Procédures légères
Etude, chez la souris, des circuits cérébraux impliqués dans la schizophrénie
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Sur les 4 660 souris utilisées, 3 040 le sont dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 620 dans des procédures d'un niveau modéré, une partie relevant du seul maintien des lignées génétiquement modifiées. Toutes sont tuées, cerveau prélevé. Les autres subissent une biopsie, des injections intracérébrales, une chirurgie d'imagerie de 45 minutes sous anesthésie, puis des tests d'interaction sociale, d'inhibition du prépulse et de contrôle attentionnel étalés sur sept jours, pour étudier les circuits cérébraux de la schizophrénie. Le porteur affirme qu'aucun remplacement n'est possible pour le maintien des lignées et présente les manipulations génétiques comme "indispensables".
Objectifs
Le cortex préfrontal est une région clé du cerveau impliquée dans des fonctions cognitives importantes comme l'attention et la mémoire. Dans des troubles psychiatriques tels que la schizophrénie, cette zone montre des altérations de l'activité neuronale. La schizophrénie se manifeste par des hallucinations, des délires, et des difficultés sociales et cognitives. Nous explorons comment des mutations spécifiques influencent ces dysfonctionnements en utilisant la génétique, le comportement animal, et l'imagerie cérébrale. Ce projet vise à mieux comprendre la schizophrénie et à développer de nouvelles stratégies de traitement pour cette maladie complexe.
Bénéfices attendus
Cette recherche est essentielle pour mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la schizophrénie pour trouver d’autres solutions thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Réalisation de biopsies (une fois, durant quelques secondes). 2) Anesthésie générale (durée : 30 minutes-45 minutes). 3) Injections intracérébrales (durée : 30 minutes). 3) Chirurgie pour l’imagerie cérébrale (durée : 45 minutes). 4) Injections des agonistes/antagonistes (30 secondes environ). 5) Prélèvement des cerveaux pour des analyses. 6) Test comportementaux pour évaluer la psychose et les déficits cognitives. Plus précisément, le test d'interaction sociale se déroulera pendant une durée de 10 minutes par souris, le test du « prepulse inhibition » (PPI) d’une durée de test environ 30 minutes et le test du contrôle attentionnel se déroule sur sept jours (20 minutes en total).
Impact sur les animaux
En général, toutes les interventions sont bien tolérées par l’animal et n’affectent pas le phénotype général de la souris. La biopsie peut provoquer un stress léger et l’anesthésie générale peut provoquer également un stress léger. Concernant la chirurgie, les nuisances comprennent douleur modérée post opératoire. Concernant les injections sous-cutanées, une douleur de classe légère peut survenir. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure un stress léger de la manipulation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin d'effectuer des analyses dans le cerveau.
Remplacement
Concernant le maintien des lignées aucun model de remplacement n’est possible. Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact normal et malade, ces expériences ne seraient pas possibles avec la culture cellulaire. De plus, l’utilisation d’un modèle animal est une nécessité pour cette étude qui nécessite une approche comportementale. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris transgéniques sont le seul modèle de référence pour étudier l'effet cholinergique sur le comportement cognitif et de faire de l'imagerie cellulaire en temps réel.
Réduction
La stratégie que nous avons utilisée pour maintenir les lignées de souris est calculée de manière à minimiser au maximum le nombre de souris. Le nombre de cages pour les élevages a été réduit au maximum afin d'obtenir la production minimale nécessaire pour nos expériences. Afin de réduire au strict minimum nécessaire le nombre d’animaux, nous utiliserons une analyse de puissance statistique pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires afin d’obtenir un résultat scientifiquement fiable. De plus, les données seront analysées avec des tests statistiques adaptés et si la significativité est atteinte avec un nombre d’animaux plus faible que prévu, les expériences seront arrêtées.
Raffinement
Le maintien, marquage et biopsie sont assurés par du personnel compétent et en fonction de l'âge de l'animal afin de réduire au minimum toute souffrance éventuelle de l'animal. Les souris seront hébergées en groupe sociaux dans un environnement enrichi. Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les animaux sont surveillés quotidiennement (aspect physique, comportement, accès à l’eau et nourriture) par un personnel compétent. La chirurgie s’effectue sur un coussin chauffant et une sonde permet de monitorer la température de ce dernier pour préserver l’animal de l’hypothermie. Les actes chirurgicaux sont réalisés sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur par voie locale et systémique. Au cours de la chirurgie, une solution d’ocrigel est appliquée sur les yeux de l’animal pour les protéger de l’assèchement. Une injection sous cutanée de solution saline est effectuée en fin de chirurgie pour palier à la déshydratation de l’animal. A la fin de la chirurgie, les animaux sont placés sur un coussin chauffant jusqu’à leur réveil complet puis replacés avec leurs congénères en cage collective avec nourriture et eau volonté. En post-opératoire la douleur est prise en charge. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez la souris. La souris est un modèle de choix pour visualiser et enregistrer les types d’interneurones que nous voulons étudier dans ce projet. En plus, les souris peuvent être génétiquement modifiées pour des gènes spécifiques . Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone ou d’une très grande population de neurones simultanément. Les animaux transgéniques seront d'abord génotypés avant l'âge de 10 jours et ensuite utilisés à partir de l’âge adulte (8 semaines).
Rôle du TNF et du TNFR2 exprimé par les lymphocytes T régulateurs dans la physiopathologie des maladies auto-immunes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Modifiées pour que leurs lymphocytes T régulateurs n'expriment plus le TNF, son récepteur, ou les deux, 2784 souris vont être utilisées, 1788 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 708 un niveau modéré et 288 un niveau léger. Deux maladies leur sont provoquées, l'une proche de la sclérose en plaques, l'autre des maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur décrit une parésie puis une paralysie de la queue et des membres qui s'aggravent jusqu'au dixième ou vingtième jour, des nécroses ou des plaies au point d'immunisation nettoyées chaque jour, et des diarrhées après l'induction de la colite. Toutes sont tuées pour prélever la rate, les ganglions, le colon et le système nerveux central.
Objectifs
Les lymphocytes T régulateurs (appelé ici Treg) jouent un rôle majeur dans le contrôle des maladies auto-immunes. Des expériences chez l’animal montrent que l’injection de réactifs capables des stimuler les Treg ont un effet thérapeutique dans ces maladies. Elles constituent ainsi une cible thérapeutique de choix en médecine et les premiers essais cliniques visant à stimuler les Treg ont démarré. Il reste encore beaucoup à découvrir pour avoir des traitements efficaces et pour en comprendre les mécanismes. C’est pourquoi nous avons encore besoin de faire des expériences chez la souris pour atteindre ces objectifs. Nous avons montré qu’une des façons d’augmenter la fonction et la prolifération des Treg consiste à les stimuler par une cytokine inflammatoire bien connue appelé TNF. Dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, nous montrons cette cytokine agit de façon directe sur les Treg pour augmenter leur fonction suppressive et ainsi contrôler la maladie. De plus, l’injection d’une molécule stimulant le récepteur au TNF a un effet thérapeutique dans cette maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre par quels mécanismes la stimulation des Treg par le TNF est capable de réguler les maladies auto-immunes. C’est pour atteindre cet objectif que nous avons généré au laboratoire des souris dans lesquelles l’expression de l’une ou l’autre molécule, ou les deux à la fois, est éliminée dans les seules Treg. Ceci est possible grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Nous allons étudier dans un premier temps si l’ablation de ces molécules sur les Treg est susceptible d’induire une maladie auto-immune. Nous allons ensuite induire deux types de maladies auto-immunes chez ces souris. L’une apparentée à la sclérose en plaques avec une atteinte du système nerveux central et l’autre apparentée aux maladies inflammatoires de l’intestin avec une atteinte de cet organe. De plus, du fait de nos résultats obtenus au laboratoire et pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes, nous injecterons également des réactifs pour neutraliser la cytokine TNF ou son récepteur, ainsi que deux autres molécules impliquées dans le fonctionnement du système immunitaire. Ce travail devrait permettre de mieux comprendre comment nous pouvons moduler la fonction des Treg dans les maladies auto-immunes à des fins thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Des études préliminaires ont démontré l’importance de l’expression du récepteur au TNF dans les Treg dans la protection contre le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet nous permettra donc d’avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement du rôle du TNF et de son récepteur exprimé par les Treg des tissus lymphoïdes (rate, ganglions lymphatiques) et non lymphoïdes (cerveau, colon…). Ces résultats peuvent ouvrir des voies vers de nouvelles stratégies thérapeutiques ; en particulier chez des patients présentant des pathologies auto-immunes.
Procédures
L’expérience consistera à injecter des médicaments non toxiques par voie intrapéritonéale. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le tronc. On fera aussi des gavages qui dureront moins de 30 secondes par souris dont on fera une contention par le tronc. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand elles auront 2 mois d’âge (compter 5 à 10 secondes par souris). On effectuera des immunisations des souris par voie sous-cutanée qui dureront moins de 30 secondes et des injections par voie intraveineuse qui dureront moins de 60 secondes. Dans les 2 cas, les animaux seront anesthésiés. On fera également des gavages et des injections par voie intrapéritonéale qui dureront moins de 30 secondes chacun par souris dont on fera une contention par le tronc. On effectuera une chirurgie pour la perfusion intra-cardiaque sur animaux anesthésiés. Une fois anesthésié, l’opération prendra environ 2 minutes. On effectuera un suivi au moins 4 fois par semaine des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 30 secondes par souris. Enfin, pour l’euthanasie des souris, compter 5 à 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Dans une étude précédente, nous avons montré que la délétion du récepteur au TNF par les Treg n’induit pas d’inflammation spontanée. Il est maintenant nécessaire de confirmer une absence maladies inflammatoires chez les souris dans lesquelles le TNF ou son récepteur ne sont pas exprimés dans les Treg. Nous n’anticipons pas qu’il y ait d’inflammation dans la mesure où les souris déficientes pour le TNF n’en développent pas mais nous devons tout de même le confirmer. Pour le gavage et les injections par voie sous-cutanées, intrapéritonéale et intraveineuse, nous anticipons un stress et des douleurs légères chez les souris. Les nuisances principales seront observées suite à l’induction du modèle de sclérose en plaques et de colite. Dans le modèle de sclérose en plaques, les animaux peuvent avoir une activité extrême (grattage et léchage anormal) et peuvent présenter une nécrose ou une plaie au niveau du site d’immunisation. Dans ces situations les plaies seront nettoyées avec de la vétédine quotidiennement. Les signes cliniques de de parésie et paralysie de la queue et des membres augmentent progressivement jusqu’à la phase aiguë, 10 à 20 jours après l’induction de la maladie. Puis on a une phase de stabilisation et de lente rémission entre les jours 20 à 30. Suite à l’induction de colite, des diarrhées peuvent être observées durant la première semaine.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, colon, système nerveux central) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.
Remplacement
Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des Treg et que nous avons développé au laboratoire un modèle de souris génétiquement modifiées unique qui permet de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, nous effectuerons un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Sur les 5 années, nous utiliserons un total de 2784 souris. Du fait de la variabilité interindividuelle entre souris, nous utiliserons 6 à 8 souris par groupe et les expériences seront répétées 3 fois (3 réplicas biologiques). Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les mêmes souris témoins seront utilisées avec différents groupes de souris expérimentales. Pour chaque animal euthanasié nous prélèverons plusieurs organes lymphoïdes et non-lymphoïdes afin de collecter et analyser le plus de données possibles par animal. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Sur les 5 années, nous utiliserons un total de 2784 souris. Du fait de la variabilité interindividuelle entre souris, nous utiliserons 6 à 8 souris par groupe et les expériences seront répétées 3 fois (3 réplicas biologiques). Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les mêmes souris témoins seront utilisées avec différents groupes de souris expérimentales. Pour chaque animal euthanasié nous prélèverons plusieurs organes lymphoïdes et non-lymphoïdes afin de collecter et analyser le plus de données possibles par animal.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation de la Directive 2010/63 EU en cages ventilées d'une superficie de 500 cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h et avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris). L'enrichissement fourni est du sizzlnest pour le nid et une maison rouge dans chaque cage. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement. Par ailleurs, un gel ophtalmique analgésique sera appliqué sur l'oeil après injection dans le sinus rétro-orbitaire et les souris seront anesthésiées et mises sur un tapis chauffant dès que possible pour réduire le stress et la douleur lors des procédures.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’Homme et les Treg en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet de répondre aux questions posées dans ce projet sur le rôle du TNF et du TNFR2 dans la biologie des Treg dans les maladies auto-immunes. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. La plupart des expériences seront initiées chez des jeunes adultes de 8 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature. Les seules exceptions concernent les expériences pour lesquelles les souris seront traitées de la naissance à l’âge de 12 semaine et les expériences de greffes de moelle osseuse pour laquelle les souris seront greffées à l’âge de 8 semaines et analysées 8 semaines après.
Evaluation de l’efficacité d’un composé actif administré par voie orale à 2 doses sur le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Mis à jeun douze heures puis anesthésiés quarante minutes le temps qu'on leur introduise dans le colon une substance qui l'ulcère, 32 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, huit autres servant de témoins avec un produit neutre. Les 40 rats sont tués à la fin pour prélever le colon et son contenu. Le porteur annonce un inconfort et une douleur "notoires", une perte de poids, une posture prostrée, une fourrure hérissée, des yeux moins ouverts, et écrit qu'aucun antidouleur ne sera administré parce qu'il interférerait avec les résultats. L'étude compare deux doses d'un composé anti-inflammatoire à un placebo et à un traitement de référence, dans l'espoir d'un essai clinique chez l'humain.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité distale du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’un composé actif ayant des propriétés anti-inflammatoires et antidouleur, administré par voie orale à 2 doses, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets d’un composé actif à 2 doses différentes chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ce composé actif sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec ce composé actif, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 32 des 40 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 8 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 6 jours sur les animaux vigiles, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. Le traitement avec le composé actif à évaluer devrait limiter cet inconfort et cette douleur ressentie et donc les effets sur les différents paramètres mesurés, tout comme le traitement anti-inflammatoire intestinal de référence comme nous l’avons démontré dans de précédentes études. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 40 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner le composé actif ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental spécifique à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront placés à 2 par cage dans des cages transparentes avec des briques d’Aspen et du papier kraft comme enrichissement, et ils auront accès à la nourritue et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur du composé actif testé sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires du composé actif qui sera testé, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique induit par le TNBS qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative.
Elevage des lignées Foxo1
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privées d'une protéine dans leurs lymphocytes T, de façon permanente ou après injection d'un composé déclencheur, 1530 souris sont élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection par jour pendant trois jours, sur animal vigile, après contention. Le porteur signale qu'une étude décrit chez ces souris une encéphalite spontanée vers six mois, qu'une autre n'en décrit aucune, et choisit de ne pas les garder au-delà de quinze semaines. Toutes sont tuées à la fin de l'élevage pour prélever le thymus, la rate et les ganglions lymphatiques.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'étudier le devenir des cellules T qui constituent une partie des globules blancs essentiels au sytème immunitaire, en présence ou absence totale ou partielle d'une protéine connue pour être fortement exprimée dans ces cellules. Nous chercherons à comprendre comment cette protéine affecte les fonctions de ces cellules T in vitro. Nous génèrerons différentes combinaisons de souris ne possédant plus cette protéine, soit de manière chronique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Après mise à mort, les organes lymphoïdes (thymus, rate, ganglions lymphatiques) seront récupérés et des expériences in vitro et ex vivo seront réalisées.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ces modèles murins nous permettra de comprendre comment cette protéine peut contrôler la génération, la maintenance, l’activation des cellules T, qui sont des acteurs principaux dans différentes pathologies autoimmunes telles que la sclérose en plaque ou l’arthrite rhumatoïde. Comprendre les mécanismes sous-jacents permettra de poser les bases moléculaires pour le développement de nouveaux traitements pour ces pathologies.
Procédures
Les injections du produit permettant la suppression totale ou partielle de notre protéine se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours consécutifs. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.
Impact sur les animaux
Une étude a décrit que les souris ne possédant pas la protéine d'intérêt dans les cellules T pouvaient développer une encéphalite spontanée à l'âge de 6 mois. Cependant, une autre étude ne décrit pas de développement de pathologie et lors de nos études précédentes, et en accord avec cette dernière publication, nos collaborateurs ainsi que nous-mêmes n'avons pas, non plus, observé de développement de phénotype dommageable. Toutefois, nous utiliserons ces souris jusqu'à maximum 15 semaines, ce qui ne permettra pas d'atteindre l'âge où un phénotype potentiellement dommageable se développerait et de garder un phénotype stable des cellules T. Pour les souris ne possédant pas la protéine après induction avec un composé, l'injection de ce dernier sera effectué par voie intrapéritonéale et ne prendra que quelques secondes. Une infection pourrait se développer au niveau du site d'injection, ce qui pourrait entraîner une douleur. Ce site sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin. Aucun phénotype dommageable n'est attendu après la délétion de la protéine suite à l'injection du composé.
Devenir
A la fin de la procédure d'élevage, les animaux seront mise à mort pour récupération d'organes.
Remplacement
Nous travaillons sur l'impact d'une protéine sur le devenir des cellules T naïves, qui sont essentielles au système immunitaire et qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des différentes populations des cellules T ex vivo et d’étudier la biologie des cellules T naïves in vitro. Nos prélèverons le maximum d’organes (ganglion, rate, thymus) pour chaque animal afin de collecter le plus d’informations au cours d’une procédure. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Un test statistique sera effectué pour comparer les groupes.
Raffinement
Comme nous étudions le système immunitaire, les animaux seront élevés dans une zone d'élevage spécifique protègeant les animaux de pathogènes spécifiques et seulement accessible par des zootechniciens. Les animaux sont élevés dans des cages ventilées, avec de l'eau et de la nourriture à volonté. Des barrières physiques bloquent l'entrée de pathogènes et des contrôles sanitaires sont effectués régulièrement sur animaux sentinelles afin de s'assurer qu'aucune contamination par des pathogènes éventuels ne soit en cours. Les animaux seront utilisés bien avant apparition d’un phénotype potentiellement dommageable. Afin de récupérer les organes d'intérêt, les animaux seront transférés dans une animalerie au statut sanitaire conventionnel. Les animaux seront élevés en groupe, dans des cages ventilées permettant une circulation d'air saine et limitant le risque d'infection des animaux. Ils auront à leur disposition tout le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Un suivi règlementaire quotidien sera effectué. Dans ces conditions d'hébergement et à l'âge où ils seront étudiés, nous n'attendons aucun phénotype dommageable pour ces animaux.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement (souris- knock-out, transgéniques), ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l’étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des maladies auto-immunes, ce qui est l’objet de notre recherche. Nous utiliserons les souris qui auront une suppression des protéines spécifiquement dans les lymphocytes T et celles qui auront une suppression des protéines aigüe, après injection d'un produit spécifique, entre 4 et 15 semaines. Cela permettra de rester éloigné de l'âge décrit (6 mois) où les animaux pourraient développer un phénotype potentiellement dommageable. De plus, la population de cellules T naïves est plus abondante et garde des caractéristiques phénotypiques stables chez les souris jeunes et adultes.
Modèles murins pour étudier le role des kinases Pim1 et Pim2 au cours de la réponse immunitaire humorale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injections intrapéritonéales, injections sous-cutanées, gavages à la canule métallique sans anesthésie et prélèvements sanguins submandibulaires répétés : 800 souris subissent ces actes sur animal vigile, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur reconnaît que le gavage peut provoquer une détresse respiratoire et un reflux, tout en affirmant que ses protocoles n'induisent "pas de phénotype" et pas d'autre stress que celui, "bref et modéré", de l'injection intrapéritonéale. L'enjeu déclaré est de comprendre comment deux kinases régulent la transformation des lymphocytes B en plasmocytes, étape que le porteur présente comme indispensable à la compréhension des lymphomes. Ni le nombre de prélèvements sanguins, décrits comme "itératifs à différents temps", ni le nombre d'immunisations, "soit unique ou répétée selon les expérimentations", ne sont précisés.
Objectifs
Les lymphomes sont des cancers des cellules du sang qui se développent à partir des lymphocytes B, cellules sanguines du système immunitaire, qui sont anormalement bloquées dans leurs processus physiologiques de développement. Les lymphocytes B ont physiologiquement la capacité à devenir des plasmocytes, cellules essentielles de l'immunité dont le rôle est de protéger l’organisme contre les infections par des agents extérieurs. L'incidence de ces cancers est en constante augmentation et restent incurables en dépit de nouvelles thérapeutiques. Identifier les étapes critiques et les acteurs qui régulent physiologiquement la transformation des lymphocytes B en plasmocyte est essentielle car leur altérations ou perturbations est à l'origine du développement de ces maladies. Dans des études menées hors de l’organisme (in vitro), il a été montré le rôle de essentiel de certains facteurs dans ce processus. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de déterminer quand et comment ces facteurs agissent au sein des organes de l'immunité où se déroule la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant le rôle de ces facteurs dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Notre objectif est d’étudier leurs rôles dans différents modèles in vivo. Tout d’abord, nous évaluerons l’effet de l’inhibition (à l'aide d'une moélcules chimique) de ces facteurs sur la réponse immunitaire dans des souris sauvages (exemptes de modification génétique). Aussi, nous utiliserons un modèle de souris modifié génétiquement dans lequel l’invalidation génique de ces facteurs sera induite spécifiquement dans les lymphocytes B activés. Pour activer les lymphocytes B, nous immuniserons les souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécules) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Cela nous permettra d’évaluer le rôle des facteurs clés dans la différenciation des lymphocytes B. Ce projet fera avancer les connaissances fondamentales sur la différenciation plasmocytaire normale, étape indispensable à la compréhension des mécanismes des lymphomes.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension du rôle de certains facteurs dans la biologie du lymphocyte B normal au cours de la réponse immunitaire, étape indispensable à la compréhension des mécanismes à l'origine des lymphomes.
Procédures
Les immunisations seront appliquées sur l'ensemble des animaux (aucune anesthésie requise). L' immunisation se fera par injection intra-péritonéale et sera soit unique ou répétée selon les expérimentations ; les injections se feront sur des animaux vigiles, et sont de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. L'injection d'une molécule spécifique pour l'étude de la prolifération sera réalisée dans certaines sexpérimentations. L'injection de cette molécule se fera sur des animaux vigiles en sous-cutanée ; elle est de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. Aussi, des prélèvements sanguins itératifs à différents temps après immunisation seront réalisés selon les procédures expérimentales décrites. Le prélèvement sanguin sera réalisé en submandibulaire et ne nécessite aucune anesthésie. Le prélèvement n'excèdera pas 1 minute. Enfin, des protocoles de gavage seront réalisés. Le gavage sera réalisé sans anesthésie à l'aide d'une canule métallique et l'introduction de la canule dans la bouche de l'animal sera de l'ordre que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Nos modèles de souris transgéniques ne devraient pas être à l'origine de phénotype dommageable. Dans notre modèle, l'invalidation génique des facteurs d'intérêt sera présente dans une population spécifique et minime de lymphocytes B activés et une population restreintes de plasmocytes, n'ayant donc pas de risque d'altérer la réponse immunitaire physiologique globale des animaux. Notre protocole d'induction de l'invalidation génique utilisé est un protocole standard largement décrit dans la littérature et n’induit pas de phenotype (nuisances ou effets indésirables) chez l’animal autre que les effets propres au geste du gavage (détresse respiratoire, reflux). Une molécule chimique (inhibiteur chimique de nos facteurs d'intérêt) sera utilisée à des doses décrites dans la littérature, sans risque d'induction de phénotypes (nuisances ou effets indésirables) chez les animaux. Notre protocole pour ce traitement chimique n'entrainera pas d’autres stress que ceux propres au geste du gavage (détresse respiratoire, reflux). Nos protocoles d'immunisations utilisés sont des protocoles standards largement décrits dans la littérature et n’induisent pas de phenotype (nuisances ou effets indésirables) chez l’animal, aussi bien à court terme (plusieurs jours) qu'à long terme (plusieurs mois). Ces procédures d'immunisation ne nécessitent ni anesthésie générale ni antalgie et n’entraineront pas d’autres stress que celui, bref et modéré lié à l'injection intrapéritonéale, sans forte douleur pour les souris.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes et fluides d'intérêts (sang et organes de l'immunité). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur lsur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Dans des études menées hors de l’organisme (in vitro), il a été montré le rôle de essentiel de certains facteurs clés, des protéines à activité kinase, dans le processus de la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant le rôle de ces facteurs dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Cependant ces modèles in vitro ne miment que partiellement la réponse immunitaire et ne peuvent pas se substituer efficacement aux analyses menées dans un organisme vivant car elles ne prennent pas en compte la complexité des organes où se produit la réponse immunitaire. L'utilisation d'un modèle animal, et le cas échant de la souris, est donc indispensable pour confirmer nos observations.
Réduction
Dans l’intérêt de réduire le nombre d’animaux utilisé, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins possible de souris, en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes et fluides d'intérêt (sang et organes de l'immnité) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Enfin les protocoles d'immunisations seront réalisés successivement afin de définir les meilleures conditions expérimentales pour notre étude et uniquement si les résultats obtenus justifient de réaliser un autre type d'immunisation. Pour nos explorations sur les modèles d'invalidation, les expérimentations seront faites parallèlement sur tous les modèles (différents gènes invalidés) afin d'utiliser le même groupe contrôle et donc de miniser l'utilisation d'animaux contrôle. Pour chaque étude, nous réaliserons des groupes de 8 animaux par génotype ou traitement, ce qui nous permettra d'obtenir des statistiques fiables et publiables.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer in vivo le rôle des certaines facteurs clés u cours de la différenciation des lymphocytes B suite à une immunisation. La souris est un modèle de choix pour l'étude in vivo des réponses immunitaires. Différents modèles murins seront utilisés. La maturité du système immunitaire chez la souris est optimale à l’âge adulte (environ 2 mois), ainsi nos études seront effectuées uniquement sur des animaux adultes à partir de 8 semaines d'âge.
Génotypage invasif des lignées transgéniques murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.
Bénéfices attendus
Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.
Devenir
Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.
Réduction
Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.
Génotypage de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les 25 000 souris de ce projet naissent dans l'animalerie de la plateforme et sont génotypées pour être triées, celles qui portent la mutation attendue étant destinées à d'autres protocoles. Elles subissent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une biopsie caudale de moins de cinq millimètres pratiquée sur animal vigile en cinq secondes. Le porteur décrit une légère perte de sang, une contention brève, du stress et une légère douleur, et ne dit rien du sort des souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt. Il affirme travailler sur des pathologies "qui ne peuvent être mimées par des cellules en culture" et conclut que l'utilisation de souris transgéniques "reste obligatoire" pour de nombreux projets de recherche.
Objectifs
Les diverses unités utilisatrices de notre plateforme s’intéressent à des thématiques diverses aussi bien dans le domaine de la biologie du développement, du métabolisme, de la trisomie 21, de tumorigénèse, le développement de vaccins… Parmi les maladies sur lesquelles nous travaillons, des modèles murins précliniques présentent des mutations gain ou perte de fonction, modèles inductibles Cre-Lox. L’objectif de ce projet est d’identifier et de génotyper des animaux génétiquement modifiés reproduits au sein de notre animalerie. Cette étape est essentielle pour identifier les animaux qui seront ensuite utilisés à des fins expérimentales dans les projets déposés au MESRI.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre la mise à disposition d’animaux d'un génotype d'intérêt pour le projet. Des lignées de souris transgéniques sont nécessaires pour la compréhension de certains mécanismes du vivant.
Procédures
Un prélèvement caudal (biopsie de la queue) de moins de 5mm pour génotypage (5s) sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Une contention de courte durée est nécessaire, pouvant entrainer un stress et une légère douleur.
Devenir
Les animaux comportant la mutation ou transgène d’intérêt seront utilisés en continu dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le MESRI.
Remplacement
Nous travaillons sur des pathologies qui ne peuvent être mimées par des cellules en culture (développement d’une obésité, d’une trisomie 21...). Il n’est donc pas encore possible de se passer totalement des modèles animaux. A ce jour, l'utilisation de souris transgéniques reste obligatoire pour de nombreux projets de recherche fondamentale et translationnelle.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche des équipes. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris transgéniques (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. En effet, le nombre de couples en reproduction est monitoré au plus près afin de l’adapter en temps réel aux besoins expérimentaux. A cette fin, les animaux sont génotypés avant le sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêts pour les autres procédures expérimentales.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées en groupe dans l’animalerie avec un statut sanitaire contrôlé. Les installations (ventilation, température et lumière) ainsi que les cages (nourriture, eau, enrichissement) sont vérifiées quotidiennement afin de réduire la détresse des animaux. De plus, un suivi quotidien des animaux est réalisé par les animaliers afin de vérifier leur bien-être. Les animaux sont euthanasiés par des procédures appropriées si leur état se dégrade soudainement. Les souris présentant une perte poids de plus de 10% ou une dégradation de leur état général sont monitorées tous les jours par le personnel de l’animalerie.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La souris mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles transgéniques pour nos molécules d’intérêt existant, l’utilisation du modèle murin est légitimée. Enfin, nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Les animaux seront marqués avant le sevrage entre 10 et 15 jours afin d’être génotypés avant le sevrage (soit à minimum 21 jours). Cela permet de rapidement déterminer le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux au moment du sevrage.
Etude des canaux potassiques dans l’activité neuronale du réseau locomoteur spinal chez les souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés sont retirés à leur mère pendant quatre heures au maximum, le temps qu'une injection virale soit faite dans leur colonne vertébrale, puis rendus à une femelle qui peut se montrer agressive à leur retour. 540 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 444 d'entre elles, léger pour 64, et menées sous anesthésie sans réveil pour 32. À partir du cinquième jour suivant l'injection, chaque animal passe trois sessions de tests comportementaux de trois à quarante minutes, et celles issues de la lignée génétiquement modifiée subissent une biopsie de l'extrémité de la queue. Le porteur indique qu'une mauvaise manipulation de l'injection rachidienne peut, rarement, léser la moelle épinière et paralyser les pattes arrière dès le réveil, 508 souris étant tuées pour prélèvement de tissus et 32 gardées vivantes pour l'élevage ou des prélèvements hors saisine.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'équilibre de la balance portée par les fibres nerveuses qui inhibent ou qui excitent le réseau de neurone innervant les muscles des pattes postérieures, est renforcé par les propriétés endogènes de ces neurones. C'est ce jeu d'influence qui dans sa finalité, conduira ou non à une contraction musculaire. L'un des projets de l'équipe est d'étudier, dans les conditions normales, les mécanismes moléculaires qui conduisent à cette réponse musculaire. Une protéine est principalement ciblée. Elle existe sous différentes formes et s'exprime à la surface des neurones. Ces différentes versions seraient susceptibles de jouer un rôle dans l'activité électrique de la cellule nerveuse. Des approches génétiques, biologiques, seront employées pour caractériser la contribution individuelle ou collective de ces protéines sur le modèle murin, des études comportementales analyseront leur effet global sur la posture et la locomotion de l'animal.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables de l'activité des cellules nerveuses dans un réseau sain. En ciblant spécifiquement une protéine d'intérêt par l'outil génétique sur le modèle de la souris, ces études approfondies fourniront des données solides sur le rôle de cette protéine dans les conditions normales. Enfin, ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté scientifique.
Procédures
Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection du virus pendant 4h maximum car c'est toute la portée qui est concernée, l'injection proprement dit se fait en moins d'une minute mais la préparation en post injection et pré-injection nécessite 20 min par animal. Plus tard dès le 5eme jour post injection, les animaux injectés vont suivre des sessions d'expérimentations non invasives à une fréquence de 3 sessions par animal sur l'ensemble de l'étude, couvrant les 3 premières semaines postnatales. Ces tests comportementaux durent entre 3 et 40 min maximum en fonction des tests, les enregistrements vidéo durent 3 min maximum par animal. Chez les souris génétiquement modifiées, pour distinguer précocément celles qui le sont de celles qui ne le sont pas, il est nécessaire de faire un test génétique à partir d'un fragment (
Impact sur les animaux
Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection virale, puis plus tard lors des tests comportementaux et des enregistrements vidéos. Les manipulations et les changements de lieux des animaux pour ces tests peuvent également engendrer du stress. Bien que l'injection dans la colonne vertébrale soit généralement sûre, dans de très rares cas , une mauvaise manipulation peut entraîner une lésion de la moelle épinière, pouvant causer une paralysie partielle ou totale des membres postérieurs, visible dès le réveil. Les animaux injectés peuvent perdre du poids. La mère peut être stressée du fait de l'enlèvement de la totalité de ses petits et peut avoir des signes d'agressivité au retour des souriceaux qui auront subi une injection virale à la naissance. Le phénotype éventuel attendu serait un déficit moteur qui pourrait potentiellement se manifester par un affaissement de l'arrière train, des tremblements des pattes postérieures. La biopsie de l'extrémité de la queue des souriceaux provenant de la lignée de souris génétiquement modifiée, peut induire du stress chez l'animal et un léger saignement.
Devenir
les animaux sont mis à mort pour prélèvement tissulaire. Les 32 animaux gardés en vie seront potentiellement utilisés pour l'élevage ou pour des prélèvements tissulaires pour des procédures hors saisine.
Remplacement
Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal demeure essentielle, car nous étudions la complexité du réseau de neurones innervant les muscles des pattes postérieures dans les conditions normales d'une activité de locomotion où de nombreux paramètres rentrent en jeu.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 540 animaux. Il s'agit d'une poursuite des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. Les études comportementales seront menées longitudinalement, ainsi chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera le nombre d'animaux utilisés. A la fin de cette étude longitudinale, les tissus des animaux âgés de 21 jours seront prélevés, évitant ainsi de rajouter un lot d'animaux supplémentaire pour les études protéiques prévues à la 3eme semaine postnatale.
Raffinement
Une fois injectés, les animaux sont maintenus en fratrie et ramenés à la mère. Pour minimiser les épisodes d'agressivité de la mère envers les nouveau-nés injectés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements stéréotypés ou anxieux. De plus, nous pourrons utiliser des récompenses pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...). Que ce soit pour l'injection virale, les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. A partir du stade juvénile, du gel nourrissant ou des récompenses peuvent leur être fourni dès qu'ils sortent de la zone de stabulation. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur, en observant des points limites pour les jeunes animaux.
Choix des espèces
Cette étude est dans la continuité de nos projets scientifiques précédents. Nous avons une grande expertise de ce modèle, nous avons accumulé de nombreuses données sur lesquelles nous pouvons nous baser. L'injection virale est également un outil que nous maîtrisons sur ce modèle. Les animaux seront utilisés principalement au cours des 3 premières semaines post-natales. La tranche d'âge de la première et deuxième semaines post-natales restent compatibles avec les techniques d'enregistrements de l'activité neuronale sur tissu prélevé tandis que la deuxième et troisième semaines post-natales sont des périodes clés pour l'acquisition de la marche et donc pour nos études comportementales chez l'animal. Nous postulons que le niveau d'expression des protéines d'intérêt est déjà détectable à la naissance, ce qui permet une étude protéique couvrant les 3 premières semaines de vie de l'animal.
Mise en place d’un protocole de cultures cellulaires primaires d’ostéoblastes et d’ostéoclastes à partir de prélèvements d’os et de moelle osseuse chez la souris C57Bl/6j irradiée ou non avec des rayons X.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Brûler la patte arrière de souris pour en tirer des cultures de cellules osseuses : 144 souris sont utilisées à cette fin, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 96. Chacune est épilée sous anesthésie, puis sa patte arrière est irradiée aux rayons X de basse énergie pendant vingt minutes au maximum, avant un suivi quotidien du pic lésionnel entre le septième et le trentième jour. Le porteur décrit sur la zone irradiée un œdème, une desquamation, un érythème, parfois une nécrose, une rétractation des tissus à la cicatrisation et une mobilité réduite de la patte. Tous les prélèvements sont faits après la mort, et le porteur qualifie le passage par un modèle "in vivo" d'"indispensable" pour mettre au point ces cultures cellulaires.
Objectifs
Bien que l’utilisation des rayonnements ionisants dans le domaine médical, industriel ou militaire soit majoritairement maitrisée, des surexpositions accidentelles peuvent se produire. Ces expositions peuvent entrainer un syndrome cutané radio-induit se traduisant par l’apparition d’érythème, de desquamation ou de nécrose tissulaire, musculaire voire osseuse dans les cas les plus sévères. Afin d’avancer dans la connaissance scientifique des expositions accidentelles induites par des rayons X de basses énergies et de contribuer à l’amélioration de la prédiction du risque de complications, nous avons développé un modèle de brûlures radiologiques induites par des rayons X de basses énergies chez la souris (irradiation localisée de la patte). Afin de mieux comprendre les processus biologiques mis en place suite à une exposition avec ces rayons X de basses énergies pour lesquels le dépôt de dose est très hétérogène (Dtissu ≠ Dmoelle ≠ Dos), nous souhaitons mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires, ostéoblastes et ostéoclastes, à partir de prélèvements faits chez la souris afin d’étudier l’impact de l’irradiation et du temps sur le devenir et les capacités de ces cellules. En effet, les ostéoblastes, d’origine mésenchymateuse, jouent un rôle clé dans la formation et la minéralisation de l’os tandis que les ostéoclastes, d’origine hématopoïétique, jouent un rôle clé dans la résorption osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires à partir de prélèvements médullaires fait chez des souris irradiées localement avec des rayons X de basses énergies. Au-delà de la mise en place de ce protocole pour notre projet de recherche, à plus long terme, nous souhaitons grâce à ces modèles de cultures cellulaires primaires mieux comprendre les processus biologiques impliqués dans l’homéostasie osseuse suite à une irradiation.
Procédures
Epilation des pattes sous anesthésie (environ 10 minutes) Irradiation patte arrière sous anesthésie (maximum 20 minutes) Scoring des lésions (contention, environ 1 minute) Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet les animaux vont développer des brûlures radiologiques au niveau de la patte arrière. Ce modèle expérimental de gravité modérée nécessite une vigilance particulière en particulier au pic de la lésion. Sur la base de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle une évaluation de la brulure radiologique basée sur du scoring lésionnel sera effectuée entre 7 jours et 30 jours après l’exposition (pic lésionnel) par des personnes formées à l’évaluation de ce type de lésions. L’irradiation localisée de la patte peut entrainer les signes suivants au niveau de la zone irradiée : œdème, desquamation, érythème, voire nécrose dans certains cas. Il s’en suit une cicatrisation qui peut conduire à une rétractation des tissus. Cette irradiation peut entrainer une mobilité moindre de la patte irradiée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les cultures primaires et les analyses éventuelles.
Remplacement
Dans le but de mettre en place des cultures cellulaires primaires et d’étudier l’impact de l’irradiation sur ces cellules irradiées in vivo, l’utilisation d’un modèle « in vivo » demeure indispensable au bon déroulement des projets scientifiques mais le nombre de souris utilisé sera réduit autant que possible. Les utilisations d’animaux dans le cadre de ce projet seront tracées (date, projet concerné, informations sur les animaux, devenir des animaux, type d’irradiation). Tout événement non attendu sera également tracé, répertorié et des actions seront mises en place si nécessaire.
Réduction
Ce projet prévoit d’utiliser au maximum 16 souris par groupe de dose et par temps. Comme nous allons procéder en étape Go / no Go l’intégralité des souris ne seront peut-être pas utilisées. L’objectif est d’avancer pas à pas afin d’utiliser le moins de souris possible pour la mise en place de ces cultures cellulaires primaires.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les souris seront hébergées en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bien-être animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel, basé sur l’observation des modifications des tissus, ainsi que la mise en place de points limites adaptés. Ce modèle expérimental de gravité modérée où des brûlures radiologiques vont être développées au niveau du membre inférieur nécessite une vigilance particulière. Sur la base de notre expérience, de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition correspondant au pic de la lésion. Des croquettes pourront également être déposées au fond de la cage avec de l’eau gélifiée afin de faciliter l’alimentation des animaux si des souris perdaient beaucoup de poids durant le pic lésionnel.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé pour les études physiologiques. De plus, le modèle de lésions musculo-cutanée radio-induites a été précédemment caractérisé pour des irradiations avec des rayons X de basse énergie au sein de notre. Le mise en place de ces cultures cellulaires primaires fait suite à ces deux projets afin de mieux comprendre l’impact de l’irradiation sur les ostéoblastes jouant un rôle clé dans la formation osseuse et la minéralisation et les ostéoclastes impliqués dans la résorption osseuse. Pour les besoins de ce projet, des animaux adultes seront utilisés (8-10 semaines). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge. De plus, en vieillissant, les souris C57BL/6J ont tendance à développer des comportements agressifs.
Rôle du récepteur Rev-erb alpha dans l’accélération de la cicatrisation endothéliale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quatre cents ovariectomies, trois cents agressions électriques de la carotide, trois cents agressions mécaniques, deux cent quarante poses de capsule ou de mini-pompe sous la peau : ces actes se répartissent sur 610 souris, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 600 d'entre elles, et le porteur prévoit d'enchaîner plusieurs interventions sur les mêmes animaux "dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général". Une souris qui montre des signes de douleur importante ou perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée. L'objectif est d'évaluer un récepteur des rythmes biologiques comme cible thérapeutique dans les maladies cardiovasculaires, ce qui conduit à opérer les femelles pour leur retirer les ovaires afin de mimer la privation œstrogénique de la ménopause.
Objectifs
En termes de santé publique, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime que les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès dans le monde, avec un coût estimé à 196 milliards d'euros en Europe. Outre les médicaments diminuant les taux de lipides les médecins ne disposent en effet pas de stratégie thérapeutique alternative efficace pour traiter les patients à haut risque cardiovasculaire et réduire le risque résiduel cardiovasculaire. À cette fin, l'identification de cibles thérapeutiques originales est indispensable. Sur la base de nos données préliminaires convaincantes et solides, ce projet a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur régulant les rythmes biologiques dans les artères, notamment dans le processus de cicatrisation endothéliale. Cibler ce récepteur par des approches pharmacologiques pourrait donc représenter un nouveau traitement alternatif aux médicaments actuels, ou pourrait être utilisé en association avec ces composés pour réduire le risque cardiovasculaire résiduel chez les patients. Cette question, qui englobe des aspects intégrés, nécessite le recours à l'expérimentation animale dans le respect des normes éthiques. L’impact du genre/sexe ainsi que de la ménopause étant déterminant dans l’apparition/le traitement des maladies cardiovasculaires, les deux sexes seront étudiés, ainsi que l’impact de la privation oestrogénique mimant la ménopause (période à haut risque cardiovasculaire chez la femme).
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de proposer un nouveau traitement alternatif aux médicaments hypolipidémiants actuels, ou pourrait être utilisé en association avec ces composés pour réduire le risque cardiovasculaire résiduel chez les patients.
Procédures
Certains animaux seront soumis à différentes interventions : - Injection intrapéritonéale (5 à 10sec) (240 animaux) - Pose de capsule ou mini-pompes en sous cutanée (5 à 10min) (240 animaux) - Ovariectomie (10 à 20min) (400 animaux) - Agression électrique de la carotide (20 min) (300 animaux) - Agression mécanique de la carotide (20-30 min) (300 animaux)
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisés dans ce projet sont de classe modérée (ovariectomie, pose de capsule, pose de mini-pompes, agression électrique ou mécanique de la carotide). Elles peuvent générer une douleur mais qui sera traitée par analgésique. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué : si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un morphinique sera administré à visée antalgique. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera mise à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
L'utilisation du modèle murin nous permettra d'identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation endothéliale. Ce processus implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales auxquelles sont soumises les cellules endothéliales, d'autant plus que l'expression du récepteur des œstrogènes est perdue dans l'ensemble des lignées cellulaires endothéliales. Par ailleurs, l'étude de l'effet du sexe, via la sécrétion d'hormones stéroïdiennes telles que l'œstrogène et la testostérone, implique de multiples fonctions, tissus et cellules dans l’organisme, qui ne peuvent être modélisés par des approches in vitro. C'est pourquoi le recours à l'expérimentation animale est l'unique approche permettant la réalisation de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.
Raffinement
Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris resteront en acclimatation pendant un minimum d'une semaine en présence d'enrichissement (de type cartons, batôns ou balle en bois) pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (variation de poids corporel, apparence et mobilité de l'animal, comportement à la contention) seront surveillés permettant de mettre en application l’arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d’arrêt des souffrances. Pour l’ensemble des chirurgies, les animaux sont gardés sur plaque chauffante pendant toute la procédure jusqu'à leur réveil. Un analgésique (morphinique) sera administré. En post opératoire, les souris sont surveillées et pesées. En cas d'amaigrissement excessif (>20%) ou de signe de souffrance de l'animal (apathie, yeux fermés, absence de toilettage, prostration, blessure), l’animal sera sorti de la procédure et euthanasié.
Choix des espèces
Mus musculus. La souris est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardio-métaboliques Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisé chez la souris adulte (à partir de 8semaines).
Elevages de souris pour l’optimisation de protocoles de transplantation de cellules souches hématopoïétiques dans des modèles de pathologie du globule rouge.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les couples reproducteurs sont tués en fin d'élevage parce qu'ils sont "trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales". 4 880 souris vont être utilisées dans cet élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 100 réutilisées ailleurs et 4 780 déclarées mortes, alors que le porteur décrit par ailleurs une utilisation continue des jeunes souris dans ses expériences de transplantation. Elles sont mises à reproduire pendant six mois, et les jeunes porteuses du modèle de drépanocytose subissent un prélèvement sanguin au niveau de l'œil pour être génotypées, tandis que les lignées immunodéficientes sont élevées en conditions stériles pour éviter les infections auxquelles leur système immunitaire les expose. Les souris qui n'entrent pas dans les expériences de transplantation "pourront également être proposées pour des formations", ce que le porteur présente comme une manière de limiter l'utilisation des animaux non-humains.
Objectifs
Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs de thérapie génique permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines, pour améliorer les protocoles de greffes et de thérapie génique chez l’homme afin de traiter deux maladies génétiques du sang, la drépanocytose et la bêta-thalassémie. L’objectif de ce projet consiste à générer un modèle de souris qui mime certains aspects de la drépanocytose et qui doit être génotypé par un prélèvement sanguin ainsi qu’un modèle murin immunodéficient permettant de réaliser des greffes de cellules souches humaines et de les maintenir dans les meilleurs conditions d’élevage possibles Ces modèles de souris sont nécessaires à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux vecteurs de thérapies géniques avant leur utilisation chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d'élevages de modèles murins de pathologies du globule rouge (drépanocytose et beta-thalassémie) ainsi que des modèles murins immunodéficients permettant de réaliser des greffes de cellules souches humaines. Des greffes de cellules souches seront réalisées sur ces modèles afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux vecteurs de thérapie géniques développés par notre laboratoire pour traiter ces maladies génétiques. Les protocoles améliorés de correction et de greffe des cellules souches sanguines dans le cadre de thérapies géniques pourront être appliqués à l’Homme.
Procédures
Les souris seront mis en accouplement pour plusieurs cycles de reproduction pendant 6 mois. Les jeunes souris modèles de la drépanocytose seront également soumises à un prélèvement sanguin qui dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les modèles immunodéficiences présentent un risque potentiel de développer des infections diverses par des pathogènes (virus, bactéries). Les souris modèles de la drépanocytose doivent être phénotypées par prélèvement sanguin, ce qui peut entrainer un stress dû à la contention ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.
Devenir
Les couples reproducteurs seront euthanasiés en fin de procédure d'élevage car ces animaux seront trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales. Les jeunes souris générées seront utilisées pour nos expériences de transplantation (utilisation continue). Les animaux ne rentrant pas dans des expériences de transplantation pourront également être proposés pour des formations afin de limiter au maximum l’utilisation des animaux
Remplacement
La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines est un phénomène complexe. Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative in vitro permettant de reproduire les différents processus physiologiques mis en jeu dans ce phénomène : guidage, implantation, survie, prolifération et différenciation de ces cellules. Leur transplantation chez un modèle animal est la seule solution pour évaluer leur capacité à se loger au niveau de la moelle osseuse et à reconstituer le système sanguin à long terme. Nous ne disposons donc pas actuellement d'alternative à l’utilisation de modèles animaux dans le cadre de nos projets de recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ces élevages dépend des projets de recherche dans lesquels ils sont utilisés. Son évaluation repose sur des travaux de recherche réalisés au sein de notre laboratoire sur les dernières années. L’anticipation et la rationalisation de nos besoins en fonction des différents projets permet de ne mettre en accouplement uniquement le nombre minimum d’animaux pour obtenir ceux nécessaires à nos expériences.
Raffinement
Les souris immunodéficientes sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce qui est stérilisée par autoclave. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Le génotypage des animaux se fait lorsque les souris sont jeunes et par une méthode peu douloureuse (prélèvement sanguin). Par ailleurs, la visite journalière des techniciens animaliers ainsi que la mise en place de points limites et de critères d’arrêts permettent de limiter la douleur à son minimum et d’intervenir rapidement en cas d’effet inattendu afin de décider avec le vétérinaire quelle est la suite à donner.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de la greffe de cellules souches sanguines. La lignée de souris drépanocytaire est utilisée comme modèle de pathologie humaine du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. La lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet d’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie génique sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de β-thalassémie. Dans ce projet la mise en accouplement se fera à 8-10 semaines, âge ou les souris sont fertiles. Le génotypage des petits s’effectuera après le sevrage afin que le prélèvement sanguin soit le plus faible possible par rapport au volume sanguin total de l’animal.
Génotypage des souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un prélèvement de tissu sous anesthésie gazeuse, de quelques secondes, permet de génotyper les souris transgéniques nées dans l'animalerie. 2 400 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la seule atteinte décrite étant le stress de la manipulation et de la contention. Le projet ne couvre que cette étape d'identification, les expériences elles-mêmes, portant sur des délétions de gènes de l'immunité liées au cancer, faisant l'objet de demandes séparées. Le devenir déclaré ne fait état d'aucun animal gardé vivant, alors que le porteur écrit que ces souris seront utilisées en continu et entreront ensuite dans d'autres protocoles.
Objectifs
Ces dix dernières années, l’immunothérapie s’est développée et a permis la mise en place d’une réponse puissante et durable chez un nombre limité de patients (20% en moyenne). Dans le but d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie des études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes de mise en place la réponse immunitaire anti-tumorale. Les études que nous réalisons au laboratoire utilisent des souris transgéniques possédant des délétions conditionnelles de gènes impliqués dans l’immunité, nous permettant d’étudier ces gènes comme des marqueurs ou des cibles pour améliorer la réponse à l’immunothérapie mais également les connaissances dans le domaine. La demande d’autorisation concerne le génotypage des souris transgéniques générées. L’utilisation de ces souris pour des études fera l’objet de demandes d’autorisation ultérieures.
Bénéfices attendus
Le cancer est aujourd’hui un problème de santé publique majeur et est la seconde cause de mortalité dans le monde. A titre d’exemple, en 2020, 20 millions de personnes ont été diagnostiquées et 10 millions de personnes sont décédées. Au laboratoire, nous travaillons sur des pistes d’améliorations pour augmenter l’efficacité de l’immunothérapie. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus permettrons de mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans une réponse anti-tumorale.
Procédures
Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse (durée : quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.
Devenir
Les animaux de ces colonies seront utilisés en continue. Ils entreront dans d’autres protocoles expérimentaux suite à leur génotypage. Ces protocoles seront soumis au comité d’éthique en amont.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, la tumeur, le système vasculaire... En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux transgéniques. Le décryptage des mécanismes moléculaires sera par la suite réalisé in vitro.
Réduction
La taille des élevages sera adaptée en fonction des nécessités expérimentales, elles-mêmes soumises au comité d’éthique. Les 2 sexes seront utilisés.
Raffinement
Les souris seront élevées dans un milieu enrichi avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. Chaque animal sera examiné 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. La procédure sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux de référence pour les études sur le cancer et l’immunité. De plus, les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée. Les manipulations relatives au génotypage et à l’identification par puce seront réalisées sur des animaux très jeunes (1ère semaine de vie) pour limiter le mal-être.