Procédures légères

Amenés depuis un autre établissement le matin et ramenés le soir même, 12 chiens, 12 porcs et 12 brebis sont anesthésiés le temps d'une séance de scanner, à laquelle s'ajoutent 12 lapins hébergés sur place. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et aucun des 48 animaux n'est tué dans le cadre de ce projet. Les lapins peuvent recevoir une anesthésie par jour pendant sept jours, pour un maximum de cinq scanners corps entier ou dix scanners ciblés, avec injection possible d'un produit de contraste. L'étude sert à préparer d'autres projets, ceux qui évalueront des candidats médicaments, et à l'issue les chiens, porcs et brebis repartent vers de nouvelles procédures expérimentales, quatre lapins seulement étant proposés à l'adoption.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la faisabilité, la plus-value et les bénéfices scientifiques et/ou éthiques (réduction du nombre d’animaux nécessaire) de l’imagerie scanner dans différents projets relatifs à des aires thérapeutiques différentes : cardio-vasculaire, maladie de l’os et du cartilage, implants, … Ainsi, ce projet servira d’étude pilote afin de tester la faisabilité de l’imagerie (répondre à la question est-il possible de visualiser et/ou quantifier l’organe/tissu cible ?) et tester différents protocoles d’imagerie (injection ou non de produit de contraste, temps d’acquisition, paramètres scanner…) permettant d’obtenir des acquisitions optimales nécessaire pour répondre à l’objectif scientifique des études principales. La réalisation de scanner pourra être réalisé sur 4 espèces en fonction des besoins scientifiques des études principales : chez le lapin, la brebis, le porc ou le chien. Les résultats obtenus permettront d’intégrer de l’imagerie scanner ultérieurement dans le cadre d’étude précliniques d’évaluation de candidats médicaments. Les études principales cités ci-dessus feront l’objet de demande d’autorisation de projet spécifique pour chacune d’entre elles. Les animaux seront fournis par un second EU. Il s'agit donc d'un projet multisite qui se déroule sur 2 EU différents.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à évaluer si l’utilisation de l’imagerie scanner dans des études d’efficacité de nouveaux médicaments / d’implants, de tolérance locale, … peut-être avantageuse afin de répondre à des objectifs précis sans avoir recours à l’euthanasie des animaux à chaque délai et donc en réduisant ainsi le nombre d’animaux inclus dans ces études. Ce projet permettra également de valider l’utilisation de l’imagerie scanner en tant que méthode d’analyse précise et robuste dans les études principales d’efficacité.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 session d’imagerie scanner pour les porcs, brebis et chiens et au maximum 1 session d’acquisition scanner sera réalisé par jour pendant 7 jours pour les lapins (1 session d’imagerie correspond à une anesthésie mais pouvant servir à la réalisation de plusieurs acquisitions scanner dans la foulée pour tester différents paramètres). Au maximum, durant toute l’étude, 5 scanners corps entier pourront être réalisés ou 10 scanners ciblés sur une région afin de minimiser la dose d’irradiation reçue. Une session d’imagerie (anesthésie comprise) durera en moyenne entre 20 et 45 minutes (maximum 1 heure).

Impact sur les animaux

Les brebis, porcs et chiens seront transportés vigiles entre leur EU d’origine et notre EU. L’aller-retour se fera dans la même journée. Ces transports peuvent être une source de stress. Les brebis, porcs et chiens seront mis à jeun avant l’examen scanner. Les animaux recevront une anesthésie en fixe (chien, porc et brebis) ou gazeuse (lapin) afin de réaliser l’imagerie scanner pouvant induire un stress. Lors de cette même anesthésie, un produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observé dans les quelques jours suivant l’anesthésie.

Devenir

Les animaux ayant simplement été utilisés pour des actes d’imagerie non invasives (n’étant pas infectés ou traités avec un traitement pouvant causer des effets secondaires à long terme), les animaux pourront être, après une période de réhabilitation, réintégrés dans une nouvelle procédures expérimentales. Pour les lapins, certains d'entre eux pourront être proposés à l'adoption.

Remplacement

Au cours de ce projet, l'objectif sera de tester la faisabilité de l’imagerie (répondre à la question est-il possible de visualiser et/ou quantifier l’organe/tissu cible ?) chez le lapin, la brebis, le porc ou le chien. Il n'existe donc pas actuellement de méthodes alternatives permettant de modéliser un corps entier ou certains organes/tissues en imagerie scanner afin de tester différents paramètres d'imagerie (paramètres scanner, injection ou non de produit de contraste, ...). L'utilisation d'animaux dans cette procédure expérimentale est donc nécessaire.

Réduction

Le recours à l’imagerie médicale par scanner (CT) permet de suivre, au cours du temps, les mêmes animaux sans avoir à les euthanasier pour réaliser des analyses histologiques par exemple. Ce projet permettra donc à terme, grâce au recours au scanner, de diminuer le nombre d’animaux inclus dans les études d’efficacité finales. L’objectif de ce projet, étant de mettre au point et de tester des protocoles expérimentaux permettant d’obtenir des images scanner exploitables pour répondre à des objectifs scientifiques d’autres projets, entre 1 et 3 animaux par étude seront utilisés (au maximum 12 lapins, 12 brebis, 12 porcs et 12 chiens). Sauf en cas d’atteintes des points limites, les animaux ne seront pas euthanasiés à l’issu de ces actes d’imagerie et seront retournés dans leur établissement d’origine pour les porcs, brebis et chiens. Pour les lapins, ils seront, autant que possible, inclus dans d’autres protocoles expérimentaux ou utilisés dans le cadre de la formation du personnel et/ou adoptés selon la procédure mise en place au sein de notre EU.

Raffinement

Pour les lapins, une période d’acclimatation de 7 jours à minima sera respectée. Ces animaux seront hébergés en groupes, en parc, pendant toute la durée de l’étude (sauf exception : bagarre ou blessure justifiant un isolement de l’animal sur recommandation du vétérinaire) avec des enrichissements appropriés tels que des bâtonnets de bois à ronger, du foin, des balles, une plateforme et cachette. Ils seront suivis quotidiennement afin de détecter précocement tout signe clinique anormal et ainsi mettre en place rapidement des mesures de soutien (désinfection de plaies, isolement, réhydratation …) ou mise à mort en cas d’état clinique irréversible. Les lapins seront pesés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de leur poids. La fréquence des pesées pourra être augmentée suivant l’état clinique des animaux et le nombre d’actes d’imagerie réalisé par animal. Une évaluation clinique des animaux sera basée sur différents critères adaptés à l’espèce. Pour les espèces: brebis, porcs et chiens, un transport sera organisé dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur entre les deux EU. Des tapis anti-dérapants seront mis en place. Un contrôle clinique de chaque animal sera réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l’arrivée. Afin de limiter le stress des animaux, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l’anesthésie pour les acquisitions scanner, et entre le réveil des animaux et le transport retour. Du gel oculaire de type vaseline ou Ocrygel sera appliquée au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux afin d’éviter tout assèchement oculaire. Une attention particulière sera portée à la lutte contre l’hypothermie : température de la salle, l’animal est placé sur le sol équipé d’un isolant avec des couvertures si besoin. Des lampes chauffantes seront rajoutées si nécessaire. En cas de doute, une mesure de la température rectale sera réalisée.

Choix des espèces

Les espèces (lapins, brebis, porcs et chiens) seront utilisés au stade adulte (à partir de 10 semaines pour les lapins, 4 mois pour les porcs et 12 mis pour les brebis et chiens). Les espèce et les stades de développement ont été choisies en fonction des espèces et des stades de développement qui seront utilisées à la suite de ce projet pour évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. L’adéquation entre les espèces et leur stade de développement de l’étude de mise au point et les études principales d’efficacité ultérieures est indispensable pour éviter tous biais expérimentaux.

Capturés à la main, glissés dans un sac opaque pendant cinq minutes au plus, mesurés, puis amputés de cinq à dix millimètres de queue aux ciseaux, 200 geckos verts poussière d'or sont relâchés sur place dans un délai de quinze minutes. Le niveau de souffrance déclaré est léger et aucun individu n'est tué. Le projet documente la reproduction de cette espèce invasive pour calibrer les efforts de lutte contre elle, au bénéfice d'un gecko endémique menacé. Chaque animal peut être repris jusqu'à vingt-quatre fois au cours de l'étude, sans que le résumé précise combien de prélèvements de queue un même gecko peut subir.

Objectifs

Le gecko vert poussière d’or (Phelsuma laticauda) est une espèce invasive qui pourrait menacer la survie des populations du gecko endémique qui est une espèce menacée. Le projet de recherche vise à (1) estimer les impacts que représentent le gecko vert invasif pour le gecko endémique (ex : compétition directe, indirecte…) et (2) à améliorer la connaissance des paramètres démographiques de l’espèce invasive impliqués dans le processus d’invasion. Ces informations sont cruciales pour améliorer la gestion de cette invasion, et ainsi la conservation du gecko endémique. Le projet global comprend ainsi l’étude 1) des mécanismes et des interactions qui pourraient conduire au déclin du gecko endémique et 2) des caractéristiques démographiques (dispersion, survie, effort reproductif, croissance) impliquées dans cette invasion biologique. La procédure expérimentale présentée ici permettra d’acquérir, à partir des individus issus de deux populations naturelles, des données sur le cycle de la reproduction et l’effort reproductif du gecko Phelsuma laticauda en milieu naturel. Ces informations permettront de mieux comprendre la dynamique de population, de modéliser l’évolution des effectifs et pourra aider à calibrer les efforts de lutte nécessaires au contrôle de cette espèce. La procédure expérimentale faisant l’objet de cette demande concerne la capture d’individus de Phelsuma laticauda issus du milieu naturel, la prise de données biométriques, des prélèvements ADN et la relâche des individus.

Bénéfices attendus

Ce projet répond à des préoccupations urgentes de conservation des populations de P. inexpectata et de gestion de P. laticauda. Il entre dans le cadre des stratégies de gestion nationales et locales de la biodiversité. En effet, les actions proposées ici correspondent ou contribuent à plusieurs des actions du Plan National d’Action en faveur du gecko endémique, notamment des actions d’études. En outre, ce projet s’inscrit dans les stratégies de gestion des espèces invasives au niveau local

Procédures

Un prélèvement de tissu caudal de 5 à 10 mm est effectué aux ciseaux puis conservé en alcool en vue d’analyses génétiques ultérieures. Ce type de prélèvement biologique est classiquement utilisé pour les lézards est bien toléré par les geckos du genre Phelsuma. Chez ces espèces, la perte de la queue est fréquente ; l’autotomie de cette partie du corps est considérée comme un mécanisme anti-prédation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables identifiés sur les animaux sont les suivants : stress lié à la capture et aux manipulations, mobilité réduite lors de la contention, perte (minime) de poids et section de la queue lors de la capture/manipulation.

Devenir

Les individus seront tous remis en liberté sur le site de prélèvement pour éviter toute désorientation dans un délai maximum de 15 minutes après leur capture.

Remplacement

L’impossibilité de remplacement de l’étude des individus de P. laticauda par une autre espèce est inhérente aux questions scientifiques posées. L’utilisation d’individus capturés en milieu naturel est nécessaire pour définir le cycle de reproduction de cette espèce in situ. La capture est indispensable pour l’obtention des indicateurs et estimateurs attendus pour répondre à la question scientifique

Réduction

Notre échantillonnage sera réalisé sur deux populations. Sur la base de suivis de populations préliminaires, nous estimons qu’un maximum de 100 individus différents par population pourront être échantillionés sur la durée de l’étude. Au regard de ces estimations et de la capturabilité de l’espèce, nous estimons être en capacité de capturer entre entre 10 et 30 individus/mois et par population. Les populations étant échantillonnées mensuellement, certains individus seront donc capturés plusieurs fois au cours de l’étude. Sur la durée de l’étude, nous estimons un nombre maximum de 100 individus différents par population feront l’objet de captures, manipulations (mesures biométriques) et prélèvements (ADN), pour ce projet. Les chiffres estimés étant des maximums, ils pourraient être inférieurs, car fonction des geckos détectables et capturables lors des journées d’échantillonnage. Le nombre d’individus capturés n’excédera pas 100 individus par population, soit 200 individus au total. Chaque individu sera capturé de 1 à 24 fois, en fonction de sa probabilité de recapture. Cet effort permettra de détecter la variabilité de la distribution temporelle des variables étudiées

Raffinement

Une attention particulière est portée à la réduction du stress et de la détresse des individus manipulées durant toutes la procédure expérimentale. Fort de l’experience acquise dans la manipulation (captures + mesures + prélèvements) de Phelsuma, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place. Les manipulations (capture manuelle et mesures biométriques) seront effectuées par des personnes ayant déjà conduit ce type d’expérimentation sur le genre Phelsuma. La réalisation de la procédure par deux personnes en tandem permet d’augmenter l’efficacité de l’opération, et ainsi de réduire le temps de manipulation, et par conséquent le stress de l’animal. Afin de réduire le stress des individus pouvant suivre leur capture, les individus sont placés pour une durée maximale de 5 minutes dans un sac de capture opaque (procédure classiquement utilisé chez les geckos). Les individus sont ensuite délicatement sortis pour les manipulations. Les individus présentant des signes de fatigue post-capture et/ou pré-relâche seront mis dans des conditions (calme, obscurité, fraicheur …) favorisant un état permettant leur relâche. Les mesures et prélèvements se dérouleront dans un environnement approprié (à l’ombre, pas de perturbation, absence de bruit…). Afin d’anticiper la gêne occasionnée pour la manipulation et le prélèvement de tissu, il sera proposé aux individus des aliments sucrées (banane, eau sucrée, miel …) sur les supports de relâche. Lors de la relâche, en cas de disfonctionnement des lamelles sous digitales permettant l’adhésion au support (pouvant être lié au stress), les geckos seront accompagnés manuellement sur leur

Choix des espèces

La caractérisation du cycle de la reproduction de l’espèce repose sur l’études des individus. Par définition, il n’est pas possible d’étudier une autre espèce pour mettre en place ce travail. A ce jour, l’obtention d’ADN ne peut être réalisé sans prélèvements de tissus directement issus d’individus Sur la base de suivis de populations préliminaires, nous estimons qu’un maximum de 100 individus différents par population pourront être échantillionnés sur la durée de l’étude. Au regard de nos estimations et de la capturabilité de l’espèce sur ces sites, nous estimons être en capacité de capturer entre entre 10 et 30 individus/mois et par population. Les captures mensuelles intègrent des recaptures d’individus préalablement capturés. Sur la durée de l’étude, nous estimons un nombre maximum de 100 individus différents par population feront l’objet de captures, manipulations (mesures biométriques) et prélèvements (ADN), pour ce projet. Les populations étant échantillonnées mensuellement, certains individus seront donc capturés plusieurs fois au cours de l’étude. Les chiffres estimés étant des maximums, ils pourraient être inférieurs, car fonction des geckos détectables et capturables lors des journées d’échantillonnage. Afin de répondre aux objectifs de l’étude, à savoir définir la taille à maturité sexuelle et caractériser la distribution et l’effort annuel de la reproduction de cette espèce, deux sites seront étudiés, l’un comprenant à la fois le gecko endémique et le gecko invasif, et l’autre comprenant uniquement l’invasif. Pour chaque site, un maximum de 100 geckos (individus différents) sera donc capturé sur la durée de l’étude. Nous ciblons un minimum de 60 individus adultes différents par site afin d’obtenir des résultats exploitables. Cet échantillonnage permettra d’obtenir des estimateurs suffisamment robustes pour décrire phénologie de la reproduction de cette espèce dans les populations étudiées.

Aucun des 30 veaux ne meurt dans le cadre de ce projet : tous partent vers un autre laboratoire, où ils seront infectés par des pathogènes respiratoires. L'établissement qui dépose ce résumé se charge de les élever et de vérifier qu'ils sont indemnes, avec deux prises de sang et deux prélèvements de fèces avant leurs 30 jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement de fèces passe par l'introduction d'un doigt dans le rectum quand l'animal ne défèque pas de lui-même. Le porteur conclut qu'aucun système in vitro ne reproduit l'interaction entre pathogènes, microbiote et mucus respiratoire, et qu'il est donc "nécessaire" de recourir à des animaux vivants.

Objectifs

Le complexe respiratoire bovin est d’une grande importance en France et dans le monde en raison de son impact sur la santé et le bien-être animal, ainsi que des pertes économiques que son infection peut enegendrer. La couche de mucus des voies respiratoires constitue une barrière physique, contenant un riche écosystème microbien qui contribue à prévenir l’invasion et à faciliter l’élimination des pathogènes. L'objectif du projet est d’étudier les mécanismes de régulation des voies respiratoires chez les veaux, ainsi que leur réaction face à une infection et à un traitement antibiotique précoce. Pour ce qui concerne notre établissement utilisateur, l'implication dans le projet se limite à la fourniture de veaux sains, pour la réalisation de l'expérimentation au sein de l'unité porteuse du projet, qui a déposé une demande auprès de son comité d'éthique local.

Bénéfices attendus

Extrait de la déclaration faite par l'unité porteuse du projet : "Le projet présente trois aspects novateurs principaux. Premièrement, nous identifierons des biomarqueurs microbiens et glycomiques liés à la réponse, à la récupération ou à la résilience à l'infection respiratoire et à l'administration d'antibiotiques. Cela complétera les mesures standard telles que la vaccination, les mesures de biosécurité, une alimentation et une hygiène correctes, le contrôle des vecteurs et des soins vétérinaires réguliers. Deuxièmement, les biomarqueurs glycomiques seront évalués in vitro et ex vivo, par exemple en validant les capacités de liaison des virus aux glycanes et la transmissibilité inter-espèces. Ce type d'information n'existe pas aujourd'hui pour les pathogènes du bétail. Troisièmement, les observations comportementales et les capteurs de surveillance du bien-être ouvriront la voie à de nouveaux types de biomarqueurs de détection précoce des maladies. Au-delà des aspects susmentionnés, les biomarqueurs glycanniques et microbiens recueillis auprès d'individus résilients ouvriront la voie à la création de glycanniques ayant un effet prébiotique et à l'assemblage de consortiums synthétiques qui seront testés en vue d'une utilisation probiotique de nouvelle géneration."

Procédures

Les animaux seront soumis à deux prises de sang et deux prélèvements de fèces (à l'âge de 5-8 jours et juste avant leur transport vers 30 j). L'ensemble des prélèvements n'excédera pas 5 min par animal.

Impact sur les animaux

Au sein de notre établissement utilisateur, les prélèvements effectués sur les animaux pour tester leur séronégativité au virus de l'Influenza D, au Corona virus et au Mycoplasma Bovis sont suscpetibles d'engendrer un stress ou une douleur ponctuels liés à l'introduction de l'aiguille pour la prise de sang et à l'introduction d'un doigt au niveau du rectum dans le cas où les fèces ne pourraient être récupérés suite à défécation naturelle de l'animal.

Devenir

Les animaux qui auront subi les prélèvements sur notre établissement utilisateur sont destinés à être utilisés en expérimentation au sein de l'unité porteuse du projet.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro capable de simuler fidèlement l’interaction complexe entre les pathogènes respiratoires, le microbiote et les mucines respiratoires. Les cultures in vitro ne permettent pas de reproduire les conditions nécessaires pour l’étude des virus, des mycoplasmes et de l’ensemble des microorganismes et mucines du système respiratoire. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux vivants pour ce projet.

Réduction

Un effectif de 7 veaux par lots expérimentaux assure la faisabilité de l’étude tout en permettant d’obtenir des données statistiques robustes pour observer un effet potentiel. Deux veaux supplémentaires seront également élevés pour pallier un éventuel problème (détection d'infection notamment). Cette stratégie s’appuie sur les données d’une étude précédente, dans laquelle un modèle de coinfection Influenza D-Mycoplasma bovis avait été utilisé sur de jeunes veaux. Malgré une variabilité individuelle notable dans la réponse clinique, un effectif de 5 animaux avait suffi à démontrer des différences significatives par rapport à des veaux témoins non infectés. De plus, les données virologiques et bactériologiques s'étaient révélées relativement homogènes entre les individus, offrant une corrélation directe avec la pathogénicité dans l’appareil respiratoire profond. Par sécurité, nous avons choisi d'inclure 2 veaux supplémentaires par lot afin de pallier d'éventuelles exclusions d'individus pour des raisons sanitaires (infections intercurrentes) ou éthiques (atteinte des points limites).

Raffinement

Les conditions de logement de leur naissance à leur transport sont les conditions de logement "normales" des veaux issus du troupeau de notre établissement utilisateur. Rapidement, les veaux, après leur naissance et après distribution du colostrum, sont placés en niche individuelle pendant 5 à 7 jours. La conception des niches permet le contact visuel et olfactif entre animaux, tout en limitant le risque de transmission de maladie auxquelles les veaux seraient particulièrement sensibles à cet âge. Après cette phase d'élevage individuelle, les veaux sont placés dans un parc collectif où ils sont alimentés en groupe. Les parcs reçoivent une litière abondante de copeaux de bois et sont nettoyés quotidiennement. Les veaux ont également accès à de l'enrichissement (bidons, brosses fixes...). Le recours à des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure également que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. En cas de stress anormal de l'animal ou si l'opérateur ne parvient pas à repérer la veine jugulaire, le prélèvement sera immédiatement arrêté et reporté.

Choix des espèces

L'espèce bovine est particulièrement visée par les pathologies respiratoires qui font l'objet des recherches menées dans le cadre du projet qui, en plus des souffrances qu'elles imposent aux animaux, engendrent de lourdes pertes économiques pour les éleveurs. Les animaux élevés pour ce projet seront des veaux naissants, jusqu'à un âge compris entre 10 et 45 jours. A l'issu de leur phase d'élevage sur notre établissement utilisateur, ils seront transportés jusqu'à l'unité porteuse du projet (par un transporteur agréé, dans le respect des règles afférentes au transport des animaux vivants) pour l'expérimentation à proprement parler avant l'âge de 45 jours. L’âge de environ 30 jours est particulièrement significatif car il marque le début de la diminution de l’immunité maternelle colostrale, rendant les veaux plus susceptibles aux infections et est donc un moment idéal pour étudier la réponse immunitaire face aux agents pathogènes. Cette fenêtre temporelle est donc stratégique pour reproduire les conditions d’apparition des maladies respiratoires et pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques.

Les souris élevées dans ce projet sont immunodéficientes et porteuses d'une modification génétique létale : sans administration continue d'un médicament, elles meurent peu après la naissance de lésions hépatiques majeures. 6 100 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie sur animal vigile pour le génotypage, et le moindre microorganisme opportuniste peut dégrader leur état. Le porteur précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer ces effectifs, calculés en fonction des besoins des laboratoires demandeurs. Une partie est expédiée vers ces clients, y compris des femelles gestantes et des souriceaux non sevrés accompagnés de leur mère, le reste étant tué pour la gestion de l'élevage ou faute de porter le génotype recherché.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines afin d’obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles sont greffées avec des cellules humaines. Il existe plusieurs types de souris humanisées en fonction des cellules humaines qui sont utilisées et des pathologies étudiées, par exemple, l’utilisation de cellules humaines de foie (hépatocytes humains) permet de générer des souris dont le foie est humanisé, l’utilisation de cellules immunitaires humaines permet de générer des souris dont le système immunitaire est humanisé. Le développement et la production de souris humanisées permet de proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles de souris dont le foie est humanisable sont pertinents, robustes et fiables. Ils permettent d’effectuer les tests précliniques de composés candidats médicaments pour le traitement de pathologies hépatiques mais également d’étudier la toxicologie de composés candidats médicaments pour d’autres pathologies.

Procédures

Les souris au foie humanisable sont immunodéficientes donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé qui sont exempts de microrganismes pathogènes ou opportunistes listés dans un référentiel afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Certaines souris au foie humanisable peuvent aussi un phénotype dommageable de trouble hépatique, inhibé par l’apport de médicament spécifique. Une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre EU1 (prestation de Sciences de la Reproduction : réception d’animaux, prélèvement gamètes…) et sur notre EU2 (Elevage).

Impact sur les animaux

Sans l’apport d’un médicament spécifique, les animaux ayant un foie défaillant dû à une modification génétique meurent très rapidement après leur naissance de lésions hépatiques majeures. Les animaux immunodéficients sont particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état. Par ailleurs, une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés pour une utilisation continue vers le laboratoire demandeur, soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (avant l'atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permet une sélection des propriétés pharmacologiques et qui permet de valider certaines hypothèses et d’obtenir de données préliminaires et complémentaires. Ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe permettant de mimer le foie humain. Il permet de réaliser des études précliniques in vivo de toxicité avant de réaliser des tests chez l’Homme. Les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Ces animaux au foie humanisable étant immunodéficients (système immunitaire affaibli ou rendu non fonctionnel via différentes modifications génétiques), un hébergement standard (litière, enrichissement et congénères) dans un milieu biologiquement sécurisé pour les protéger de la survenue d’infections est réalisé. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Ces animaux seront surveillés quotidiennement. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Les souris au foie humanisable présentant une invalidation génétique particulière ont un foie dysfonctionnel. Cette modification génétique est léthal. Un médicament spécifique permettant le maintien d’un fonctionnement normal de leur foie leur sera administré afin d’assurer leur survie y compris pendant le transport. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux. Le médicament spécifique permettant de contrecarrer le phénotype des animaux au foie humanisable leur sera fourni tout au long du transport soit dans l’aliment soit dans le gel servant d’eau de boisson.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les souris sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elles constituent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des informations pertinentes pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins de nos clients. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de leur gestation.

Une biopsie d'un millimètre de queue, prélevée au moment du baguage, sert à génotyper chacune des souris de deux nouvelles lignées créées pour ce projet. 210 souris vont être utilisées, toutes tuées à 48 semaines pour un prélèvement terminal, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sur les 168 animaux issus des croisements, 84 sont susceptibles de présenter un phénotype dommageable, avec un retard de croissance au stade fœtal et une létalité périnatale possibles. Le projet annonce évaluer le bien-être de ces lignées, et le porteur écrit dans le même document que leurs effets ne sont pas connus puisqu'elles n'ont jamais été générées, tout en assurant que ce type de calcifications cérébrales ne provoque pas de phénotype dommageable chez la souris.

Objectifs

L’objectif est de créer et d’évaluer le bien-être animal de deux nouvelles lignées et d’identifier génétiquement celles-ci via une méthode de génotypage invasif. La production de ces animaux est nécessaire pour nos projets de recherche sur les rôles et les mécanismes d’action de la protéine Xpr1 dans les processus de calcifications ectopiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. L’utilisation de ces deux lignée de souris permettra de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires d'une mutation identifiée chez les patients humains porteurs de la maladie PFBC (Primary Familial Brain Calcification) et qui est responsable de l’apparition de calcifications vasculaires cérébrales. Elles permettront également d’identifier les mécanismes cellulaires qui sont à l’origine de l’apparition des calcifications cérébrales. Le génotypage, quant à lui, permet la caractérisation génétique des lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques.

Procédures

1 prélèvement (1mm) à l'extrêmité de la queue - pesée des animaux 1 fois par semaine - évaluation de l’état des animaux (retard de croissance au stade fœtal et létalité péri-natale possible)

Impact sur les animaux

Le stress ressenti par l’animal est limité lors des pesées qui sont rapides et par l’utilisation d’un tunnel pour prendre la souris (1 fois par semaine pendant 14 semaines). Ces deux lignées n'ont jamais été générées, les effets des modifications génétiques ne sont donc pas connus. Néanmoins, nous savons que la présence de ce type de calcifications cérébrales chez la souris n'est pas responsable de phénotype dommageable. La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux âgés de 48 semaines seront mis à mort pour prélèvement terminal dans le cadre d’un projet dont l’objectif est de comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie de calcifications cérébrales primaires

Remplacement

Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine connue pour transporter du phosphate du milieu intracellulaire vers l’extérieur de la cellule. La régulation des concentrations de phosphate dans le sang et en local est une composante importante pour notre problématique, ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier.

Réduction

Les croisements sont élaborés pour obtenir un nombre suffisant d’animaux permettant d’obtenir des résultats robustes et fiables pour l’évaluation du bien-être animal (au moins 14 animaux par génotype selon les recommandations européennes). Leur nombre est adapté aux besoins de l’évaluation du bien-être chez les deux sexes.

Raffinement

Les schémas d'accouplement de nos lignées permettent de ne pas générer d’animaux dont le phénotype serait très probablement létal pendant la gestation. Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. La biopsie de queue est réalisée lors du baguage sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal.

Choix des espèces

D’autres modèles de souris génétiquement altérées sur d’autres gènes identifiés comme responsables de la maladie PFBC existent dans la littérature. Les deux nouveaux modèles que nous proposons apporteront des réponses clés sur le rôle du gène X dans la pathogenèse de la maladie PFBC. Ils permettront d’observer les effets systémiques d’une mutation fréquemment identifiée sur ce gène chez les patients atteints de PFBC. Ils permettront également d’étudier le rôle spécifique des cellules vasculaires musculaires lisses dans l’apparition ou la progression des calcifications dans le cerveau. Dans ce projet, 14 mâles géniteurs et 28 femelles génitrices seront utilisés pour générer des groupes d’animaux contrôles et mutants suffisamment importants pour apporter des conclusions robustes sur l’évaluation du bien-être animal. Sur les 168 animaux constituant ces groupes, 84 seront susceptibles de présenter un phénotype dommageable, les 84 autres animaux correspondent aux souris contrôles issues des mêmes portées. Exceptées les femelles génitrices C57Bl/6 (n=8), tous les autres animaux seront biopsiés et génotypés. Ce nombre de croisement permettra d’obtenir au moins 14 animaux par groupe, nombre recommandé par le guide européen « Caring for animals ».

Rendus à la filière d'élevage à l'issue de l'essai, 96 veaux issus de races laitières vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit cinq contentions pour pesée, un prélèvement de fèces et une biopsie de cartilage à l'oreille, avec un risque de blessure et une douleur que le porteur qualifie de légers. Il s'agit de mesurer le méthane qu'ils émettent selon leur race, pour ajuster les références nationales et orienter la sélection vers des animaux qui en produisent moins tout en fournissant autant de viande. Aucun calcul d'effectif n'accompagne le projet, le porteur indiquant que le nombre de veaux a été "chiffré pour correspondre au besoin optimal" de l'essai.

Objectifs

Au sein des gaz à effet de serre, le méthane entérique représente 16 % de la production française lorsqu’il est rapporté à la une même durée de vie que le dioxyde de carbone et un pouvoir de réchauffement global adapté sur cette durée. Ce gaz provient en premier lieu du secteur agricole, plus particulièrement des ruminants, qui en produisent naturellement via leur processus de dégradation ruminale, qui est ensuite éructé par leur bouche. Parmi les solutions existantes pour réduire le méthane entérique, la race en est une prometteuse, puisque les écarts d’ingestion entre races affectent directement les émissions de méthane entérique. En France, un déficit de références apparait chez les veaux issus de races laitières. L’essai envisagé permettra de répondre à deux objectifs. Le premier consiste à acquérir des références d’émission de méthane entérique dans un système français de production de viande à partir de veaux issus de races laitières. Le deuxième ambitionne de déterminer si une ou plusieurs races émettent moins de méthane entérique tout en combinant une production de viande suffisante pour répondre aux enjeux environnementaux et d’autonomie alimentaire française.

Bénéfices attendus

Les bénéfices associés sont situés à plusieurs échelles et domaines. Au sein du projet, l’acquisition de références françaises sur les veaux de race laitière permettra de définir leur niveau d’émission de méthane entérique et ainsi ajuster les valeurs actuellement utilisées pour calculer les émissions totales au niveau national au sein de simulations diverses. En élevage, il pourrait être recommandé d’utiliser certains types génétiques favorisant la moindre production de méthane entérique, tout en ciblant un même niveau de production animale pour assurer la souveraineté alimentaire française.

Procédures

Les 48 animaux par série (96 au total) seront soumis aux interventions suivantes : - Contention et manipulation : lors de chaque pesée 5 fois et pendant environ 2 minutes par animal pour cette intervention - Prélèvement de fèces : une seule fois, cette intervention durera environ 2 minutes maximum par animal - Prélèvement de cartilage par biopsie auriculaire : une seule fois, cette intervention durera moins de 5 secondes par animal

Impact sur les animaux

Les effets indésirables dus aux interventions sont : - Le stress lié à la contention / manipulation, prélèvement de fèces et de cartilage par biopsie auriculaire - Un risque de blessure et de douleur légère liés à la manipulation et au prélèvement de cartilage par biopsie auriculaire.

Devenir

Les animaux poursuivront ensuite leur parcours d’animaux d’élevage.

Remplacement

A ce jour, les méthodes d’évaluation indirectes des émissions de méthane entérique sont prometteuses, mais insuffisamment précises et génériques pour se passer du modèle animal. De ce fait, avoir recours aux veaux (animal cible) est obligatoire pour répondre à la problématique de cet essai.

Réduction

En l'état actuel de nos connaissances sur la littérature scientifique existante, aucun essai n'a testé la comparaison des émissions de CH4 entérique chez des jeunes veaux laitiers. Selon plusieurs hypothèses et extrapolations à cette catégorie de ruminant, l’effectif de veaux a été chiffré pour correspondre au besoin optimal pour répondre à l’objectif de cet essai.

Raffinement

Les diverses mesures envisagées ont été réduites au minimum sur le type de mesure ou leur nombre par animal afin de collecter suffisamment de données utiles pour répondre à l’objectif de l’essai. Le prélèvement unique de fèces sera divisé en 2 sous-échantillons destinés à des analyses différentes. Notons que plusieurs mesures ou prélèvements sur un même animal (fèces, poids et cartilage) seront réalisés au même moment afin de limiter les manipulations contraignantes des animaux. Les prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté sur les sites ce qui garantira une gêne minimale pour les animaux. Ces mêmes animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les personnels animaliers. Tout signe de souffrance sera signalé auprès d’un vétérinaire, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entrainer l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné.

Choix des espèces

Le méthane entérique, un puissant gaz à effet de serre avec un effet délétère sur le climat, est majoritairement émis par les bovins en France. En absence d’outils ou de variables substitue proxyss fiables actuellement pour quantifier ces émissions, l’utilisation de bovins est essentielle pour collecter ces données et chercher des solutions de réduction du méthane entérique à l’échelle française. Le choix des veaux âgé de 15 à 21 jours (âge de comercialisation ds veaux issus du cheptel laitier) à 4 mois comme sujet d’étude résulte d’une absence de référence d’émission de méthane entérique sur ces animaux dans la littérature française, mais aussi pour d’élargir la plage de variation du méthane entérique avec des faibles valeurs dans un jeu de données en cours de construction pour développer et un index génétique et une équation de prédiction du méthane entérique plus robuste.

Nées de mères gavées avec un mélange de quatre composés perfluorés pendant la gestation et la lactation, les souris de ce projet sont suivies jusqu'à l'âge de six mois. 384 vont être utilisées, toutes tuées pour prélever le foie et le tissu adipeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune est marquée par poinçonnage de l'oreille, gavée, puis soumise à des prélèvements sanguins lors des tests de tolérance au glucose, à trois mois, à six mois et avant la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre "pas de nuisances particulières" aux doses retenues, et présente comme une "réduction très importante" du nombre d'animaux le fait d'administrer les quatre polluants en mélange plutôt qu'un par un.

Objectifs

Les composés alkyl perfluorés (PFAS) sont des substances chimiques synthétiques utilisées depuis la fin des années 40 dans une large gamme de produits industriels et de biens de consommation courants. Leur résistance à la biodégradation est responsable de leur persistance dans l’environnement. L’exposition humaine aux PFAS a ainsi lieu via l’eau potable, l’alimentation, les produits de consommation, la poussière et l’air. Les PFAS persistent dans l’environnement, peuvent s’accumuler dans le corps humain et altérer le métabolisme et la reproduction. L’exposition aux PFAS est associée à des perturbations métaboliques comme l'accumulation de gras dans le foie, une pathologie en constante augmentation et pour laquelle il n’existe pas de traitement. Le récepteur nucléaire CAR est particulièrement pertinent à étudier l'effet des PFAS puisqu’il régule à la fois le métabolisme et la détoxification. L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle du récepteur CAR dans les effets induits par les PFAS sur le développement de troubles métaboliques hépatiques. Des souris de type sauvage ou n'exprimant pas CAR dans tout l'organisme ou uniquement au niveau hépatique seront exposées à 4 perfluorés pendant la gestation et la lactation à des doses représentatives de l’exposition humaine. Les effets métaboliques sont évalués sur la descendance mâle et femelle.

Bénéfices attendus

Ces données permettront d’évaluer l’impact d’une exposition pendant la gestation et la lactation à un mélange de 4 PFAS correspondant à ceux auxquels nous sommes le plus exposés sur le développement de troubles métaboliques chez les descendants. L’utilisation de descendants mâles et femelles permettra de mettre en évidence une éventuelle différence d'effets entre males et femelles. Les effets évalués porteront sur des dérégulations du métabolisme glucidique (tests de tolérance au glucose) et du métabolisme lipidique (stéatose hépatique et dérégulation de voies métaboliques ).

Procédures

Le génotypage des souris est réalisé par prélèvement d'un poinçon à l'oreille au moment du marquage des souris. Un gavage d'eau ou de mélange de PFAS est réalisé en début d'exposition (durée 30 secondes), un prélèvement de sang est envisagé au cours des tests de tolérance au glucose (durée 1min). Un prélèvement de sang à la veine faciale submandibulaire est envisagé à 3 mois, à 6 mois et avant l’euthanasie (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Nous n’attendons pas de nuisances particulières chez les animaux exposés aux doses que nous avons sélectionnées pour ces 4 PFAS. Une douleur est associée aux prélèvements de sang pendant le test de tolérance au glucose et précédent la mise à mort. Un stress est généré par la manipulation et la contention des souris. Une douleur légère de courte durée est provoquée par le poiçonnage à l'oreille qui permet le marquage des animaux et la récupération du poiçon pour le génotypage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de préveler le foie et le tissu adipeux pour le besoin de l'étude

Remplacement

Ce type d'étude ne peut être réalisé sur modèles cellulaires qui ne permettent pas de traiter l'aspect exposition pendant la gestation et la lactation. L’utilisation d’animaux permet par ailleurs d’avoir une approche physiologique qui permet d’évaluer tous les troubles métaboliques qui découlent de l’exposition.

Réduction

Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’utilisation d’une approche cocktail pour l’administration des PFAS en mélange. En effet, cette approche permettra de réduire le nombre de lots d'animaux en évitant l'administration des PFAS seul à seul.

Raffinement

La mise en place de maisonnettes en inox permet aux animaux de s'isoler au besoin. Des matérieux de nidification comme du papier déchiqueté sont ajoutés. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront habitués à la préhension par les zootechniciens. Un anesthésique local (crème de lidocaïne) est prévue pour les prélèvements de sang pendant le test de tolérance au glucose. En cas d’atteinte d’un des points limites établis, l'animal sera retiré de l'étude et euthanasié si des soins curatifs ne peuvent lui être appliqués.

Choix des espèces

Nous utiliserons pour ce projet des souris C57BL6/J qui sont particulièrement adaptées pour les études de perturbations métaboliques. Ce fond génétique nous permet d’utiliser des souris invalidées pour le récepteur nucléaire CAR au niveau du foie ou de tous les organes afin de mieux évaluer son rôle dans les perturbations métaboliques induites par l’exposition aux PFAS. Des souris femelles adultes seront exposées aux PFAS en début de gestation et jusqu’au sevrage des animaux. Afin de voir l’effet de cette exposition sur la descendance mâle et femelle à l’âge adulte, les souriceaux seront suivis jusqu’à l’âge de 6 mois.

775 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pouvant recevoir jusqu'à dix injections intraveineuses d'un vecteur viral. S'y ajoutent une injection intramusculaire sous anesthésie, un prélèvement de sang toutes les une à deux semaines et jusqu'à une séance d'imagerie par semaine, après injection intrapéritonéale d'un produit de contraste. Le RNT annonce des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale et écrit ailleurs que tous les prélèvements sont pratiqués sans anesthésie et causent des douleurs temporaires. Le bénéfice avancé, traiter les malades que leur immunité contre le virus prive aujourd'hui de thérapie génique, dépend d'une démonstration que le projet doit encore produire.

Objectifs

La thérapie génique a été conçue comme une approche thérapeutique destinée aux maladies génétiques liées à la dysfonction d’un gène, délivrant aux cellules un gène "sain" capable de remplacer le gène "malade". Pour cela nous utilisons un virus transformé en médicament nommé vecteur L’objectif de ce projet est de rendre résistant à la réponse immunitaire le vecteur en l’enveloppant dans une vésicule. Nous avons montré que le vecteur enveloppé dans une vésicule était capable d’entrer dans des cellules cultivées en laboratoire et qu’il était résistant à une partie des composants de l’immunité. Nous cherchons maintenant à déterminer si le vecteur enveloppé dans la vésicule est aussi efficace que le vecteur « standard » chez la souris. Ensuite nous souhaitons montrer qu’il fonctionne chez la souris possédant une immunité complète. Enfin nous chercherons à déterminer si la présence de vésicules modifie les organes ciblés par le vecteur.

Bénéfices attendus

Une grande partie de la population humaine a déjà été en contact avec ce virus ce qui peut entrainer l’apparition d’une immunité dirigée contre ce dernier. De plus traitement de thérapie génique par ce virus médicament induit également une immunité. La présence de cette immunité chez les malades empêche le traitement avec ce virus médicament. Le développement d’un virus résistant à la réponse immunitaire permettrait de traiter les malades qui jusqu’à présent avaient été privés de traitement due à leur immunité ainsi que les patients pour lesquels le traitement n’avait pas marché.

Procédures

Injection du virus médicament en intraveineux chez un animal sain : Entre 1 et 10 injections du virus médicament en intraveineux sur animaux vigiles, ce geste dure 1 minute. Injection intramusculaire : 1 injection du virus médicament en intramusculaire sous anesthésie. Bilan sanguin : 1 prélèvement de sang toute les 1 ou 2 semaines par animal sous anesthésie générale (ce geste dure 1 minute). Imagerie sur animal: 1 injection par voie intrapéritonéale de produit nécéssaire à la visualisation par imagerie ( ce geste dure 1 minute) puis l'animal est placé dans l'appareil d'imagerie pour la capture des images (pendant 10 minutes). Pour chaque animal un maximum de 1 imagerie par semaine sera réalisé.

Impact sur les animaux

Nous utilisons des virus médicaments non dangereux et à des doses non toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Les nuisances seront donc uniquement liées aux gestes techniques qui seront pratiqués. Ces gestes comprennent l’injection du virus (intraveineux et intramusculaire) ainsi que de prélèvements sanguins. Ces actes sont réalisés à l’aide d’aiguilles appropriées et entraîneront donc des répercussions mineures pour l’animal. Certaines de ces injections et tous les prélèvements sont réalisées sans anesthésie et causent des douleurs temporaries chez les animaux. De manière plus générale, toute manipulation des animaux provoque un stress.

Devenir

Afin de pouvoir évaluer la répartition du vecteur dans le corps des animaux, les organes doivent être prélevés et analysés. Les animaux seront donc mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir récupérer les organes.

Remplacement

Nos vecteurs ont préalablement été testés sur des cellules. Néanmoins, une fois dans l’organisme, le vecteur doit échapper au système immunitaire, traverser la paroi des vaisseaux sanguins et pénétrer dans les organes cibles afin d’apporter le gène manquant. Malheureusement, ces étapes ne sont pas encore réalisables dans des cellules cultivées en laboratoire. Il est donc indispensable de devoir recourir à des animaux pour se rapprocher le plus possible de ce qu’il se passera chez l’Homme.

Réduction

Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat fiable nous permettant de répondre aux problématiques posées. De plus, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de s'assurer que le maximum d'informations possible est recueilli sur chaque animal.

Raffinement

D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les souris utilisées lors de ce projet sont saines. Les vecteurs utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, et de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Néanmoins, les souris seront quand même surveillées au cours des protocoles avec une inspection quotidienne et des points limites adaptés (critères d’arrêt de la procédure) ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance animale. Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux, dans le but de réduire leur stress. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité.

Choix des espèces

Le système immunitaire des souris est proche de celui de l’Homme. C’est un modèle validé par la communauté scientifique. Par conséquent nous allons tester notre traitement dans cette espèce animale. Les souris seront adultes car les tests doivent être effectués sur des organes dont le développement est terminé sous peine de fausser les résultats obtenus.

Pour vérifier si l'inhibition d'une protéine fait maigrir, 546 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux administrations par semaine pendant trois mois, par injection dans l'abdomen, par voie orale ou en application sur la peau du dos, cette dernière voie pouvant être poursuivie dix-huit mois, avec des prélèvements de sang répétés dans la veine de la joue et dans la queue, et pour une partie d'entre elles une nourriture riche en graisses pendant trois mois. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour comparer le vieillissement des souris privées de la protéine à celui des témoins. Le porteur indique que l'injection d'insuline peut provoquer une hypoglycémie et prévoit d'injecter du glucose aux souris qui atteignent le point limite de glycémie.

Objectifs

Nous avons récemment découvert un nouveau rôle d'une protéine dans le contrôle du stockage des graisses. Nous avons constaté que lorsque cette protéine n'est pas présente chez les souris, elles deviennent plus minces et affichent une diminution significative du tissu adipeux sans aucun autre effet délétère. Nous avons en outre identifié un inhibiteur de cette protéine par criblage "in vitro" qui, lorsqu'il est ajouté aux cellules, favorise une diminution spectaculaire du stockage des graisses dans les gouttelettes lipidiques. L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment cette protéine contrôle le métabolisme des graisses et de vérifier si notre inhibiteur pourrait être un nouvel outil thérapeutique pour le traitement de l'obésité et le diabète.

Bénéfices attendus

L’obésité est le plus grave problème de santé publique des dernières décennies. Elle est associée à de multiples maladies, comme le diabète de type 2 ou l’infarctus du myocarde. Les options de traitement restent assez limitées. D’un côté, l’usage d’agents thérapeutiques avec une perte de poids très limitée et des effets secondaires importants comme incontinence fécale, un défaut d’absorption de vitamines, des maux de tête, des nausées, des vomissements, diarrhées, etc... De l’autre côté, les interventions chirurgicales avec de bons résultats de perte de poids, mais avec des complications importantes et irréversibles. Cependant, cette approche peut être exclusivement envisagée pour des adultes de plus de 18 ans. Avec 38 millions d’enfants de moins de 5 ans dans le monde en 2019 en surpoids ou obèses, il y a un réel besoin de trouver des nouvelles thérapies médicamenteuses pouvant favoriser la perte de poids, qui ne présentent pas ou peu d’effets secondaires, et pouvant permettre d’aborder le traitement de l’obésité chez les adultes, mais aussi chez les enfants et les adolescents. Nous avons identifié une protéine comme un acteur majeur dans la perte de poids. Nous avons également identifié un inhibiteur de cette protéine. Notre objectif est de comprendre comment cette protéine régule le métabolisme de lipides "in vivo". Nous voulons également démontrer l’intérêt thérapeutique de cibler cette protéine pour le traitement de l’obésité et l’efficacité de notre inhibiteur à ce propos. Ce projet peut permettre d’identifier une nouvelle molécule avec un puissant effet amaigrissant associé à peu d’effets secondaires et devenir un atout majeur pour le traitement de l’obésité et des maladies associées.

Procédures

1-Injections intrapéritonéales deux fois par semaine pendant trois mois 2-Administration orale deux fois par semaine pendant trois mois 3-Administration topique sur la peau du dos deux fois par semaine pendant trois mois ou 18 mois 4- Prélèvements sanguins à 1 et 3 mois d'âge par la veine sous-maxillaire (durée du geste : 30 secondes) et par la veine caudal (durée du geste :10 secondes) et trois prélèvements sanguins par la veine sous-maxillaire (durée du geste : 30 secondes) à 1, 3, 6, 12 et 18 mois d'âge dépendant de la procédure 5-Nourriture riche en graisses pendant trois mois

Impact sur les animaux

1-Pour le test de glycémie, l'injection d'insuline pourrait induire un risque d’hypoglycémie, même si cet effet est rare. Les animaux seront donc suivis attentivement après chaque administration et si le point limite de glycémie est atteint, l’animal recevra immédiatement une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose. 2-L’administration topique peut induire des irritations sur la peau des animaux qui seront traitées avec une application de vaseline.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure dans le but de prélever des échantillons des tissues. Cela permettra de charteriser les effets de l'élimination de notre protéine chez la souris et de déterminer les effets de notre drogue inhibitrice in vivo. Une étude histologique de tous les tissues sera également essentielle pour analyser et comparer le vieillissement dans les souris contrôles versus les souris dépourvues de la protéine.

Remplacement

La lignée de souris où notre protéine d'intérêt peut être conditionnellement éliminée est la seule permettant l'élimination totale de la protéine chez l'animal. Nous savons que cette protéine joue un rôle essentiel sur la prolifération cellulaire dans les cellules en culture, déterminer son vrai rôle chez l’animal reste difficile. L’analyse « in vivo » chez la souris, est le plus proche de ce qui se passe chez l’homme. Nous avons montré que « in vivo » l'élimination de cette protéine dans les tissus somatiques n'a pas d'impact sur la prolifération cellulaire, mais elle induit un ralentissement de la prise de poids corporel associée à une complète perte de tissu adipeux blanc et une diminution significative du tissu adipeux brun. L'objectif de ce projet est de réaliser des nouveaux tests pour déterminer si cette protéine pourrait être une cible intéressante pour le traitement de l’obésité et le diabète. Il est donc essentiel d’utiliser à nouveau les souris transgéniques modifiés pour le gène de cette protéine. Outre que l'analyse de l'effet de l'ablation de ce gène "in vivo", nous testerons aussi l'activité amaigrissante d'un inhibiteur identifié par criblage "in vitro" chez les souris contrôle obèses de la même souche que les souris transgéniques et nous comparerons les résultats. Nous avons donc également besoin des souris obèses. Finalement nous utiliserons les souris transgéniques pour étudier l’effet de la perte de cette protéine sur le vieillissement.

Réduction

Dans le but de diminuer au maximum le nombre de souris, nous avons calculé par un test de puissance le nombre minimal d’animaux nécessaire pour chaque procédure pour garder une puissance statistique et pour palier l’abandon de certaines souris dans l’expérimentation. Pour ce calcule nous avons utilisé les variables de différence de la moyenne et d’écart-type déjà connues par nos expériences précédentes ou obtenues par recherche bibliographique.

Raffinement

Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés. Si les souris manifestent des signes de stress, de la nourriture gélifiée sera placée dans la cage pour faciliter la réhydratation et limiter la souffrance des animaux. Leur environnement sera enrichi par un mélange de copeaux et sciure et un fond sonore musical sera maintenu dans les pièces de stabulation afin de limiter les variations de bruit. Enfin, les animaliers s’occuperont toujours des mêmes souris qui seront changées selon un planning hebdomadaire strict afin d’éviter de les stresser.

Choix des espèces

La souris permet l’utilisation des approches de génétique pour étudier l’effet de la protéine d'intérêt au cours de processus fondamentaux tels que le développement embryonnaire, la prolifération cellulaire normale ou tumorale chez les mammifères. Nous disposons d'une lignée de souris où l'élimination du gène de notre protéine peut être induit. Cette lignée nous permettra de comprendre comment cette protéine régule le stockage de graisses et la prise de poids in vivo. Nous utiliserons des souris à 4 mois d'âge quand les réservoirs de graisses sont déjà remplis pour déterminer si, en plus d'un replanissement de la prise de poids, l'inhibition de l'activité de cette protéine induit également la perte de poids corporel.