Procédures légères

Expédiés vers d'autres établissements, utilisés sur place ou mis à mort au titre de la gestion de l'élevage, 904 000 rongeurs, dont 901 000 souris et 3 000 rats, sont élevés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces animaux naissent immunodéficients, donc sans défense contre les microorganismes, et sont maintenus derrière des barrières sanitaires pour que cette fragilité ne se déclare pas. Une partie subit une biopsie sur animal vigile pour génotypage, et des femelles gestantes peuvent être transportées avant le dernier tiers de la gestation. Le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer ces effectifs, et renvoie au savoir-faire de l'établissement et à ses données historiques.

Objectifs

Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions particulières de propreté afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.

Procédures

Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).

Impact sur les animaux

Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

Produits sur place, dans une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat, 20 000 souris et 1 000 rats âgés de 7 à 21 jours vont être identifiés et génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né reçoit un tatouage digital ou une puce sous-cutanée, puis l'extrémité de sa queue est amputée, sans anesthésie ni analgésie locale, le porteur indiquant qu'un produit appliqué au bout de la queue serait léché par la mère. Hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère et modification du comportement liée à la douleur figurent parmi les effets indésirables reconnus, présentés comme très rares. Les animaux au génotype recherché partent en expérimentation ou en reproduction, les autres sont réorientés vers d'autres projets ou vers la formation, et ceux qui ne trouvent aucun emploi sont tués.

Objectifs

L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans notre Etablissement Utilisateur, le génotypage permettant d'identifier les animaux porteurs d'une modification génétique d'intérêt. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital ou en l’implantation d’une puce d’identification, suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal âgé de 7 à 21 jours. Cette demande d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Cette demande couvre environ une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt, à la fois pour l'élevage, la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d'organes ou de tissus pour études ex vivo. L’identification par tatouage/pucage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.

Procédures

Les animaux identifiés et génotypés sont soumis 1) à l'implantation en sous-cutané d'une puce ou en un tatouage digital ) 2) à une bisopsie du bout de la queue. L'implantattion d'une puce est réalisée une seule fois et le geste dure une dizaine de seconde. Le tatouage est réalisé une seule fois et la contention dure de 30sec à 1 min. La bisopsie de queue est réalisée une unique fois et dure 5sec.

Impact sur les animaux

le tatouage ou l'implantation d'une puce d'identification et la biopsie de queue peuvent entraîner une légère douleur. La contention de l'animal durant ces gestes peut être source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère, modification du comportement liée à la douleur.

Devenir

Les animaux ayant un génotype d'intérêt partirons en expérimentation ou seront utilisés pour perpétrer l'élevage. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt scientifique seront utilisés dès que possible dans d'autres projets ou pour formation. Les animaux ne pouvant être utilisés dans les projets, les formations ou l'élevage seront euthanasiés.

Remplacement

A ce jour, les prélèvements non invasifs à base de salive ou de poils ne permettent pas de procéder à l'identification d'animaux génétiquement modifiés de façon fiable. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements. Une erreur se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; la naissance d’animaux non viables ; l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages/puçage et la biopsie de queue.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’Etablissement et l'équipe de zootechnie établissent les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’Etablissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.

Raffinement

Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’Etablissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Sur nouveau-nés pas de médication envisagée car tout anesthésique local serait difficilement applicable au bout de la queue et serait ensuite léché par la mère, ce qui engendrerait des effets indésirables. Dans la balance bénéfice risque, ce sont les gestes maitrisés et les instruments appropriés qui sont garant du raffinement de la procédure pour limiter toute douleur, souffrance et stress. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions misent en place n'ont pas les résultats escomptés, l'équipe de zootechnie prends la décision sans délai de mise à mort d'un animal. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée avec eau et nourriture ad libitum, dans des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Ils sont hébergés en groupe sociaux avec un enrichissement adapté pour reproduire les comportements naturels (tunnel/dômes pour se refugier, pelote de bois pour la nidification, bâtons à ronger) et leur bien-être est évalué quotidiennement par des personnels formés et compétents.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le modèle rongeur. La souris et le rat représentent une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux du rongeur permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus à l’espèce humaine. Par ailleurs, les rongeurs peuvent être manipulés génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Les rongeurs sont donc des animaux sur lesquels les évaluations comportementales dans le domaine des neurosciences sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille dont l'élevage est facilement réalisable et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l'animalerie de l'unité. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 21 jours, âge où les gestes sont réalisés plus facilement et plus rapidement car la contention est plus facile. La biopsie est également plus aisée à cet âge et moins douloureuse car le cartilage n'est pas encore complètement formé. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.

Élevées en groupe dès l'éclosion, mises en reproduction à neuf mois par prélèvement de semence chez les coqs et insémination des poules, 2 394 poules et coqs subissent une à deux prises de sang dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement au sinus occipital peut provoquer des lésions cérébrales, et l'élevage prolongé en groupe entraîne du picage et des blessures cutanées, traités par des répulsifs. Ces deux lignées, sélectionnées de façon divergente sur l'efficience alimentaire et déjà très consanguines, sont maintenues pour identifier des marqueurs utiles à l'industrie avicole. 600 individus sont réutilisés dans d'autres protocoles et 1 794 restent en élevage, les reproducteurs étant tués quand leurs descendants atteignent quinze jours.

Objectifs

Le présent projet vise à poursuivre le maintien de ces deux lignées avec un nombre suffisant de familles pour limiter au maximum l'augmentation de la consanguinité, déjà très elevée, et à continuer à caractériser leurs génome, épigénome et microbiome de manière approfondie, afin d'identifier les facteurs génétiques et non génétiques qui contribuent à l'efficience alimentaire.

Bénéfices attendus

Les lignées de poules hautes et basses représentent un modèle unique pour mieux comprendre les mécanismes génétiques et non génétiques influençant l'efficience alimentaire, un caractère très important pour l'industrie avicole. Le but final des nombreux projets en cours utilisant ces lignées est d'identifier des biomarqueurs, qu'ils soient génétiques ou non génétiques, permettant une sélection des animaux les plus efficaces, sans nécessiter de mesures individuelles de consommation. L'étude de ces lignées permet également de mieux comprendre l'impact de la sélection sur l'efficience alimentaire en ce qui concerne d'autres caractères, tels que la capacité reproductive et la réponse immunitaire, ainsi que les mécanismes d'allocation des ressources entre les différentes fonctions biologiques.

Procédures

Une à 2 prises de sang de 1 à 1.5 mL d'une durée de moins d'une minute

Impact sur les animaux

L’élevage en groupe peut entraîner des comportements agressifs. Ces comportements présentent des risques inhérents de picage entre les animaux, ce qui peut causer des blessures cutanées de gravité diverse. Les comportements de domination sont généralement plus fréquents jusqu'à ce que l'ordre social soit rétabli. Dans les élevages de longue durée comme celui-ci, une détérioration de l'état général de certains individus peut également être observée, les causes n'étant parfois déterminées qu'après une autopsie. La prise de sang peut également entraîner la formation d'un hématome, et si elle est réalisée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent survenir. Une attention particulière sera apportée lors des contentions et des manipulations des animaux que ce soit pour la réalisation des prises de sang ou les actes de reproduction, prélèvements des mâles et inséminations des femelles.

Devenir

Nous utilisons les individus pour permettre la production d'une descendance. Les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de pouvoir les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus des lignées R+ et R-(Envviron 25% des animaux sont réutiliés).

Remplacement

Ce projet vise à maintenir une population d'animaux vivants divergents sur l’effcience alimentare. La complexité du déterminisme de ce caractère nécessite une approche globale (voies métaboliques impliqués/régulation genique/control epigenetique/microbiote) et ne peut donc être abordé que par une approche sur les animaux.

Réduction

Pour conserver la variabilité génétique des lignées et gérer la consanguinité, il est nécessaire de disposer d'un nombre suffisant de familles et de procéder à des accouplements contrôlés. Les effectifs animaux mis en place au début de l'expérimentation permettent de garantir un nombre d'adultes suffisant pour maintenir la variabilité intra- et inter-lignées, tout en limitant la consanguinité et la dérive génétique. Des essais de reproduction utilisant de la semence congelée ont été menés indiquant que l'utilisation de la semence congelée ne constitue pas une stratégie de préservation viable pour ces lignées.

Raffinement

Dès l'éclosion, les animaux sont élevés en groupe tout au long de leur vie. Les cages collectives hébergeant les poules seront équipées de divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques et des bandelettes de tissu pour stimuler le jeu. Les coqs, hébergés dans des parquets au sol, bénéficieront également de divers enrichissements, comme des perchoirs et des blocs à picorer . Pour prévenir le picage, des répulsifs antipicage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision, destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite), a été développé et sera fourni aux animaliers en charge du suivi des animaux. Raffinement du prélèvement sanguin : Dans le cas de la prise de sang au niveau du sinus occipital, afin de réduire les risques de lésions cérébrales associées à cette procédure, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur l'aiguille pour éviter tout enfoncement excessif. La facilité de visualisation de ce site d'injection évitera l'arrachage douloureux des plumes pour les animaux. Une compression de 30 à 60 secondes sera effectuée pour limiter la formation d'hématomes. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour assurer une contention appropriée pendant la prise de sang, limitant ainsi les mouvements erratiques des animaux susceptibles de perturber le prélèvement. Les personnes chargées du prélèvement sanguin au sinus occipital recevront une formation spécifique à cette procédure et seront expérimentées, garantissant la fluidité des gestes. Pour la prise de sang effectuée à la veine alaire, de l'alcool à 70 % sera appliqué pour désinfecter la zone de prélèvement et profiter de ses propriétés vasodilatatrices, facilitant ainsi la ponction. De plus, un point de compression sera réalisé et deux expérimentateurs seront mobilisés.

Choix des espèces

Le projet vise à conserver les lignées qui sont un modèle de choix pour étudier les mécanismes impliqués dans l'utilisation de l'énergie ingérée chez la poule pondeuse et l'allocation des ressources entre les fonctions biologiques. La complexité du déterminisme de ce caractère nécessite une approche globale et ne peut donc être abordée que par une étude sur les animaux. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 9 mois, moment auquel ils seront mis en reproduction pour produire les poussins de la génération suivante. Lorsque leurs descendants auront 15 jours d’âge, ces reproducteurs seront euthanasiés.

50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 5 âgées de 75 à 85 semaines, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs oreilles. Chaque animal reçoit sous anesthésie une blessure à l'emporte-pièce dans l'oreille, dont la cicatrisation est suivie jusqu'à 21 jours, certains subissant en plus trois injections intrapéritonéales puis une saignée partielle avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le projet cherche à établir le rôle de cellules immunitaires appelées basophiles dans la réparation de la peau, avec l'espoir lointain de traiter des plaies chroniques. Pour arriver à cinquante individus, le porteur compte chaque oreille comme un "individu unique" et divise ainsi par deux l'effectif déclaré.

Objectifs

Une mauvaise cicatrisation de la peau accroit les risques d’infection et de formation excessive de tissu cicatriciel. Ce problème est fréquent chez les personnes âgées. Il y a un réel besoin de comprendre comment les tissus et le système immunitaire interagissent pour contrôler les différentes étapes de la cicatrisation. La cicatrisation est contrôlée en partie par des cellules immunitaires résidentes de la peau : les macrophages. Normalement, ces macrophages réparent les tissus et les nettoient de leurs cellules mortes : ils sont appelés «M2». Lors d’une blessure, ils perdent ce statut et deviennent inflammatoires : ils sécrètent des molécules qui tuent les microbes mais qui occasionnent également des dommages collatéraux au tissu environnant. Une bonne réparation du tissu nécessite donc que les macrophages redeviennent «M2». Les basophiles sont des cellules immunitaires sanguines capables de sécréter des molécules favorisant la transformation des macrophages de la peau en macrophages M2. Des expériences préliminaires nous ont permis d’observer que des basophiles infiltraient la peau pendant les 3 premières semaines du processus de cicatrisation. Cela nous laisse penser que les basophiles ont un rôle à jouer dans la cicatrisation. Le but de ce projet est de déterminer les conséquences de la sécrétion de molécules pro-«M2» par les basophiles sur les macrophages au cours des différentes phases de la cicatrisation. Pour ce faire nous allons déléter spécifiquement les basophiles ou les molécules qu’ils sécrètent in vivo sur des souris adultes ou âgées, et observer l’évolution de la cicatrisation, de l’inflammation cutanée, et de l’activation des leucocytes de la peau. Cela permettra d’affiner notre connaissance du contrôle qu’exerce le système immunitaire sur la cicatrisation, et ainsi de mieux comprendre pourquoi la cicatrisation peut être défectueuse afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour faciliter la cicatrisation de personnes âgées.

Bénéfices attendus

La finalisation de ce projet nous permettra de démontrer formellement que les basophiles favorisent la résolution de l’inflammation et la cicatrisation de la peau dans un contexte sain mais également dans le cadre du vieillissement. Ces avancées fondamentales pourront permettre d’imaginer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la cicatrisation des plaies chroniques, qui sont un enjeu clinique majeur du 21eme siècle.

Procédures

Les animaux seront bléssés aux oreilles par un punch stérile sous anesthésie générale. La cicatrisation de leur blessure sera ensuite observée pendant de 1 à 21 jours. Certains animaux subieront trois injections péritonéales . De plus, parmi ces animaux, certains subieront une injection intravasculaire sous anesthésie, en présence d'un collyre antalgique, avant de subir une exsanguination partielle et d’être sacrifiés par dislocation cervicale toujour sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Des expériences précédentes nous ont permis d’observer que les biopsies d’oreilles ne s’infectaient quasiment jamais et n’induisaient pas de phénotype dommageable. Nous n’avons pas observé non plus de signes de démangeaisons et pensons qu’il s’agit du modèle le moins invasif possible pour étudier la cicatrisation de la peau chez la souris. Cependant, il existe un risque très rare que les oreilles des souris développent une légère infection au niveau de la blessure, qui semble associée à des combats ou des grattages importants. Notre expérience d’injection intrapéritonéale de toxine diphtérique chez la souris nous a montré qu’aux doses utilisées il n’y avait aucun effet détectable sur la santé ou le comportement des souris. L’injection intraveineuse pour le marquage intravasculaire est très bien décrit, nous l’avons déjà utilisé sans que cela n’ait entrainé un phénotype détectable chez les animaux. Il s’agit d’une procédure sous anesthésie sans réveil.

Devenir

Les analyses prévues nécessitent la mise à mort des animaux pour leur prélever leur sang et/ou leurs oreilles.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer ces animaux pour étudier le rôle des basophiles dans la cicatrisation cutanée. Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. De plus les basophiles sont des cellules circulant dans le sang. Il est donc impossible de remplacer l'étude la cicatrisation in vivo par l'étude de la cicatrisation d'explants de peau.

Réduction

L’étude de la cicatrisation au niveau de l’oreille nous permet de considérer chaque oreille comme un « individu unique » afin de diviser par deux le nombre d'animaux nécessaires. Une analyse de la puissance statistique nous apprend que la comparaison de groupes de quatre oreilles peut nous permettre d'observer une variation moyenne de 50% avec une puissance de 84%. Répéter chaque expérience une deuxième fois nous permettra de confirmer nos observations, de regrouper nos résultats et d’observer une variation moyenne de 30% avec une puissance de 80%, ce qui semble suffisant pour représenter un effet biologique concret. Il est nécessaire de rajouter une marge de 10% sur le nombre d’échantillons afin d’éviter toute place du hasard dans notre évaluation statistique. Ainsi il apparait que l’utilisation de groupes de 10 oreilles soit 5 individus serait optimale pour étudier nos variables d’intérêt. Nous estimons que cette analyse est également valable pour les individues agés.

Raffinement

Nous pouvons étudier la cicatrisation en réalisant une biopsie stérile de 2mm de diamètre sur l’oreille des souris. Cette procédure légère est couramment utilisée pour identifier les animaux en animalerie, ou pour faire des microprélèvements de peau humaine. Dans le but d’éviter de générer toute forme de douleur, cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale. La cicatrisation (inflammation, réépithélialisation, revascularisation, fibrose), le recrutement et le profil des basophiles et des macrophages et leur sécrétion de molécules peuvent être facilement observés par différentes techniques. Des modèles de souris modifiées au niveau des basophiles (déficientes ou dont les basophiles ne peuvent exprimer certains facteurs) permettront d’apporter des réponses précises à nos hypothèses en évitant d’utiliser des méthodes invasives. Les prélèvements de sang se feront uniquement post-mortem, avant de prélever d’autres organes. Nous étudierons l’influence des basophiles sur les 3 premières semaines de cicatrisation de la peau. Les interventions expérimentales sur animaux vivants se limiteront à l’administration quotidienne (orale ou intrapéritonéale) de traitements connus à des doses inoffensives, pour au maximum quatre jours consécutifs. Le bien-être de tous les individus sera relevé quotidiennement pendant ces traitements à l’aide d’une grille d’évaluation incluant une mesure de poids, l’observation de la posture (prostration, poil hérissé) du comportement et de l’évolution de la plaie. Ces différentes observations nous permettrons de déterminer le point-limite entrainant l’arrêt des expérimentations pour les individus concernés. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, et leurs organes analysés. Aucun traitement induisant la mort ou une souffrance soutenue de l’animal n’est prévu dans le présent projet. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Ils sont élevés en conditions standardisées en accord avec la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons de nidification ou tunnels en plastique) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Même si aucune des procédures ne doit induire de souffrance/mal-être manifeste de l’animal, en cas d’observation de tels signes les animaux concernés seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’utiliser des modèles animaux génétiquement modifiés qui nous permettent d’étudier le rôle du basophile in vivo. Ceux-ci n’existent qu’en modèle murin. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines (45 individus). 5 animaux seront utilisés âgés car l’intérêt de l’étude et d’observer le rôle des basophiles dans le défaut de cicatrisation associé au vieillissement (de 75 à 85 semaines).

Vérifier qu'un lot de suspension bactérienne destiné à un vaccin contre la toux des chenils est bien inactivé : 100 jeunes souris femelles sevrées vont être utilisées pour ce contrôle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit sur animal vigile une injection intrapéritonéale unique de 0,5 ml, puis reste hébergée en confinement, ce qui exclut toute adoption comme toute réutilisation, et aucune ne sort vivante du test. L'établissement indique qu'aucune méthode sans animaux ne permet aujourd'hui de démontrer cette inactivation et que le contrôle est réclamé par les autorités australiennes, à qui il attribue un caractère de "stricte nécessité". Le chiffre de dix souris par lot testé figure dans le permis d'importation et n'est, selon le porteur, pas modifiable.

Objectifs

Vérifier que la totalité des particules bactériennes a bien été inactivée au cours du procédé de fabrication de la suspension Bordetella bronchiseptica. Il est obligatoire de s’assurer qu’un produit biologique (Bordetella bronchiseptica) ne présente aucun risque avant sa mise sur le marché. La réglementation encadre la production et le contrôle qualité des produit biologique exigeant des preuves solides d’inactivation des agents pathogènes. A ce jour aucune méthode alternative (vitro) n’existe pour démontrer l’inactivation du produit. Seule l’utilisation sur souris permet de vérifier cette inactivation.

Bénéfices attendus

Garantir l’inactivation de la suspension vaccinale Bordetella bronchiseptica qui servira à formuler le vaccin Toux des Chenils et ainsi sa commercialisation

Procédures

Une administration ponctuelle et unique par voie voie intrapéritonéale de 0,5 ml par animal d’une durée de 3 à 5 secondes

Impact sur les animaux

Une injection par voie intrapéritonéale est réalisée sur l’animal vigile au cours du test. Cette injection, réalisée par du personnel formé et compétent entraîne une douleur légère chez la souris.

Devenir

Les animaux sont hébergés en pièce de niveau de confinement permettant de garantir la sécurité du personnel vis à vis d’une éventuelle non inactivation de la suspension vaccinale De ce fait, aucun animal ne pourra être réutilisé ou mis à l’adoption.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucune méthode alternative. Les contrôles sont demandés par les Autorités Australiennes. Ils ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacés par d'autres stratégies ou méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d’animaux est défini dans le permis d'importation de la suspension vaccinale Bordetella bronchiseptica (10 souris par lot de vaccin testé) et n’est pas modifiable. Nous prévoyons 2 lots de vaccins par an soit 100 souris au total sur 5 ans. Le personnel est formé permettant la reproductibilité et la robustesse du test afin d’éviter au maximum des nouveaux contrôles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe. Toutes les conditions environnementales (taille des cages, alimentation, eau, enrichissement etc…) sont adaptées à l’espèce. Les installations sont suivies en températures, hygrométrie et les animaux sont hébergés à l‘aide de portoirs ventilés. Toute anomalie sur les installations est directement remontée à un poste de garde (24/h/24h) permettant une intervention rapide y compris les weekend. Les animaux sont observés quotidiennement de la réception jusqu’au terme du test. Une période d’acclimatation de 4 jours minimum est mise en place avant le début du test. Aucun effet indésirable n'est attendu dans cette procédure, cependant des points limites spécifiques et précis sont mis en place afin d'éviter toute souffrance aux animaux.

Choix des espèces

Selon la réglementation australienne, les essais sont réalisés sur de jeunes souris femelles sevrées.

50 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, alors qu'elles sont âgées de 7 à 12 jours. Chaque animal, maintenu en contention et sans anesthésie, subit un tatouage par perforation des phalanges ou des coussinets puis l'amputation de l'extrémité de la queue. Ce tri alimente douze autres projets, et les souris dont le génotype ne convient à rien sont tuées dès le sevrage, les autres partant en expérimentation, en formation ou en reproduction. Le porteur affirme que les prélèvements de salive ou de poils ne permettent pas un génotypage fiable sur les équipements robotisés et conclut qu'il est "indispensable" de recourir à la biopsie de queue.

Objectifs

Il y a 12 projets qui pourront être réalisés avec cet élevage. L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans l’établissement utilisateur. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal vigile âgé de 7 à 12 jours. Cette demande d'autorisation de projet d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demande d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour • la formation, • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo (hors champ de demande d'autorisation de projet). Les animaux dont les génotypes ne conviennent pas pour les projets expérimentaux soumis, et n’étant pas utilisés pour les prélèvements post mortem, pour les activités d’élevage ou encore pour la formation seront mis à mort.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.

Procédures

Tous les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs consécutifs : 1/ l'identification par tatouage digital : 1 fois – durée : quelques secondes 2/ la biopsie de queue : 1 fois – durée : quelques secondes Cette procédure est réalisée sur animal vigile.

Impact sur les animaux

La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage par perforation des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les 2 actes et donc tout au long de la procédure, ce qui est une source de stress. En de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : - une hémorragie - un rejet du nouveau-né par la mère - une modification du comportement liée à la douleur

Devenir

Tous les animaux ne sont pas maintenus en vie à la fin de la procédure. Après le génotypage, leur sort est déterminé en fonction des résultats et des besoins spécifiques des projets : 1/ Animaux correspondant aux génotypes requis : Ils sont sélectionnés pour des projets spécifiques, pour des activités de formation ou pour le maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP). Ils peuvent être conservés pour l’entretien des colonies de reproduction si nécessaire. 2/ Animaux ne répondant pas aux besoins des projets : Ils sont mis à mort pour des prélèvements de tissus post-mortem. En l’absence de possibilité d’utilisation, ils sont mis à mort dès le sevrage. Ces décisions sont prises dans le respect des objectifs scientifiques et des principes d’éthique animale, tout en optimisant l’utilisation des ressources biologiques disponibles.

Remplacement

A ce jour, les prélèvements non invasifs à base d’écouvillons salivaires ou de follicules pileux ne permettent pas de procéder au génotypage de façon fiable sur les équipements robotisés. Un doute sur les résultats des génotypages conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements et génotypages. Une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; - la naissance d’animaux avec des phénotypes potentiellement délétères ; - l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’établissement utilisateur établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’établissement utilisateur. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.

Raffinement

Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie . Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Aussi, il existe des souris transgéniques permettant d'invalider certains gènes d’intérêt. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 12 jours. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.