Procédures légères

Pour comprendre comment une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers est régulée dans le muscle, 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Réparties en trois lots de 140, elles reçoivent une injection intramusculaire, une injection intraveineuse, ou deux injections suivies d'un transfert de gène localisé, chaque fois sous anesthésie. Le jour de la mise à mort, une mesure de contractilité musculaire de quinze minutes est pratiquée sous anesthésie, sans réveil, avant les prélèvements. Le porteur indique que les deux muscles tibialis antérieurs sont injectés chez chaque animal pour réduire l'effectif, et que toute souris montrant un signe de détérioration de sa santé est tuée immédiatement.

Objectifs

Une expansion anormale d’acides aminés dans une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers cause une maladie génétique musculaire appelée la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe). Le niveau de cette protéine est très bas dans le muscle mais très peu de choses sont connues concernant la régulation de cette protéine dans le muscle. Ce projet consiste à étudier sa régulation dans le muscle squelettique in vivo. Dans ce projet, nous modulerons plusieurs facteurs décrits comme régulateurs de cette protéine, afin d’étudier leurs effets sur l’expression de la protéine dans le muscle in vivo. Cette étude permettra de mieux comprendre sa régulation et d’envisager des approches thérapeutiques pour prévenir et limiter les conséquences de l'atteinte musculaire de l'OPMD.

Bénéfices attendus

L’étude de la régulation de l’expression d’une protéine mutée dans la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe) nous permettra de trouver des solutions pour restaurer un niveau fonctionnel suffisant de cette protéine dans les muscles atteints dans la maladie. Le bénéfice attendu est l’arrêt ou la diminution de la progression de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois interventions réalisées sous anesthésie. Le lot1 (140 animaux) sera soumis à une injection intramusculaire (sous anesthésie). Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectué sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie e et des prélèvements. Le lot2 (140 animaux) sera soumis à une injection intraveineuse (sous anesthésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements. Le lot3 (140 animaux) sera soumis à deux injections intramusculaires (sous anesthésie), suivi par un transfert de gène localisé dans le muscle (sous anesthésie et sous analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements.

Impact sur les animaux

Dans notre projet, nous injectons des AAV (virus adéno-associés) en intramusculaire (dans le muscle tibialis anterior) et en systémique (dans la veine de la queue) et nous réalisons un transfert de gène localisé dans le muscle. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants: effets sur les variables physiologiques (température, tension, oxygénation) pendant l'anesthésie. Après la mesure de la contractilité du muscle squelettique réalisée sous anesthésie/analgésie (durée d'environ 15 minutes), les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'anesthésie générale afin d'éviter tout effet indésirable ou douleur.

Devenir

Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organses (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise

Remplacement

L'expression d’une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers dans le muscle squelettique est étroitement contrôlée. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité présente in vivo et ne permettent pas d’arriver à une maturation comparable à celle in vivo justifiant le choix d’utilisant la souris comme modèle

Réduction

Chaque groupe sera constitué de 10 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris nous injecterons le muscle Tibialis Anterior de la patte gauche et de la patte droite. Au maximum un total de 420 souris seront utilisées dans ce projet. Des études préliminaires ont montré la faisabilité de cette approche (il n’y a pas d’interférence expérimentale entre l’injection de deux Tibialis Anterior). Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.

Raffinement

Pour le raffinement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à l’acte chirurgical, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les injections en intramusculaire et en systémique, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (8-40 semaines) : cela nous permettra d’analyser les changements de la régulation de notre protéine d’intérêt en modulant des protéines décrites dans la littérature comme ses régulatrices, dans un environnement contrôle adulte.

Capturées au verveux et laissées piégées jusqu'à quatorze heures, 900 anguilles européennes sont ensuite versées dans une cuve, endormies au bain d'anesthésique, mesurées, puis équipées d'une puce injectée dans la cavité abdominale. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et c'est au nom de sa sauvegarde que le porteur prévoit d'en marquer 300 par an pendant trois ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Il décrit le marquage comme un stress de moins d'une minute et l'anesthésie comme une nuisance de moins de cinq minutes, le temps de piégeage restant la contrainte la plus longue. Toutes les anguilles marquées sont remises à l'eau, le bac de réveil étant versé directement dans le fossé à poissons.

Objectifs

L’anguille européenne (Anguilla anguilla) est un poisson migrateur amphihalin (espèce migrant entre le milieu marin et le milieu d'eau douce) classé en danger critique d’extinction. Afin d'assurer sa sauvegarde, un plan de gestion national a été validé en 2010 pour mettre en place des mesures de reconstitution du stock d'anguilles européennes. Les actions se font sur les différents habitats (estuaire, marais, fluvial) et dans une démarche de suivi de l’évolution de la population des entrées de civelles (recrutement) aux sorties d’argentées (échappement). Le projet vise la migration de dévalaison (retour en mer) des anguilles sortant des marais salés. L’étude se fera sur une entité hydraulique indépendante, appelé localement fossé à poissons, alimenté en eau salée par les marées par un ouvrage unique d’entrée et de sortie et sans arrivée d’eau douce. Nous suivrons la cinétique de dévalaison des anguilles dans leur phase argentée, c’est-à-dire lorsqu’elles sont prêtes à retourner en mer pour effectuer leur migration de reproduction. Les anguilles seront capturées dans le fossé à poissons. Elles seront marquées avec une puce afin de suivre en continue leur dévalaison par la sortie unique qui sera équipée d’un système d’antennes de détection de marques automatique qui permettra de repérer l’identité et les horaires de passage des individus. Le projet permettra de connaître la cinétique de dévalaison des anguilles afin de caractériser notamment la vitesse du processus ainsi que les mécanismes qui l’expliquent. Le principal objectif est d’analyser les fréquences de sortie des anguilles en lien avec les facteurs déclenchants cette migration (par exemple la luminosité, les conditions hydroclimatiques, la température, les coefficients de marée…). Par ailleurs, le suivi permettra de vérifier les périodes favorables de dévalaison pour proposer, le cas échéant, des mesures de gestion et connaitre le temps de transformation des anguilles jaunes en anguilles argentées dans ce type de milieu salé très particulier.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des connaissances sur la phase d’argenture des anguilles une fois leur croissance effectuée en marais salé. Également, il permettra de caractériser la cinétique de migration de dévalaison (retour en mer) et notamment, les périodes, la vitesse du processus ainsi que les mécanismes qui l’expliquent. L’aspect important du projet vise à mettre en avant l’apport des marais salé pour la production de géniteurs d’anguilles et de promouvoir sa conservation et sa gestion pour arriver à une sortie efficace de ces individus et au final un échappement en mer pour la reproduction. La production d’anguilles argentées est la première cible à atteindre (Plan de gestion national de 2010). Aussi, les résultats de ce suivi permettront de sensibiliser les propriétaires de fossés à poissons au fort potentiel de leur marais en production de géniteurs et à proposer une optimisation de la gestion des ouvrages de vidange.

Procédures

Les anguilles seront capturées en une seule fois avec un engin de pêche dans un fossé à poissons. Elles resteront piégées dans l’engin de pêche pendant maximum 14 heures. Puis, l’engin de pêche sera vidé directement vers un bac de stabulation composée d’une cuve cylindrique de 50L, et les anguilles seront prélevées par groupe de 20 avec une épuisette de taille adaptée à la taille de l'individu capturé (épuisettes en filet non abrasif) pour être déposées dans un bac contenant de l’anesthésiant. Une fois anesthésiés, elles seront prélevées une par une à la main (mains humides) et déposées sur un linge humide pour être mesurées et marquées avec une puce magnétique d'un poids permettant de respecter le ratio inférieur à 2% du poids de l'individu (marquage bref de quelques secondes). Elles seront ensuite déposées dans un bac de réveil avant d'être libérée directement dans le milieu naturel une fois réveillées. Afin de limiter la manipulation des individus, ils sont relâchés en versant le bac de réveil directement dans le milieu naturel, les anguilles repartent naturellement à l’eau.

Impact sur les animaux

La capture des anguilles constitue un premier moment stressant pour les individus d'une durée de 14h maximum. L'anesthésie constitue également une nuisance d'intensité légère de courte durée moins de 5 min. Le marquage constitue un autre moment stressant d'une durée très brève (moins d'une minute).

Devenir

Tous les poissons marqués seront conservés vivants et relâchés dans le milieu naturel.

Remplacement

L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique des déplacements dans le fossé à poissons donc en milieu naturel, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes de plus de 20 cm et argentées) afin d’obtenir des données pertinentes.

Réduction

L'objectif du projet est d’enrichir les connaissances scientifiques sur le comportement de la migration de dévalaison des anguilles argentées en marais salé. La bibliographie montre une estimation d’anguilles argentées de 44 kg/ha soit 30% du stock total (120 kg/ha) avec des individus de 25-35 cm. Le fossé à poissons étudié est suivi depuis 2007. Nous pouvons estimer un stock en place dans ce fossé de 1500 anguilles. En prenant le pourcentage de 30% pour la quantité d’argentées produites sur le premier hiver, on obtient un nombre d’argentées estimées de 450 individus. Pour comprendre la cinétique de sortie des argentées sur ce fossé sur les 3 années du suivi, nous prévoyons de marquer chaque année les anguilles argentées mais également les anguilles jaunes qui pourront s’argenter. Pour avoir des résultats robustes et avec la pose de 5 verveux nous pouvons estimer une capture autour de 20% du stock en place, soit une capture de 300 anguilles. Sur ce lot de 300 individus, 200 seraient anguilles jaunes et pourront se transformer en argentées, et 100 seraient anguilles argentées et prêtent à dévaler. L’objectif est de marquer 300 anguilles chaque année et de le répéter pendant 3 ans afin d’avoir des statistiques robustes. Ce choix de marquer 900 individus sur la durée du projet correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités intra-spécifique (sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif) et les paramètres environnementaux impliqués dans la phase de migration (saisonnalité, débit, température, blocages…). Ce nombre de poissons représente une part extrêmement faible de prélevement sur l’ensemble des fossés à poissons du marais (surface totale de plus de 9000 Ha, estimation à 0,025% de prélèvement du stock en place).

Raffinement

Pour la phase de capture, l’oxygène et la température sont mesurés à la pose des verveux. Les verveux sont vidés délicatement dans des cuves cylindriques de 50 L pleines d’eau prélevées dans le même milieu que celui de capture des anguilles. L’opération sera faite à l’abri du soleil pour protéger les anguilles d’une exposition lumineuse trop forte. Un couvercle sera disposé sur les bacs pour éviter de stresser les anguilles. La stabulation des individus a lieu pendant un temps réduit (moins de 2h). La teneur en oxygène sera mesurée, un bulleur sera ajouté dans les bacs et l’oxygène sera contrôlé régulièrement. Si la teneur en oxygène est inférieure à 3 mg/L les anguilles ne seront pas manipulées ni marquées. Les individus présentant des pathologies externes ou amaigris sont écartés de la manipulation et remis à l’eau directement. Des lots de 20 anguilles maximum sont ensuite prélevés à l’aide d’épuisette nylon de maille 1,5 mm pour ne pas abimer les anguilles, pour être placées dans un bac noir avec couvercle contenant l'anesthésique. L’eau est claire et une vérification des différentes phases de l’anesthésie des individus est effectuée. Le stade d’anesthésie recherché est l’immobilisation. Une fois anesthésiée, les marques stériles sont insérées par injection dans la cavité abdominale. Le marquage se fera à l'abri du soleil et prendra quelques secondes. Puis les anguilles seront placées dans un bac de réveil de contenance 50 L rempli avec l’eau du milieu naturel du fossé. L’oxygène de ce bac est vérifié en permanence. Un bulleur sera placé pour améliorer la teneur en oxygène. Une vigilance des opérateurs sera apportée au raffinement dans toutes les étapes de la procédure : • Acclimatation à l’eau de la rivière (contrôle de la température et de l’oxygène dans les bacs), • Marquage de poissons sains, • Capture avec épuisette réduite, • Cuve de réveil avec l’eau du milieu de libération pour observer le comportement du poisson marqué, • Surveillance des poissons pendant toutes les phases, de la capture au lâcher.

Choix des espèces

L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique de dévalaison des anguilles en milieu naturel dans les fossés à poissons de marais salé, il est indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes et argentées). Nous utiliserons les anguilles jaunes de plus de 20 cm et les anguilles argentées afin d’analyser les cinétiques de migration de dévalaison dans un fossé à poissons de marais salé en connexion avec l’estuaire.

Chauves-souris endémiques de La Réunion, oiseaux, rats, tangues, geckos et amphibiens, le projet cible toute la communauté de vertébrés d'un même site. 600 animaux sauvages vont être capturés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, soit 200 oiseaux, 100 chauves-souris, 100 petits mammifères terrestres, 100 reptiles et 100 amphibiens. Chacun subit en cinq à dix minutes un écouvillon de fèces, un prélèvement d'urine, un écouvillon buccal, une prise de sang et un retrait de parasites, sans anesthésie pour les oiseaux, que le porteur juge plus risquée que les gestes eux-mêmes. La capture peut provoquer hyperthermie, déshydratation, essoufflement et cyanose des muqueuses, et si la plupart des animaux repartent, les individus des espèces visées par un arrêté préfectoral de destruction, rats noirs, rats bruns, souris grises, tangues, musaraignes, agames et geckos verts non indigènes, ne sont pas relâchés.

Objectifs

L’émergence des zoonoses (maladie causée par un agent infectieux pouvant se transmettre entre l’homme et d’autre animaux vertébrés) est liée à un ensemble de facteurs environnementaux, populationnels et intrinsèques aux agents infectieux. L’étude de ces facteurs permet d’évaluer le niveau de menace associé aux agents infectieux, mais également leur risque d’émergence, en particulier dans les populations humaines. Les zoonoses impliquant, par définition, des échanges d’agents infectieux entre des espèces animales vertébrées et l’homme, l’estimation du potentiel de sauts d’espèces de ces agents infectieux est une étape incontournable à l’évaluation du risque. Le franchissement de la barrière d’espèce est cependant conditionné par les contacts, directs ou indirects, entre espèces de vertébrés, mais aussi par les propriétés moléculaires des agents infectieux et leur capacité à se multiplier et se transmettre dans de nouvelles espèces. A La Réunion, quatre familles virales ont été décrites chez le Petit Molosse (Mormopterus francoismoutoui) : les Coronaviridae, les Paramyxoviridae, les Astroviridae et les Rhabdoviridae. Les analyses phylogénétiques réalisées sur ces virus semblent indiquer la possibilité d’échanges entre chauves-souris, rongeurs, et potentiellement oiseaux, en particulier pour les Paramyxoviridae et les Astroviridae. Le sens de ces échanges de virus (chauves-souris vers autres groupes taxonomiques, ou inversement), de même que la fréquence, le mode de transmission (par contact ou transmission environnementale) ou encore la capacité de ces virus à induire une excrétion virale assurant une transmission pérenne chez une nouvelle espèce, sont des aspects pour lesquels nous n’avons pas d’élément de réponse. L’objectif de ce projet est d’estimer le potentiel de changement d’hôtes des virus associés au Petit Molosse. Nous nous focaliserons sur les Coronaviridae, les Paramyxoviridae et les Astroviridae, pour lesquels la présence d’ARN viral a été mise en évidence à de nombreuses reprises. Les Rhabdoviridae ne seront pas inclus dans cette étude, étant donné qu’ils ont été mis en évidence uniquement sur la base d’analyses sérologiques (6), que leur détection sur des chauves-souris vivante est extrêmement rare, et du fait de leur potentiel limité à s’implanter durablement chez de nouveaux hôtes

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mettre en évidence des échanges des virus entre les chauves-souris et les autres espèces de vertébrés partageant le même habitat, et de déterminer le sens de ces échanges. La prise en compte du statut des espèces à La Réunion, indigènes ou introduites, permettra de confirmer la transmission de virus depuis des espèces synanthropiques (e.g. rats, pigeons) vers le Petit Molosse, seule espèce de mammifère endémique sur l’île. Nous apporterons également des réponses sur le mode de transmission inter-espèces, par l’analyse d’échantillons environnementaux (e.g. guano, terre, eau). Pour les Coronaviridae et les Paramyxoviridae, la faible diversité génétique permettra l’application de systèmes de détection spécifiques, de quantifier la charge virale et de confirmer le statut de réservoir de ces espèces. L’analyse de la diversité génétique des Astroviridae confirmera l’hypothèse d’une circulation « écosystémique » de ces virus. L’ensemble de ces résultats affinera notre évaluation du risque zoonotique associé à ces « virus réunionnais ».

Procédures

Pour chaque animal, les prélèvements suivant seront réalisés : (i) un prélèvement de fèces par écouvillon ou collecte dans le sac de contention, (ii) un prélèvement d’urine pour les mammifères, (iii) un prélèvement de salive (écouvillon oropharyngé ou buccal), (iv) une prise de sang (excepté pour les amphibiens), et (v) des parasites hématophages (pour les oiseaux et mammifères). L'ensemble de ces prélèvements durera environ 5 minutes pour chaque animal. L’anesthésie des oiseaux étudiés dans le projet représente en soit une procédure de classe supérieur à celle qui sera réalisée ici. Afin de limiter le stress des oiseaux nous n'anesthésierons donc pas les animaux dans le cadre de ce projet.

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sur animaux sont toutes légères et courtes, mais le cumul de gestes est à prendre en compte car la durée de capture sera en conséquence plus longue. Nous estimons la durée de marquage et de prélèvements biologique (écouvillons et prise de sang) de 5 à 10 minutes par animal (quel que soit le groupe taxonomique). Toutes les espèces concernées étant des espèces sauvages non captives, l’ensemble des procédures induira un stress sur les animaux. Les nuisances attendues seraient des effets aiguës liés à la manipulation, mais nous n’attendons aucun effet sur le long terme, étant donné le caractère non invasif des procédures réalisées. Même si des mesures de raffinement et des points limites adaptés seront mis en place, nous pouvons observer des effets indésirables en relation avec le stress aiguë lié à la captivité : hyperthermie, déshydratation, essoufflement, cyanose (coloration anormale bleutée de la peau qui indique un manque d’oxygène dans le sang) des muqueuses, fatigue. La procédure de prélèvement sanguin serait la plus invasive. Nous pourrions observer exceptionnellement des hématomes sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront replacés, excepté les individus d’espèces soumises à un arrêté préfectoral de destruction ne seront pas relâchés dans l'environnement (Rat noir, rat brun, Souris grise, Tangue, Musaraigne, Agame des roches et geckos verts diurnes non indigènes).

Remplacement

Le projet porte spécifiquement sur la diversité et la transmission des agents infectieux chez des animaux sauvages, dans leur environnement naturel. Les espèces ciblées ne peuvent donc pas être remplacées.

Réduction

Le nombre maximal d'animaux utilisés sera de 100 à 200 par groupe taxonomique, ce qui permettra d'avoir un seuil de détection viral acceptable d'un point de vue statistique. Cette approche est en accord avec les stratégies d'expérimentation que nous avons utilisé dans le passé qui ont permis d'obtenir à la fois des résultats valides d'un point de vue statistique sans pour autant affecter la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux.

Raffinement

Pour les oiseaux, nous réaliserons les captures principalement à l’aube, pour une durée maximale de 5 heures. Nous éviterons de manipuler des oiseaux par temps de pluie, pour ne pas altérer l’étanchéité des plumes. La pose d'une bague permettra également d'identifier individuellement les oiseaux et de les relâcher immédiatement en cas de recapture. Pour les prises de sang, la vitesse normale de coagulation pour les oiseaux n'est pas connue, mais est habituellement considérée d'une durée d'environ cinq minutes. Le stress et les températures élevées sont susceptibles d'affecter cette durée. La fin de l'écoulement sanguin sera vérifiée avant le relâché des oiseaux. Enfin, l'hydratation des oiseaux sera réalisée de façon systématique avec une solution de glucose. Pour les chauves-souris, les captures se déroulerons le matin lors du retour des chauves-souris dans leur gîte, ou en fin d’après-midi afin de relâcher les individus au moment du coucher du soleil, heure normale à laquelle les chauves-souris partent s’alimenter. Les animaux seront capturés à l’aide d’un filet à papillon, en approchant délicatement les individus accrochés sur les parois de la grotte. Les chauves-souris seront immédiatement hydratées avec de l’eau et placées individuellement dans des pochons propres opaque, suspendus au calme et à l’ombre et recouverts d’un tissu polaire. Pour les petits mammifères terrestres, les animaux seront maintenus dans leur cage-piège à l’ombre recouvert d’un drap pour diminuer le stress avant manipulation. Un biberon d’eau sera proposé à tous les animaux quand ils seront encore dans leurs cages-pièges, avant le début de la contention. Une durée maximum sera fixée pour la réalisation de tous les actes dès lors que l’animal est contenu. Cette durée sera de 10 minutes maximum par individu, de la contention au relâché. L’environnement de l’animal pendant toutes les manipulations sera contrôlé : endroit calme, à l’abri du soleil, en sécurité, propre, avec une faible luminosité. Pour les reptiles et amphibiens, les captures se feront de deux heures après le lever du soleil à deux heures après le coucher du soleil. Cela permettra de couvrir l’ensemble des plages horaires d’activité des différentes espèces. Les animaux capturés seront placés dans des sacs en tissus pour diminuer le stress avant les mesures et seront relâchés sur la zone de captures.

Choix des espèces

Ce projet porte spécifiquement sur un ensemble d’espèces (communauté) partageant le même habitat. Nous ciblerons donc la totalité des espèces de vertébrés identifiées sur notre site d’étude : chauves-souris, oiseaux, petits mammifères terrestres, reptiles et amphibiens. Le nombre précis d’espèce ne peut être indiqué en amont du projet car il dépendra des opportunités de captures des animaux sur le terrain. Nous ciblons cependant : 1 espèce de chauves-souris, 10 espèces d’oiseaux, 5 espèces de petits mammifères terrestres, 11 espèces de reptiles et 2 espèces d’amphibiens. Les animaux seront classés en deux grandes catégories d'age pour ce projet : juvénile et adulte. Tous seront échantillonnés, excepté pour les amphibiens ou seuls les adultes seront capturés. Pour les autres groupes taxonomiques, les jeunes non sevrés ne seront pas capturés (poussins et jeunes mammifères non volant/sevrés).

Des entreprises clientes commandent ces études de distribution et le laboratoire leur facture le passage in vivo de leurs candidats médicaments. 1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une molécule marquée par un élément radioactif, subit jusqu'à dix prélèvements de sang, passe jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie et séjourne en cage à métabolisme, un stress que le porteur qualifie lui-même de modéré. Le RNT présente l'imagerie planaire comme un moyen d'évaluer la distribution "sans sacrifice des animaux", avant d'indiquer que tous les animaux de chaque procédure sont mis à mort.

Objectifs

Les études de distribution tissulaire de médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans leur développement. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Cette distribution est rendue possible par le marquage du médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L’objectif de ce projet est donc de suivre le devenir du médicament par la technique d’imagerie planaire, technique d'imagerie deux dimensions permettant de voir la localisation de la radioactivité du médicament dans l'animal et de faire une évaluation précoce du ciblage des molécules testées et de leur répartition vers les organes cibles et vers d’autres organes non-cibles (majoritairement foie et reins). L'imagerie planaire chez le même animal à différents temps post administration de la molécule radiomarquée permet d'évaluer la distribution de la molécule radiomarquée sans sacrifice des animaux contrairement à la biodistribution classique par prélèvement d'organe/tissus et permet ainsi de faire un screening rapide des molécules sur un nombre réduit d'animaux avant d'entreprendre des études de biodistribution plus poussées pour les molécules prometteuses. Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de médicaments préalablement marqués par un élément radioactif non toxique aux doses utilisées afin de tracer et de suivre par imagerie ces candidats dans les différents tissus et les fluides biologiques d’intérêt. Ces médicaments ont été testées chez nos clients et sont connus pour ne pas présenter d’effets délétères. Ce sont des protéines, des peptides et/ou des anticorps dilués dans des tampons respectant la physiologie de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme (organes cibles et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études de distribution tissulaire avec quantification (l’imagerie permettant d’avoir une très bonne idée de la répartition du candidat mais sans quantification précise) et / ou d'efficacité dans le cadre d'autres projets.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (3 fois/semaine, 20 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour et 2 fois, 15 s) ; prélèvements de sang par microsampling (10 fois maximum, 1 min) Sur animal anesthésié : Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; Imagerie planaire (jusqu’à 10 fois ; 10 min ou une fois : 2 heures)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intramusculaire, voie intra péritonéale ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ; Stress modéré lié à la mise en cage à métabolisme.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organe ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale ; Fin de l’étude

Remplacement

Les molécules testes de nos clients ont fait l’objet d’études d’efficacité in vitro et/ ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autre de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Les groupes d'animaux utilisés sont en théorie de 2 maximum. En effet, la caméra planaire permet une vision fiable, rapide et reproductible de la distribution tissulaire. Elle peut représenter une étape préalable de validation rapide de candidats médicaments qui pourront être évalués dans un second temps par des méthodes quantitatives et robustes si pertinent. De plus, les biodistributions classiques entraînent la mise à mort des animaux à chaque temps d’intérêt. La mise en place de l’imagerie planaire par notre laboratoire permettra un suivi longitudinal des animaux et un nombre d’animaux utilisés bien moins important que classiquement.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 à 3 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similitude de sa biologie par rapport à l’Homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Pour estimer combien d'anguilles les stations de pompage agricole aspirent du Rhône vers des canaux fermés à la mer, 7 500 anguilles européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune est anesthésiée cinq à dix minutes, reçoit sous la peau une puce RFID de 8 millimètres, puis passe une heure en bac oxygéné avant d'être relâchée près de son lieu de capture. Le porteur liste le stress, la perte de mucus et d'écailles, la dessiccation, l'éblouissement et un saignement léger à l'injection. Les individus marqués mesurent tous plus de 40 centimètres, des anguillettes juvéniles aux femelles matures, dans une espèce en danger critique d'extinction que le porteur dit ne pas pouvoir remplacer puisqu'elle est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer.

Objectifs

Sur le delta du Rhône, il y a une multitude de stations de pompages qui puisent l'eau du Rhône vers des canaux d'irrgation pour la riziculture. Ce pompage peut aspirer des poissons dont l'Anguille et les introduire dans des canaux qui ne sont pas connectés à la mer. L'étude de l'impact du pompage agricole sur les anguilles en Camargue vise à estimer les densités des Anguilles européennes (Anguilla anguilla, L., 1758) présentes dans ces canaux de drainage et comprendre quel est leur devenir, à savoir si leur migration de reproduction vers la mer est possible ou si les individus se retrouvent bloqués dans des systèmes fonctionnant à huit clos. L'étude utilise la technique de Capture-Marquage-Recapture, au travers de captures via des filets et marquage par puces RFID (Radio Frequency IDentification). L'objectif est d'estimer les densités présentes dans le canal du Barcarin, appartenant à l’Association Syndicale Forcée du canal du Japon et dans le canal de Corrège Major situé plus au Nord de l'Etang du Vaccares. Ces milieux seront échantillonnés au verveux chaque année du projet afin de recapturer les anguilles marquées et estimer la densité d'anguilles. Si ces milieux présentent de fortes abondances, il faudra proposer des mesures de gestion visant à limiter l'introduction d'anguilles ou alors des mesures de gestion visant à capturer ces anguilles et les tranférer dans un milieu connecté à la mer.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des densités d'anguilles présentes dans les canaux de drainage de Camargue et du devenir de ces individus permettra d'engager des mesures de gestion afin de faciliter voire améliorer les possibilités de retour en mer pour cette espèce classée en Danger critique d'extinction.

Procédures

Anesthésie profonde (5-10 minutes), puis implantation d'une puce RFID de 8 mm (environ 1 minute) avec un injecteur unique, suivi d'un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation puis un bac de surveillance (environ 1h en observation).

Impact sur les animaux

Stress et changement de comportement. Nuisance induite par l'anesthésie : répulsion du produit Nuisance induite par la biométrie : stress des individus, perte de mucus, perte d'écailles, dessication, éblouissement Nuisances induites par le marquage : saignement léger lors de l'injection, stress et douleur/gêne post-opératoire de courte durée

Devenir

Toutes les anguilles capturées sont relâchées dans le milieu naturel, à proximité immédiate de leur lieu de capture.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvages dans leur milieu naturel. De plus, l'Anguille est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer. Il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre

Réduction

Le marquage est limité à 1500 individus par an. Cette approche permet d'estimer des densités par capture marquage recapture et nécessite de marquer toutes les anguilles capturées. Les anguilles de moins de 40cm ne sont pas marquées et sont remises à l'eau.

Raffinement

Le projet prévoit de capturer les anguilles aux verveux car c'est la méthode de pêche connue pour être la moins impactante pour ces poissons. Pose des verveux la veille au soir et relève le lendemain matin pour limiter au maximum le stress des individus. Seules les anguilles de plus de 40cm seront marquées afin de limiter le caractère intrusif des pit tags de 8mm en sous cutané. Les anguilles de moins de 40cm sont triées à l'oeil sans anesthésie et relâchées. Les anguilles de plus de 40cm sont transférées dans un bac permettant une anesthésie profonde (Benzocaïne (50-100 mg/L) ou Tricaïne MS222 (100-150 mg/L, tamponnée avec du bicarbonate de soude)). Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant la stabulation (blocs pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité nombre d'individus limité à 5 pour chaque bac). Une fois que les anguilles ont récupéré un comportement normal elles sont placées pendant 1h dans des bacs oxygénés et placés dans l'obscurité avec une température optimale pour les animaux (changement de l'eau du bac si augmentation de température de plus de 2°C). La taille des marques est réduite à 8mm car il n'y a pas besoin de détecter les anguilles sur des antennes fixes qui nécessitent des marques de 23mm. Avant le marquage, les anguilles se verront administrer une solution d'analgésique (Lidocaine 1mg/kg dilué au quart dans du chlorure de sodium, 0,05mL/kg) à proximité de la zone d'insertion du pit tag. La méthode de suivi ici est la recapture et détection par scanette RFID. La recapture se fait les années suivant le marquage uniquement.

Choix des espèces

L'Anguille européenne est le seul migrateur amphihalin dont la reproduction se déroule en mer. En Camargue, les densités et modalités de retour en mer pour les individus présents dans les canaux de drainage sont mal connus. Les anguilles marquées sont des individus de plus de 40cm, soit des "anguillettes" (juvéniles de moins de 3 ans), des "anguilles jaunes" (Femelles stade 1 et 2 immatures), des anguilles jaunes en cours de métamorphose (Femelle stade 3) et des anguilles argentées (Femelle stade 4 et 5 ou males dévalant corresponndant à des anguilles suffisamment matures pour rejoindre a mer et se reproduire). Cette classification des individus a été proposée par la chercheuse Caroline Durif en 2009

7 010 souris immunodéficientes ou dystrophiques vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte infligé est une biopsie de la queue, pratiquée une fois sur l'animal juvénile pour vérifier son génotype, avec une douleur brève et un risque d'infection au point de prélèvement que le porteur reconnaît. Ce projet ne produit par lui-même aucune connaissance, il sert à élever et à trier des lignées destinées à d'autres protocoles, le porteur affirmant que ces souris sans défense immunitaire sont "indispensables" pour tester des cellules humaines sans immunosuppression. La grande majorité des animaux part vers d'autres projets d'expérimentation, ceux du mauvais génotype et les anciens reproducteurs étant tués.

Objectifs

Nous travaillons avec quatre lignées de souris à phénotype dommageable où une biopsie sear nécessaire afin de génotyper les animaux : une lignée de souris immunodéficiente (sans défense immunitaire), deux lignées de souris immunodéficientes et dystrophiques et une lignée de souris dystrophiques. Nous nous intéressons au muscle squelettique et nos recherches sont orientées à comprendre la régénération musculaire, essentiellement chez l’homme. Les souris immunodéficientes et les immunodéficientes avec dystrophies sont essentielles puisqu'elles nous permettent de tester in vivo le comportement de cellules humaines, murines ou même des vecteurs viraux sans adopter un traitement d’immunosuppression de l’animal. La lignée de souris dystrophique est elle essentielle pour pouvoir étudier la régénération musculaire dans sa globalité en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques. L’objectif est donc la génération de lots de souris immunodéficientes et dystrophiques du bon génotype indispensables pour mener à bien nos projets de recherche.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet (souris immunodéficientes et dystrophiques) permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur la régénération musculaire dans les dystrophies musculaire chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La régénération musculaire est un processus qui est altéré notamment dans la dystrophie musculaire de Duchenne (la dystrophie la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant qui affecte l’ensemble des muscles du corps et qui touche un garçon sur 3500 nés) et dans la dystrophie musculaire des ceintures (un groupe de maladies neuromusculaires qui touchent les muscles situés dans la région scapulaire et pelvienne)

Procédures

Nous élèverons différentes lignées mutines à phénotype dommageable (immunodéficientes et/ou dystrophiques) pour lesquels un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourraient induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Si un phénotype se déclare, les animaux pourront avoir un risque d'infection accrue ou bien une attente musculaire légère pouvant induire une mobilité réduite (suivant le modèle animal).

Devenir

La grande majorité des animaux seront transférés pour expérimentation et affectés à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont déjà en cours, d’autres sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Les animaux du mauvais génotype et les anciens reproducteurs seront euthanasiés.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant à la régénération musculaire et à la mise en place des pathologies musculaires. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.

Réduction

Les souris générées dans ce projet seront transférées pour expérimentation dans d’autres procédures expérimentales où le nombre des souris sera attentivement étudié et réduit au maximum utilisant par exemple des tests statistiques adéquats, des méthodes de calcul de la taille des groups (7010 animaux estimés pour 5 ans). Le choix attentif de ces éléments permettra de réduire aussi le nombre de souris à générer dans cette demande d’autorisation. En outre, le nombre d'accouplement en cours sera régulièrement réévalué en fonction des besoins des projets.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Pour éviter l'apparition du phénotype des animaux, ils sont maintenus sous un statut sanitaire stricte en conditions stériles, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique. Des animaux immunodéficientes sont indispensables pour pouvoir tester in vivo le comportement de cellules humaines ou des vecteurs viraux sans adopter un régime d’immunosuppression de l’animale. Les animaux dans cette procédure genotypés entre 7 et 14 jour de vie puis utilisés à l’âge adulte pour constituer des accouplements. Les animaux générés dans cette procédure et impliquée dans d’autres procédures seront utilisés à l’âge adulte.