, de précédentes études ont montré des résultats robustes et significatifs à partir de 10 animaux. Cependant, l'enregistrement de la température interne avec le capteur télémétrique pouvant être parfois défaillant et la chirurgie pouvant amener des effets secondaires non désirables, nous avons choisi d'ajouter 2 animaux supplémentaires pour nous assurer d'obtenir assez de données exploitables. Il a été choisi de réaliser les expérimentations sur 16 animaux par groupe de souris. Les analyses ex vivo seront réalisées sur des tissus parfois présents en faible quantité chez la souris. Ainsi, ce nombre permettra d’avoir une puissante statistique suffisamment forte pour réaliser des tests robustes car les réponses individuelles peuvent être faibles et non exploitables. Nous utiliserons que des individus mâles car les effets sur les récepteurs au froid sont normalement similaires (pas d'effet sexe observé lors de précédentes études). Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel spécifique. Les effets testés au cours de ce projet seront les fréquences d’exposition (3,5 GHz/26 GHz), les niveaux d’exposition (DAS et DSP), la durée d’exposition (1 et 4 semaines), le sexe (mâle et femelle) et la cage (hébergement et exposition). En effet, le groupe contrôle négatif permettra de déterminer un éventuel effet stress lié à la manipulation et au transport entre la cage d’hébergement et la cage d’exposition.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de vérifier leur bien-être grâce à des critères précis, permettant de déterminer un score et de prendre en charge précocement les signes de détresse, stress ou douleur. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques. Pour des scores supérieurs à 3, des mesures seront prises afin de soulager l’animal. Un score inférieur à 3 est un bon indicateur du bien-être de l’animal au sein du protocole. Un enrichissement sera mis en place pour les animaux afin de limiter le stress lié à leur hébergement (cylindres en carton, lanières de papier kraft, bâtons de bois à ronger). Les animaux seront hébergés à plusieurs dans les cages d’hébergements en prenant en compte la taille de la cage ainsi que le poids des animaux. Dans les cages d’exposition, les rats seront deux par cage et les souris deux ou trois par cage. Les rats qui seront opérés sous anesthésie pour implanter le capteur Anipill auront un traitement pré-opératoire avec l'administration d'un antalgique et l'application d'un anesthésique sur la zone à inciser. Pendant la chirurgie, les animaux seront sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie et des mesures d'aseptie seront mises en place (stérilisation des instruments, utilisation de matériel stérile et à usage unique). Un traitement post-opératoire avec l'administration d'un antalgique sera effectué pour éviter la douleur liée à l’incision abdominale. Cette dernière sera la plus petite possible (maximum 1,5 cm de long). Après la chirurgie, les rats seront hébergés à plusieurs par cage avec les mêmes congénères qu'avant l'opération. Ils seront également étroitement surveillés pendant une semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux avant de réaliser les expositions aux CEM. Un test comportemental de préférence thermique sera réalisé chez les rats. Pour limiter le stress lié à un nouvel environnement, les animaux seront habitués 5 minutes au dispositif 3 jours avant le test pour limiter le comportement exploratoire et ainsi d’avoir rapidement la préférence thermique. La mise à mort des animaux se fera sous anesthésie avec l'injection préalable d'un analgésique.

Choix des espèces

Le modèle rongeur (rat et souris) est un excellent modèle in vivo pour étudier les effets des CEM. En effet, l'énergie émise par les CEM est absorbée par l'organisme. Cette énergie peut induire une élévation de température qui est généralement dissipée par la thermorégulation. Ce système est relativement similaire à celui de l'homme. Le rat est un modèle pertinent pour son comportement thermorégulateur et les réponses physiologiques mis en place. De plus, les systèmes physiologiques sont largement décrits dans la littérature. La souris est un bon modèle pour les études génomiques qui seront réalisées pour étudier l'implication de récepteurs au froid, leurs génomes étant entièrement séquencés et ayant une forte similitude avec le génome humain. Les rats utilisés seront des adultes d'environ 3 mois afin d'avoir une quantité de sang suffisante pour réaliser tous les dosages hormonaux. De plus, de précédentes études dans le laboratoire ont déjà été réalisées avec des rats à différents âges sans observer de différence. Les souris seront juvéniles avec un âge de 5 semaines au début de l'exposition afin de voir si les effets observés lors d'une précédente étude chez le rat juvénile sont également observés chez la souris.

640 souris porteuses d'une accumulation de protéines toxiques mimant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'autre moitié un niveau modéré, toutes tuées pour prélever cerveau et sang. Elles reçoivent de la curcumine ou ses analogues dans l'eau de boisson, sont isolées en cage individuelle avec une roue pour mesurer leur activité, et doivent nager pour retrouver une plateforme immergée. Ce test de mémoire spatiale et l'anesthésie sans réveil final comptent parmi les quatre interventions au plus que subit chaque souris. Le porteur écrit que l'accumulation de protéines "n'engendre pas nuisance affectant l'état physiologique des animaux", tout en décrivant un déficit cognitif et des défauts de mémorisation qui s'aggravent avec l'âge.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveau des agrégats protéiques toxiques participant à l’aggravation de la maladie. Des travaux de l’équipe ont rapporté le rôle toxique de protéine s’accumulant de façon précoce et contribuant au développement de la MA. D’autres travaux publiés ont démontré que la curcumine exerce un effet neuroprotecteur dans un modèle murin mimant les formes sporadiques majoritaires de MA. Cependant, la curcumine présente une faible biodisponibilité dans le cerveau. C'est pourquoi nous avons synthétisé deux analogues de la curcumine, non toxiques, qui montrent un effet anti-inflammatoire et antioxydant sur des cultures cellulaires traitées avec des protéines toxiques impliqués dans le développement de la MA. L'objectif de ce projet est donc de déterminer l'effet de la curcumine et de ses analogues à des stades précoces et avancés de la MA en utilisant un modèle murin de la MA mimant la pathologie chez l’homme.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de valider l’effet de ces molécules dans un modèle murin de la MA, qui intègre à la fois l’accumulation des protéines toxiques observés chez les patients Alzheimer et chez qui il est possible d’évaluer l’impact préventif (administration au début du développement de la pathologie) et aussi thérapeutique (administration après l’apparition des symptômes de la pathologie). De plus, il vise à examiner spécifiquement le rôle de l’accumulation de protéines toxiques et aussi de la neuroinflammation dans le développement et la progression de la MA. Cette recherche fondamentale devrait fournir des informations précieuses sur les mécanismes cellulaires et moléculaires que ces molécules pourraient cibler et déterminer si elles sont capables de restaurer les phénotypes pathologiques caractéristiques de la MA. En outre, elle pourrait offrir des perspectives essentielles pour l'utilisation future de ces molécules dans la prévention ou le traitement de la MA chez l’homme.

Procédures

Les animaux subiront au plus 4 interventions : 1-Le traitement par une administration des molécules dans l'eau de boisson . 2-Les mesures d'activité spontanée et l’exercice dans des cages expérimentales contenant une roue. 3-Le test de la mémoire spatiale qui consiste en l’apprentissage de la localisation d’une plateforme submergée dans l’eau. 4- l’anesthésie sans réveil final.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype potentiellement dommageable avec un déficit cognitif, des défauts d’apprentissage et de mémorisation qui s’aggravent avec l’âge et sont liés à l'accumulation de protéines toxiques. Cette accumulation de protéines n'engendre pas nuisance affectant l'état physiologique des animaux puisqu'ils conservent un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. La curcumine, la molécule mère, utilisée dans ce projet a déjà été administrée à des rats sans effet indésirable visible sur l'état physiologique des animaux conservant un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. Dans le cadre de ce projet, les souris sont contraintes à nager dans l’eau qui est un environnement stressant pour les souris, mais la durée du test n'est pas suffisamment longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien-être des animaux. Les mesures d'activité dans les cages expérimentales consistent à isoler les souris dans des cages individuelles. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisamment longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien-être des animaux. De plus cet isolement est compensé par la présence d'une roue dans la cage considérée comme un enrichissement de l'environnement. Pour les analyses histologiques, certaines souris seront profondément anesthésiées et pour éviter toute douleur à l'animal, avant toute intervention, la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée au préalable par l'absence de réaction de l'animal au pincement de la membrane interdigitale.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques et le sang pour récupérer le sérum. Ces prélèvements sont nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Les expériences de comportement sur les souris telles que le test d’apprentissage dans une piscine ou d’évaluation de l’exercice dans des cages expérimentales ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont étudiées en parallèle sur des modèles cellulaires qui reproduisent l’accumulation des protéines toxiques liées à la Maladie d'Alzheimer.

Réduction

Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est déterminé avec un logiciel de statistique et sont également basés sur notre expertise et travaux déjà publiés. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 20 animaux maximum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, quand cela est possible, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs tests comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.

Raffinement

Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés. L'accumulation des protéines toxiques n'engendre pas de nuisance apparentes. Nous avons prévu les conditions d'hébergement assurant un bien être aux souris. Les procédures proposées prévoient des tests d’activité et d’apprentissage pouvant potentiellement engendrer un stress aux animaux. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur surveillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores et nous nous référons aux points limites. Nous avons prévu des procédures de raffinement adaptés à chaque procédure permettant de réduire les nuisances au maximum.

Choix des espèces

La validation de nos résultats obtenus dans des modèles cellulaires nécessite l’application dans un modèle animal mimant la maladie d’Alzheimer. En effet, le modèle de souris que nous avons au laboratoire développe à la fois les pathologies liées à l'accumulation de protéines toxiques et un déficit de type apathie et un déficit de mémoire spatiale. Dans cette optique, nous comptons déterminer l’effet thérapeutique des nouvelles molécules dans ce modèle soit en préventif à 4 mois souris montrent une accumulation de protéines toxiques localisée dans une région du cerveau et comportement d’apathie) ou en curatif à 12mois (les souris montrent une aggravation de l’accumulation des protéines toxiques dans différentes régions du cerveau et comportement d’apathie et de déficit de la mémoire).

Deux plaies cutanées sont ouvertes dans le dos de chaque souris jusqu'au muscle de la peau, puis maintenues par des disques de silicone suturés, les pansements étant changés chaque jour sous anesthésie. 760 souris vont être utilisées de cette façon, 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 560 un niveau modéré, avec des injections intrapéritonéales quotidiennes d'un composé issu du régime cétogène. Le point limite retenu est la présence simultanée de trois signes de douleur parmi la fermeture des yeux, l'immobilité, les poils piqués et le suintement de la plaie. Le porteur annonce la mise à mort de 740 animaux à l'issue, quand le tableau de gravité du même résumé en déclare 760.

Objectifs

Le composé X est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient.

Bénéfices attendus

Au-delà des informations fondamentales les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. Le composé X est produit naturallement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais restent à être validées in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime spécifique ou seront traités par des injections intrapéritonéales du composé X ou seront traités directement en topique avec le composé X. Les 3 traitements seront réalisés sur des souris ayant subi une chirurgie afin d’induire deux lésions cutanées sur le dos de l’animal (modèle de cicatrisation). Les injections intrapéritonéales sont rapides et n’excèdent pas quelques secondes de manipulation. Elles seront réalisées alternativement à droite et à gauche d’un jour à l’autre afin de réduire la douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et antidouleur local. Le temps de raser les animaux, de réaliser la plaie, d’appliquer et de fixer les disques de silicones avec des points de suture, une vingtaine de minutes sont nécessaires par souris. Les pansements des plaies des animaux seront changés chaque jour sous anesthésie. Le temps de changer les pansements, de faire l’acquisition d’images afin de suivre l’évolution de la cicatrisation et d’appliquer le composé X sur les plaies environ 5 minutes sont nécessaires par souris..

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections quotidiennes en intrapéritonéales alternativement à droite et à gauche. Ces injections répétées pourraient induire une réponse inflammatoire. Les animaux subiront également une procédure expérimentale appelée modèle de cicatrisation consistant en l’induction de deux lésions cutanées (tissus sous cutanés incluant la couche de muscle de la peau panniculus carnosus) sur le dos de l’animal qui pourrait causer de l’inconfort et de la douleur. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une modification de comportement par l’absence de mobilité, un suintement de la plaie et une ouverture plus importante de la plaie, un aspect général de son pelage présentant des pics (poils piqué), en présence d’un de ces signes, un analgésique sera donné. La présence de 3 signes simultanés constituera le point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante.

Devenir

La totalité des animaux (740) sera mis à mort à la fin des 2 procédures pour prélèvement d’organes post mortem.

Remplacement

Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique d’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car la cicatrisation est plus longue et peut devenir pathologique avec l’âge. Nous voulons donc tester si notre composé X est capable de favoriser la cicatrisation indépendamment des difficultés de cicatrisation liée à l’âge.