Procédures légères

Une stimulation électrique poussée jusque dans le cœur, sous anesthésie et sans réveil, termine le parcours des souris transférées vers l'animalerie d'expérimentation. 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées, les cœurs prélevés pour analyse. Le porteur décrit l'échocardiographie comme une procédure "non invasive et non douloureuse", et indique par ailleurs que la lignée porte un phénotype dommageable pouvant provoquer des troubles du rythme jusqu'au décès. Les reproducteurs en fin de reproduction, les animaux écartés à cause de leur génotype et les hétérozygotes "générés en surplus" sont tués sans entrer dans le projet.

Objectifs

Le projet s’insère dans un contexte de recherche qui a pour but de comprendre les mécanismes à l’origine de pathologies cardiovasculaires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Pour cela l’effet de diverses substances ou de protéines mutantes introduites chez des souris normales est étudié et leurs conséquences physiologiques chez l’animal sont mesurées. Ces expériences nécessitent un suivi phénotypique. L’objectif du projet est la caractérisation fonctionnelle d’une mutation humaine dans un gène qui vient d'être découvert comme responsable d'une nouvelle forme de cardiomyopathie associée à des troubles du rythme cardiaque pouvant conduire à des pertes de connaissance et à une mort subite. Le but de ce projet est donc de comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les régulations auxquelles participe cette protéine. Ces connaissances seront facilitées en utilisant un modèle in vivo qui garantit la présence des molécules partenaires dans un contexte physiologique.

Bénéfices attendus

L'étude de ce modèle murin nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie liée à des troubles du rythme cardiaque atrial et ventriculaire, et de déterminer si les souris développent ou non une cardiopathie associée. A plus long terme, des stratégies thérapeutiques pourront être testées sur ce modèle car ces arythmies peuvent être mortelles chez l'Homme et nous ne disposons pas de traitements efficaces. Du point de vue de l’incidence, c’est certainement une maladie rare, en particulier en Europe où il y a peu de familles consanguines. Quand les résultats de nos recherches seront publiés, d’autres études viendront conforter et compléter nos premiers résultats. Il est probable que des mutations fondatrices existent dans certaines régions du monde, transmises de génération en génération et que seuls les patients homozygotes par descendance soient atteints avec une incidence locale plus élevée et un réel besoin de traitements pour prévenir le développement d'arythmies ventriculaires possiblement léthales.

Procédures

Une biopsie sera réalisée pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1 minute, EU1). Les animaux seront transférés de l’établissement d’élevage vers l’établissement secondaire où seront effectuées les différentes explorations (EU2). Les enregistrements électrocardiographiques avec le système Tunnel sont effectués sur animal vigiles qui sont juste placés dans un tunnel, avec chaque patte positionnée sur une plaque, ce qui permet l’enregistrement de l’électrocardiogramme (4 fois au maximum, 5 min, EU2). L’échocardiographie est enregistrée sur animal anesthésié très légèrement afin de juste les maintenir immobiles. C’est une procédure non invasive et non douloureuse. Les animaux se réveillent juste après l’arrêt de l’anesthésie (4 fois au maximum, 30 min, EU2). Les animaux seront également soumis à une stimulation transoesophagienne pour mettre en évidence et analyser une éventuelle susceptibilité à déclencher une fibrillation atriale (sous anesthésie et analgésie, 3 fois au maximum, 30 min, EU2). Le protocole de stimulation intracardiaque ne sera fait qu’une seule fois (acte unique, sous anesthésie et analgésie, durée 40 min, EU2), car c’est une procédure terminale, sans réveil, avant euthanasie. Les souris subissent cette procédure chirurgicale afin d’évaluer la susceptibilité des modèles murins aux arythmies ventriculaires.

Impact sur les animaux

Les nuisances découlant des procédures sont 1) l’utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des souris réalisée par une biopsie, ce qui peut être une cause de stress et de douleur légère de courte durée, 2) ce projet consiste à phénotyper une nouvelle lignée murine, le phénotype dommageable des animaux pourrait entrainer des troubles du rythme cardiaque pouvant provoquer le décès dans les cas les plus graves, 3) le stress lié au transport des animaux de l'animalerie d'élevage à l'animalerie d'expérimentation, 4) le stress lié aux diverses manipulations pour les administrations ou durant le suivi, 5) douleur légère de courte durée au point d'injection, 6) lors de certains actes sous anesthésie gazeuse, une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les reproducteurs en fin de période de reproduction ou exclus du fait de leur génotype ne pouvant être inclus dans le projet, ainsi que les hétérozygotes générés en surplus seront euthanasiés. Tous les animaux transférés pour l'expérimentation seront euthanasiés à la fin de la procédure chirurgicale et les cœurs seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n’existent pas en lignées. Nous disposons de protocoles d’établissement de cardiomyocytes issus d’iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l’organisme) et utilisons également ce modèle, mais ils présentent des inconvénients comme une immaturité et la présence de plusieurs types cellulaires. Ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration de signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.

Réduction

640 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Une étude pilote sera effectuée afin de définir précisément les âges optimaux pour réaliser les analyses. A la fin des études expérimentales, des organes seront prélevés sur tous les animaux afin de maximiser les informations analysables. Un isolement et une étude des cardiomyocytes isolés seront également réalisés. Ce modèle cellulaire ex vivo permettra de tester l’effet de composés pharmacologiques pour tenter de corriger des anomalies à l’origine des dysfonctionnements cardiaques, plutôt que de tester directement in vivo l’effet de ces composés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. En élevage, une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Le transport entre les deux EU est réalisé sans changement de cage pour limiter le stress des animaux. Les cages sont délicatement placées dans un sac kraft et sur un chariot. Le transfert est réalisé par un tunnel sous terrain sans passage par l'extérieur. La durée du trajet est de 5 minutes. Le projet a également été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce 2) le développement et la physiologie sont bien connus. 3) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 4) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. Les animaux seront utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour réaliser une biopsie, entre 2 et 6 mois pour la reproduction et entre 15 jours et 8 mois de vie pour le suivi (poids, fonction cardiaque)

14 820 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 10 500 larves pour cribler 500 molécules, à raison de deux doses par groupe de dix larves. Chacune passe quinze minutes par jour sous microscope pendant dix jours, immobilisée dans l'agarose ou anesthésiée, après une illumination aux ultraviolets proches qui active un oncogène dans une cellule unique. Les 720 fondateurs des lignées transgéniques sont conservés et renouvelés, tous les autres poissons étant tués pour analyser leurs tumeurs. Le porteur qualifie l'imagerie de non invasive et affirme qu'elle ne cause aucune souffrance particulière, tout en indiquant que les poissons développant un cancer ne survivent pas plus de quinze jours et que les molécules testées peuvent provoquer une nage erratique, des postures sur le flanc et la mort.

Objectifs

Le projet a pour but de réaliser des expériences de recherche fondamentale et translationnelle en cancérologie en mesurant la probabilité de cancérogénèse à partir d’une cellule mutée sur un oncogène, un gène dont l’expression favorise la survenue de cancers. Il s’agit de comprendre, dans un contexte physiologique, pourquoi certaines cellules développent une tumeur et d’autres non, d’identifier les marqueurs biologiques de la transformation maligne, et d’en suivre l’évolution en présence ou non de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Nous utilisons le modèle poisson-zèbre (Danio rerio), modèle utilisé dans l’étude de pathologies humaines, notamment le cancer. Transparent aux stades embryonnaires et larvaires, ce modèle permet l’utilisation de méthodes optiques pour contrôler l’expression de gènes (optogénétique) in vivo, et l’imagerie in vivo, pour suivre l’évolution de tumeurs locales. Ces méthodes sont non invasives. Nous avons mis au point une méthode qui permet la transformation maligne d’une cellule somatique, déjà différenciée et spécialisée, en cellule cancéreuse. Nous modifions l’homéostasie cellulaire, c’est-à-dire les paramètres physiologiques de la cellule, par l’expression photocontrôlée d’un oncogène muté et d’une protéine particulière qui confère à la cellule un potentiel de dédifférenciation. Nous utiliserons un système CRISPR/cas9 photoactivable (les fameux ciseaux moléculaires capables de modifier le génome en des endroits spécifiquement choisis), pour modifier l’environnement de la tumeur (c’est-à-dire modifer l’homéostasie des cellules qui entourent les cellules tulmorales) après l’invalidation ciblée de gènes, impliqués par exemple dans la réponse immunitaire ou le métabolisme énergétique. Dans ces différents contextes nous évaluerons la probabilité de développement de tumeurs par suivi en imagerie in vivo, à l’aide de rapporteurs fluorescents spécifiques, et en présence ou non de composés pharmacologiques. Après euthanasie, les tumeurs qui se seront développées seront analysées et comparées au tissu sain. Le projet devrait mener à l’identification de nouveaux biomarqueurs prédictifs du cancer et de substances pharmacologiques à visée thérapeutique prophylactique.

Bénéfices attendus

La caractérisation des étapes initiales de la transformation maligne d’une cellule in vivo permettra d’identifier des biomarqueurs de la cancérogénèse et son évolution depuis son initiation dans un contexte physiologique. Nous utiliserons des gènes dont les mutations sont associées à la survenue de cancers humains de mauvais pronostic, notamment des tumeurs du pancréas et du cerveau, observées dans notre modèle d’activation contrôlée. Ces biomarqueurs pourraient donc être prédicitifs du développement de tumeurs de mauvais pronostic chez l’humain. Le criblage de composés pharmacologiques devrait permettre l’identification de substances d’intérêt prophylactique et thérapeutique, pouvant conduire à un développement pharmacologique. Inversement, certains composés pourraient apparaître toxiques ou favorables au développement tumoral.

Procédures

Injection de constructions moléculaires pour la création de lignées transgéniques : intervention indolore sur œufs fécondés ne dépassant pas quelques secondes par œuf. Exposition à des temps courts d’illumination aux UV proches sur des larves immobilisées en agarose ou anesthésiées. Durée totale de la procédure : 5 à 10 minutes, réalisées 1 ou 2 fois par animal selon le protocole. Exposition à des faisceaux lumineux de différentes longueurs d’onde sous microscope (ou loupe binoculaire) pour prendre des images des larves anesthésiées. Durée totale de la procédure : 15 minutes par animal, une fois par jour pendant 10 jours. Exposition aux molécules pharmacologiques : 1 bain de 48h dès la photoactivation.

Impact sur les animaux

Nous anticipons les nuisances suivantes sur les larves de poissons zèbres : Toxicité potentielle des composés pharmacologiques testés, identifiés par des comportements anormaux (ex. nage erratique, postures sur le flanc), pouvant entraîner la mort des animaux selon les doses appliquées. Influence directe de certaines longueurs d’onde de lumière lors des séances d’imagerie : léger inconfort de courte durée.

Devenir

Les animaux fondateurs des lignées transgéniques permettant le contrôle par la lumière de l’expression de gènes d’intérêt seront conservés et renouvelés. Les animaux utilisés pour l’étude de la cancérogénèse à partir d’une cellule unique in vivo, et pour le criblage de molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront euthanasiés pour analyser les tumeurs qui se seront développées. Les tissus cancéreux seront comparés aux tissus restés sains.

Remplacement

Le projet nécessite l’utilisation de larves de poissons transgéniques, dont la peau est transparente, et qui expriment des protéines fluorescentes. Les tumeurs induites après illumination seront suivies par imagerie fluorescente sur plusieurs jours, voire plusieurs semaines. Toutefois, nos résultats actuels montrent que la survie des poissons développant les tumeurs, et par conséquent des cancers, ne dépasse pas 15 jours post-induction. Cette approche est la seule actuellement qui permet de caractériser l’initiation de la transformation maligne d’une cellule somatique et d’en suivre l’évolution en tumeurs et métastases, dans un contexte physiologique intégré. Les modèles de cultures cellulaires humaines ou animales in vitro en trois dimensions, peuvent amener au développement d’organes, mais sont souvent opaques (nécessitant la microscopie multi-photonique) et ne permettent pas d’étudier la relation entre la tumeur et son microenvironnement cellulaire sain, ni la progression tumorale et la motilité des cellules cancéreuses in vivo. D’autre part, et dans le cadre du criblage de molécules pharmacologiques d’intérêt thérapeutique, le modèle animal permettra d’apprécier la toxicité éventuelle des composés sur l’ensemble de l’organisme. Ainsi pourraient être identifiés des composés efficaces contre le développement tumoral, mais nocifs pour d’autres tissus sains. Cet aspect ne peut pas être évalué par l’utilisation de modèles in vitro.

Réduction

La mesure de la probabilité de cancérogénèse suite à l’activation d’un ou plusieurs oncogènes (gènes dont l’expression d’une mutation est associée à la survenue de cancers) dans des environnements génétiques et physiologiques différents nécessite des expériences sur un grand nombre d’embryons (plusieurs dizaines par essai) dans lesquels des oncogènes auront été exprimés globalement dans plusieurs dizaines de cellules (pour tester l’efficacité des constructions transgéniques et des oncogènes), et localement dans une (ou plusieurs) cellule(s) d’un embryon. 3600 larves de poissons seront utilisées pour cette expérimentation. Concernant le criblage de molécules pharmacologiques, une évaluation bibliographique de composés potentiellement pertinents sera réalisée pour le choix du panel de molécules à tester. Deux doses de chaque composé seront testées par groupe de 10 larves de poissons. Les tests seront organisés et groupés en fonction des pontes (100 à 300 œufs par couple) afin de minimiser les groupes contrôles nécessaires pour tester la viabilité des pontes et la toxicité du solvant des composés dans un batch d’œufs. Par exemple l’obtention de 500 œufs (2 à 4 couples) permettra de tester 20 composés à raison de 2 doses par groupe de 10 larves (400 larves) et d’obtenir au moins 2 groupes contrôle de 10 larves. 10500 larves de poissons seront utilisées pour le criblage de 500 molécules. Les embryons sur lesquels la photo-activation n’aura pas fonctionné, absence d’expresssion d’un rapporteur fluorescent dans les 24h suivantes, seront euthanasiés pour n'élever que le nombre minimal d'embryons nécessaires aux expériences. Les larves, après la fin des expériences, seront immédiatement euthanasiées et utilisées pour les analyses post-mortem. La population de 720 poissons adultes fondateurs ne sera utilisée que pour produire des embryons et garder des lignées transgéniques et mutantes. Un nombre total de 14820 animaux est nécessaire à la réalisation du projet.

Raffinement

Nous utilisons des techniques d'imagerie, méthode non invasive, sur des larves intactes de Danio rerio. Ceci ne cause aucune souffrance particulière aux larves. De plus, nous manipulons les larves avec une extrême précaution, car nos projets de contrôle de l’expression de gènes par la lumière exigent le minimum de perturbation et une grande précision pour récolter des données fiables. Afin de respecter le bien-être des animaux les manipulations aux stades larvaires et adultes se feront sous anesthésie. Les animaux seront suivis individuellement, mais élevés en groupe afin de respecter leur instinct grégaire. Une surveillance quotidienne de leur comportement permettra de prévenir des états de souffrance (mobilité, nage erratique, prostration, isolement, etc.). Les animaux developpant des tumeurs, soit au point limite de l’expérience, ou après identification d’un état de souffrance seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le projet de l'équipe consiste à étudier les étapes la cancérogénèse à partir d’une seule cellule. L’environnement génétique, physiologique et immunitaire jouant un rôle crucial dans ces étapes initiales et très peu étudiées de la cancérogénèse, il est impératif d’utiliser un modèle animal. Par ailleurs la nécessité d’obtenir une statistique significative sur des événements rares nous oriente vers un organisme capable de générer des centaines de larves identiques. Pour ces raisons, Danio rerio s’est imposé ces dernières années comme modèle animal de choix en cancérogénèse. La complexité du développement tumoral ne nous permet pas encore l'utilisation de modèles in silico. Notre projet implique l'analyse des relations entre cellules normales, cellules mutées, environnement tissulaire et fond génétique. L'utilisation de modèles in vitro ne peut donc pas être envisagée à ce stade. Les larves de poissons zèbre sont utilisées entre 1 et 9 jours après fertilisation car, à ce stade de développement, l'alevin peut respirer par diffusion de l'oxygène à travers la peau. Il est alors possible de les immobiliser dans l'agarose sans risque d'asphyxie et de photo-activer localement oncogènes et protéines responsables de la cancérogénèse. Les animaux ayant développé une tumeur seront suivis jusqu’au point limite de l’expérience défini, puis euthanasiés.

Exposées à des champs électromagnétiques dès le stade de l'œuf, à trois ou quatre semaines, puis élevées en bassin jusqu'à six mois : 200 petites roussettes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque mois elles sont pesées et mesurées, une fois au stade juvénile elles passent vingt-quatre heures isolées dans un respiromètre, et leur comportement est filmé deux heures le matin, deux heures l'après-midi et une nuit. Le porteur reconnaît ne pas pouvoir déterminer à l'avance la sévérité d'une exposition prolongée aux champs électromagnétiques, faute de connaissances sur les requins, et signale que les points limites applicables aux poissons sont mal établis. Les 200 individus doivent être relâchés en mer après accord d'un vétérinaire, ceux dont le développement ou la santé se sera dégradé étant tués.

Objectifs

Dans le contexte de changement climatique, la production d’énergie constitue l’un des défis socio-économiques et environnementaux majeurs des décennies à venir et soulève d’importants enjeux stratégiques, économiques et financier. Les énergies marines renouvelables (EMR), basées sur le vent, les marées et les courants marins font des océans et des mers une source inépuisable d’énergie permettant de produire de l’électricité. Parmi elles, les parcs éoliens offshores (OWF) sont aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Les OWF peuvent induire du bruit, des Dans le contexte de changement climatique, la production d’énergie constitue l’un des défis socio-économiques et environnementaux majeurs des décennies à venir et soulève d’importants enjeux stratégiques, économiques et financier. Les énergies marines renouvelables (EMR), basées sur le vent, les marées et les courants marins font des océans et des mers une source inépuisable d’énergie permettant de produire de l’électricité. Parmi elles, les parcs éoliens offshores (OWF) sont aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Les OWF peuvent induire du bruit, des vibrations, l’interruption de continuité écologique et des perturbations liées aux champs électromagnétiques qui peuvent avoir des impacts potentiellement négatifs sur les espèces marines. En transportant l’énergie produite, les câbles électriques sous-marins au sein des OWF génèrent des champs électromagnétiques (CEM) qui peuvent affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles , qui utilisent les champs électromagnétiques pour se déplacer et se nourrir. La forte croissance de l’éolien offshore risque d’amplifier ces effets mais les informations existantes sur leurs conséquences sur les communautés ichtyologiques restent aujourd’hui encore insuffisantes. Les études réalisées sont limitées à quelques espèces d’intérêt commercial et sur une durée relativement courte. Ce projet vise à répondre à cette lacune et à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les requins, espèces élétro-sensibles. L’état de santé des individus sera évalué à travers un panel d’indicateurs : survie, mesures taille/poids (i.e. biométrie) et suivi de la croissance, développement, métabolisme énergétique (i.e. indicateur de stress évalué via des mesures de consommation d’oxygène au repos et à l’effort).

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien offshore entraine une modification de l’habitat. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. Il existe très peu de connaissances sur l'impact des parcs éoliens offshore sur les requins. Ces connaissances relatives à la biologie de ces espèces d’intérêt serviront de cas concrets pour la mise en place de suivi pérennes des populations aux sein des OWF afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général. Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment les requins réagissent aux champs électromagnétiques en courant continu. Ils permettront d’améliorer les connaissances des impacts des EMR sur les espèces marines et ainsi apporteront les informations essentielles aux gestionnaires et décideurs pour répondre aux enjeux de développement des EMR sans nuire au maintien de la biodiversité marine.

Procédures

Biometrie : une fois par mois les individus seront pesés et mesurés pour assurer un suivi de leur croissance et de leur état de santé. Mesures de respirometrie : 1 fois au stade juvénile, évaluation de la capacite metabolique aerobie individuelle. Ce test durera 24 h et 20 juveniles par condition (i.e. controle, 3 differents champs electromagnetiques) seront testés soit 10 poissons par bassin. Tests comportementaux : les tests comportementaux auront lieu 2 fois au stade juvenile. Une camera placée au dessus de chacun des bassins permettra d'enregistrer leur comportement a differents temps de la journee. L'experimentateur n'interviendra pas dans le bassin ni sur les animaux mais enclenchera les enregistrement a des temps donne (1 fois 2h le matin, 1 fois 2h l'apres midi, 1 nuit).

Impact sur les animaux

La littérature récente souligne le manque de connaissances s'agissant des points limites (objectifs et quantitatifs) applicables pour l'expérimentation sur les poissons, les réponses à la douleur étant par ailleurs très variables entre les espèces. L’ensemble des manipulations (mise en bassin, anesthésie, mesures taille poids, réveil, stimulation avec un stick, respirométrie) seront réalisées sur une période de temps optimisée afin de minimiser un maximum ce stress. La condition des poissons (indice de condition, état général) sera évaluée au niveau individuel durant toute l’expérimentation. Le manque de connaissances sur l’impact des champs électromagnétiques sur les requins de manière générale ne permet pas de déterminer la sévérité de ce type d’exposition en amont. L’exposition aux champs électromagnétiques pourrait avoir des effets indésirables sur l’espèce étudiée. L'isolement sensoriel des individus dans les respiromètres pourrait engendrer un léger stress.

Devenir

Les individus seront relâchés dans l’environnement après accord d’un vétérinaire. Le cas échéant les individus seront euthanasiés. En effet les individus vont être exposés de manière prolongée à des champs électromagnétiques en courant continu. Si cette exposition altère le développement ou la santé des individus ils ne pourront etre relachés dans l'environnement. Les individus marqués sont maintenus en vie et utilisés durant toute l’expérimentation

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser l’impact des champs électromagnétiques sur les requins, aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne peut être envisagée puisqu’aucune méthode de remplacement ne saurait reproduire le développement et le comportement de cette espèce. Nous ne pouvons pas imiter la complexité d’un organisme en entier subissant des conditions particulières impactant sa biologie et son comportement en milieu naturel Aussi, pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique de l’écosystème marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie et à la biologie des espèces vivant dans l’habitat impacté.

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique L’exposition se fera au stade œuf de 4 semaines jusqu’au stade juvénile. En prenant en compte l’incertitude de la fécondation des œufs, du bon développement des embryons et la littérature existante, un nombre total de 25 individus par bassin est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques et des résultats pouvant être extrapolé à l’échelle de la population.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors de l’élevage, de mesures biologiques telles que le poids et la taille, des tests comportementaux et l’évaluation de l’état de santé de l’organisme via des indicateurs de stress Une surveillance de routine sera effectuée quotidiennement dans les bassins d’élevage. Une bonne oxygénation du milieu et une température de 16°C seront maintenus tout au long de l’expérience, un cycle jour/nuit fixe. Les bassins seront enrichis de tubes PVC permettant de mettre à disposition des cachettes pour les individus. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Les individus seront retirés de la procédure dès qu’un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). Une fois éclos, les juvéniles seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bon état de santé des individus et bon état des installations. Des suivis plus poussés, notamment des tests comportementaux (e.g. prise alimentaire, locomotion) et écophysiologiques (métabolismes aérobie, indice de condition, croissance) , seront assurés par les agents une à deux fois par mois. Au bout de 6 mois, un point d’étape sera réalisé sur les travaux effectués sous la forme d’un rapport intermédiaire et d’une réunion dédiée. A l’issue de ces expérimentations, si les résultats le permettent, les données seront analysées et valorisées sous forme d’article(s) scientifique(s)..

Choix des espèces

Les requins sont des especes électrosensibles susceptible d'être impactées par les champs electro- magnétiques generes par les OWF. L’ensemble de ces espèces est présent sur les differents sites d’étude avec un degré de mobilité plus ou moins important. La petite roussette (classée « preoccupation mineure » par l’IUCN) présente globalement une sédentarité au site avec des déplacements relativement limités. L'étude débutera au stade embryonnaire (oeuf de 3-4 semaines) jusqu'au stade juvenile de 6 mois. Les oeufs sont fixés par les femelles sur le lieu de ponte qui peut être par conséquent un parc éolien offshore. Ensuite, les juvéniles sont très peu mobiles à la naissance et vont rester sur la zone de ponte quelques mois. Afin d' évaluer l'impact des champs électromagnétiques sur le développement il est donc nécessaire d'exposer les individus à partir du stade embryonnaire. Le stade de 3-4 semaines permet de s'assurer de la viabilité et de la fécondation des oeufs avec un embryon qui commence à être visible. Cela permet de ne pas exposer d'oeufs dits "clairs" et non fécondés.

La moitié des rats subit une chirurgie terminale, l'autre moitié deux chirurgies du cerveau espacées de huit semaines, suivies d'une procédure terminale trois jours après la seconde. 384 rats vont être utilisés ainsi, tous tués pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objet déclaré est de vérifier une hypothèse sur la plasticité de trois populations de neurones de l'hippocampe apparues à trois âges différents, dont des ratons opérés au troisième jour après la naissance. Le porteur annonce que sa priorité est le confort des animaux, tout en plaçant les rats opérés en cage individuelle une semaine après la première chirurgie puis trois jours après la seconde, pour éviter que le compagnon de cage ne morde les points de suture.

Objectifs

Le but de notre projet est de caractériser le degré avec lequel les différentes "couches" de neurones situés dans une région du cerveau appelée l'hippocampe sont capables de manifester des phénomènes de plasticité synaptique, c'est-à-dire de renforcer leurs connexions avec le reste du cerveau. Les "couches" qui nous intéressent sont celles qui apparaissent soit au tout début du développement de l'animal (3 jours après sa naissance, que nous appelons la couche Dev), soit lors de son adolescence (21 jours chez le rat, couche Adolescente), soit au début de leur âge adulte (à 2 mois, couche Adu). Plusieurs données comportementales suggèrent que ces "couches" pourraient présenter une réactivité différentielle à la plasticité, avec un gradient croissant en fonction de l'age d'apparition: Adu serait plus réactives que Adolescente, elle-même plus réactive que Dev. Toutefois, aucune donnée fonctionnelle n'est disponible pour confirmer cette théorie. Nous nous proposons ici de mettre à profit notre connaissance, à la fois des protocoles de mise enévidence de plasticité dans le cerveau, et des processus entourant la génèse des différentes "couches", pour tenter de démontrer cette hypothèse.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de mieux connaître les fonctions des différentes populations de neurones qui composent l'hippocampe, une région du cerveau qui joue un rôle majeur dans les processus de mémoire, mais aussi dans l'apparition de troubles de l'humeur tels que la dépression. En effet, dans l'une de ses sous-structures (appelée le gyrus dentelé), l'hippocampe connaît un phénomène de synthèse de nouveaux neurones tout au long dela vie de l'individu, ce qui constitue une exception dans le cerveau des mammifères. Comprendre les rôles respectifs de ces "couches" successives de nouveaux neurones donnera de nouvelles clés pour décrypter les mécanismes par lesquels les différents types de mémoire et d'apprentissage se mettent en place, avec une complexité croissante en fonction du développement de l'individu. Une des premières étapes consiste à déterminer ce qui différencie ces différentes populations quant à leur réactivité à un stimulus de plasticité, comme proposé dans le présent projet.

Procédures

Dasns ce projet, nous prévoyons d'utiliser 384 animaux en chirurgie. La moitié d'entre eux (192) subiront une procédure chirurgicale terminale, l'autre moitié connaîtra 2 chirurgies espacées de 8 semaines, suivie d'une procédure terminale 3 jours après la seconde chrirugie.

Impact sur les animaux

1. Une partie des animaux ne subiront que des procédures chirurgicales terminales, c'est-à-dire qu'ils seront euthanasiés à la fin de la chirurgie par une surdose d'anesthésique. Avant cela, les seules manipulations effectuées seront des injections aiguës (de 1 à 3 jours consécutifs selon les groupes expérimentaux) d'un composé sans effet sur leur métabolisme. Dans ce cas, la seule nuisance sera une douleur légère et de courte durée, due à la piqure de l'aiguille d'injection. 2. D'autres expériences nécessiteront de procéder à des micro-injections de marqueurs morphologiques dans des régions très précises du cerveau, avant d'utiliser à nouveau les animaux pour une seconde chirurgie, elle-même suivie 3 jours après d'une procédure terminale. Après les chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement afin de déceler le moindre signe de stress ou d'inconfort. Les risques de nuisance seront de type post-opératoire: infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie. Durant une semaine après la première chrirugie, et pendant les 3 jours qui suivront la seconde, les rats seront en isolement (stabulation en en cages individuelles), afin d'éviter les morsures du compagnon de cage au niveau des points de suture.

Devenir

Il sera nécessaire de prélever le cerveau de tous les animaux utilisés. En effet, que ces derniers subissent une seule procédure terminale, ou bien deux chirurgies suivies d'une procédure terminale, il s'agit dans les deux cas de visualiser des "marqueurs" moprhologiques dans l'hippocampe des rats. Nous étudions comment ces marqueurs réagissent dans les différentes "couches" de neurones, dans des conditions où on permet à l'hippocampe de mettre en place un renforcement de ses connexions synaptiques. Seule une obervation méticuleuse en microscopie permettra de comparer l'évolution des marqueurs au sein des différents types de neurones.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo les propriétés plastiques de populations neuronales distinctes au sein du système nerveux. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant de préserver le fonctionnement cérébral de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, les mécanismes sous-tendant l’intégration synaptique de ces neurones étant en grande partie inconnus, complexes, et impliquant l’activité du système nerveux dans son intégrité (impossible à modéliser).

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statisitquement fiables et robustes. Pour celà, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque groupe expérimental, en nous basant sur les acquis de nos précédents travaux.

Raffinement

En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximuim leur confort et leur sécurité durant la totalité des procédures expérimentales. Ainsi, les animaux adolescents et adultes seront d'abord en cages collectives de deux individus enrichies, puis en cages individuelles après la première chirurgie, un risque important de morsures mutuelles des points de suture étant à craindre à ce moment là. Cet isolement ne sera maintenu que durant une semaine après la chirurgie, un délai supérieur risquant d'entraîner des agressions inter-individuelles. Ces cages individuelles seront pourvues d'un environnement enrichi visant notamment à pallier l'isolement social (présence de plusieurs "tunnels" ludiques); les animaux seront en outre manipulés individuellement par l'expérimentateur pendant plusieurs minutes, 5 jours/semaine. Passé le délai d'une semaine, ils seront replacés avec leur précédent compagnon de cage. Après la seconde chirurgie, là encore les animaux seront mis en cages individuelles enrichies avant d'être euthanasiés 3 jours plus tard, toujours pour éviter les cas de morsure des sutures. Dans tous les cas, une pesée et une observation quotidienne post-opératoire seront réalisées, permettant de s’assurer du bon état de la plaie, des sutures et du bien-être des animaux, durant 3 jours consécutifs. Pour le cas particulier des ratons de 3 jours, la surveillance sera encore renforcée: ils seront surveillés 3 fois par jour durant la semaine post-opératoire. Notamment nous vérifierons si la poche gastrique (estomac vu "par transparence" à cet âge) est remplie de lait, indiquant que les animaux s’alimentent. Dans le cas contraire ils seront nourris par gavage: lait concentré dilué, via canule de gavage pour souris. Après sevrage, ils seront placés en cages collectives de deux individus, enrichies.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. Il s’agit en effet d’une espèce qui, de par ses capacités cognitives, sert de modèle de référence dans les études liées à l’apprentissage ou la mémoire, et donc également pour ce qui concerne la plasticité synaptique des neurones de l’hippocampe. Nous souhaitons utiliser les animaux à trois stades de développement différents: Le stade adulte (plus de 8 semaines chez le rat): les animaux seront donc par définition adultes au moment de la réalisation des expériences et lors de leur mise à mort. Le stade de développement P3 (3ème jour post-natal), et le stade adolescent (21 jours): étant donné que nous attendrons au minimum 8 semaines avant la seconde chrirugie, les animaux seront devenus adultes pour la suite des procédures.

Comparer six candidats vaccins vivants atténués contre la tuberculose au BCG actuel, dans deux fonds génétiques de souris de résistance différente : 554 souris sont utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont vaccinées une fois, subissent trois prélèvements sanguins, puis sont infectées par les bacilles de la tuberculose en chambre de contention pendant dix-sept minutes. Le porteur qualifie ces nuisances de modérées et de courte durée en les ramenant aux minutes de contention, sans décrire à cet endroit la pathologie que l'infection installe ensuite. Il annonce une grille de score et des points limites précoces sans en donner les seuils, et affirme que le modèle animal est "incontournable" faute de modèle cellulaire pertinent.

Objectifs

La tuberculose (TB) demeure un problème majeur de santé publique et constitue un frein au développement économique. Les données épidémiologiques pour cette maladie sont édifiantes : 1/4 de la population mondiale est infecté et le taux de mortalité chez les adultes (1.5 millions de mort par an) est plus élevé que celui causé par le SIDA, le paludisme et toutes les autres infections tropicales réunies. Des thérapies existent mais sont souvent tenues en échec par leur coût, leurs effets secondaires et l’apparition de souches résistantes. De même, un vaccin vivant, Mycobacterium bovis BCG, est disponible mais son efficacité est extrêmement variable en fonction des populations vaccinées. Il est donc urgent de développer et d’optimiser de nouveaux vaccins pour arriver à contrôler la tuberculose. Au cours des dernières années, différents candidats vaccins reposant sur des antigènes ou des combinaisons d’antigène ont été évalués mais n’ont pas permis d’obtenir une efficacité supérieure au vaccin actuel le BCG. Ces résultats ont poussé la communauté scientifique à reconsidérer les vaccins vivants dérivés de Mycobacterium tuberculosis, l’agent principal de la tuberculose humaine, ou de BCG. Dans ce contexte, notre objectif est de comparer, entre eux et avec le vaccin actuel, les 6 candidats vaccins les plus prometteurs. Cette étude multicentrique impliquera plusieurs laboratoires français et internationaux. Pour réaliser cette comparaison, les différents laboratoires utiliseront plusieurs modèles de souris et plusieurs voies de vaccination. Notre rôle dans cette étude, consistera à comparer l’efficacité de protection de ces 6 candidats dans les modèles deux modèles de souris immunocompétentes présentant différentes réponses anti-TB retrouvées chez l’homme.

Bénéfices attendus

Nos études visent à identifier un vaccin vivant atténué de nouvelle génération qui mérite d'être étudié plus en profondeur dans le cadre d'essais pré-cliniques et cliniques et d’un développement potentiel en tant que vaccin amélioré contre la tuberculose. L'analyse comparative des performances de 6 souches de vaccin vivant atténué administrées par différentes voies dans 2 modèles de souris présentant une résistance variable à l’infection par les bacilles de la tuberculose contribuera à orienter l'allocation cruciale de ressources mondiales limitées pour identifier et développer une souche de vaccin vivant atténué plus efficace pour remplacer le BCG.

Procédures

Ce projet implique: 1) pour la procédure de calibration du système d'infection: une infection sur animaux placés dans des chambres de contention. Celle-ci sera réalisée une fois et la durée maximale sera de 30 minutes. 2) pour la procédure d'évaluation de l'efficacité protectrice: Tous les animaux subiront 3 prélèvements. Ces prélèvements durent 2 min environ. Tous les animaux seront vaccinés une fois et la vaccination dure environ 2 min. Enfin tous les animaux seront infectés. Pour cela ils seront placés dans des chambres de contention pendant 17min.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont présents à deux niveaux dans nos expériences : 1) lors de l’anesthésie, des prélèvements, de la vaccination et de l’infection des animaux (piqûre, contention, et prélèvement de sang), et 2) lors de la pathologie éventuelle induite par l’infection. Il s’agit de nuisances modérées et de courtes durées (17 min de contention pour l'infection et 2 min environ pour la vaccination ou le prélèvement de sang).

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse du développement de l'infection (évaluation de la charge bactérienne dans les organes et analyse histopathologique).

Remplacement

Différents modèles cellulaires ou animaux sont utilisés par les équipes travaillant sur la tuberculose. Malheureusement il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour comparer l’efficacité de candidat vaccin. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé en première intention est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases des projets seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, la taille des lots à utiliser a été déterminée par une équipe de statisticien. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures sont prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie lors de la vaccination, limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et des prélèvements, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à comparer l’efficacité de candidats vaccin-vivant, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes (avec un système immunitaire mature) et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant sept à quinze injections dans l'abdomen en seize jours selon la fréquence testée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trois prélèvements de sang au-dessus de la mâchoire s'y ajoutent par animal, sous anesthésie gazeuse. Le porteur reconnaît que ces injections répétées peuvent être douloureuses et stressantes, que les sites d'injection peuvent gonfler, et que plus la fréquence augmente, plus les désagréments augmentent. Le projet cherche la fréquence la plus basse qui reste efficace, la molécule ayant déjà été testée sur des cellules humaines, et le porteur affirme que le passage par un "organisme entier" est "nécessaire" pour repérer les effets secondaires.

Objectifs

Lorsque quelqu'un reçoit un organe d'une autre personne, son corps peut rejeter cet organe, c'est-à-dire que son système immunitaire attaque l'organe greffé, ce qui peut entraîner une perte de celui-ci. Ce phénomène, appelé "rejet vasculaire chronique", est la principale cause de perte d'un organe greffé à long terme. Parmi les cellules du système immunitaire qui participent à ce rejet, il y a un type de cellule appelé "Natural Killer" ou NK. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace sans effets secondaires importants permettant d’empêcher les cellules NK d’attaquer l’organe greffé. Ce projet vise donc à tester l’efficacité de deux molécules capables de bloquer l’activation des cellules NK dans un modèle de souris. Différentes fréquences d'administration seront donc testées afin de déterminer la fréquence la plus faible, c’est-à-dire nécessitant le moins d’injections tout en étant efficace. Lorsque l’efficacité d’une fréquence est démontrée, le projet s’arrête, la ou les autres fréquences restantes ne sont pas testées.

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous utilisons un modèle de souris pour tester l'efficacité d'un traitement qui vise à bloquer une voie spécifique dans les cellules NK lorsqu'elles sont dans un organisme vivant. Les résultats de cette étude nous aideront à déterminer quelle fréquence d'administration du traitement est la plus efficace tout en minimisant les effets secondaires. Il n’existe pas de traitement permettant de soigner efficacement le rejet causé par les cellules NK, c’est pourquoi découvrir de nouveaux traitements anti-rejet permettrait d’aider les patients greffés.

Procédures

Dans une première partie 32 animaux vigiles subiront une injection dans le ventre toutes les 54h à 60h (lundi à 7h, mercredi à 13h et vendredi à 19h) qui durera moins d’une minute pendant seize jours. Cela correspond à un total de 7 injections sur seize jours. Trois prélèvements de sang seront réalisés au-dessus de la mâchoire à huit jours d’intervalle minimum pour chacun des 32 animaux de la procédure qui auront été endormis au préalable à l’aide d’un gaz. Le prélèvement durera une à deux minutes. Le seizième jour les animaux seront endormis par respiration de gaz et seront mis à mort. Dans une deuxième partie, si elle est nécessaire, 32 animaux vigiles subiront une injection dans le ventre toutes les 48h qui durera moins d’une minute pendant seize jours. Cela correspond à un total de 8 injections sur seize jours. Trois prélèvements de sang seront réalisés au-dessus de la mâchoire à neuf jours d’intervalle minimum pour chacun des 32 animaux de la procédure qui auront été endormis au préalable à l’aide d’un gaz. Le prélèvement durera une à deux minutes. Le seizième jour les animaux seront endormis par respiration de gaz et seront mis à mort. Dans une troisième partie, si elle est nécessaire, 32 animaux vigiles subiront une injection dans le ventre toutes les 24h qui durera moins d’une minute pendant seize jours. Cela correspond à un total de 15 injections sur seize jours. Trois prélèvements de sang seront réalisés au-dessus de la mâchoire à neuf jours d’intervalle minimum pour chacun des 32 animaux de la procédure qui auront été endormis au préalable à l’aide d’un gaz. Le prélèvement durera une à deux minutes. Le seizième jour les animaux seront endormis par respiration de gaz et seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Au cours de la première partie du projet, les animaux recevront des injections dans le ventre toutes les 54 à 60 heures (lundi matin, mercredi après-midi et vendredi soir) pendant deux semaines. Au cours de la deuxième partie du projet, les animaux recevront des injections toutes les 48 heures pendant deux semaines. Au cours de la troisième partie du projet, les injections seront données toutes les 24 heures pendant deux semaines. Ces injections répétées peuvent être douloureuses et stressantes pour les animaux. Les endroits où ils reçoivent les injections peuvent gonfler et devenir douloureux à cause de la répétition. Plus les injections sont fréquentes, plus les désagréments sont importants. Les produits injectés peuvent aussi causer des effets secondaires, comme un changement de poids (prise ou perte de poids) chez l'animal, qui sera surveillé. Pour chaque procédure et pour chaque animal, on fera aussi trois prises de sang à au moins huit jours d'intervalle au niveau de la mâchoire. Cela peut être stressant et causer des douleurs pendant la guérison.

Devenir

Pour obtenir les résultats à la fin de chaque partie du projet, les cellules contenues dans un organe de l’animal sont nécessaires (la rate). Ils seront tous mis à mort de manière réglementaire à la fin de chaque expérience.

Remplacement

Il n'existe pas d'autre méthode que l'utilisation des animaux pour vérifier l'efficacité du traitement dans un organisme vivant. L'efficacité du traitement a déjà été testée sur des cellules humaines en laboratoire, mais l'utilisation d'animaux est nécessaire pour voir comment il fonctionne dans un organisme entier et pour détecter les effets secondaires. Des interactions complexes entre les cellules ont lieu dans un organisme vivant, il n’est pas possible de recréer ces échanges en laboratoire, c’est pourquoi l’utilisation des animaux est nécessaire pour répondre à notre question.

Réduction

Les fréquences d'administration seront testées une par une, avec des intervalles de temps de plus en plus courts, pour arrêter le projet dès que l'efficacité est prouvée. Le nombre minimum d'animaux nécessaires pour chaque test a été fixé pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre a été déterminé grâce à un test de puissance permettant de connaître le nombre d’animaux minimal pour tirer une conclusion.

Raffinement

Les injections seront faites à différents endroits du ventre pour éviter les zones rouges et gonflées, afin de ne pas causer de douleur aux animaux. Les prises de sang au-dessus de la mâchoire seront faites à différents endroits chaque semaine, et les animaux seront endormis avec un gaz avant. Le poids des animaux sera surveillé tout au long du traitement : ils seront pesés avant chaque injection. Dans la première partie, ils seront pesés trois fois par semaine, dans la deuxième partie quatre fois par semaine, et dans la troisième partie, tous les jours. Les signes de douleur seront contrôlés 5 jours sur 7 pour les parties 1 et 2 , et tous les jours pour la partie 3. On surveillera si les animaux ont le dos et courbé, des poils ébouriffés, une activité réduite, un changement d'appétit, ou s'ils s'isolent. Les animaux seront habitués à leur nouvel environnement pendant deux semaines avant de commencer les procédures, pour réduire le stress. Ils resteront en groupe pour éviter le stress lié à l'isolement. Leur comportement sera aussi surveillé, comme leur alimentation, leur toilettage, la construction de nids et l'exploration de leur environnement. Leur habitat sera enrichi pour permettre ces comportements. Enfin, les animaux seront endormis avec un gaz avant chaque geste de mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal avec une anatomie et un fonctionnement du corps assez similaires à ceux de l'être humain. Le système immunitaire de la souris fonctionne de manière comparable à celui de l'humain, notamment en ce qui concerne le rejet d'organes. C'est pourquoi la souris a déjà été utilisée dans la recherche pour étudier ces mécanismes. Des souris de plus de 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, leur système immunitaire est mature. Elles seront aussi âgées de moins de 2 ans et demi, ce qui correspond chez l'humain à la fourchette d'âge où on peut recevoir une greffe d'organe.

Une à deux séries de cinq injections dans l'abdomen, une chirurgie de dix minutes pour implanter une micro-pompe sous la peau du dos, quinze minutes d'anesthésie pour une échocardiographie : 3 040 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le projet cherche à savoir si le passage des lipides à travers la paroi des capillaires cardiaques peut être contrôlé, dans une forme d'insuffisance cardiaque liée à l'obésité et au vieillissement. Vingt souris par groupe sont demandées, au motif qu'une seule souris ne suffit pas à toutes les analyses. Le porteur résume en quatre mots les atteintes attendues, un surpoids et une bosse sur le dos, sans dire ce que délivre la micro-pompe ni comment le surpoids est obtenu.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente 50% des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée, dans laquelle, le ventricule gauche ne se remplit pas assez de sang parce que le muscle cardiaque est raide et incapable de se détendre. Il a récemment été proposé que l’accumulation de lipides dans les cellules cardiaques en particulier chez les patients obèses puisse être toxique pour le cœur et induire une rigidification des parois cardiaques. Il faut savoir que pour atteindre les cellules cardiaques, les lipides qui circulent dans le sang doivent passer à travers la paroi des capillaires constituée de cellules endothéliales. Nous avons fait l’hypothèse que l’accumulation toxique des lipides dans le cœur pourrait être limitée en contrôlant la fonction de barrière de la paroi des capillaires sanguins. L'objectif de ce projet est d'une part de tester cette hypothèse et d'autre part de caractériser le rôle de certaines voies de signalisation dans le contrôle du passage des lipides à travers les cellules endothéliales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l'insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée ce qui est nécessaire pour identifier de nouvelles cible thérapeutiques et améliorer la qualité de vie et la survie des patients.

Procédures

Les souris subiront 1 à 2 séries de 5 injections intrapéritonéales (chaque injection dure mois de 15 secondes), une chirurgie de 10 minutes visant à implanter une micro-pompe en sous cutané et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.

Impact sur les animaux

Administration intrapéritonéales répétées (pendant 5 jours consécutifs), Douleur post-chirurgicale, Surpoids, présence d'une bosse sur le dos

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure pour prélevement d'organes

Remplacement

L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions diverses entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes, fibroblastes) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas, à l'heure actuelle, être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.

Raffinement

L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.

Jusqu'à quatorze heures sans nourriture pendant leur période d'activité, pour qu'elles cherchent un morceau de fromage enfoui dans la sciure : 460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent le pneumovirus murin par instillation nasale sous anesthésie, et jusqu'à 360 d'entre elles sont contaminées par simple contact avec des congénères infectées, pour étudier la transmission du virus entre individus. Le porteur nomme les tests olfactifs et en donne la durée, sept minutes au maximum, qu'il juge sans stress pour un animal habitué. Il précise que les lignées transgéniques seront utilisées avant six mois d'âge et ne disposeront d'aucune mesure de raffinement spécifique.

Objectifs

Le projet présente deux objectifs : Mieux comprendre la physiopathologie des virus respiratoires au niveau de la cavité nasale en utilisant le pneumovirus murin (PVM) comme modèle, et mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la dissémination inter-individuelle. Le PVM est un virus naturellement adapté à la souris, la souris y est donc naturellement sensible, contrairement à d'autres modèles murins basés sur des virus humains par exemple. Elle développe une infection permettant la production de nouvelles particules virales, et une pathologie typique d’une infection par virus respiratoire.

Bénéfices attendus

Nos résultats permettront de comparer l’impact de ce virus PVM vis-à-vis de la littérature par rapport aux infections par d’autres virus respiratoires illustrant les différentes stratégies d’infections virales et les différentes défenses immunitaires de l’hôte. Nos travaux devraient ouvrir de nouvelles connaissances pour lutter contre des virus responsables de nombreux décès chez l’humain et de baisse de productivité dans les élevages animaux. La dernière pandémie (COVID-19) a ainsi tué au moins 7 millions de personnes dans le monde, la grippe aviaire est responsable chaque année de l’abattage de plusieurs millions d’animaux juste en France. A ce jour ; la physiopathologie de ces virus dans la cavité nasale ainsi que leur transmission restent largement à caractériser.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux (en dehors des animaux servant à étudier la propagation naturelle du virus soit au maximum 360 souris) seront soumis à une instillation nasale par souris sous anesthésie générale qui durent moins de 5 min afin de procéder à l’infection par le PVMLes animaux pourront suivre des tests olfactifs qui durent moins de 7 min par animal ce qui n’engendre pas de stress pour un animal habitué (toutes les souris pourront être concernées soit 460 souris). Ces tests seraient réalisés en début de journée jusqu’à 3 fois au cours du protocole. Au cours de ces tests, l'animal cherche de la nourriture cachée dans la sciure (petit morceau de fromage). Afin de motiver l’animal dans ces recherches, il peut être nécessaire de les mettre à jeun sur 14h maximum pendant leur période d’activité. Les capacités respiratoires des animaux seront mesurées à l’aide d’un appareil spécifique adapté aux souris.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont limités à une perte de poids et des difficultés respiratoires, car le virus utilisé est peu pathogène chez les souris utilisées. L’instillation nasale peut engendrer un stress chez l’animal et une fausse déglutition. L’évaluation du comportement olfactif induit un stress léger car il consiste à laisser l’animal seul rechercher de la nourriture enfouie. Ce test est également réalisé après une mise à jeun de 14h maximum.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus qui seront utilisés pour étudier les infections virales et la réponse immunitaire de l'hôte.

Remplacement

Les études concernant les interactions virus-hôte ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes avec un système immunitaire et un écoulement de mucus normal de la cavité nasale. Nous utiliserons ici des lignées modifiées génétiquement qui montreront des fonctions de mucus modifiées afin d’étudier son importance dans les infections respiratoires. Certaines interactions seront réalisées sur des cultures primaires de tissus issus de la cavité nasale de souris permettant de réaliser plus d’expérience par animal utilisé.

Réduction

Le nombre d'animaux est limité par des expériences pilotes déjà réalisées ainsi que des effectifs adaptés de 10 animaux des deux sexes par groupe pour obtenir des différences statistiques en se basant sur nos précédentes expériences.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupe sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement, ils disposent également d’un enrichissement de leur environnement notamment pour créer un nid à l’abri d’une maison en carton de type igloo ainsi que de bout de bois à ronger. Préalablement à l'infection des animaux par instillation intranasale, et lors de l'euthanasie, les animaux seront anesthésiés. Les études comportementales seront précédées d'une période d'habituation pour limiter le stress des animaux lors de la réalisation des tests. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue lorsqu’ils seront soumis aux infections respiratoires et selon le statut génétique (prise de poids journalier et évaluation de l’état de l’animal quotidienne). Des points limites sont déterminés pour éviter la douleur des animaux. En cas d'atteinte de ces critères, les animaux seront euthanasiés. Les lignées transgéniques seront utilisées avant que leur état général soit altéré (

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature permettant d’étudier les relations hôtes-pathogènes. Le choix de la souris repose sur les nombreux outils existant pour étudier la physiologie de cette animal modèle. Les lignées transgéniques permettront de spécifiquement étudier le rôle du mucus dans l’infection virale au niveau de la cavité nasale.

Les poissons qui montrent une nage modifiée, une respiration accélérée ou une apathie sont retirés et tués avant le terme prévu. 10 380 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, puis, dès l'apparition de la première tumeur, un suivi hebdomadaire pouvant inclure des photographies sous anesthésie, sur six à douze mois. Le porteur affirme que le poisson zèbre est une bonne alternative à la souris parce qu'il offre de meilleures possibilités de manipulation génétique, et tous les poissons sont tués au terme du suivi, qu'ils aient ou non développé une tumeur.

Objectifs

Le cancer est la première cause de mortalité en France et dans de nombreux pays. Malgré des progrès thérapeutiques importants au cours des 20 dernières années, le taux de survie à 5 ans des patients atteints de tumeurs solides demeure faible. Une compréhension approfondie des mécanismes d’initiation et de progression des cancers est nécessaire pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Une approche de ces mécanismes consiste à décrypter les anomalies génétiques dont l’accumulation est à l’origine des cancers. Leur description s’est beaucoup améliorée, notamment grâce à l’essor de technologies de séquençage appliquées aux tumeurs humaines. Cependant, certains cancers comme le mélanome, une tumeur agressive de la peau qui touche près de 10000 personnes par an en France, présentent un très grand nombre d’altérations génétiques. De plus, leur description ne peut se traduire par une meilleure compréhension des mécanismes tumoraux qu’à travers l’étude approfondie de la fonction biologique des gènes altérés. L'étude de l’influence de ces gènes sur le développement des tumeurs nécessite le recours à des modèles in vivo qui reflètent l'évolution du cancer au cours du temps. L’objectif de ce projet est de tester dans des modèles de mélanome dans le poisson zèbre le rôle de 5 gènes candidats fréquemment altérés dans les mélanomes humains et pour lesquels des indications in vitro suggèrent qu’ils pourraient réguler l’initiation et la progression des tumeurs. Le poisson zèbre est un vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer et plusieurs modèles très fiables de mélanome sont disponibles. Ces modèles seront utilisés pour évaluer les conséquences de l’expression ou de l’inactivation des gènes candidats sur la survenue des tumeurs et sur leurs caractéristiques. L’expression et l’inactivation de gènes proposées ici sont restreintes à certaines cellules de la peau et ne sont donc pas censées induire de pathologies autres que la formation de mélanomes à l’âge adulte. Les études présentées ici devraient permettre de découvrir la fonction de nouveaux gènes impliqués dans le développement du mélanome humain et pourraient révéler de nouvelles vulnérabilités des cellules cancéreuses permettant d’ouvrir des perspectives thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans l’initiation et la progression du mélanome. La compréhension de leur mécanisme d’action pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques contre ces tumeurs.

Procédures

Le génotypage des poissons implique un prélèvement unique sous anesthésie d’une petite partie de la nageoire caudale qui repousse dès la première semaine. La procédure ne dépasse pas 2 minutes. A partir de l’apparition de la première tumeur, les poissons sujets au développement de tumeurs seront soumis à une observation hebdomadaire et individuelle. Pour suivre l’évolution des tumeurs, une documentation photographique pourra être réalisée sous anesthésie au plus une fois par semaine. Le suivi des poissons sera réalisé sur une durée de 6 à 12 mois en fonction du génotype des tumeurs, après quoi tous les poissons seront mis à mort, qu’ils aient ou non développé une tumeur.

Impact sur les animaux

La procédure de génotypage peut induire un stress passager ainsi qu’une modification temporaire de la nage due au prélèvement d’un fragment de nageoire. Certains animaux peuvent présenter des signes de stress ou de mal-être dus au développement de tumeurs primaires. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une respiration accélérée ou une apathie passagère. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés au moins 2 fois par semaine et des points limites précoces ont été mis en place. La manipulation des poissons pour le comptage des tumeurs et pour la prise de photos introduit un stress supplémentaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Des modèles de croissance et de prolifération cellulaires in vitro sont utilisés à chaque fois que cela est possible, notamment pour les analyses du mécanistique d’action des gènes d’intérêt. Cependant, les lignées cellulaires de cancers humains modélisent mal les étapes précoces de l’initiation tumorale et d’évolution temporelle des tumeurs. La plupart des lignées cellulaires de mélanome humain proviennent de métastases, donc de stades tumoraux avancés, et se sont adaptées à leurs conditions de culture in vitro. Les méthodes alternatives telles que la culture en 3D ont aussi été envisagées mais ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.

Réduction

Dans un but de réduction, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe d’animaux que la mesure de leur vitesse d’apparition. Dans la mesure du possible, les manipulations génétiques seront en outre regroupées au maximum de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Des analyses statistiques a priori basées sur notre expérience du type de manipulations proposées ont permis d’établir les nombres minimums d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives.

Raffinement

La souffrance éventuelle associée au développement de tumeurs peut être prévenue par une surveillance attentive des animaux et l’application de points limites définis, facilités par notre connaissance du modèle. Les poissons sujets au développement de tumeurs seront observés au moins deux fois par semaine à la recherche de signes ou de changements de comportement précoces et prédictifs de la maladie. Le stress éventuel pourra être réduit par le recours à l’anesthésie lors des manipulations de génotypage et de documentation photographique. Dans un souci de raffinement, les poissons seront également nourris une fois par jour avec des artémias pour préserver leurs instincts prédateurs et enrichir leur milieu.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté à l'étude de la génétique du cancer. Les gènes impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. C’est ainsi qu’ont été générés des modèles très fiables de mélanome dans le poisson zèbre. Des espèces d'animaux invertébrés pourraient être envisagées mais leurs organes diffèrent considérablement de ceux de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral.

Gavées une fois par semaine pendant sept semaines pour déclencher une allergie alimentaire, ou huit fois en deux semaines pour induire une tolérance orale, puis exposées aux acariens par voie intranasale sous anesthésie légère à cinq reprises sur seize jours, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent deux à trois prélèvements sanguins sous anesthésie et des collectes de fèces en cage individuelle. Le projet mesure l'effet d'une alimentation périnatale plus végétale sur le risque d'allergie de la descendance, les régimes étant donnés à la mère pendant la gestation et la lactation puis aux petits au sevrage, et les mâles reproducteurs sont isolés une semaine avant l'accouplement. Les souris sont tuées pour prélever leurs tissus, sauf 480 reproducteurs et reproductrices que le porteur dit vouloir proposer à d'autres utilisateurs de l'unité expérimentale, faute de quoi ils seront tués à leur tour.

Objectifs

Les allergies sont un problème majeur de santé publique. Elles résultent d’une réponse immunitaire inappropriée contre certaines protéines d’aliments, de pollens ou d’acariens, appelées allergènes. Normalement inoffensifs pour l’organisme, ces allergènes devraient être tolérés : l’allergie résulte ainsi d’une maturation inadéquate du système immunitaire. Différents facteurs environnementaux peuvent agir dès l’enfance, voire dès la grossesse, et favoriser le développement des allergies. Ces facteurs peuvent interférer avec la maturation de la muqueuse intestinale, du système immunitaire associé et du microbiote intestinal. Un défaut de l’un de ces paramètres peut être déterminant dans la propension de l’enfant à développer plus tard une allergie. Les protéines intégrées dans l’alimentation du nouveau-né, au sevrage et lors de la diversification, participent à la maturation du système immunitaire. Cependant, si l’effet protecteur d’une diversification alimentaire plus précoce a été démontré sur la prévention des allergies, le rôle de l’origine et de la diversité des protéines alimentaires n’est pas encore connu. Par ailleurs, la diminution de la consommation de protéines animales constitue un enjeu environnemental, économique et de santé majeur. Afin de répondre aux attentes sociétales sur ce sujet, nous devons mieux comprendre les facteurs et déterminants permettant une plus forte végétalisation de l’alimentation. Il est alors indispensable d’en définir les impacts sur la santé, notamment pendant les périodes sensibles de la vie. Notre projet a pour but d’étudier, dans un modèle murin, l’effet de la végétalisation de l’alimentation pendant la période périnatale sur la propension à développer plus tard une allergie. Différents régimes alimentaires seront donnés à la mère durant la gestation et la lactation, puis à la descendance au moment du sevrage. L’impact de ces régimes présentant différents degrés de végétalisation sera évalué au niveau de la composition du microbiote intestinal et de la maturation du système immunitaire chez la descendance, en lien avec sa propension à développer, suivant différents modèles expérimentaux, une allergie alimentaire, une allergie respiratoire ou une tolérance orale à un aliment. Ces travaux sont fondés sur la littérature et l’utilisation de données issues de l’analyse de cohortes de naissance pour l’identification de facteurs pertinents et ils ne cherchent pas à reproduire des travaux déjà réalisés.

Bénéfices attendus

Trouver des sources protéiques alternatives aux protéines animales, constitue un enjeu environnemental, économique et de santé publique majeur. Nos travaux participent à l’évaluation de l’impact sur la santé d’une végétalisation accrue de nos régimes alimentaires. Ils permettront ainsi plus globalement d’enrichir la connaissance scientifique sur les facteurs périnataux favorisant le développement de pathologies liées à des dysfonctionnements immunitaires tels que les allergies. De plus, ces travaux aideront à établir des politiques publiques de prévention efficace dans le contexte de l’épidémie des allergies. Les résultats permettront également de mieux caractériser l’impact de nos changements de régimes alimentaires sur notre santé, en parallèle de l’impact environnemental envisagé, et peut-être à terme, aboutir à l’élaboration de nouvelles formules infantiles.

Procédures

- Des administrations intra-gastriques sur animaux vigiles seront réalisés pour les animaux soumis à un protocole d’induction d’allergie alimentaire (1 gavage par semaine, pendant 7 semaines) ou d’induction de tolérance orale (8 gavages sur 2 semaines puis 1 gavage par semaine pendant 7 semaines). Le gavage est réalisé en un minimum de temps (environ 30 secondes). - Des administrations intranasales d’allergènes respiratoires (acariens de poussière de maison) sous anesthésie légère seront réalisées chez les animaux soumis au protocole d’induction d’allergie respiratoire (5 administrations, réparties sur 16 jours) - Deux à trois prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie légère, selon les groupes. Les prélèvements sont réalisés en 1-2 minutes maximum - Des prélèvements des fèces seront réalisés sur animaux vigiles : les fèces sont collectés au fond des cages, après mise des animaux en cage propre individuelle pendant 3 à 5 minutes.

Impact sur les animaux

Toutes les interventions sur animaux seront réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant au maximum le stress des animaux. On ne peut cependant exclure le stress lié aux manutentions répétées lors des administrations intra-gastriques, des anesthésies, des changes et des pesées. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie légère. Au maximum, 3 prélèvements sanguins/animal sont prévus, avec des intervalles et des volumes adaptés et conformes à la règlementation. Le stress est limité, lié à la contention. Un isolement des mâles en cage individuelle est réalisé pendant 7 jours, juste en amont des mises en accouplement, ce qui peut générer un stress modéré pour ces mâles.

Devenir

les souris seront euthanasiées, pour prélever des tissus d’intérêt afin d’évaluer l’effet des expositions sur les différents paramètres de l’homéostasie (barrière intestinale, immunité, microbiote, métabolisme global) et de l’inflammation allergique. En fin de projet, les animaux reproducteurs seront proposés pour une réutilisation aux différents utilisateurs de l’Unité Expérimentale (sous accord éthique) sinon ils seront également euthanasiés.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n’est disponible pour tester l’impact des facteurs périnataux sur la descendance : ces effets résultent en effet du passage transplacentaire/dans le lait maternel d’une information (protéines alimentaires, molécules ou cellules inflammatoires en résultant...), et/ou d’un comportement impactant la mise en place in utero puis en période néonatale du système immunitaire et du microbiote intestinal chez le petit – les deux étant étroitement liés. L’impact de ces maturations altérées ne se révèleront que plusieurs semaines plus tard, sur la capacité à induire une tolérance ou au contraire une allergie. Cette étude nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal permettant d’analyser de façon intégrative ces différents facteurs. Un modèle mère-enfant et un modèle expérimental d’allergie alimentaire/de tolérance orale induite chez le rongeur seront ainsi mis en œuvre..

Réduction

Afin de limiter le nombre de conditions expérimentales potentiellement testées et donc le nombre d’animaux en expérimentation, nos expériences seront basées sur les informations pertinentes obtenues par des analyses épidémiologiques (cohortes de naissance). La taille des lots est fixée à 8-12 animaux/lot, selon les taux de reproduction et la descendance obtenue. Ce nombre d’animaux à inclure est déterminé par notre expérience, et permet de prendre en compte la forte variabilité interindividuelle observée sur les paramètres mesurés, tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Des analyses statistiques seront dans un premier temps réalisées sur l’ensemble des paramètres mesurés pour chaque animal, permettant d’identifier tout individu ou toute variable aberrante. Des analyses statistiques seront ensuite menées, visant à construire un modèle discriminant nos groupes de traitement à l’aide de tous les paramètres analysés, et permettant d’identifier les groupes de variables permettant de discriminer les lots. Des analyses sur chaque paramètre mesuré pris individuellement seront réalisées en parallèle, afin de confirmer nos observations. La combinaison de ces approches statistiques permettra une analyse objective et maximisée de l’ensemble des paramètres analysés.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux sont réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant le stress des animaux. Les cages sont enrichies par des sopalins et des coques type boîte à œuf, permettant la fabrication d’un habitat et des nids. Les animaux sont hébergés par groupe, avec une taille de cage règlementaire adaptée au nombre d’animaux, permettant un comportement grégaire et sociable. Les cages sont placées dans des portoirs ventilés, permettant une isolation phonique vis-à-vis de l’extérieur. Les animaux sont surveillés visuellement quotidiennement pour identifier rapidement tout animal en souffrance. Des points limites sont établis pour identifier ces animaux. Si un tel animal est identifié, une fiche de suivi individuel est initiée et l’animal sera isolé afin de faciliter son rétablissement et surveillé spécifiquement plusieurs fois par jour, par les zootechniciens et les responsables de la procédure. En cas de non amélioration, il sera sorti de la procédure expérimentale et euthanasié. Par ailleurs, chaque animal est suivi par mesure hebdomadaire de son poids.

Choix des espèces

Le modèle souris présente de nombreux avantages, notamment la disponibilité de lignées caractérisées, un système immunitaire bien décrit, de nombreuses données sur la réponse allergique. De plus, de nombreux réactifs permettant l'étude du système immunitaire sont disponibles chez cet animal. La souche de souris utilisée est particulièrement utilisée dans nos protocoles du fait d’un phénotype biaisé vers une réponse immune mimant le sujet atopique (c’est-à-dire la prédisposition génétique à développer une allergie). Ce modèle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire, ainsi que le modèle mère-enfant. La mère en devenir, gestante et/ou allaitante, sera exposée aux différents régimes alimentaires, à des doses réalistes, afin d’étudier l’impact de ces expositions en période critique sur la santé de la descendance, qui sera évaluée après le sevrage.