Procédures légères

Le bout de la queue est coupé chaque semaine pour prélever du sang, environ vingt fois sur cinq mois, chez 208 rats. Ils vont tous être tués pour prélever les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 192 d'entre eux reçoivent trois injections par semaine pendant quatre semaines d'un inhibiteur candidat contre le diabète de type 2, et 48 subissent un test métabolique de deux heures avec cinq prises de sang supplémentaires. Le porteur retient un rat rendu obèse par un régime riche en graisse et un rat GK spontanément diabétique, qu'il présente comme proches de la maladie humaine, l'inconfort lié à l'obésité étant qualifié de léger.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par un taux de glucose élevé dans le sang du à une diminution du nombre de cellules qui sécrètent l'insuline (les cellules bêta du pancréas) et à une diminution de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles (foie, tissus adipeux et muscle). La prolifération des cellules bêta du pancréas est modulée par une enzyme et les inhibiteurs de cette enzyme se présentent comme des candidats médicament prometteurs pour le traitement du diabète. Ce projet se situe dans la continuité des travaux en cours dans notre équipe sur un nouvel inhibiteur sélectif. Nos résultats de cette première étude montrent que le traitement à l'inhibiteur entraine une augmentation de la prolifération et donc du nombre de cellules bêta et une réduction des taux de glucose sanguin chez le rat diabétique. Nous proposons à présent d'étudier les effets de cet inhibiteur sur les tissus cibles de l'insuline afin d'établir si le traitement améliore l'action de l'insuline. Nous analyserons les effets de l'inhibiteur dans deux modèles : un modèle de diabète de type 2 spontané, le rat GK (Goto-Kakizaki), caractérisé par une légère diminution de la sensibilité à l'insuline sans obésité associée, et un modèle d'obésité avec une réduction importante de la sensibilité à l'insuline induit par un régime riche en graisse (HFD, High Fat Diet). Ces différents modèles sont nécessaires en raison de leur complémentarité (diminution de la sensibilité à l'insuline, obésité ...) pour disséquer au mieux les effets de l'inhibiteur sur ces maladies métaboliques présentes chez l'humain. De plus, cette étude sera effectuée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique à l'inhibiteur peut améliorer l'action de l'insuline sur ses tissus cibles dans les deux sexes. Nous utiliserons le rat sain Wistar (mâle et femelle) comme contrôle de ces deux modèles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de cette étude sera d'identifier l'inhibiteur de DYRK1A comme candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée chez les patients diabétiques de type 2. Les résultats positifs de notre projet en cours sur la croissance des cellules bêta pancréatiques implémentés par cette nouvelle étude sur la résistance à l'insuline nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique "curative" plus complète, capable de limiter la progression du diabète grâce à la restauration d'une masse cellulaire bêta fonctionnelle et une amélioration de la sensibilité à l'insuline de ces tissus cibles chez le patient diabétique de type 2.

Procédures

Tous les animaux (208 rats) subiront plusieurs prélevements d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant toute la durée du projet (environ 20 prélèvements sur 5 mois). Ce prélèvement dure quelques secondes et engendre une douleur légère. 144 animaux subiront 2 prélèvements de sang pour les dosages d'insuline: - un prélèvement avant et un prélèvement à la fin du regime. Ce prélèvement dure moins d'une minute. 192 animaux subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (3 injections par semaine pendant 4 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, 48 rats subiront une injection et 5 prélevements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Contrairement aux inhibiteurs "classiques" qui provoquent bradycardie et tachycardie, la nouvelle génération d'inhibiteur utilisée dans ce projet, n'induit pas de toxicité ni de neurotoxicicté du fait qu'il ne traverse pas la barrière hématoencéphalique. Les légers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure lors de l'injection du traitement mais également à la piqure lors de l'injection du glucose et de l'insuline pendant les tests métaboliques, ainsi qu'a la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. De plus, l'obésité générée par le régime riche en graisse peut induire un léger inconfort pour les animaux. L'étude sur la signalisation de l'insuline n'entraine pas de nuisance car les prélèvements sont effectués post mortem.

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Cette étude sur la signalisation insulinique nécessite de travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in vitro, notamment sur des lignées de cellules immortalisées, ou ex vivo, sur des îlots de Langerhans isolés permettent uniquement de mettre en évidence des mécanismes spécifiques, mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements. Ainsi pour atteindre notre objectif spécifique, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable. Le choix du rat Wistar HFD et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'ils présentent de grandes similitudes dans leur physiologie et leur physiopathologie avec la maladie chez l'humain.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier l’implication de DYRK1A sur les voies de signalisation de l'insuline. Dans ce sens nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. En référence à nos études précédentes et en accord avec les tests statistiques, nous utiliserons des groupes de 8 animaux. L'impact environnemental de cette étude n'est pas source d'angoisse et de souffrance particulière.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de deux par cage pour respecter leur comportement social naturel. Les animaux diabétique auront une litière adaptée et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux. Les biberons seront renouvelés 3 fois par semaine. Les cages comprendont des batonnets de bois afin que les animaux puissent satisfaire leur besoin naturel de rongueur. Les rats seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique, le comportement et les modifications de poids selon un grille de score établie préalablement avec l'utilisation de points limites et de critères d'arrêt de souffrance adaptés.

Choix des espèces

Nous développerons notre projet en utilisant le rats Wistar et le modèle de rat Goto Kakizaki (GK). Le modèle Wistar est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité et des comorbidités associées telles que le diabète. Le modèle des rats GK est dérivé du rat Wistar et présente spontanément un diabète de type 2 au stade adulte. Les animaux non vertébrés n'ont pas de pancréas organisé comme l'humain et les rongeurs. De ce fait, le choix du rat pour cette étude réside dans les grande similitudes que cette espèces présente dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'humain. La génération de notre modèle nécessite l'utilisation de jeunes rats âgés de 6 semaines. Le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline chez ces rats nécessite au moins trois mois. De ce fait, le traitement pharmacologique ne pourra débuter que vers l'age de 4-5 mois. Les tests métaboliques et le test de signalisation insulinique seront effectués après 4 semaines de traitement pharmacologique, et donc les rats seront âgés entre 5 et 6 mois.

Six chats sont enfermés dix minutes deux fois par jour dans une cage individuelle devant une station d'alimentation, cathétérisés puis prélevés au sang. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et seront réutilisés ensuite, sous réserve de l'accord du vétérinaire de l'établissement. L'enjeu déclaré est de valider un appareil mesurant la masse grasse et la masse maigre par bio-impédancemétrie, en le comparant à la méthode de référence, qui repose sur des prises de sang. Le nombre de prélèvements reste ouvert, de trois à six par animal selon le nombre de cinétiques réalisées, et le porteur annonce qu'aucun effet indésirable n'est attendu.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont (1) d'évaluer, en conditions contrôlées, le fonctionnement d'une station d'alimentation permettant de mesurer la composition corporelle des chats (masse maigre et masse grasse, masse musculaire), et (2) de comparer cette méthode de mesure à une méthode de référence nécessitant des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux matériels permettant de déterminer la composition corporelle des chats sans réalisation de prises de sang est de nature à améliorer la connaissance, la détection, la prévention et la prise en charge des problèmes de surpoids et de santé du chat. Leur validation est un prérequis indispensable à leur utilisation, aussi bien en clinique qu’en recherche.

Procédures

Placement en cage lors de l'utilisation du dispositif d'alimentation : 10 min, 2 fois par jour, J1 à J22 +/- J36 à J43; administration intraveineuse (après pose d'un cathéter) : 1 min, 1 à 2 en fonction du nombre de cinétiques effectuées; prises de sang : 1 min, 3 à 6 en fonction du nombre de cinétiques effectuées.

Impact sur les animaux

L'utilisation de la station d'alimentation n'entrainera pas de modification de la quantité quotidienne ingérée et des horaires d'alimentation habituels des chats. Il n'y a pas d'effet indésirable attendu de l'administration et des prélèvements sanguins faits sur les chats.

Devenir

La procédure étant une procédure légère qui ne devrait pas avoir d'impact sur la santé des animaux, ils pourront être réutilisés (sous réserve de l'accord du vétérinaire référent de l'établissement utilisateur).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet, la station d'alimentation ayant pour but de mesurer des paramètres corporels (eau corporelle, masse maigre, masse grasse) chez l'animal. Cependant, cette étude permettra de valider le remplacement d'une méthode invasive actuelle (administration d'eau doublement marquée et prises de sang) par une méthode non invasive de détermination de la composition corporelle des chats.

Réduction

Cette étude est menée sur un nombre limité de 6 animaux car c'est une première étude exploratoire du dispositif d'alimentation. Des études complémentaires sur un plus grand nombre d'animaux ne seront à envisager que si les premiers résultats sont convaincants. Les études complémentaires pourront être menées avec des chats de propriétaire lors d'une étude clinique.

Raffinement

L'utilisation du dispositif se fera selon les conditions habituelles d'alimentation des animaux (pas de changement de la quantité d'aliment quotidien, pas de changement des horaires d'alimentation) afin de perturber le moins possible les habitudes des chats. La seule modification consistera dans le placement des stations d'alimentation dans des cages individuelles où seront placés les chats le temps de manger. Le placement des chats dans ces cages sera de très courte durée et a déjà été réalisé pour une précédente étude également pour les nourrir sans que cela n'ait d'impact sur les animaux. Les chats sont hébergés en groupe social stable, avec des plateformes, des jouets, des couchages, des brosses, des griffoirs et un arbre à chat à disposition. Pour faciliter les manipulations lors des prises de sang et les observations quotidiennes lors de la prise d'aliment, les chats sont régulièrement habitués à être manipulés lors de séances de socialisation et de medical training hebdomadaires. Les prises de sang seront limitées à un très faible volume (100 µL), ce qui permettra de préserver la veine prélevée et de limiter le risque d'hématome.

Choix des espèces

Espèce cible pour laquelle la station d'alimentation souhaite être validée. Animaux adultes car c'est la population cible pour l'utilisation de la station d'alimentation par la suite.

Pêchés à l'épuisette, anesthésiés par balnéation, amputés d'un morceau de nageoire caudale en cinq minutes, 3 750 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement sert à génotyper des lignées génétiquement modifiées et à repérer celles qui portent la combinaison de gènes attendue. Le porteur affirme que la nageoire se régénère complètement en vingt jours et que la douleur au réveil reste légère, et il pratique aussi ce prélèvement sur des larves de trois jours. 2 812 poissons au bon génotype sont gardés comme géniteurs, les 938 autres sont mis à mort.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de garantir la sélection et l’identification par génotypage de lignées de "poisson-zébre" génétiquement modifiées, à phénotype non dommageable.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’optimisation des effectifs des animaux et la gestion des élevages d’animaux génétiquement modifiés nécessaires aux expérimentations des chercheurs. L'élevage de ces modèles permettra de valider de nouveaux traitements contre des maladies neurologiques.

Procédures

Après anesthésie par balnéation, un prélèvement de la nageoire caudale sera réalisé, ce prélèvement est limité au minimum de tissus nécessaire, la nageoire caudale est capable de régénération complète en 20 jours. Temps de la biopsie (anesthésie incluse): 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables suite au prélèvement de tissus de la nageoire caudale sont un stress léger au moment de la pêche par épuisette, de l’anesthésie et une douleur légère suite au réveil associée à la coupure. Ce projet a pour but de minimiser au maximum tout signe de nuisances.

Devenir

Les poissons présentant le génotype d'intérêt sont gardés et utilisés comme géniteurs, les animaux ne présentant pas la bonne combinaison de gènes seront mis à mort.

Remplacement

Le développement du modèle animal poisson-zèbre est pour nous un choix incontournable car l'étude des maladies humaines comme les maladies neurodégénératives nécessite de considérer l'organisme entier. Il n'existe pas de méthode de remplacement pour le génotypage des animaux.

Réduction

Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Les effectifs pour chaque lignée sont discutés avec les utilisateurs, qui ont estimé leurs besoins par des méthodes statistiques. Nous nous appuyons également sur l’expérience zootechnique d’élevage, c’est-à-dire la variabilité individuelle des performances de reproduction. Afin d’améliorer nos pratiques, nous avons également mis au point un protocole de génotypage pour les larves de 3 jours, ce qui permet de sélectionner les animaux portant le génotype correct avant le stade de larve autonom. La croissance de la larve n’est pas altérée du fait des capacités de régénération de la queue en quelques jours. Le nombre d’animaux en élevage est donc réduit. Ce protocole à un stade précoce est limité au génotypage simple, sans séquençage des mutations, soit 1/4 des lignées.

Raffinement

Chez le poisson-zèbre, bien que la cicatrisation et la régénération des tissus de la queue soient rapides, les conditions d’isolement seront maintenues au strict minimum et les capacités de nage et de prise alimentaire seront contrôlées dès les premières heures après la biopsie. Une surveillance accrue au cours des 24h suivantes se fera en surveillant les points limites définis et validés avec la Structure du Bien Etre Animal: la prise alimentaire , le comportement de nage et l'activité globale .

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la création de modèle de pathologie humaine. Son développement embryonnaire rapide et externe, permet de modifier facilement son génome qui présente plus de 70% d’homologie avec celui de l’homme. La possibilité d’étudier les mécanismes biologiques dès les stades larvaires permet de suivre en microscopie à fluorescence et en comportement sensori-moteur, le développement des maladies modèlisées. Ce modèle permet de tester et valider de nouvelles stratégies thérapeutiques, qui pourront être appliquées chez l’Homme. La procédure s'applique aux animaux adultes.

Mettre à jour les tables nutritionnelles qui servent à formuler les aliments de plusieurs millions de porcs chaque année : 1 260 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont pesés au début et à la fin de chaque essai, puis enfermés seuls dans une case de 1 m² pendant les quatre jours de collecte des fèces, à trois stades de croissance, de 10 à 60 kg. Le porteur reconnaît que cet isolement stresse un animal sociable, que la réduction d'espace limite ses mouvements jusqu'à provoquer de l'ennui, et que les matières premières testées peuvent causer des diarrhées. Aucun cochon n'est tué dans le projet, tous repartant en case collective pour "continuer leur phase d'élevage classique", et le porteur qualifie ce travail d'"indispensable" pour mieux valoriser les matières premières.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à mesurer la valeur nutritionnelle des matières premières destinées à l’alimentation des porcs. Les tables nutritionnelles utilisées pour formuler les aliments nécessitent d’être régulièrement mises à jour car les matières premières évoluent en fonction des années ou encore de leur origine. Le maintien à niveau de ces tables nutritionnelles à jour permet de formuler précisément des aliments qui répondent au mieux aux besoins nutritionnels des porcs. Si une matière première est mal évaluée nutritionnellement, elle sera mal valorisée par l’animal : il faudra plus d’aliment pour le nourrir, les rejets dans les fèces seront plus importants, ce qui augmente l’impact sur l’environnement (nitrates par exemple). L’animal peut même être malade car il digère mal ce qu’on lui donne à manger. Ainsi, nous optimisons les aliments qui nourrissent plusieurs millions de porcs chaque année en France et dans le monde. Ce projet fait suite à un projet de 5 ans déjà avisé en 2014 et 2019.

Bénéfices attendus

Ce projet est indispensable pour mesurer des digestibilités et ainsi évaluer les matières premières : cela permettra ensuite de compléter des tables de valeurs qui permettent de formuler les aliments des porcs d’élevage (aliments qui correspondront mieux aux besoins de l’animal). Ce projet permet de maîtriser les consommations individuelles et de réaliser une collecte de fèces de bonne qualité (non souillés).

Procédures

Les porcs sont peu sollicités, il n’y a pas de prélèvements ou de procédures chirurgicales de réalisés sur animaux. Les animaux sont manipulés uniquement au début et à la fin de chaque essai pour être pesés. Les animaliers passent plusieurs fois par jour pendant les périodes de mesures, notamment pour collecter les fèces sur les plateaux sous les caillebotis, ce qui ne nécessite pas de contact avec les animaux.

Impact sur les animaux

En fonction des matières premières testées, les nuisances attendues peuvent être des modifications de consistance de fèces (voir des diarrhées). La nuisance liée à l’isolement peut être un stress car le porc est un animal sociable. Les nuisances liées à la réduction de surface peuvent être des mouvements limités ce qui peut causer un ennui ou une segmentation de l’espace plus difficile pour l’animal. Une baisse de consommation de l’aliment peut également être observée.

Devenir

Les porcs sont ensuite élevés dans des cases en groupe après l'essai pour continuer leur phase d'élevage classique.

Remplacement

Les évaluations de ces matières premières à partir d’analyses chimiques restent problématiques et les techniques in vitro utilisant des préparations enzymatiques sont encore délicates à mettre en œuvre. De plus, elles demeurent imprécises quand on cumule l’incertitude des modèles de prédiction à celle associée à la variabilité analytique. L’objectif de ce projet est d’évaluer des matières premières pour les utiliser dans l’alimentation animale (notamment en porcs), c’est pourquoi il est nécessaire de faire appel à des porcs. Nous utilisons des porcs à 3 âges différents car le système digestif évolue avec l’âge et que les aliments commercialisés dans les élevages sont différents selon le stade de l’animal (aliments 1er âge, 2ème âge, croissance). Ces mesures sont réalisées sur des animaux en croissance ce qui est le plus représentatif des animaux présents dans les élevages.

Réduction

La méthodologie utilisée détermine l’énergie digestible des matières premières sur des porcs de 3 âges différents (1er âge, 2ème âge, croissance). Grâce à la méthode par marqueur indigestible, nous ne sommes plus obligés, comme avant, de récolter la totalité des fèces. La contention des animaux est donc moins limitante et la durée de récolte est réduite à 4 jours par âge (vs 7 jours avec la méthode avant). La méthode ne nécessite plus de mise à jeun comme l’ancienne méthode. Pour le dispositif appliqué en phase croissance, les mêmes animaux sont utilisés pour tester 1 aliment sur 2 séries différentes, chaque série étant espacée par une période de « repos ». Quand les essais se succèdent, les animaux sont réutilisés pour limiter le nombre. Les essais 1er et 2ème âge durent chacun 3 semaines avec 6 répétitions par groupe (1 répétition = 1 case de 2 animaux), les essais croissance durent 31 jours avec 12 répétitions par groupe (1 répétition = 1 case de 1 animal). Dans chaque essai, 7 matières premières sont testées (1 témoin et 6 matières premières). Ce nombre de porcs a été calculé afin de pouvoir observer des différences significatives (pour une valeur de probabilité de 5%, soit une chance sur 20 que notre hypothèse soit fausse) sur la digestibilité entre les groupes. Ce nombre a été déterminé par un test statistique de puissance de notre dispositif expérimental (avec calcul de la ppds = plus petite différence significative que le dispositif permet de détecter entre les groupes).

Raffinement

Pour enrichir le milieu, une chaîne est installée dans chaque case. Cet enrichissement efficace permet aux porcs de mâchouiller ce matériau (sans l’ingérer, pour ne pas avoir de biais dans nos essais de digestibilité). Le module (=case) est configurable en deux versions grâce à des cloisons amovibles. Pendant les périodes d’adaptation, le module est en 1 seul espace de 3.2m² avec deux porcs. Le module est divisé en deux cases individuelles de 1m² uniquement pendant la phase de collecte (4 jours). Une fois les mesures terminées, les porcs sont ensuite replacés dans notre élevage dans des cases en groupe comme en élevage conventionnel. Les porcs sont peu sollicités, il n’y a pas de prélèvements sur animaux ou de procédures chirurgicales de réalisés. Pour limiter le stress et que les porcs s’adaptent à l’environnement, il y a d’abord une première phase d’adaptation sans manipulation, ni mesure, où les animaux sont placés à 4 /module pour les essais 1er âge et 2ème âge, à 2 modules pour les essais croissance. Les animaux sont manipulés uniquement au début et à la fin de chaque essai pour être pesés. Les animaliers passent plusieurs fois par jour pendant les périodes de mesures, notamment pour collecter les fèces sur les plateaux sous les caillebotis, ce qui ne nécessite pas de contact avec les animaux. La méthode indigestible par marqueur ne nécessite plus de mise à jeun des porcs. Des points limites sont mis en place pour s’assurer du bien-être des animaux dans le cadre de ce projet. En présence d’un seul signe clinique notable, un protocole de soins établi par le vétérinaire sanitaire est appliqué. Les signes cliniques sont notamment en lien avec la consistance des déjections, la présence de boiterie, de lésions, d’amaigrissement, de gonflements etc.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible. Porcs en 1er âge (environ 10 kg), 2ème âge (environ 20 kg) et croissance (jusqu'à 60 kg) afin d'obtenir des mesures correspondants aux besoins des animaux d'élevage à différents stades.

Chevaux d'expérimentation déjà en service, réutilisés d'un projet à l'autre après des périodes de repos, 10 équidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent jusqu'à vingt prélèvements de sang en cinq ans, de trois minutes chacun, et sont entraînés à uriner sur demande, pour constituer une banque d'échantillons dits "blancs" servant à mettre au point les méthodes de contrôle antidopage. Aucun n'est tué dans le cadre du projet. Ils restent en vie et réutilisables, sont confiés à des propriétaires privés au bout de dix ans de service ou avant, et le porteur écrit que l'usage de matrices biologiques de cheval est "indispensable" pour disposer d'échantillons de référence dans l'espèce contrôlée.

Objectifs

L’objectif est de disposer d’échantillons dits « blancs » pour le développement, la validation de méthodes de contrôles antidopage ainsi que pour constituer une banque d’échantillons dits « blancs » disponibles pour des développements de nouvelles techniques. Ces échantillons dits « blancs » c’est-à-dire dépourvus de toutes substances prohibées et/ou interdites, proviennent de chevaux d’expérimentation, suite à une période d'attente suffisante. Les prélèvements de sang et d’urine de l’animal peuvent alors être considérés comme échantillons témoins. Ces prélèvements biologiques sanguins et urinaires serviront - pour des développements de méthodes, - pour des contrôles intermédiaires et des suivis de ces méthodes - pour les dossiers de validation - pour des contrôles inter laboratoire - pour définir un échantillon blanc pour un nouveau projet de détection De plus, dans le cadre de la détection de nouvelles classes de molécules comme par exemple les anticorps, ces prélèvements pourront aussi servir de banque de données Ces échantillons vont aussi pouvoir servir à la validation de métabolites mis en évidence par des études de métabolisme in vitro.

Bénéfices attendus

L’utilisation de matrice biologique provenant du cheval est indispensable afin de réaliser des développements analytiques et aussi de disposer d’échantillons de référence.

Procédures

Le protocole comprend une unique procédure expérimentale répétable plusieurs fois dans l’année. Chaque procédure comprend un prélèvement de sang. La durée de ce prélèvement est d'environ 3 minutes. Le nombre de prélèvements cumulé sur 5 ans pour cette procédure n'excéde pas 20 prélèvements en tout sur 5 ans.

Impact sur les animaux

Légère douleur à la ponction veineuse lors des prises de sang.

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie pour être réutilisés pour d'autres projets après une période de repos suffisante. Ensuite, au bout de 10 ans de service ou moins si nécessaire, ils sont acceuillis en retraite par des propriètaires privés.

Remplacement

Remplacer : cette étude ne peut être réalisée que chez l’animal vivant et sur l’espèce cheval. Ces matrices biologiques serviront de base aux expériences in vitro permettant ainsi de limiter le recours ultérieur à des animaux vivants. L’utilisation de matrices biologiques provenant du cheval est indispensable afin de réaliser des développements analytiques et aussi de disposer d’échantillons de référence.

Réduction

Réduire : le nombre d’animaux impliqués est réduit au maximum. Ces essais sont généralement conduits sur un, deux ou trois chevauxà chaque campagne de prélèvements. La taille du cheval permet le prélèvement d’une assez grande quantité de sang ou d’urine par animal.

Raffinement

Raffiner : les chevaux sont quotidiennement surveillés et observés. Tout éventuel signe d’inconfort est noté afin d’optimiser les tests ultérieurs. La quantité de prélèvement varie d’un animal à l’autre afin de s’adapter aux possibilités physiologiques de chacun et ne pas aller au-delà du seuil de tolérance de chacun. Enrichissement par des sorties et propositions éducatives diverses. Les chevaux sont entrainés à uriner sur demande.

Choix des espèces

L’utilisation de matrices biologiques provenant du cheval est indispensable afin de réaliser des développements analytiques et aussi de disposer d’échantillons de référence dans l'espèce cible. Les chevaux recrutés sont des chevaux adultes, agés de 3 ans à 15 ans environ; l'âge et la race sont proches de ceux de la population de chevaux contrôlés quotidiennement.

Attrapés à partir de l'âge de deux mois, anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour être génotypés, puis isolés jusqu'à 72 heures en attendant le résultat : 2 250 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet porte sur l'entretien de lignées génétiquement modifiées pour l'étude d'une maladie humaine de la coordination des mouvements, dont les retombées thérapeutiques annoncées sont renvoyées à plus de cinq ans. Une quarantaine de reproducteurs et de reproductrices par lignée et par an sont gardés en vie jusqu'à 18 mois, puis remplacés tous les huit mois. Les autres sont tués pour ne pas garder d'animaux "non nécessaires" à la conduite du projet.

Objectifs

La maladie sur laquelle nous travaillons est une maladie génétique caractérisée par une dégradation progressive des fonctions sensorielles et motrices qui conduit à une perte des mouvements volontaires. Celle maladie est due à une diminution d’une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Plusieurs mutations ont été identifiées à ce jour, qui mènent à des symptômes différents d’un patient à l’autre. L'objectif de notre projet est de comprendre comment différentes altérations dans un même gène présentent des pathologies différentes. Nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire à l’Humain et sont transparents au stade où nous allons les étudier. Dans notre projet, nous allons étudier des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine défectueuse équivalente à celle retrouvée chez les patients. De plus, nous utiliserons des poissons présentant une absence du gène en question, entraînant l'absence de la protéine. En comparant ces deux mutations chez le poisson zèbre, nous voulons mieux comprendre comment les altérations du gène associé à la maladie conduisent à la pathologie, dans le but ultime de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur la protéine associée avec cette maladie. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes pathologiques, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

Le maintien de lignées de poissons-zèbres implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Ainsi, l’identification génétique (génotypage) des individus par prélèvement d’un morceau de nageoire caudale (

Impact sur les animaux

L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs sains. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement de phénotypes dommageables au fil du temps. Nous nous concentrons principalement sur les anomalies qui pourraient être liées à un système nerveux défectueux, comme d’anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité). Lors du maintien de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale (

Devenir

Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre comment les altérations dans notre gène d'intérêt retrouvées chez l’Homme entraînent différentes pathologies. Bien que la maladie affecte les neurones, on s'attend à ce que d'autres types de cellules entourant le neurone malade jouent un rôle important dans la pathologie. Les méthodes de culture cellulaire actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec tous les types de cellules, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.

Réduction

Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au minimum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres porteurs sains nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres porteurs sains nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une quarantaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Les renouvellement des géniteurs/génitrices ne se feront tous les 8 mois afin de réduire le nombre d’animaux. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus.

Raffinement

Seul le strict minimum d’animaux nécessaires au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum en couple le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous porteurs sains et ne présenteront pas de phénotype. Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. Des points limites précis et prédictifs ont été définis, et l’observation qu’un de ces points limites est atteint telles que blessures sur l’animal, anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac...) conduira à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.