Procédures légères

Biopsiées à la queue sous anesthésie quand elles sont juvéniles, 244 souris reçoivent ensuite du tamoxifène, des substances introduites dans l'estomac et des immunisations, et subissent des prises de sang sous anesthésie. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces souris sont construites pour développer des tumeurs de plasmocytes, par désactivation d'un gène qui déclenche la mort des cellules et activation d'un autre qui stimule leur multiplication. Le porteur s'attend à des déformations osseuses liées aux tumeurs, à des difficultés à se déplacer ou à se tenir debout et à l'apparition de masses dans les organes lymphatiques. Toutes seront tuées à la fin de l'étude, le RNT indiquant par ailleurs qu'une partie des animaux modifiés pourra servir à établir de nouvelles lignées.

Objectifs

Dans ce projet, nous créons un modèle de souris pour mieux comprendre comment certains gènes peuvent provoquer des tumeurs dans les plasmocytes, qui sont des cellules du système immunitaire produisant des anticorps pour nous protéger contre les infections. Nous allons modifier l'ADN de ces souris en désactivant un gène qui entraîne la mort des cellules et en activant un autre qui stimule leur multiplication. Cela permettra à ces cellules de survivre et de se multiplier davantage. Grâce à ce modèle, nous espérons comprendre comment ces changements génétiques conduisent à la formation de tumeurs et trouver de nouveaux traitements pour ce type de cancer.

Bénéfices attendus

Notre projet cherche à comprendre comment le cancer se développe en étudiant le rôle de deux gènes dans un type particulier de cellule, les plasmocytes, qui produisent des anticorps. Ces gènes jouent un rôle clé dans la croissance des cellules et sont impliqués dans un cancer du sang appelé myélome multiple. En étudiant ces gènes, nous espérons découvrir comment ils contribuent à la formation de ce cancer, en particulier dans ses stades avancés. L’un de ces gènes aide normalement les cellules à maintenir leur ADN stable, ce qui les protège contre le cancer. Cependant, dans le myélome multiple, ce gène est souvent modifié, rendant les cellules plus vulnérables aux mutations et favorisant leur croissance incontrôlée. L’autre gène, impliqué dans la survie des cellules immunitaires, est souvent activé de manière anormale dans les cellules cancéreuses. En étudiant ces gènes dans les plasmocytes, nous souhaitons mieux comprendre leur rôle dans le développement du myélome multiple. Une meilleure compréhension de ce processus pourrait conduire à la mise au point de nouveaux traitements plus efficaces pour les personnes atteintes de ce cancer complexe, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques et améliorant les perspectives de traitement pour les patients.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à plusieurs interventions dans le cadre des expériences, telles que : 1. Alimentation contrôlée: Des substances spécifiques seront introduites dans l'estomac des animaux pour répondre aux besoins de l'étude. 2. Stimulations du système immunitaire : Des injections seront réalisées pour activer la réponse immunitaire des animaux. 3. Prélèvements sanguins sous anesthésie : Du sang sera prélevé afin d'analyser l'état de santé et certains paramètres biologiques des animaux. 4. Analyse génétique : Un petit échantillon de tissu sera prélevé sur la queue des souris juvéniles sous anesthésie pour déterminer leurs caractéristiques génétiques et sélectionner celles qui participeront aux expériences.

Impact sur les animaux

1. Réactions immunitaires : Les animaux pourraient avoir des réactions indésirables liées à l’activation de leur système immunitaire. 2. Changements de comportement : Des changements dans le comportement des animaux, comme plus de calme ou de fatigue, peuvent être observés. 3. Perte de poids : Si l’animal perd une quantité importante de poids. 4. Problèmes osseux : Des changements dans la structure de ses os, comme des déformations liés aux tumeurs. 5. Problèmes de mobilité ou de posture : Des difficultés à se déplacer ou à se tenir debout. 6. Apparition de grosseurs: Formation de masses ressemblant à des tumeurs, particulièrement dans les organes lymphatiques. Par ailleurs, certaines interventions techniques pourraient occasionner un inconfort pour les animaux : - Biopsies de queue Effectuées sous anesthésie, elles peuvent provoquer une légère douleur passagère ainsi qu’un stress dû à la manipulation. -Injections de tamoxifène : Ce traitement peut entraîner une irritation au point d’injection et un stress temporaire. Un suivi attentif sera mis en place pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l’étude.

Devenir

À la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui ne seront pas intégrés aux expériences ou aux croisements seront retirés dès que possible. Pour les animaux ayant subi des modifications génétiques, certains pourront être réutilisés pour établir de nouvelles lignées sans nécessiter d'autres tests. Une fois les expériences terminées, l’analyse des organes des animaux permettra d’approfondir notre compréhension des effets des traitements étudiés.

Remplacement

Bien que des modèles cellulaires, comme les cellules provenant de patients ou des lignées de cellules, puissent être utilisés pour étudier certaines tumeurs de plasmocytes, telles que celles du myélome multiple ou de la maladie de Waldenström, ces recherches en laboratoire ne reproduisent pas la complexité des processus qui se déroulent dans la moelle osseuse ou les organes lymphoïdes, où ces maladies apparaissent naturellement. De même, bien que certaines modifications génétiques des cellules en laboratoire nous aident à mieux comprendre certains aspects de ces tumeurs, elles ne reflètent pas entièrement la manière dont elles se forment et évoluent dans un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux, comme la souris, est essentielle pour approfondir nos connaissances. En recréant ces tumeurs chez la souris, nous pourrons observer comment ces modifications affectent l’organisme dans un environnement naturel et complexe. Cela nous permettra d’obtenir des résultats plus précis et de tester de nouvelles thérapies pour traiter ces cancers.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, nous avons mis en place plusieurs mesures pour être plus efficaces tout en respectant leur bien-être. Voici les principales stratégies : - Choix du modèle animal : Nous utilisons une lignée de souris spécifique, ce qui permet d'avoir moins de variations entre les animaux et d’obtenir des résultats plus fiables. - Planification des expériences: Nous organisons les études pour éviter les manipulations répétées, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. - Utilisation de mâles et femelles : Nous ne faisons pas de distinction entre les sexes, ce qui permet de réduire le nombre total d'animaux. - Euthanasie à la fin des expériences : Les animaux sont euthanasiés à la fin des études, et tous leurs organes sont prélevés pour maximiser les informations obtenues. - Analyses statistiques : Nous utilisons des méthodes d’analyse qui nous permettent de tirer des conclusions solides avec moins d’animaux. - Suivi des animaux : Selon les résultats des analyses sanguines, les animaux sont suivis et euthanasiés à des âges différents pour optimiser leur utilisation. Ces stratégies nous aident à minimiser le nombre d'animaux tout en respectant les règles éthiques et en garantissant leur bien-être.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté pour minimiser leur stress. Nous les habituons progressivement aux manipulations et assurons un contact régulier avec le personnel soignant. Lors des interventions, des méthodes douces sont utilisées pour réduire le stress, et seules des personnes expérimentées réalisent les manipulations. Les animaux sont anesthésiés pour les prélèvements sanguins. Après chaque intervention, nous les surveillons attentivement pour nous assurer qu'ils se rétablissent bien et qu'ils ne souffrent pas. Ces mesures garantissent leur bien-être et la qualité des résultats.

Choix des espèces

Dans notre projet, nous utilisons des souris qui développent des problèmes similaires à ceux que l'on trouve chez les humains, comme le myélome multiple. Les mécanismes de ces maladies chez les souris sont très proches de ceux observés chez les humains. Par exemple, des protéines appelées immunoglobulines, qui jouent un rôle clé dans le développement de ces maladies, sont très similaires dans les deux espèces. Pour notre expérience, nous avons choisi de faire nos expériences sur des souris âgées de 8 semaines . Cet âge est choisi car les souris ont alors un système immunitaire bien développé, ce qui est important pour commencer les immunisations.

Pour mettre au point un boîtier imprimé en 3D destiné à mesurer la rigidité des tissus par IRM, 60 souris et 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal passe jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie gazeuse, de deux heures au maximum, pendant quatre mois. Tous sont tués au terme de la procédure pour prélèvement d'organes. Le porteur présente le dispositif comme un outil non invasif qui réduira le stress et les effets secondaires subis par les animaux non-humains dans les études futures, et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider son fonctionnement in vivo.

Objectifs

Nous utilisons une technique non invasive qui permet de mesurer les propriétés mécaniques des tissus et des organes, c'est à dire leur dureté et leur élasticité. On mesure la réaction du tissus à de petites vibrations par technique d'imagerie par résonance magnétique (IRM), permettant de qualifier qualitativement et quantitavement ces propriétés mécaniques. Cela nous aide à évaluer l'état de santé d'un organe, à suivre l'évolution de maladies ou à vérifier l’efficacité des traitements. Notre équipe a déjà acquis une expertise importante dans ce domaine, en appliquant cette approche à des modèles en laboratoire (cellules, tissus) ainsi qu'à des souris. Toutefois, l’appareil utilisé doit être adapté en fonction de l’organe ou de la pathologie étudiée. Dans cette étude, notre objectif est de développer un appareil compatible avec l’IRM, capable de mesurer les propriétés mécaniques des tissus chez les souris et les rats. Pour cela, nous allons concevoir cet appareil en utilisant l'impression 3D avec des matériaux plastiques. Une fois fabriqué, il sera testé d'abord sur un matériau inerte simulant les tissus, puis sur des animaux.

Bénéfices attendus

Le dispositif que nous développons permettra de mieux comprendre les propriétés mécaniques des tissus, en fournissant des données essentielles pour l’étude de maladies qui affectent la rigidité des organes, comme la fibrose ou le cancer. La possibilité de mesurer précisément les changements dans la structure des tissus contribuera à améliorer la détection et le suivi de ces maladies, tout en offrant une meilleure compréhension de leur évolution et en aidant à optimiser les traitements chez l’humain. Ce dispositif servira aussi à évaluer l’efficacité des thérapies. En outre, ce dispositif, représente un outil important pour la recherche biomédicale, car il permet d’évaluer les tissus sans intervention invasive. Cela garantit des résultats fiables tout en réduisant le stress et les effets secondaires sur les animaux utilisés pour les études.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse le temps de l'IRM qui se déroulera un maximum de 1 à 2 fois par semaine pendant au maximum 2h et en respectant un minimum de 12h de repos sans anesthésie pour l'animal entre chaque séance d'IRM. Les animaux seront gardés au maximum 4 mois.

Impact sur les animaux

Un stress léger et de courte durée pourra être ressenti par l’animal lors de la préhension pour l’anesthésie gazeuse. Ce stress pourra également être induit par la répétition des séances d'imagerie. L’exposition prolongée à l’anesthésie peut entrainer des fluctuations des paramètres vitaux tels que le rythme cardiaque et la respiration.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à la fin de la procédure pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est indispensable pour évaluer l'efficacité de notre dispositif in vivo, c'est-à-dire dans un organisme vivant et fonctionnel, étant donné que son application future concernera des études menées sur l’homme. Cette étape est cruciale, car elle réplique les conditions physiologiques réelles, c'est-à-dire les processus naturels du corps, comme la circulation sanguine, la respiration, et la réponse des tissus. Il est essentiel de valider son fonctionnement dans ces conditions afin de garantir des résultats fiables et transposables à l'Homme. En amont de cette demande, une première phase de mise au point a déjà été réalisée sur des tissus non vivants, permettant de confirmer les bases techniques du dispositif.

Réduction

Il s’agit d’une étude pilote donc le nombre d'animaux a été déterminé en fonction de notre expertise dans le domaine et des besoins minimum et suffisamment significatif pour valider les étapes de mise au point. Afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés, et compte tenu de la bonne tolérance des animaux à la procédure, chaque animal sera réutilisé en veillant à ne pas dépasser deux séances d'IRM sous anesthésie par semaine et pendant 4 mois maximum.

Raffinement

Ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Une surveillance quotidienne du bien être animal sera faite par le personnel de zootechnie. Au préalable de la procédure, l'animal recevra du gel occulaire pour prévenir la sécheresse oculaire. Lors des sessions d’IRM faites sous anesthésie gazeuse, la respiration des animaux sera monitorée dans l’IRM afin d’ajuster si besoin la dose d’anesthésique. La respiration sera maintenue aux alentours de 50 respirations/minute. L’animal sera surveillé jusqu’à son réveil. Nous limitons le nombre de séances d’imagerie autant que possible et optimisons la durée de chaque session afin de réduire l’exposition à l’anesthésie et ainsi prévenir des fluctuations des paramètres vitaux tels que le rythme cardiaque et la respiration. La procédure n’induit aucune douleur.

Choix des espèces

Les espèces ont été choisies dans le but de répondre aux attentes de projet futurs au sein de l’équipe ou de collaborations. Pour ces études, le rongeur, un organisme vivant complet et proche de l'Homme est necessaire, afin de pouvoir transposer nos résultats en clinique. Des souris et des rats adultes, âgés d’environ 10 à 16 semaines au début de la procédure (pour tous les rongeurs), sont sélectionnés pour ces expériences en raison de leur taille et de leur développement physique stable, ce qui les rend représentatifs des projets de recherche menés au sein de l’équipe.

Les souris de ce projet portent une modification génétique qui, déclenchée par du tamoxifène, supprime le cil primaire de leurs cellules mammaires, un modèle que l'équipe crée faute de le trouver dans le commerce. 116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de niveau léger. Elles reçoivent le tamoxifène par gavage cinq jours de suite, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut perforer l'œsophage ou faire passer la solution dans les poumons, et sont mises en reproduction à sept semaines pour que l'ablation du cil intervienne en fin de lactation. Les femelles sont tuées quatre jours après le sevrage ou à quinze jours d'une seconde gestation, leurs embryons décapités, et les souriceaux exposés au tamoxifène par le lait sont tués au sevrage.

Objectifs

La glande mammaire subit des changements importants pendant le cycle de reproduction. Sous l’influence des hormones, les cellules se multiplient et se transforment pour permettre la production de lait. Après la lactation, certaines cellules meurent pour que le tissu mammaire puisse revenir à son état initial. Pendant ce processus, les cellules du système immunitaire présentes dans le sein aident à éliminer les cellules mortes. Cependant la manière dont les cellules du sein et les cellules immunitaires communiquent entre elles pendant ce processus est inconnue. Nous avons observé la présence d’un cil primaire, une antenne sensorielle présente à la surface des cellules mammaires, à la surface d’interaction entre les cellules. Le but de cette étude est de comprendre le rôle de ce cil dans la communication entre les cellules mammaires et immunitaires, ainsi que dans le remodelage de la glande mammaire après la lactation. Pour ce faire, nous perturberons la formation de des cils primaires dans des cellules mammaires de souris et observer les effets. Cela pourrait nous donner de nouvelles informations sur la lactation, l'involution, et le rôle des cils dans ces processus.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de révéler de nouveau mécanismes cellulaires et moléculaires qui coordonnent la lactation et l’involution mammaire. Le bon déroulement de ces deux processus physiologiques est nécessaire à l’allaitement et au remodelage de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Des anomalies de lactation et d’involution mammaire post-lactation peuvent conduire à des défauts d’allaitement et des cancers du sein agressifs. Les résultats du projet permettront le développement de nos connaissances sur la biologie de la lactation et du remodelage de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Ils révéleront de nouvelles informations sur l’étiologie des maladies qui y sont associées et pourraient à long-terme révéler de nouvelles pistes pour améliorer l’allaitement et prévenir les cancers du seins associés à une gestation. Le développement d’un modèle murin est essentiel pour comprendre la biologie de la glande mammaire, un écosystème cellulaire complexe qui répond à des stimuli hormonaux. Le modèle murin que nous allons développer n’est pas commercialement disponible et nous permettra d’étudier la physiologie de la glande mammaire dans l’organisme entier dans un contexte pertinent.

Procédures

Du tamoxifène (un médicament qui est utilisé chez l’homme pour le traitement de certains cancers) sera administré par gavage aux souris du protocole 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs. La durée de l’acte est d’environ 1 minute par souris. Les animaux seront également pesés quotidiennement lors de l'administration du tamoxifène et dans la semaine qui suit. La durée de l'acte est d’environ 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

L’administration du traitement par gavage présente des risques, comme la possibilité de percer l’œsophage ou que la solution pénètre dans les poumons, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires. Le traitement au tamoxifène sur une courte période ne produit pas d’effet indésirable, à la fois chez les souris adultes et les nouveau-nés d’après la littérature scientifique. L’ablation du cil primaire dans la glande mammaire mènera sans doute à une réorganisation de la glande, mais aucun effet indésirable n’est attendu sur une courte période.

Devenir

Les animaux qui détiennent les modifications génétiques souhaitées qui auront été au contact du tamoxifène pour nos expériences seront mis à mort pour les analyses qui concernent nos expériences. Les animaux qui auront été exposés au tamoxifène avant leur sevrage (par allaitement) seront mis à mort au sevrage.

Remplacement

Le projet vise à identifier des nouvelles bases moléculaires et cellulaires de la physiologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Notre objectif est d’étudier les communications intercellulaires et l’implication du cil primaire dans un écosystème cellulaire complexe qui répond à des signaux hormonaux dans un organisme entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle alternatif à l’animal pour la culture de divers types cellulaire (épithélium/stroma) qui répondent aux hormones et miment le cycle de reproduction in vitro. L’utilisation de la souris est essentielle à la compréhension fine de la physiologie de la lactation. Toutefois, nous travaillons sur la culture d’organoïdes mammaires qui contiennent les différents types cellulaires épithéliaux in vitro. Nous nous efforçons d’utiliser ces modèles alternatifs pour répondre à nos questions scientifiques qui ne concernent que la biologie du tissu épithélial en absence de stroma. Nous avons par exemple utilisé ces modèles ex vivo pour démontrer que l’invalidation génétique d’IFT20 est suffisante pour l’inhibition de la ciliogénèse des cellules mammaires. Ces travaux in vitro nous permettent de limiter autant que possible le recours à la souris et de proposer des stratégies pertinentes et optimisées lorsque le recours à la souris est indispensable.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale, notamment pour optimiser la planification et les analyses. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’obtenir des résultats fiables. Le protocole d’administration du tamoxifène, issu de la littérature scientifique, est validé et robuste pour l’invalidation génétique. Nous anticipons donc que notre stratégie mènera à une bonne invalidation génétique dans la glande mammaire des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. Enfin, le personnel travaillera avec d'autres équipes pour partager les animaux (si certains ne sont pas adaptés ou disponibles) et pour échanger des données et des connaissances sur l'analyse des résultats.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible. La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possible. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages et réduire les risques de perforation de l’œsophage, des sondes de gavage à bout arrondie seront utilisées. Différents lieux accueilleront les animaux pour une distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et de sacrifice. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les jours lors de l’administration du tamoxifène ou tous les 2-3 jours autrement, tout en assurant un passage quotidien afin de déterminer le plus précocement possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole. Si des douleurs mineures sont constatées, des protocoles d’analgésie seront engagés sur la souris.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour cette étude du fait de : - Phases du cycle de reproduction bien décrites dans le temps (publiées) - Rapidité du cycle de reproduction chez la souris - Similitude de la physiologie de la glande mammaire murine et humaine - Résultats préliminaires sur la dynamique de ciliogénèse obtenus chez la souris - Disponibilité de souches génétiquement modifiées (commercialement disponible) Pour la procédure 1, l’administration de tamoxifène sera réalisée sur des animaux de 6 semaines environ pendant 5 jours consécutifs par gavage et une mise à mort 4 jours plus tard (cf. annexe 1). Concernant la procédure 2, pour le groupe « vierge », les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines, avec une induction du Tamoxifène pendant 5 jours consécutifs par gavage et une mise à mort 4 jours plus tard (cf. annexe 2). Pour les groupes « involution » et « 2ème gestation », les croisements permettant d’induire chez des femelles un cycle de reproduction seront lancés à l’âge de 7 semaines. L’induction au Tamoxifène sera réalisée du jour 17 au jour 21 de lactation. Les nouveaux nés seront sevrés à 21 jours de lactation. Une partie des animaux sera sacrifié au jour 4 d’involution. Ce jour correspond à l’initiation de la phase irréversible de l’involution et au moment où la ciliogénèse est induite dans le tissu mammaire. Le dernier groupe de femelle sera croisé de nouveau après 15 jours d’involution pour induire un nouveau cycle de mammogénèse. Les animaux seront sacrifiés à 15 jours de gestation. Une phase à laquelle une forte alvéologénèse a lieu et afin de juger de l’impact de l’inhibition du cil à ce stade. A la suite du sacrifice de l’animal, les embryons seront décapités.

Réutilisés ensuite pour la formation continue de vétérinaires ophtalmologues, 40 lapins adultes subissent une ponction de l'humeur aqueuse d'un œil sous anesthésie locale, dans des procédures déclarées de niveau léger. Chacun est emmailloté dans une serviette et contenu à la main le temps du geste, qui dure moins d'une minute et que le porteur qualifie d'indolore. L'excipient testé est destiné au chien, au cheval et à l'humain, le lapin n'étant retenu que parce que des animaux étaient déjà prévus pour la formation. Le porteur présente d'ailleurs cette disponibilité comme sa mesure de réduction, écrivant vouloir éviter de commander des lapins pour le seul projet.

Objectifs

Une première étude chez le chien a démontré de façon statistiquement significative que la dilatation pupillaire induite par un mydriatique (produit permettant la dilatation de la pupille) était plus importante quand ce mydriatique était administré conjointement à un nouvel excipient que quand il est administré seul. Ces résultats préliminaires très encourageants amènent donc à penser que l'excipient pourrait faciliter le passage intraoculaire d'une molécule d'intérêt ophtalmologique administrée sous forme de collyre. Pour en apporter la preuve formelle, il est nécessaire de mesurer chez l'animal, à différents temps, la concentration dans la chambre antérieure de l'oeil d'une molécule d'intérêt lors de son administration conjointement ou non à ce nouvel excipient.

Bénéfices attendus

Si les premiers résultats obtenus chez le chien sont bien confirmés par les dosages de la molécule d'intérêt dans l'humeur aqueuse, nous confirmerons que le nouvel excipient permet une meilleure pénétration intraoculaire de molécules d'intérêt ophtalmologiques dans un modèle lapin. Cela présente un intérêt clinique pour réduire signifiativement l'inflammation présente lors de chirurgies de l'oeil chez l'Homme comme en médecine vétérinaire.

Procédures

Une ponction de l'humeur aqueuse d'un oeil sous anesthésie locale : 1 à 2 min pour installation de l'anesthésie, maximum 1 min pour réalisation de la ponction.

Impact sur les animaux

La ponction de l'humeur aqueuse est un geste indolore pratiqué couramment en ophtalmologie sous anesthésie locale. Les animaux seront contenus manuellement, emmaillotés dans une serviette, ce qui peut engendrer un stress de courte durée. Il peut également y avoir exceptionnellement une micro-hémorragie se résorbant en quelques heures sans aucune conséquence par la suite sur le bien-être des animaux.

Devenir

Afin de réduire le nombre d'animaux, les lapins utilisés dans ce projet seront réutilisés pour des activités de formation.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans l'organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption de la molécule, diffusion dans l'humeur aqueuse, élimination de la molécule). Cependant, nous avons remplacé l'utilisation de chiens ou de chevaux (qui sont deux espèces cibles de l'excipient testé) par une étude sur lapins, ces lapins étant utilisés par ailleurs dans le cadre d'une formation.

Réduction

Afin de ne pas commander des lapins uniquement pour ce projet, les lapins utilisés seront ceux prévus intialement pour la formation continue des vétérinaires ophtalmologues (cette formation aura lieu après ce projet). Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par un test de puissance statistique à partir de données bibliographiques sur différentes formulations contenant la molécule d'intérêt ophtalmologique testées chez l'Homme.

Raffinement

Les lapins seront hébergés en groupe. Ils auront à leur disposition des balles remplies de foin qu'ils peuvent faire rouler, des bois à ronger et seront nourris à volonté avec des granulés. Afin de ne pas multiplier les ponctions sur chaque lapin et réduire les risques d'impact de ces ponctions sur les animaux, nous réaliserons une seule ponction sur un seul des deux yeux de chaque lapin. Cette ponction sera réalisée sous anesthésie locale. C'est un acte indolore qui sera réalisé par des vétérinaires ophtalmologues qui pratiquent cet acte au quotidien. Cependant, des points limites ont été fixés dans le cas exceptionnel de l'apparition d'une micro-hémorragie qui ne se résorberait pas en quelques heures.

Choix des espèces

L'excipient vise à être développé d'une part pour une utilisation en médecine humaine, et d'autre part pour une utilisation en médecine vétérinaire majoritairement chez le chien et le cheval. Cependant, il pourra être utilisé également chez les Nouveaux Animaux de Compagnie (NAC) comme le lapin. De plus, le dosage de la molécule d'intérêt ophtalmologique utilisée dans ce projet a été décrite chez le lapin. Enfin, l'utilisation de lapins permet d'utiliser des animaux déjà prévus par ailleurs pour une utilisation dans le cadre d'activités de formation. Animaux adultes. Les animaux trop vieux (>4-5 ans) seront écartés car ils peuvent présenter des pathologies occulaires impactant les résultats de l'étude. Les animaux non complétement matures (

40 vaches de plus d'un an subissent une à deux prises de sang par an à la veine jugulaire, dans des procédures déclarées de niveau léger, et resteront en vie pour être réutilisées dans d'autres projets. Chaque prélèvement dure moins de deux minutes, la tête maintenue au cornadis déjà utilisé pour l'alimentation, avec une distribution de granulés en récompense. Le sang frais doit servir à cartographier la réponse des neutrophiles et des macrophages à Besnoitia besnoiti, un parasite dont l'enjeu est d'abord économique, l'infertilité et la mortalité qu'il cause dans les troupeaux, la lutte actuelle passant par l'élimination des bovins malades. Le porteur affirme qu'aucune lignée cellulaire ne peut remplacer des cellules fraîchement prélevées.

Objectifs

Les bovins peuvent être touchés par diverses maladies parasitaires, dont certaines sont négligées. Ainsi, la besnoitiose, due au parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti, est cause d’infertilité, d’atteintes cutanées, de perte de poids et de mortalité jusqu’à 10% au sein des troupeaux. Maladie ré-émergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites présents dans la peau sont transmis par l’intermédiaire d’insectes ou d’aiguilles avec une progression jusqu’à 20% de nouveaux animaux infectés par an dans les troupeaux touchés. Une transmission par ingestion de parasites présents dans l’environnement sous forme d’oocystes est également suspectée. Aucun traitement curatif n’est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limités au dépistage et à l’élimination des animaux malades ou à l’utilisation d’insecticides. Le développement d’un vaccin contre la besnoitiose est rendu difficile par le manque de connaissances sur les réponses immunitaires des bovins à une infection par ce parasite. De plus, tous les essais d’infection expérimentale ont échoué à reproduire la maladie. Les neutrophiles et les monocytes/macrophages (cellules de l’immunité innée) jouent un rôle essentiel dans les premières étapes de la réponse immunitaire nécessaires à la détection et l’élimination des pathogènes. Le but du projet est donc de mieux comprendre le rôle de ces cellules dans les mécanismes de défense des bovins vis-à-vis des parasites, mais aussi vis-à-vis d’un vaccin anti-besnoitiose en développement. Les connaissances générées pourraient être utiles pour d’autres maladies parasitaires bovines. Il n’existe aucune lignée de cellules bovines pouvant remplacer les cellules sanguines fraichement prélevées. Le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre l’objectif dépendra du niveau des réponses des cellules et de la variabilité inter-individuelle mais restera dans la limite de 40 vaches, avec un maximum de deux prélèvements par an à plusieurs semaines d’intervalle pour chacune des vaches. Les bovins sont sociaux et les animaux impliqués dans le projet seront maintenus dans leur groupe et dans leur environnement habituel. Seuls des animaux calmes au moment du prélèvement seront inclus. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire nécessitent une contention minimale de la tête. Un renforcement positif par une récompense alimentaire (granulés) sera appliqué au moment de la contention et la prise de sang.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la cartographie de la réponse immunitaire innée des bovins vis-à-vis du parasite Besnoitia besnoiti. Le projet s’inscrit dans une étude plus large intégrant des bovins d’élevages touchés par la besnoitiose, symptomatiques et asymptomatiques. Ainsi, la comparaison des résultats obtenus avec des animaux de différents statuts sanitaires permettra d’appréhender les corrélats de protection, informations préalables indispensables au développement d’un vaccin efficace.

Procédures

Les animaux vigiles subiront une à deux prises de sang par an à plusieurs semaines d’intervalle. La prise de sang dure moins de 2 minutes et nécessite une contention de la tête de même durée.

Impact sur les animaux

La contention de la tête de l’animal peut engendrer un stress temporaire. La prise de sang à la veine jugulaire peut entrainer une douleur légère temporaire ainsi qu’un éventuel hématome au site de prélèvement.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie et pourront être réutilisés pour d'autres projets en raison de la classe légère de la procédure.

Remplacement

Il n’existe aucune lignée de neutrophiles pouvant être maintenue in vitro et pouvant remplacer les cellules sanguines. Seules celles issues de sang fraichement prélevé peuvent donner les informations recherchées sur la réponse immunitaire innée.

Réduction

Les variabilités interindividuelles sont très élevées chez les bovins. Les résultats attendus sont donc une tendance à une différence entre les conditions de culture des cellules seules et des cellules stimulées par les parasites, les extraits parasitaires ou les formulations vaccinales sur certains paramètres biologiques quantifiables. Si aucune différence ne tend à apparaitre avec les cellules d’une dizaine de vaches distinctes, les prélèvements ne seront pas poursuivis. Les animaux sont utilisés dans le cadre d'autres projets. L'espacement de plusieurs semaines entre deux prélèvements et le nombre maximum de deux prélèvements par an seront respectés.

Raffinement

Les bovins sont sociaux et les animaux impliqués dans le projet seront maintenus dans leur groupe et dans leur environnement habituel. Seuls des animaux calmes au moment du prélèvement seront inclus. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire nécessitent une contention minimale de la tête qui se fera à l’aide d’une barrière (cornadis) déjà utilisée au quotidien lors de l'alimentation dees animaux. Un renforcement positif par une récompense alimentaire (granulés pour vaches laitières) sera appliqué au moment de la contention et après la prise de sang.

Choix des espèces

Les bovins sont les animaux touchés par le parasite étudié, Besnoitia besnoiti. Le projet vise à étudier les réponses immunitaires innées des bovins vis-à-vis de ce pathogène. Le risque de contamination naturelle par Besnoitia besnoiti augmentant avec l’âge des animaux, il est pertinent d’étudier la réponse immunitaire d’animaux adultes âgés d’au moins un an.

150 chevaux âgés de 5 à 15 ans reçoivent chacun vingt nébulisations, matin et soir pendant dix jours, et subissent deux fois à onze jours d'intervalle une prise de sang, un lavage trachéal et un lavage broncho-alvéolaire d'un poumon sous endoscope et sédation, dans des procédures déclarées de niveau léger. Le porteur signale une gêne au passage de l'endoscope, de la toux, des saignements pouvant aller de quelques stries à un flux continu, et des réactions aux sédatifs allant du tremblement au choc allergique. Les mélanges d'huiles essentielles testés sont déjà employés sur le terrain sans qu'aucune étude n'ait établi leur innocuité ni leur efficacité. Tous les chevaux sont gardés en vie, et le porteur présente les données recherchées comme "indispensables" aux vétérinaires pour répondre à la croissance des demandes de leurs clients.

Objectifs

Les affections des voies respiratoires représentent la deuxième cause de baisse de performance chez le cheval de course et de sport après les affections musculosquelettiques. Le nombre de chevaux présentant une inflammation des voies respiratoires profondes ne cesse de croître, en raison de plusieurs facteurs : pollution environnementale, réchauffement climatique avec diminution des pâturages, dégradation de la qualité des fourrages avec augmentation des poussières, facteurs génétiques, mais aussi des contaminations fongiques et des surinfections bactériennes. L’enjeu économique et sanitaire est donc majeur. Leur traitement repose sur l’utilisation de corticoïdes éventuellement associés à des bronchodilatateurs. En cas de surinfection, des traitements antifongiques et/ou antibiotiques sont également recommandés. Les thérapies complémentaires sont largement employées, sur prescription vétérinaire ou par automédication de la part des propriétaires. Parmi celles-ci, l’utilisation de produits à base de mélange d’huiles essentielles (HE) par nébulisation prend de plus en plus d’ampleur. Elles sont administrées par voie orale ou par inhalation à l’aide de dispositifs adaptés aux équidés assurant leur distribution directe au niveau de l’arbre respiratoire. Ces thérapies complémentaires ont pour but de diminuer l’utilisation des médicaments et leurs effets secondaires et risques associés (fourbure dans le cas des corticoïdes, résistance antimicrobienne dans le cas des surinfections bactériennes). A ce jour, aucune étude n’a montré l’innocuité de l’utilisation quotidienne par inhalation des HE (ou mélange d’HE) sur les voies respiratoires profondes du cheval. De même, aucune étude n’a permis de montrer leur efficacité clinique (diminution de l’inflammation pulmonaire) et spécifique (propriétés antibactériennes et antifongiques) alors qu’elles sont largement utilisées en pratique. Le but du projet est d’évaluer l’innocuité et efficacité des huiles essentielles (HE) en inhalation pour le traitement des affections respiratoires équines, afin de proposer aux vétérinaires et autres utilisateurs des données scientifiques fiables sur l’emploi des composés à base d’HE, qui, s’ils s’avèrent pertinents, pourront être utilisés comme alternatifs aux traitements classiquement utilisés.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit dans l’étude des effets antibactériens et antiviraux des huiles essentielles. La réalisation d’une étude terrain basée sur des utilisations fréquemment rencontrées en pratique va permettre de récolter de données scientifiques, exploitables par les vétérinaires, et indispensable pour leur permettre de répondre à la forte croissance des demandes de leurs clients dans ce domaine.

Procédures

Après un examen clinque, chaque individu de chaque lot sera prélevé avant et après traitement (soit 2 fois durant l'étude à 11 jours d'intervalle). Il sera réalisé des prélèvements de sang, un lavage trachéal et un lavage broncho-alvéolaire d’un des deux poumons. Les lavages seront réalisés avec l'aide d'un endoscope et après sédation. Pour chaque animal, l'ensemble de ces interventions durera moins de 30 min. Le traitement consiste en la nébulisation matin et soir (10 min / nébulisation) pendant 10 jours de sérum physiologique (groupe témoin) ou de produits à base de mélange d’HE (les 2 autres groupes de chevaux).

Impact sur les animaux

Du stress peut être induit par les différents actes. Une gêne peut également être ressentie par le cheval au moment du passage de l'endoscope et du liquide dans les voies respiratoires pouvant occasioner de la toux qui sera limitée par les effets de la sédation. . Des saignements, lors de prélèvements respiratoires, peuvent survenir en cas d'irritations des cavités nasales ou lorsqu'on tape l’ethmoïde (ce qui peut arriver lorsque le cheval bouge ou qu'il lève la tête brusquement). Une évaluation initiale permet de qualifier la quantité de sang visible. Si elle est minime (stries ou petites gouttes), la situation est souvent bénigne. Si cette quantité est modérée à abondante (c’est à dire un flux continu ou une accumulation dans les voies respiratoires), cela signale une complication nécessitant une intervention immédiate. Une réaction à l'administration des sédatifs peut également survenir (tremblements, sudation excessive, hyperthermie, malaise, choc allergique).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie.

Remplacement

La caractérisation des Huile Essentielles (HE) a été réalisée in vitro sur quatre espèces bactériennes lors d’un précédent projet. Les effets antimicrobiens évalués sur différentes HE pures ou leurs principes actifs sont significatifs pour certaines combination HE/espèce bactérienne. Il est maintenant nécessaire de transposer cette évaluation sur des mélanges d’HE utilisées sur le terrain sans que leurs effets n’aient été scientifiquement évalués sur le terrain. La caractérisation des mélanges à bases d’HE et la démonstration de leur effet antimicrobien à travers l’étude terrain imaginée ici pourrait conduire à terme à les proposer comme thérapie complémentaire en médecine vétérinaire équin, en lieu et place des antibiotiques et des anti-inflammatoires. Il n'y a pas à ce jour d'alternative in vitro à ce projet car : - les modèles sur culture cellulaire (Cellules dermiques) ont été évaluées pour caractérisées les effets antiviraux des HE pures et de leurs principes actifs. Ils ont permis de démontrer un effet cytotoxique des HE important comparés à d'autres molécules antivirales. - les modèles de type "organoïde' sont en phase expérimentale de conception pour le volet respiratoire équin et ne sont pas disponibles à ce jour.

Réduction

Comme il n'y a pas d'études publiées sur l'innocuité et l'efficacité des mélanges d'HE retenus. Nous sommes ici dans le cadre d'une étude pilote. Dans notre étude avec 3 groupes de 50 chevaux, le scénario peut impliquer une comparaison entre les trois groupes pour évaluer l'effet des deux mélanges d'huiles essentielles par rapport à un contrôle ou entre eux. Nous allons donc comparer des groupes indépendants (chaque groupe reçoit un mélange différent), avec des mesures répétées sur les mêmes individus (avant/après application). L'effectif de chevaux défini a été calculé de manière être suffisamment puissant pour détecter des effets moyens ou grands, mais insuffisant pour des effets très faibles. Dans ce dernier cas, une nouvelle étude avec des effectifs plus grands sera à envisager. Tous les échantillons seront conservés en bio-banques et pourront être utilisés dans d’autres travaux réduisant le besoin d’effectuer de nouveaux prélèvements biologiques.

Raffinement

Les procédures sont réalisées selon un protocole standardisé par un vétérinaire. La gêne (et/ou douleur) et le stress induits par ces procédures seront contrôlés par la sédation réalisée par intraveineuse (posologie définie en fonction de l’équidé par le vétérinaire). Si des saignements apparaissent, une évaluation initiale permettra de qualifier la quantité de sang visible. Si elle est minime (stries ou petites gouttes), la situation est souvent bénigne. Si cette quantité est modérée à abondante (c’est à dire un flux continu ou une accumulation dans les voies respiratoires), cela signale une complication et une intervention du vétérinaire sera immédiate. A la fin de chaque prélèvement, les chevaux utilisés seront surveillés et hébergés dans un box avec litière, proche d’un autre congénère, avec un panier de jeûne, évitant tout risque de fausse déglutition, et ce jusqu’à absence d’effet visible de la sédation (locomotion normale, port de tête au-dessus de l’horizontal, réactivité face au test de clignement à la menace, test de sensibilité tactile, attention à l’environnement). Le cheval sera dans son environnement familier non stressant, ce sont les vétérinaires qui se déplacement sur son lieu d’élevage. Il sera manipulé par des personnes qui ont en régulièrement la charge.

Choix des espèces

Les travaux menés ont pour espèce cible le cheval où les mélanges à base d’HE sont déjà utilisés sans aucun référentiel. Il est donc important d’accumuler des données de terrain pour établir à termes ces référentiels utilisables par l’ensemble des acteurs de la filière équine. Les chevaux inclus seront âgés entre 5 et 15 ans pour correspondre à ce qui est réalisé sur le terrain, à savoir que les mélanges d’HE sélectionnés sont déjà utilisés sur cette population d’animaux.

Pour mettre au point un modèle destiné à comparer une muramidase déjà commercialisée à un nouvel additif alimentaire, 36 poulets de chair sont utilisés dans des procédures déclarées de niveau léger. Livrés à un jour et 40 grammes, élevés en cages en batterie, ils reçoivent pendant les sept derniers jours un aliment enrichi en contenus caecaux lyophilisés. La finalité déclarée mêle l'efficacité alimentaire, le bien-être des animaux non-humains et le développement durable, pour un additif dont le débouché est l'élevage de volailles de chair. Le porteur attend une baisse de consommation liée à l'inappétence de cet aliment et "probablement de la diarrhée", et tous les poulets seront tués à vingt-huit jours pour prélever le contenu de leur jéjunum.

Objectifs

La fonction gastro intestinale est influencée par de nombreux facteurs comme l’alimentation, le bien-être des animaux, l’intégrité de la barrière gastro intestinale et son interaction avec les microorganismes intestinaux. Ce microbiote complexe est en renouvellement constant et entraine naturellement une libération et une accumulation de débris cellulaires, dont des peptidoglycanes, qui constituent les parois bactériennes. Or, l’accumulation de ces débris cellulaires pourrait interférer avec la capacité du tractus gastrointestinal à absorber les nutriments, réduisant la digestibilité et altérant l'efficacité alimentaire. Une solution consiste à ajouter à l’alimentation une enzyme spécifique : la muramidase. Par son action de solubilisation du peptidoglycane présent dans les débris cellulaires, elle contribue à l’amélioration de la fonctionnalité gastro-intestinale considérée comme un élément clé dans l’efficacité alimentaire, le bien-être animal et le développement durable. En effet, lorsque la fonction intestinale et la santé sont altérées, la digestion et l’absorption des nutriments sont affectées entrainant, in fine, une détérioration des performances de croissance. Actuellement, la muramidase disponible commercialement a été développée in vitro en se basant sur sa capacité à dégrader les débris cellulaires de bactéries spécifiques mais parfois peu présentes au sein du microbiote intestinal. Or, il se trouve que de nombreuses souches bactériennes synthétisent différents peptidoglycanes. Aussi, afin de représenter la forte diversité de substrats observée d’un animal à un autre, il convient de développer une muramidase plus polyvalente capable d’hydrolyser un spectre plus large de peptidoglycanes et ainsi améliorer davantage les effets sur l’absorption des nutriments et sur la solubilisation du substrat. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle animal qui permette d’augmenter la concentration intestinale en PGN de manière contrôlée et de quantifier les capacités de la muramidase actuelle et de celle en cours de développement en se basant sur leurs capacités à solubiliser les PGN intestinaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de 1) développer le modèle d’apport intestinal en peptidoglycanes issus de contenus caecaux lyophilisés ,2) déterminer si l’apport contrôlé a permis une augmentation de la concentration en peptidoglycanes totaux 3) valider que le modèle permet une augmentation de la concentration en acide muramique soluble en présence de la muramidase commercialisée. Ce projet permettra ensuite de tester in vivo, à partir du modèle contrôlé, de nouveaux candidats qui auront été sélectionnés in vitro au moyen du même substrat.

Procédures

Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leurs besoins nutritionnels pendant 21 jours et ensuite pendant 7 jours avec l'aliment supplémenté. Stress et inconfort des animaux qui seront sortis de leur cage pour être pesés (< 1min) à jour 21 et à jour 28.

Impact sur les animaux

Baisse possible de la consommation alimentaire en raison de l’inappétence de l’aliment due au substrat ajouté et probablement de la diarrhée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des contenus jéjunaux

Remplacement

La procédure vise à reproduire la diversité du substrat pour être plus représentatif de la variabilité du microbiote intestinal d’un animal à un autre dans le but de développer, ultérieurement, une nouvelle muramidase qui soit active quel que soit la variabilité du substrat. Le développement du nouvel additif alimentaire implique de connaitre son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné impliquant l'utilisation d'animaux vivants.

Réduction

La procédure expérimentale mise en œuvre est une étude exploratoire. Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux adéquat pour ce projet et a été réduit à la stricte nécessité pour aborder l’objectif du projet. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter de bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale nécessaire au bien-être des animaux et d’obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post mortem seront réalisées sur les contenus intestinaux de chaque animal afin de générer le maximum d’informations possibles par animal.

Raffinement

La gestion du bien-être des animaux tout au long du projet inclut l’application de points limites spécifiques et précoces. L’inconfort et le stress dus à la sortie des cages pour la pesée en groupe des animaux sont réduits en réalisant les opérations de capture le plus silencieusement possible, par une manipulation délicate des animaux saisis au niveau du tarse juste au-dessus des doigts pour être transférés dans des contenants suffisamment grands pour éviter l’empilement et donc l’étouffement. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place au démarrage de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux se coincent les pattes dans les mailles de la grille et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture. L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, ajustement régulier de la hauteur des lignes d’eau ainsi que des ouvertures d’accès aux mangeoires en fonction de l’âge des animaux. L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (grelots scintillants), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les nouvelles muramidases qui seront ensuite testées au moyen de ce modèle sont destinés à être incorporées dans les rations alimentaires distribuées aux volailles (poulets de chair) pour faire face aux problèmes associés aux peptidoglycanes sur les processus digestifs. Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour (poids moyen 40 g). Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 21 jours. Des poulets juvéniles et jusqu’à 28 jours d’âge seront utilisés dans cette étude afin d’avoir des animaux dont le microbiote intestinal, source de peptidoglycane, soit stabilisé et donc de favoriser l’enrichissement en substrat recherché.